JPS6249857A - 人工移植物体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒト（人）に移植するための人工移植物体に
関するものであり、より詳細には、現在ではヒト患者の
大静脈または大動脈７＃換するために一般に用いられる
血管移植片のような合成移植物に関するものである。更
に本発明は−そのような移植片を提供して内皮細胞粘着
および／またけその上での増殖？改善する処理に関係す
る。

〔従来技術とその問題点〕

人工血管移植片の概念の発達は、最初の移植片が３０年
以上も前に用いられて以来、血管外科の重要な目標であ
った。大部分のアプローチは、抗凝血性である表面７作
り出丁ことに集中し、これら努力の大部分には改良ポリ
マー表面に向けられた。多分、理想的な血液・表面・界
面は天然に生成するヒト内皮であろう。もしそれが人工
的移植片に存在するならば、それは本来の血管の利点？
数多提ｆ＃でるであろう。残念なことに、ヒトに挿入さ
れた人工移植片には、移植片の内皮形成がおこる動物と
は対照的に、内皮形成は限られた程度にしかおこらない
。動物におもては、移植前に予め凝固した人工移植片に
内皮ａ胞を植えつけると移植片の内皮細胞による被覆は
改善された。しかしこの技法の使用はヒトにおいては制
限される。

ブルースジャレル等（Ｂｒｕｃｅ　Ｊａｒｒｅｌ　Ｉ　
ｅｔａｌ　）の培養ぜるヒト成内皮細胞の増殖（Ｈｕｍ
ａｎ　Ａｄｕｌｔ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌ
　Ｇｒｏｗｔｈ　５　　Ｉｎ　ジャーナル・オブ・グア
スキュラニ・サージエリー−第１　巻−Ａ　６　。

７５７−７６４ページ（１９８４年１１月）：へＩノ：
／グ等（Ｈｅｒｒｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ　）の”血管移植
片に自家内皮ン植えつけるための単一および段階的技術
（Ａ　Ｓｉｎｇｌｅ　ａｎｄ　Ｓｔａｇｅｄ　Ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　Ｓｅｅｄｉｎｇ　Ｖａｓｃｕｌａ
ｒ　Ｇｒａｆｔｓ　ｗｉｔｈ　Ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓ　
Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）”サージエリ−，１９７８，
８４巻４９８−５０４ページ；グラハム等（Ｇｒａｈａ
ｍ　ｅｔ　ａｌ　）の　培養自家内皮細胞の血管人工移
植片への播種（Ｃｕ１ｔｕｒｅｄ　Ａｕｔｏｇｅｎｏｕ
ｓ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｓｅｅｄｉｎ
ｇｏｆ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ　Ｇ
ｒａｆｔｓ　）　　、　Ｓａｒｇ　Ｆｏｒｕｍ３０巻、
２０４−６ページ（１９７９）；グラハム等（Ｇｒａｈ
ａｍ　ｅｔ　ａ　Ｉ　）の１酵素的に誘導し、培養した
イヌ内皮細胞χ植えつけた拡散ポリテトラフルオｏｘチ
レン人工血管（Ｅｘｐａｎｄｅｄ　Ｐｏ１ｙｔｅｔｒａ
ｆＩｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｐ
ｒｏｓｔｈｅｓｅｓ　５ｅｅｄｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｚ
ｙｍａｔｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｒｉｎｅｄ　ａｎｄ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅｄ　Ｃａｎ１ｎｅ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
　ｃｅｌｌｓ　）”サージエリ−１９）巻。

５５０−９ページ（１９８２）およびディレィ等（Ｄｉ
　ｌ１ｅｙ　ｅｔ　ａｌ　）の”人工血管への内皮播種
（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｓｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｖ
ａｓｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ）”ジャツフエ
編集、内皮細胞の生物学、　Ｔｈｅ　Ｈａｇｕｅ：Ｍａ
ｒｔｉｎｕｓ　Ｎ１ｊｈｏｆｆ　、　１９８４．４（１
１−１１ページビ参照せよ。

過去３０年間にわたって、アテローム硬化性血管疾患の
結果として生じる虚血領域へ血流Ｚ速かに回復せしめる
ために１人工移植片が用いられてきた。その他に、慢性
腎不全患者における血液透析のための血管進入路７作る
ために、また動脈瘤の修復知も用いられている。雇初は
虚血組織への濯流回得に成功するとはいえ、これら移植
片の長期予後はかんばしくない。長期に互ると、直径４
ｍｍ以下の移植片は、フィブリン沈着および細胞粘着に
よって閉塞され、開放性ン失う（ディレィ同上）。この
プロセスは二次的であるようにみえる。そして一部には
、移植人工物の露出した（すなわち内皮が形成されてい
ない）表面の血栓形成性て因るようにみえる。バーガー
等（Ｂｅｒｇｅｒ　ｅｔａｌ）の”人におよる人工血管
の治療；その不完全性（Ｈｅａｌｉｎｇ　ｏｆ　Ａｒｔ
ｅｒｉａｌ　Ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ　ｉｎ　Ｍａｎ。

Ｉｔｓ　Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅｎｅｓｓ　）”、　Ａｎ
ｎ、　Ｓｕｒｇ、　１７５巻。

１１８−２７ページ（１９７２）参照。そこで現在の多
くの研究は、ヒト本来の血管にあるような。

非血栓形成性内皮細胞表面７作り出てことｔ望んで次の
どちらかＺ目指している：（Ｉ）人工的な、非血伶形底
性表面Ｚもった移植片の開発、（２）ヒト内皮細胞で内
張りした人工血管。

１９２０年以来、動物由来の内皮細胞？培養して研究し
た。１９７３年にジャツフエ等はヒト謄静脈の内皮細胞
の培養に成功し、これらの細胞７機能的に特徴づけた。

ジャツフエ等の　培養ヒト内皮による抗血友病性因子抗
原の合ｆｆ　（５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ａｎｔｉｈ
ｅｍｏｐｈｉｌｉａ　Ｆａｃｔｏｒ　Ａｎｔｉｇｅｎ　
ｂｙ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｅｎｄｏｔｈｅ
ｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌ　）　、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖ
ｅｓｔ、５５巻、２７５７−６４ベージ（１９７３）；
およびレヴイス（Ｌｅｗｉｓ　）の　組織培養における
内皮（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｕｉｍ　ｉｎ　Ｔｉ５ｓｕｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅ　）Ａｍ、Ｊ、Ａｎａｔ　、　３０巻、
３９−５９ページ（１９２２）：ジャツフエ等、　　静
脈から取り出したヒト内皮細胞の培養（Ｃｕ１ｔｕｒｅ
　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｃｌ
ｌｓ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｆｒｏｍ　Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ
　Ｖｅｉｎｓ　）”Ｊ　、、ＣＩ　ｉｎ　、Ｉｎｖｅｓ
ｔ　、　　５２巻、２７４５−５６ページ（１９７３）
ｉ参照せよ。これらの培養細胞は増殖ポテンシャル２示
すが、単一の請静脈から生産される細胞の総数は非常に
限られるのが普通で。

収穫内皮細胞では１０−１００倍の範囲の増加に過ぎな
い。

ヒト謄静脈内皮を用いて生産される細胞数ンふや丁ため
にいくつかの技法が提案されたが、内皮細胞の大Ｉ培養
は理想には１だ遠い。若干の研究者は肺動脈および静脈
からのヒト成内皮細胞の培養に成る程度成功したが、こ
れは短期間に過ぎなかった。ヒト腸骨動脈内皮細胞が不
十分な回動ではあるが培養できることも証明された。例
えばグラスペルグ（Ｇｌａｓｓｂｅｒｇ　）等の研究に
おいて。

１２．７ｃｍ（５インチ）の血管切片あたり５０〜５０
０ケの生存能力ある細胞か得られる。これは非常に低い
収量モある。　ヒト腸骨動脈に由来せる内皮細胞の培養
（Ｃｕ１ｔｕｒｅｄ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃａ１
ｌｓＤｅｒｉｖｅｄ　Ｆｒｏｍ　Ｈｕｍａｎ　Ｉ　１ｉ
ａｃ　Ａｒｔｅｒｉｅｓ　）　’　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、
　１８巻−８５９−６６ページ（１９８２）。

フライ等（Ｆｒｙ　ｅｔ　ａｌ　）は、死体提供者から
の腎摘出時に切除した腹部動脈からのヒト成内皮細胞を
培養することに成功したと報告した。しかしこれらの細
胞も増殖能力は限定されていることが証明された。

現存の技術からは、提供患者から採取した血管の合理的
１て移植片にあらかじめ内皮ン形成させるほど十分な量
の細胞Ｚ生産することはむづかしいことは明らかである
。移植前に移植片！完全に内皮化する代りに、前凝固（
（Ｐｒｅｃ！ｏｔｔｅｄ　）　Ｈ植片の半融合の播場の
概念が発生した。移、触片に自家内皮細胞ビ播種すると
、実験動物の移植片の内皮被覆率が高することが最近判
明した。−ＩＪソングおよびグラハム等（同上）暑参照
せよ。ひとたび内皮でおおわれた。イヌにおける移植物
は、血小板反応によって測定した場合、血栓形成性がよ
り小さくなり、血液中にある細菌の牧草による感染に、
より大きな抵抗性７示し、直径の小さい血管移植物の開
放性Ｚ持続さゼることが判明した。

シャレフキン（５ｈａｒｅｆｋｉｎ　）等の　イヌにお
けるダクロン人造動脈の内皮播種による血小板生存性の
早期正常化（Ｅａｒｌｙ　Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ
　ｏｆ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　５ｕｒｖｉｖａＩ　ｂｙ　
Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｓｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｄａ
ｃｒｏｎ　Ａｒｔｅｒｉａｌ　Ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ　
ｉｎ　Ｄｏｇｓ　　、サージエリ−９２巻３８５−９３
ページ（１９８２）；スタンレー（５ｔａｎｌｅｙ　）
等の一内皮細胞ビ植えつけた。

小直径の外部から支持されたダクロン腸骨−大腸骨秘植
片の開放性の増大（Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｐａｔｅｎｃｙ
　ｏｆＳｍａｌｌ　Ｄｉａｍｅｔｅｒ　Ｅｘｔｅｒｎａ
ｌｌｙ　５ｕｐｐｏｒｔｅｄ　ＤａｃｒｏｎＩ　ＩｉＯ
ｆｅｍｏｒａｌ　Ｇａｆｔ５５ｅｅｄｅｄ　ｗｉ　ｔｈ
　ＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌｓ）　　、　　サー
ジＸ　Ｉ＋　−９２巻；９９４−１００５ページ（１９
８２）；およびワトキンス（Ｗａｔｋｉｎｓ　）等の　
成ヒト伏在静脈内皮細胞二人造血管への内皮播種に使用
する場合のそれらの増殖能力の評価（Ａｄｕｌｔ　Ｈｕ
ｍａｎ　５ａｐｈｅｎｏｕｓ　Ｖｅｉｎ　Ｅｎｄ。

ｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌｓ　Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　
ｏｆ　Ｔｈｅｎ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　Ｃａｐａ
ｃｉｔｙ’ｆｏｒ　Ｕｓｅ　ｉｎ　ｇｎｄｏｔｈｅｌｉ
ａｌ　８ｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｐｒ
ｏｓｔｈｅｓｅｓ　）　ｓ−Ｊ　、　Ｓｕｒｇ、Ｒｅｓ
。

３６巻５８８−９６ページ（１９８４）’Ｙ参照。

ヒト移植片に細胞２移す時の主要な問題点は。

ヒト血管Ｍｉ織？用いて移植片乞内皮で被覆できるほど
高苫度に播種するに十分な内皮細胞が生産できろかとう
かである。ワトキンス等は、冠動脈バイパス手術後のヒ
ト伏在静脈残遺物？用いて少量の内皮細胞ど培養して生
産することに成功し、４〜６週後培養基の融合細胞領域
に１００倍増殖したと報告した。ワトキンス等（同上）
参照。

活発な倍量技術によって、使用できる細胞数ビ著しくふ
やすことはできるとはいえ一４０！たは５０回も細胞ビ
倍加さゼた後の内皮細胞の“健康”に関する懸念が１だ
残る。さらてこのような細胞の自然の環境とは別物（異
種）である培養基でこれらを培養することは、遺伝的変
化および／フたは患者がヴイルス、トキシンまたはその
他の侵害物質により汚染されることについての心配のｌ
である。

多くの内皮形放法が文献に示唆されている。この領域の
研究は、内皮そのものの多様性によって。

並びに内皮の振舞および特性に関して見つかった１１間
の相異によって複雑である。フィッシュマン（Ｆｉｓｈ
ｍａｎ　）の　内皮：多様の能カン有する分布器官（Ｅ
ｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ　：　ＡＤｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ
　Ｏｒｇａｎ　ｏｆＤｉｖｅｒｓｅ　Ｃａｐａｂｉｌｉ
ｔｉｅｓ　）”、アナシス・オフ・ニューヨーク・アカ
デミ−・オフ・サイエンシス１−８ページ（１９８２）
；ソーブエイジ（Ｓａｕｖａｇｅ）等の“多孔性人造動
脈一種間治療（Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ　Ｈｅａｌｉ
ｎｇ　ｏｆ　Ｐｏｒｏｕｓ　Ａｒｔｅｒｉａｌ　Ｐｒｏ
ｓｔｈｅｓｅｓ”、Ａｒｃｈ　Ｓｕｒｇ　Ｉ　Ｏ９巻６
９８−７０５ページ（１９７４）；およびバーガーの“
ヒトにおける人造動脈治療　（同上）。それでもなお文
献にｒｆｉ種々の種において種々の移植片に内皮細胞を
播種することを含む実験の報告が多数あり、結果はいろ
いろである。ヘス等（Ｆ　、Ｈｅ５ｓ　ｅｔａｌ　）の
１ラツトの腹部大動脈に移植した繊維性ポリウレタン微
小血管人工物の内皮形成プロセス（Ｔｈｅ　Ｅｎｄｏｔ
ｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｌｓｓ　ｏｆ　
ａ　　Ｆｉｂｒｏｕｓ　ＰｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅＭｉ
ｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ　Ａｆ
ｔｅｒ　ｒｒｎｐｌａｎｔａｔｉｏｎｉｎ　　ｔｈｅ　
Ａｂｄｏｍｉｎａｌ　Ａｏｒｔａ　ｏｆ　　ｔｈｅ　Ｒ
ａｔ）　　、ジャーナル・オフ゛・カルジオヴアスキュ
ラー・サージエリ−１２４巻、扁５　５１６＝５２４ペ
ージ（１９８３年９−１０月ン；ニコラス（Ｗ、に、Ｎ
１ｃｈ。

Ｉａｓ　）等の　細胞外基質（ｍａｔｒｉｘ）で前被覆
ゼるバイオマンに対する血管内皮細胞の粘着性の増大（
Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｖａ
ｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌｓ　
ｔｏ　Ｂｉｏｍｅｒ　Ｐｒｅｃｏａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　
ＥｘｔｒａｃｅｌＩｕｌａｒ　Ｍａｔｒｉｘ　）ミ　Ｔ
ｒａｎｓ　Ａｍ　Ｓｏｃ　Ａｒｔｉｆ　　Ｉｎｔｅｒｎ
　Ｏｒｇａｎｓ　、　　２８巻２０８−２１２ページ（
１９８１）；イブニス（Ｃ，Ｌ、Ｉｎｅｓ　）等の“定
常流に反応する内皮細胞配列力学における細胞起源およ
び基質の重要性（Ｔｈｅ　Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ　ｏｆ
　ＣｅｌｌＯｒｉｇｉｎ　ａｎｄ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ
　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｅｎｄｏｔ
ｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　
Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　ｔｏ　５ｔｅａｄｙ　Ｆ　ｌｏｗ　
）”、　Ｔｒａｎｓ　、Ａｍ、　Ｓｏｃ　、Ａｒｔｉｆ
　ＩｎｔｅｎＯｒｇａｎｓ、　２９巻２６９−２７４ペ
ージ（１９８３）；グラハム（Ｌ　、　Ｍ　、　Ｇｒａ
ｈａｍ　）等の°酵素的て誘導し、培養したイヌ内皮細
胞ビ播種した拡張ボ１１テトラフルオロエチレン人造血
管（ＥｘｐａｎｄｅｄＰｏｌｙ　ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒ
ｏｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｓｔｈ
ｅｓｅｓ　５ｅｅｄｅｄ　ｗｉｔｈ　ｅｎｚｙｍａｔｉ
ｃａｌｌｙ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　ａｎｄＣｕｌｔｕｒｅｄ
　Ｃａｎ１ｎｅ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌｓ
　）　’、　　サージエリ−９）巻ｔＫ　５　５５０　
５５９　（１９８２）；ニスキン（Ｓ　、　Ｇ、Ｅｓｋ
ｉｎ　）等、”　ｉｎ　Ｖｉｔｒ□で流動条件下におけ
るシラスチックおよびダクロンベロアに培養した内皮細
胞の振舞：細胞で内張りした血管移植片（Ｂｅｈａｖｉ
ｏｒ　ｏｆ　ＥｎｄｏｔｈｅＪｉａｌＣｅ１ｌｓ　　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅｄ　　ｏｎ　　８ｉ１ａｓｔｉｃ　　ａｎ
ｄ　　Ｄａｃｒｏｎ　Ｖｅｔ。

ｕｒ　　ｕｎｄｅｒ　Ｆｌｏｗ　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
　　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ：　Ｉｍｐｌｉｃａｔｗｕｓ　　
ｆｏｒ　Ｐｒｅｌｉｎｉｎｇ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｇａ
ｆｆ５　ｗｉｔｈ　Ｃｅ１ｌｓ）”、了−テイフイシャ
ルオルガンズ、７（１７巻。

３１−３７ページ（１９８２）：ベルデン（Ｔ。

Ａ　、　Ｂｅ　Ｉｄｅｎ　）等の１直径の小さい血管移
植片の内皮細胞播種（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１
ｌ’Ｓｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｓｍａｌｌ−Ｄｉａｍｅｔ
ｅｒＶａｓｃｕｌａｒＣｒｒａｆｔｓ）　　　、　　Ｔ
ｒａｎｓ。

Ａｍ　、　Ｓｏｃ　、Ａｒｔｉｆ　、　Ｉｎｔｅｒｎ　
、　Ｏｒｇａｎｓ　、２８巻１７３−１７７ページ（１
９８２）：バーケル（Ｗ。

Ｅ、Ｂｕｒｋｅｌ　）等の　酵素的に誘導ゼる自家イヌ
内皮？播種したニットのダクロンペロ了血ｖｓ植片の運
命（Ｆａｔｅ　ｏｆ　Ｋｎｉｔｔｅｄ　Ｄａｃｒｏｎ　
Ｖｅｌｏｕｒ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｇｒａｆｔｓ　５ｅ
ｅｄｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ　Ｄ
ｅｒｉｖｅｄ　Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　Ｃａｎ１ｎｅ　
Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）　　Ｔｒａｎｓ、Ａｍ、Ｓｏ
ｃ、Ａｒｔｉｆ、Ｉｎｔｅｒｎ、Ｏｒｇａｎｓ−２８巻
１７８−１８２ページ（１９８２）　；ワトキンス等。

１成ヒト伏在静脈内皮細胞；人造血管への内皮播種に用
いる場合のそれらの゛増殖能力の評価（前出−訳者）　
ジャーナル・オフ・サージカル・リサーチ、３６巻、５
８８−５９６ページ（１９８４）；ヘリング（Ｍ　、　
Ｂ　、　Ｈｅｒｒｌｎｇ　）等の１人造動脈への血管内
皮播種（Ｓｅｅｄｉｎｇ　Ａｒｔｅｒｉａｌ　Ｐｒｏｓ
ｔｈｅｓｅｓ　　ｗｉｔｈ　　Ｉａｓｃｕｌａｒ　　Ｅ
ｎｄｏｔｈｅＪｉｕｍ）　　″　Ａｎｎ　　、　５ｕｒ
ｙ、。

１９０巻、扁１，８４−９０ページ（１９７９年７月）
；ウエソロウ（Ａ　、　Ｗｅｓｏｌｏｗ　）の°人造動
脈治療−技術の状態（Ｔｈｅ　Ｈｅａｌｉｎｇ　ｏｆ　
ＡｒｔｅｒｉａｌＰｒａｓｔｈｅｓｅｓ−Ｔｈｅ　５ｔ
ａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｒｔ　）”、　Ｔｈｏｒａｃ
　、　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ　、　Ｓｕｒｇｅｏｎ　、
　３０巻１９６−２０８ページ（１９８２）；イシハラ
（Ｔ　、　ｌ５ｈｉｈａｒａ）等の　利植したブタ生物
人工弁における内皮細胞の発生および意味（０ｃｕｒｒ
ｅｎｃｅ　ａｎｄ　５１ｇｎ１ｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　
Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｐｌ
ａｎｔｅｄ　Ｐｏｒｅｉｎｅ　Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｔ
ｉｃ　Ｖａｌｖｅｓ　）　　、　７メリカン・ジャーナ
ル・オフ゛・カルレオロジー４８巻４４３〜４５４ペー
ジ（１９８１年９月）；バーゲル等の酵素的に誘導ゼる
自家イヌ内皮を播種したニットのダクロンベロア血管移
動片の運命（前出−訳者）　２８巻１７８−１８２ペー
ジ（１９８２）。

共ｔｌｉ［ＦＦ究者スチュ了−トウィリ了ムスとの共著
である多数の論文は、副こう丸脂肪を含む種々の組織源
に由来するその種の細胞を含むラットの微小血管内皮細
胞の分離および機能づけに関するものである。これらの
論文にはＰｒ□ｃ、　Ｎａｔ１％Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ　、　　Ｕ　Ｓ　Ａ、　　７８（４１巻２３９３
−２３９７ページ（１９８１）；ミクログアスキュラー
・リサーチ２１巻、１７５−１８２ページ（１９８１）
；Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　１０
７巻、１７−２０ページ（１９８０）；ミクログアスキ
ュラー、リサーチ、１９巻、１２７−１３０ページ（１
９８０）；ミクロヴアスキュラーリサーチ、１８；１７
５−１８４（１９７９）；了ナルス・オフ・ザ・ニュー
ヨークアカデミ−・オブ・サイエンシス、４５７−４６
７ページ（１９８３）；ミクロク了スキュラー１１サー
チ、２８巻３１１−３２１ページ（１９８４）；ジャー
ナル・オフ・セルラー・フイジオロジー、１２０巻、１
５７−１６２（１９８４）；およびジャーナル・オフ・
二ニーロケミスドリー、３５　（２１巻、３７４−３８
１ページ（２９８０）がある。微小血管研究のための螢
光−蛋白質−結合体の製造および使用に関するミクロヴ
了スキュラー、リサーチ２７巻、１４−２７ページ（１
９８４）も参照せよ。

ケルン（Ｋｅｒｎ）等はヒト微小血管内皮細胞の分離に
ついて報告し、それらを培養し、機能的研究に用いるこ
とを記した。ケルン等、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、１ｎｖｅｓｔ、
７１巻１８２２−１８２９ページ（１９８３）。

マトリ（Ｍａｄｒｉ）およびウィリアムス（Ｗｉｌｌｉ
ａｍｓ）の　毛細血管内皮細胞の培養二基質成分による
表現型の転形（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌ
ｉａｌ　Ｃｅ１ｌｓＣｕｌｔｕｒｅｓ　　：　　Ｐｂｅ
ｎｏｔｙｐｉｃ　　Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　　ｂｙ　　
ＭａｔｒｉｘＣｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　）　　、ジャーナ
ル・オフ・セルバイオロジー、９７巻、１５３−１６５
ページ（１９８３）は、ラット副こう丸脂肪からの毛細
管内皮細胞の分離およびウシ大動脈内皮細胞およびＩ／
Ｉｌｌ型およびＩＶ／Ｖ型コラーゲンを含む介在性また
は基礎膜コラーゲンから成る基質とによって条件づけら
れた培地に培養することを開示する。この論文は、間質
性コラーゲンで細胞を増殖さぼる時、それは増殖して連
続ゼる細晧層を形成し、長肋間培養する場合は時々チュ
ーブ様構造を杉皮すること乞教示する。そｉ、は更に、
これら細胞が基礎膜コラーゲンで増殖する場合には、増
殖しないで凝集し、培養の初期にチューブ様構造ン形成
することを開示した。

ライ１１了ム等の１成ヒト内皮細胞の１人工移植片材料
との適合性（Ａｄｕｌｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｅｎｄｏｔｈｅ
ｌｉａｌＣｅｌｌ　Ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｗｉ
ｔｈ　Ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ　ＧｒａｆｔＭａｔｅｒｉ
ａｌ　）　　ジャーナル・オフ゛・サージカル、リサー
チ、３８巻＋　　６１８−６２９ページ（１９８５）も
興味深い。主論文のアブストラクトが１９８４年１０月
３１日〜１１月３日の　アソシエーション・フォア・ア
カデミツク・サージエ１１−の年会で配布された。論文
その−ものは、１９８５年の８月にた１だで催された年
会でのその学会の編集会議に提出された。このウィリア
ムス等の論文は１人工移植片材料を細胞外基質（Ｔ／Ｉ
ＩＩ型コラーゲン）、フィブロネクチンまたけ血漿で被
覆する効果について報じている。最大の密度の粘着性が
認められたのは、コラーゲン被覆ダクロンベロアで、そ
の粘着性は、ゼラチン被覆ｃｕｌｔｕｒｅｐｌａｓｔｉ
ｃ上で増殖したヒト成内皮細胞（ＨＡＥＣ）の融合単層
て認められる細胞密度に等しかった。

ジャンル（Ｊａｒｒｅｌｌ　）等の１培養基におけるヒ
ト成内皮細胞の増殖（Ｈｕｍａｎ　Ａｄｕｌｔ　Ｅｎｄ
ｏｔｈｅｌｉａｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ　）″、レジャール。

オフ・ヴアスキュラー・サージエリ−，１（６１巻−７
５７−７６４ページ（１９８４年１１月）は、本出願に
参照によって挿入さｉ、るクロス−リファレンス出願の
開示と同様の開示を含む。７６２−６６４ページにある
、脂肪中の毛細血管の内皮細胞に関する。共同発明者ジ
ャレルとの議論が注目される。

多数の発表が、フィブロネクチン、血漿またはコラーゲ
ンであらかじめ処理した移植片を用いる播種技術を明ら
かにしている。ニスキン等の”１ｎＶｉｔｒｏで流動条
件下におけるシラスチックおよびダクロンベロアに培養
した内皮細胞の振舞：細胞で内張すした血管移植片（前
出−訳者）”、アーテイフイシ了ルオルガン＋　　７（
１１巻、　　３１−３７ページ（１９８３）は、大動脈
の流景および圧力条件を刺激するように設計したｉｎ　
ｖｉｔｒｏ循環ループの流れに、組織培養したウシ大動
脈内皮細胞をさらす実装を開示する。ニスキン等は、生
物材料基質て培養された内皮細胞は、血液接触面として
移植した場合非血栓形成性であるが、この技法は臨床的
（ＩＣ使用可能であることは１だ証明されていない、と
説明している。なぜならば二つの手術的処置が必要であ
る（一つは細胞収獲のため、第二のものは細胞４植のた
めで、その間ｖｃ　ｉｎ　ｖｉｔｒ。

細胞増殖の期間がある）からであり、１だ、定常的環境
で培養された細胞は、流れる血液にさらされた時少くと
も一部は除去されるからである。工は、収穫したばかり
の自家内皮細胞を含む血液でｐｒｅｃｌｏｔ　した移植
片は、血液のみでｐｒｅｃｌｏｔ　ｌ、たそれよりも大
きい開放性を示す。これは、細胞を培養する介在期間な
しに細胞収獲と細胞移植を一回の操作で行うことができ
ることを示すと言えよう。これは、この技法を非血栓形
成性表面を生成する手段として臨床的に使用可能にする
ものである。

ワトキンス等の　成ヒト伏在静脈内皮細施：人造血管へ
の内皮播種に用いる場合の、その増殖能力の評価ジャー
ナル・オフ・サージカル・＋Ｊ　ｆ−チ、３６巻５８８
−５９６ページ（１９８４）　　　　’において、静脈
内皮細胞を用いる人造血管の自己内皮播種は、血小板−
人工物の相互作用を減少さぞ、イヌにおける直径の小さ
い人工物の開放性を改善することが報告された。イヌ試
験で得られたデータは、自己内皮播種がヒト患者を救う
ことを示唆している一方、この方法には多くの欠点があ
ることが論ぜられた。それらの欠虚としては、長い末梢
静脈を使用すること。この方法で用いる粗コラゲナーゼ
がロフト毎に差があること。そして、静脈内皮細胞の増
殖能が、末梢静脈のほんの小さいフラクションから得ら
れる内皮細胞で自己内皮播種できるほど十分に大きいと
いう証明がないことである。

行われた試験は、族ヒト伏在静脈内皮細胞の増殖ポテン
シャルは、　直接的に手術中に自己内皮播種するにも、
培養によって移植前に内皮細胞を人造血管表面に増殖さ
せて内張りとするためにも、理論的には十分大きい　こ
とを示唆している。その結果はヒト試験を行う一つの条
件は満足していることが示されるが、著者等は１いくつ
かの理由によって、そのようなヒト試験が成功すること
を証明するには十分な結果ではない”と結論づける。

近年、直径の小さい血管移植片で一般にあ筐つ良くない
結果が得られることが注目されている。

４ｍｍ以下か４ｍｍの内径をもつことによって一般に特
徴づけられるような移植片は用いないのが普通である。

グアノ・ヴアクメツ）　（Ｖａｎ　Ｗａｃｈｅｍｅｔ）
等の°培養ヒト内皮細胞と、種々の浸潤性をもつ重合面
との相互作用（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃ
ｅ１ｌｓ　ｗｉｔｈ　Ｐａｌｙｍｅｒｉｃ　５ａｒｆａ
ｃｅｓ　）　　ビオブチ１１了ルス、６巻、４０３−４
０８（１９８５年１１月）は、比較的内径の大きい（４
ｍｍ以上）合成ポリマー移植片が、形成された生物学的
内張りが−ほとんど非血橙形取性でない　にもかかわら
ず、成功に至った、と報告した。そのような直径の大き
い移植片はモレを防ぐためにあらかじめ血液でｐｒｅｃ
ｌｏｔ　ｌ、、かなり血栓成形性の面を残しているにも
かかわらず、大きい血流速度（血流量）および抗凝固処
理により、移植片表面のそれ以上の血栓生成による閉鎖
が阻止されることが示唆さ九る。直径の小さい移植片を
用いた場合の臨床的結果は、主として　移植片の即時的
閉鎖”のために、悲観的であると言われている。イヌで
は、直径の大きいおよび小さい移植片両方共、その上に
内皮細胞を植えつけると、１〜４ケ月間に完全な内皮内
張りを形成することがわかった。血管内皮は特異な非血
栓形成性面であると言われているから、内皮細胞は、“
直径の小さい血管移植片の内張りのたぬの第一の論理的
選歌である　と報告されている。内皮細胞と、異なる表
面特性をもったポリマーとの相互作用の系統的研究を行
えば、　内皮細胞の過大増殖をおこす移植片の開発”に
至るという仮説がある。これに関して、ヴ了ンヴアケム
等は、成る材料の表面湿潤性は種々の型の哺乳類細胞の
粘着性および増殖に影響を与えると言われ、細胞粘着は
水に濡れろ表面に優先的におこると考えた。血清が培養
培地にある時には、湿潤可能の基質への細胞粘着は、血
清蛋白質のその基質への吸着によって影響を受けること
が示唆されろ。血清を含１ない培地において細胞粘着を
研究する場合には、その細胞に由来する蛋白質の湿潤可
能の基質への吸着が重要であるかも知れない。

ヴ了ンヴ７ケム等は、内皮細胞はガラス上およびグロー
放１処理をしたボ１１スチレンである湿潤可能の組織倍
量ポリスチレン上で培養できることを認ぬた。こうして
ヴアケム等は、血清を含む培養培地で、種々の湿潤性を
有する多数のポリマー上でのヒト内皮細胞の粘着性およ
び増殖性を試論し、それを報告し、示唆した。

既述の論文の他に、ヘス等の　ラットの腹部大動脈に移
植した繊維性ポリウレタン微小血管人工物の内皮形成プ
ロセス”ジャーナル・オフ・カルジオヴアスキュラー・
サージエリ−２４（５１巻５１６−５２４ページ（１９
８３）を参照せよ。これは、線維性微小血管ポ１１ウレ
タン人工物を用いて２１日目て完全に内皮を形成した人
工物が生成したことを報告している。

次の発表は、内皮細胞培養技術に関する開示が特に興味
深い。アジズカン（Ａｚｉｚｋｈａｎ　）等の発表では
、ｉｎ　ｖｉｔｒｏウシ毛細血管内皮細肥およびマヌト
細胞から放出される因子に対するそれらの細胞の接動反
応に関する開示が興味深い。ロブ１１ン（Ｒｏｂｌｉｎ
）等およびヤング（Ｙａｎｇ）等の発表では成る哺乳類
培養細胞の増殖に影響を与える因子の開示が興味深い。

ツートン（Ｔｈｏｒｔｏｎ　）等では、ヒ）！静脈内皮
細胞の培養を含むヒト内皮、細胞学殖に与えるーバリン
の影響の開示が興味深い。ツートン等は彼等が述べた連
続二次培養の方法が、これ１でに発表された方法に比べ
てＨｕｖＥａ胞の収量を１０８倍も高め、放血管内皮細
胞の収１を１２倍も高めることを教示する。これは大量
の培養内皮細胞を生産するために最小量のヒト血管組織
の使用ですみ、これにより内皮に関係するヒトの疾患の
問題に、ヒト内皮細胞モデルを用いて直接アプローチで
きるようになるのである。その上、その細胞系は、血管
作用性穿削のｉｌ　ｖｉｔｒｏ試験とか、人工移植片材
料の被覆とかのような種々の臨床応用のために価値があ
ることが判ったと記さレテイる。ラテラ（Ｌａｔｅｒａ
　）等の発表では、線維芽細胞の原質粘着におけるフイ
ブロネクチンヒアルロネートおよび−パフ１ンブロテオ
グリカンの機能の開示が興味深い。マシアグ（Ｍａｃｉ
ａｇ）等（１９７９）では、中性のＰＨで調整されたウ
シ視床下部エキスから得たヒト内皮細胞ｍｉｔｏｇｅｎ
　（細胞分裂誘起物賞）の記載が興味深い。神経由来の
内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ　）は静止したヒト膝静脈
内皮記胞を培養基において刺激し増殖させる能力をもつ
といわれる。ウシ胎仔血清中にヒト謄静脈（ＨＵ　Ｖ　
）内皮細胞を小さい播種−密度で培養したものにＥＣＧ
Ｆを加えると、血清のみの場合に比べて内皮細胞増殖は
著しく増加するといわれる。マシアグ（Ｍａｃｉａｇ）
等（１９８１）は、ウシ胎仔血清および内皮細胞増殖因
子を強化した培地１９９を用い、フイプａネクチン基質
でヒ）ｌＩｉＷ静脈内皮細胞を増殖さゼたと報告した。

こうして、クロス・リファレンス関連出願における発表
および開示は、ヒト内皮細胞、特にヒト膀静脈内皮細胞
（ＨＵＥＣ）のような太い血管の内皮細ヴを培養するこ
とに関する技術の現状を示している。

この領域＋報告された研究にもかかわらず、ヒト移植物
表面、例えば血管移植片の表面の内皮形成を成功さゼ得
る簡単な信頼できる方法の必要性がい１だに叫ばれてい
る。

本発明の主な目的は、血管移植片およびその他の移植物
体の内皮細胞による被覆を改善することにある。

本発明のその他の目的は、微小血管内皮細胞で内皮化さ
れる。改良された合成でたけ自然の移植物または移植片
、特に、改良された血管移植片を提供することである。

〔問題点を解決するだめの手段及び作用〕本発明に関係
するヒト患者に移植する目的の移植物体を処理する方法
においては、合成基質材料を用意し、その材料をＩＶ／
Ｖ型コラーゲンで処理してヒト内皮細胞の粘着、増殖お
よび形態を改善する段階を含んでいろ。好ましい実施態
様において、このような内皮細胞は、その患者のヒト微
小血管内皮細胞；τ富む組織から採取され、それはその
組織から分離され、その移植物のＩＶ／■型コラーゲン
面に適用され、処理すべき上記移植物表面に少くとも５
０％以上の上記細胞の融合面を作る。本発明によれば、
移植の少し前に高密度で植えつけた時に、その患者の微
小血管内皮、細胞の粘着および増殖を促進するように十
分適合するであろう。ＩＶ／Ｖ型コラー′ゲン表面層を
備えた移植物体を提供することができる。

好ましい移植物体は合成基質と１　／１１１型コラーゲ
ンの１枚以上の直接層とＩＶ／Ｖコラーゲン表面層とを
含んで成る。したがって、移植される移植片は少くとも
ＩＶ／Ｖ型コラーゲン最上面と、１／Ｉ　１１コラ一ゲ
ン下層とから成るラミネートで被覆された基質を含んで
成る。このコラーゲンラミネートはヒト羊膜に由来する
非細胞性ラミネートであることが好ましい。好ましい移
植物体は次のようにして作られる。ポリマー（ダクロン
）基質のような合成基質をグロー放電血漿クリーナーヲ
用イテ処理し、コラーゲン被覆のための移植片表面をつ
くる。なお、本案ではポリエステル元素の台底繊維（テ
トロン）をダクロンと呼ぶことにする。この装置によっ
て生成したグロー放１血棗は、移植片表面のエツチング
をおこし、コラーゲンおよび移植片間をより強く結合さ
せる。それからこの移植片の表面を、ウシ、または好ま
しくはヒト、原料から調製したエラーゲンエおよび／−
！たは■混合物でマドＵ　（Ｍａｄｒｉ　）の”細胞外
基質の免疫化学（Ｔｈｅ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　ｏｆ　Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｍａｔｒｉ
ｘ　）”、ポサラトン、フロリダ、ＣＲＣプレス、（１
９８２）１巻、７５−９０ページに報告されているよう
な一般的方法を用いて処理する。生成したコラーゲンを
、その酢酸溶解性：てよって混入蛋白質から分離し、高
塩化す）　ＩＪウム濃度における分別溶解性によってそ
の他の基質蛋白質から分離する。それから移植片基質を
、前述の１だ酢酸に溶けているコラーゲン溶液で処理し
、中性緩衝液を加えて溶液のＰＨを上げることによって
、コラーゲンを移植片表面および移植片内で重合させる
。３７℃でコラーゲンはゲル化する。

それをその後グルタールアルデヒドで架橋する。

この処理はゲルを安定化さぞ、その上アルデヒドにより
活性化された表面を作り出す。

移植片はその時、ヒト羊膜に由来するコラーゲンラミネ
ートを受は取るばかりになっている。この羊膜はりオツ
タ（Ｌｉｏｔｔａ　）等の方法〔カンサーレタース、１
１巻１４１−１５２ページ（１９８０）〕にしたがって
用意されたヒト胎盤から得られる。羊膜を繊毛膜から物
理的に引っばってとり、化学的（Ｃ処理する。羊膜上皮
細胞を年度表面から物理的にはぎとり、基礎膜コラーゲ
ン（ＪＶ／Ｖ型）を−面に、間質性コラーゲン（］／Ｉ
ＩＩ型）を他ｆに残す。羊膜は、前述のように処理した
移植片材料に適用する前に、燐酸緩衝食塩液に浸す。

生成したコラーゲンラミネートを、コラーゲン１／■を
移植片の方へ向けて、移植片材料のフルデヒド活性化表
面上に置く。羊膜層表面は相互作用をおこして共有結合
する。残っている遊＠アルデヒド基は、その後移植片を
アミン、アミノ酸でたけ、アルデヒド活性アミノ基を含
むペプチドで処理することにより不活性化される。１）
ジンは、燐酸緩衝食塩液に溶解するため、現在のところ
好フしい。今は羊膜の基底膜表面は移植片から離れた方
を向いている。そして続いてヒト微小血管内皮細胞で処
理して単層を形成することができる。生成した移植片を
照射またはその他の適した方法によって殺菌し、使用の
ために必要になる１で貯蔵する。工ＶＺＶ型コラーゲン
表面ば内皮細胞の高密度播種を受は入れる用意ができて
いる。このような播種は速かに（２時間以内）剪断抵抗
性内皮細胞単層の形成に導く。この単層は自然界に出現
する丸石（ｃｏｂｂｅｓｔｏｎｅ）の形態を有する。

この方法にしたがって作った移植片を、イヌの大静脈に
置換するためにイヌに挿入する。普通の条件下では未処
理の移植片は常に急速に凝血をおこし、しばしば閉塞す
る。このようなイヌのかなりのパーセント、多分大部分
はこのような移植片のために移植後２０分以内に死ぬこ
ともよくある。

試験動物にお１ハては、ここに記載の方法にしたがって
形成された大静脈を２日後にとり出したところ、それは
不定の開放性と矛盾する徴候は何も示さなかった。

出願人は太い血管の内皮細胞と微小血管内皮細胞との間
には、それら本来の組織においては形態学的並びに機能
的相異があるとはいえ、ヒト徽小血管内皮細胞、すなわ
ち毛細血管、細静脈に由来する細胞は太い血管の細胞の
代りとしても十分良く機能することを認めた。その上、
微小血管内皮細胞は体組織に豊富にあり、脂肪組織に最
も顕著に認められる。そしてそれを用いて、大部分の移
植物の予後を劇的に改善するほどの移植前融合（すなわ
ち最低５０％の融合）を確立することができるかも知れ
ない。その後の説明の目的のためには、脂肪組織を微小
血管内皮細胞の典型的原料とするが、他の組織原料から
の内皮細胞も同様に使えることは当然である。

血管移植片またはその他の移植物を、連続的外科処置の
始めに得られる脂肪から分離した微小血管内皮細胞を用
いて融合するように処理する。無菌条件を確立してから
脂肪組織を患者からとる。

その脂肪の微小血管内皮細胞を、酵素的消化と遠心分離
によって組織から速かに分薄し、それを用いて同じ手術
の後の方の段階で、その患者に移植することになってい
る表面を処理する。この方法では、底内皮細胞を培養し
て数をふやす必要がなくなり、患者は自分自身の新鮮な
　健康な　内皮細胞でそれが融合に至る１で、またけ過
度に融合する１で処理した移植片を受けることができろ
。

本発明の好ましい実施態様によると、得られた微小血管
に富む組織は腎周囲脂肪、皮下脂肪、網、または胸腔ま
たは腹腔と関連ある脂肪である。この組織は、カゼイン
分解酵素およびトリプシンから成るコラゲナーゼのよう
な蛋白分解酵素を用いて消化される。すなわちこの酵素
を、組織塊がばらばらになって組織消化液が生ずる１で
、組織と共にインキュベートする。それから低速度遠心
分離によって微小血管内皮細胞を消化液から分離し内皮
細胞に富むベレットを形成する。ベレットを緩衝食塩溶
液で洗う。連続勾配遠心分離プロセスによって、またけ
選択的篩の使用によって更に精製することもできる。生
成した微小血管内皮細胞を好１しくはその後、血Ｖ蛋白
質を、好フしくば１％血漿蛋白質の濃度で含む緩衝食塩
溶液に懸濁させる。それから、ベレット対溶液の比が容
量ペースでｌ：５〜１：１５’Ｅたはより好１しくは約
１：１０であるこの懸濁液を用いて表面を処理する。そ
の場合、微小血管内皮、！［１胞がその表面に十分に粘
着し、少くとも５０％の融合かおこるでで、細胞をその
表面と共にインキュベートする。その結果、融合してい
るか、移植後非常に速く（細胞数の一倍加以内て）融合
に達する内皮化表面をもつ改善された移植片または移植
物が得られる。

内皮細胞か粘着する最初のパーセンテージは、ＩＶ／Ｖ
型表面層表面層る人工物を用いた場合、さほど大きくな
いのが普通であるとはいえ、生成した内皮細胞層の形態
は、その他の人工表面および／でたけ表面前処理を用い
て得られるそれよりも遥かにすぐれている。こうして微
小血管内皮、細胞の使用により、低い粘着率を補ってあ
１つある高い密度の播種が可能になる。

よって、本発明又は好ましい実施測知よれば、血管移植
片およびその他の移植物の内皮細胞ＩＣよる被覆を改善
することができる。また微小血管内皮細胞で内皮化され
る改良された合収テたは自然の移植物または移植片、特
に、改良された血管移植片を提供することができる。

〔実施例〕

本発明に関係する好ましい方法は１種々の型の内皮細胞
の機能および特性を研究する仕事から発している。ここ
に記載せる方法は無菌条件下における（たとえば手術室
）ヒト微小血管化組織（腎周囲脂肪、網、または皮下脂
肪）からの大量の微小血管内皮細胞の分離を可能にする
。大量の細胞の獲得のために、分離に続き組織培養を行
う必要がなくなる。これらの方法は、組織源としてラッ
ト副こう丸を用いて非ヒト（ラット）微小血管内皮細胞
を分離する研究中に開発された方法と関係がある。最近
、非ヒト、ラット脂肪−微小血管内皮細胞を分離する方
法が、皮膚および脂肪からと１・微小血管内皮細胞を分
離、培養するために役立つということが報告された。ケ
ルン（Ｋｅｒｎ）等はこれらの分離した内皮細胞を次い
で培養し、機能的研究に用いた。Ｊ　、Ｃｌ１ｎ　、Ｉ
ｎｖｅｓｔ　、　７１巻、１８２２−１８２９ページ（
１９８３）、ジャンル等の　培養したヒト成内皮細胞の
増殖（ＨｕｍａｎＡｄｕｌｔ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
　Ｃｅ１ｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　）、ジャーナル・オフ・グ
アスキュラー・サージエリ−Ｎ６１巻、７５７−７６４
ページ（１９８４年１１月）、これは参照によってここ
に挿入される。

本発明は血管内移植物に内皮細胞同張りを作るために、
分離した微小血管内皮細胞を用いる新規な方法を提供す
る。このような移植物としては例えば人工血管、人工心
臓、心臓弁のような、血管関係の考案物があるが、これ
らに限定されるわけではない。ここに説明する方法がそ
の他の人工器官または考案物の開発に通ずることが期待
されろ。

これらの器官および考案物は移植後かまたけ体外回路に
おいて循環血液を受けとる。そして本性は、血液と移植
面との間に非血栓杉皮注の、または抗トｏンボゲン性の
界面を提供する。本発明の直接の目的は、ここに記載の
方法を用いて既知の合皮材料例えばポリエステルおよび
ポリテトラフルオロエチレン″４！たけ天然に発生する
材料、例えば）静脈、伏在静脈および本来のウシ動脈か
ら成る面に内皮を形成することである。

本発明は、ヒト患者に接種することを目的とした移植物
を処理する方法であって、その患者からヒト微小血管に
富む組織を得ることと、その組織から微小血管内皮細胞
を分離することと、上記微小血管内皮細胞を上記移植物
上に置いて、処理すべき上記移植物表面だ最低約５０％
の上記細胞の融合を形５３ｉ：せしめることとから成る
方法を提供する。この方法は迅速かつ比較的簡単で、患
者自身の　新鮮な　（培養しない）内皮細胞で処理した
人工物または面の移植を容易にする。外科的処置がそっ
くり単一の無菌環境で行われるから内皮化窩植片が汚染
される可能性は最小である。

本発明の方法により、組織培養を行うことなく多量の内
皮細胞を分離することができる。しかも含ブれる処置は
手術室で容易に行うことができる。

患者の組織から微小血管内皮細胞を分離する方法の一般
的流れ（２）を第１図に示す。これらの処理法は脂肪以
外の組織、例えば脳、肺、網膜、副腎、肝臓および筋肉
から内皮細胞を分離するたぬにも用いられるが、細胞源
として脂肪組織を用いるのが好フしい。それは豊富にあ
り、手に入れ易く、その切除が治療を受ける患者に不都
合な作用をおこさないからである。そこで、第１図に示
すように、成る景のヒト微小血管化脂肪（４）を多数の
原料の中から調達する。あフリ好１しくはないが、脳死
の心臓は生きている死体提供者、または患者以外の他の
提供者から（この場合は提供者の手術中に）ヒト腎周囲
脂肪を得ろことも可能である。いかなる場合も提供組織
をすぐに水冷緩衝食塩液（ＰＨ７，４’）に移す。この
場合緩衝剤は燐酸塩、丁なわち燐酸緩衝食塩液（ＰＢＳ
）であるのが好でしい。よく切れるはさみで組織を細切
しく段階Ｂ）緩衝液を傾淳する。カゼイン分解酵素とト
リプシンとを含む蛋白質分解酵素コラゲナーゼをその組
織に加え、組織塊がばらばらになる壕で３７℃でインキ
ュベートする。この消化は３０分以内におこり、一般に
は２０分以内にするべきである。

消化液を滅菌試験管に移しテーブルトップ遠心分離器を
用いて低速度（７００×ｇ）で室温で５分間遠沈する（
段階Ｃ）。こうして生成したペレットは内皮細胞９５％
以上から取る。これらの内皮細胞は、細動脈、毛細血管
および細静脈、微小血管系のすべての成分に由来するか
ら、これらの内皮細胞をここでは微小血管内皮細胞（Ｍ
　ＥＣ）と呼ぶことにする。このＭＥＣペレ゛ノドを緩
衝食塩液、好１しくはＰＢＳと共に遠沈することにより
一回洗浄し、それ以上精製することなく直接ここに記載
の処理（適用）段階に用いることができる。

別法として、これらの微小血管内皮細胞をその細胞を連
続的勾配で遠沈することにより、さらて精製することが
できる（第１図段階Ｄ）。この勾配は多数の高分子溶質
から形成される。これら溶質としては、了ルプミン、デ
キストラン、またはパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ　）　
（ファルマシア社、ビス力タウエイ、Ｎ、Ｊ、）’！た
けナイコデンツ（Ｎｙｃｏｄｅｎｚ　）　（ナイエガー
ルド社、ノールウェー）のような市販の密度勾配材料が
ある。勾配遠心沈澱は、赤血球、白血球および平滑筋細
胞を除去するために用いられる。ここに報告した研究に
おいては、パーコール４５％溶液を常用した。細胞をパ
ーコール溶液の表面に層状に置き、１３０００Ｘｇで２
０分間遠沈した。または、形成されたパーコール勾配上
に細胞を置き、室温で５分間４００×ｇで遠沈した。内
皮細胞の厚いバンドが勾配の上端に生成する。これらの
細胞をピペットでとり、燐酸緩衝食塩液と共に遠沈する
ことにより一回洗った。

ヒト微小血管組織に由来する微小血管内皮細胞を、人工
血管表面に適用するためにさらに治療したりすることな
く、直接本発明の播種段階に用いた。この方法の主な利
点は、血管移植片の被覆のために、多量の内皮細胞をヒ
ト組織から調達することができることである。その上、
これら細胞を人工物移植を受ける提供者から得ることが
できる。

したがってこの方法では、移植可能の表面を同ｆｌ内皮
細胎で処理することができる。

本発明のもう一つの方法によると、Ｍ　ＢＣを受けとる
べき人工表面を、何ら前処理なしに、製造業者がそれら
を包装する条件下において直接用いることができる。し
かし、水性溶液でこれらの表面をあらかじめぬらしてお
く方が都合がよい。前処理は、内皮細胞の表面への粘着
、拡大および増殖を促進するために行われる。本発明の
もう一つの実施悪様の処理段階の実施にあたっては、分
離したヒト微小血管内皮細胞を、その患者からの血漿由
来蛋白質を含む緩衝食塩液に懸濁させろ。この蛋白質溶
液は６部分の緩衝溶液と１部分の血漿を混合し、約１％
の蛋白質を含む溶液を作る、というようにして調製され
ろ。１表のデータは、内皮付着が懸濁液中の蛋白質濃度
により影響されることを示している。１表のデータが示
すように、至適蛋白質濃度は約１％である。そして表面
処理中に蛋白質が必要であることを示す。アルブミンが
好ましい蛋白質源であるが、非血柴性蛋白質源を用いる
こともできる。

第１表二種々のアルブミン濃度がＨＡＥＣの最初の粘着
および増殖に与える影響。

融合パーセント アルブミン濃度　２時間　　　　２４時間０％　　　３
６．５％　　　６３．６％※ ０．１％　　　３２．５％　　　６１．２％※ １．０％　　　４７．７％　　　６７．９％※ ４．５％　　　１１．５％　　　６１．７％融合パーセ
ントは＃ＥＣ／１０　ａｌ胞／ｃｍ　　で示す。

※は有意な変化を示す。

その後微小血管内皮細胞懸濁液を、好１しくは遠沈して
（２００Ｘｇ）ペレットとし、そのペレットを蛋白質含
有緩衝溶液に再懸濁させる。この再懸濁を行う場合、詰
１つた（包み込１れた）微小血管内皮細胞：緩衝溶液の
容量比は約１：５〜１：１５”ｆたは１：１０にするべ
きである。その細胞懸濁液を管状移植片に加えて両端を
締めるか、または細胞を処理すべき表面上に層状に置く
。細胞を相互作用さゼる最適期間は正確には足でってい
ない。それは人工物の材料、その材料が受ける前処理の
性質、および人工物の表面が微小血管内皮細胞をより良
く受けとれろように変形されているかどうかによって変
化する。例えば、未処理ポリエステル移植片表面への内
皮細胞の粘着には２時間必要であるが、蛋白質で処理し
た同様の表面に粘着さぞろには１０分以下でよいことが
わかった。この粘着行動け、平らな未処理のダクロン移
植片上のヒト微小血管内皮細胞（ＭＥＣ）の走査型電子
顕微鏡研究により確かめられた。内皮細胞が移植片表面
に粘着するに十分な時間インキュベーション後、その表
面を蛋白質含有緩衝液で洗う。

そこでその人工物を普通の方法で移植することができる
。

生化学的データと形態学的データの両方に基づいて、ヒ
ト微小血管内皮細胞は未処理の移植片表面に粘着するこ
とがわかっている。走査型電子顕微鏡は、上述の方法を
用いて未処理ダクロンポリエステル士に置かれたヒトＭ
ＢＣは粘着をおこし、その後培養基で１日おいた後細胞
被覆（完全な融合）がおこることを明らかにした。細胞
は移植片の特殊の領域に付着し、未処理絽植片表面を完
全には被覆しない。ヒトＭＢＣを血漿処理−ダクロン−
ポリエステル移植片上に播種する時には、未処理ダクロ
ン表面に播種する時と比べて、被覆は最初は著しく大き
い。走査電子顕微鏡は、血漿−コーティング移植片がヒ
）ＭＢＣで融合被覆されていることを明らかにした。第
２表は、未処理および蛋白質コーティング−ダクロン−
ポリエステル移植片のヒト微小血管内皮細胞の粘着およ
び増殖（最初は１日目、そして１４日後）を説明する。

第　　２　　表 未処理および蛋白質コーティング−タークロン邸植片上
のヒト微小血管内皮細胞の粘着および増殖融合パーセン
ト ダクロン前処理　　ＥＣ−０ＥＣ−２ＥＣ−１０時間（
日）　　　Ｉ　　　１４１　　１４１　　　１４未処理
　　　３７％・・・・３７％４３％・・・・５６％４４
％・・・・３８％コラーゲン ＣＩ／Ｉエエ型）　　　２９・・・・３１５９・・・・
６８　４７−・・・２６血漿　　　５３・・・・５５６
５・・・・１００６３・・・・３５上記の融合パーセン
トは＃　ＥＣ／］ｏ細胞／ａｍ２で示す。

※印は有意な変化を示す。

第２表が示すように、ＭＢＣ粘着は移植片表面の蛋白質
処理によって容易になる。人工物表面の内皮細胞増殖が
蛋白質処理の実施によって促進されることもわかった。

前述の′よう忙、人工物表面上の完全無傷の単層の形成
は、移植の前に形成されたならば最も都合が良いかも知
れない。この内皮化表面は、もし剪断抵抗を有するなら
ば直接的抗−トロンボゲン表面を提供するであろう。そ
こで、微小血管内皮細胞層の剪断抵抗を調べた。ヒト脂
肪をコラゲナーゼで２５分間処理し、洗浄し、パーコー
ル勾配分離で精製した。この収量は１．２５±０．４５
×ＩＯ’細胞／ｇ脂肪であった。血漿コーティング−ダ
クロン上で１時間インキュベーション後、　　２．８±
１．５　＋　１０　が表面にしっかりと粘着して残った
。

２時間、Ｏ〜８０　ｄｙｎｅｓ／　ｃｍ　の剪断応力で
流れにさらした時、最初に粘着していた細胞の５０〜１
００％が粘着した１１残った。このデータの統計的分析
では、粘着細胞数と剪断速度との間に強い相関関係を証
明することはできなかった。走査型電子顕微鏡は、血漿
コーティング−ダクロンに付着した。種々の付着時期−
おける内皮細胞を明らかにする。大部分の細胞はでだ丸
く、焦点的に表面に付着しているだけだが、若干の細胞
は最大に平らになり、細胞−細胞接触を形成していた。

大きい細胞収量としつかりした粘着性のため、微小血管
内皮細胞は、細胞培養の必要性なし釦、外科移植時に融
合内皮細胞を移植片に播種する可能性を与える。

その他の実施例によって、移植後、内皮細胞を植えつけ
た移植片が動脈血流にさらされる時の条件を模するため
に、蛋白質処理表面への内皮細胞の粘着を剪断応力下で
試験した。ヒト成微小血管内皮細胞を、ＩＲＢ議定書（
プロトコール）にしたがって、脳死状態で心臓は動いて
いる死体器官提供者または無関係の手術的措置を受けて
いる患者から採取したヒト腎周囲脂肪または腸網膜脂肪
から分離した。その脂肪を機械的に細切し、ダルベツコ
−陽イオ：ｙ　−ｆｒｅｅ　−（Ｄ　ＣＦ　）緩衝液、
ＰＨ７，４，１０ｍｌ　ヲｗう）ｊナーゼ（ウォーシン
トンエ型；クーパー、バイオメディ了ル、マルグエルン
、ＦＡ　）　４　ｍｇ／ｍ＋　　およびウシ血清アルブ
ミン（シグマＶ型；シグマケミカル社、セントルイス、
ＭＯ）　４　ｍｇ／ｍ＋と共に含む減菌５０ｍ１ねじ蓋
つきエルレンマイヤーフラスコに入れた。そのフラスコ
をしづかに攪拌しながら３７℃で２５分間培養（インキ
ュベート）シた。フラスコの内容物を２００Ｘｇで７分
間遠沈した。ベレットを０．１％ＢＳＡを含むＤＣＦ緩
衝液で２回洗ｖ−，２００Ｘ　ｇで３分間回した。

生成したペレットをＤＣＦ中の４５％バーコル（ファル
マシアファインケミカルス、ビスカタウェイ、Ｎ、Ｊ、
）Ｋ再懸濁し、４℃、２００００Ｘｇで遠沈した。毛細
管内皮細胞の群即ち小血管束（タフト）は、ベレット中
の血管フラグメントおよび細胞破片と共に、密度勾配の
てっぺんの乳白色の層中にあった。毛、１ｉＩ７１管内
皮細胞をＤＣＦ’−ＢＣＡ緩衝液中で、３分間、２００
Ｘｇで２回洗った。

細胞群（タフト）を２０％ウシ胎仔血清（ハゼルタウン
リサーチラボラトリース、デンバー、ＰＡ）と共に培地
１９９に再懸濁させた。−次分離物中の内皮細胞の確認
は、主として位相差面微鏡による形態学的試験に基づい
て行われた。高密度にプレート上に接種され、−次培養
を受けた一次分離物は、第ＶＩＩｒ因子関連抗原が陽性
の染色を示し、アンギオテンシンエ変換酵素（ＡＣＥ）
活性をあられした。

移植片表面を次の方法を用いて処理した。クーレイ・ク
ラフト・ウーブン・ポロシティ−・ダク０７　、７了ブ
リツク（Ｃｏｏｌｅｙ　Ｇｒａｆｔ　Ｗｏｖｅｎ　Ｐｏ
ｒｏｓｉｔｙ　Ｄａｃｒｏｎ　Ｆａｂｒｉｃ　）　（メ
ドツクスメディカル、オーク−５ンド、ＮＪ、から供給
される）をア七トン、８．５％Ｈ３ＰＯ４、ｌＮＮａＯ
Ｈで次々に洗った。

この後で２回、蒸溜水で大がかりに洗った。乾いてから
、それを空気中で１０　トール（ｔｏｒｒ　）において
、ハリク血漿クリーナー（ハリクインダストリー、オツ
シニング、ＮＹ）中に１０分間つけた。移植片材料の２
，５　Ｘ　５　ｃｍ切片を、基質コーティング並びに内
皮細胞播種のためた用意した。

それから、ダクロン移植片材料を多血小板血漿で処理し
た。多血小板血漿は、正常なヒト提供者から採取した、
抗凝固化（ＡＣＤ）したばかりの全血から作った。その
多血小板面！１（ＰＲＰ）を、移植治療の直前に５０　
ｍＭ　ＣａＣｌ２と混ぜた。それからＰＲＰを播種室に
固定した移植片材料上に置いた。ひとたびＰＲＰで処理
すると、移植片表面に３７℃でフィブリンクロアト（ｆ
ｉｂｒｉｎ　　ｃｌｏｔ　）が形成された。過剰のクロ
ッ）（ｃｌｏｔ）を除去し、ＥＣ播種釦先立って移植片
表面を培養培地で洗った。

播種室に固定され、ＰＲＰをコーティングした織物のダ
クロン移植片に、培養培地０．５　ｃｃ中の５Ｘ１０Ｅ
Ｃを、播種凹み（１ｃｍ　面積）て置いて播ａ　Ｌ、３
７°Ｃ培饗基倍量１時間以上培養する。

培養（インキュベーション）後、上澄液を除去し、＃植
片表面を培養培地で軽く洗った。対照Ｈ制御）室には新
鮮な培養培地０．５　ｃｃを充填し、これを循環ループ
試験管の中Ｃで置いた。それから再循環培養培地を用い
て、ＥＣを３７℃で２時間、０〜８０　ｄｙｎｅｓ／ｃ
ｍの剪断応力に１回さらした。流している間に、無視し
得る程度の圧力勾配、ＰＨおよび電解質濃度の変化が認
められた。剪断応力は平行プレート間の運搬運動量の式
を用いて計算された。バード（Ｂｉｒｄ　）等の　運搬
現象（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ　）　
　、ニーｚ−−ヨーク、１９６０゜ジョンウィリー＆サ
ンズ社、１−７０ページ参照。

我々の研究で計算された最大レイノルズ数は６００で、
層流を示唆した。さらに、流量対圧力測定値は、遭遇す
る剪断速度全体７通じて直線関係を示した。流れの終り
に、室を分解して移植片表面を光および走査型電子顕微
鏡によって調べた。

光顕微鏡検鏡は、０．１％ＢＳＡを含むダルベツコの燐
酸緩衝食塩液で洗い、９５％エタノールで１５分間固定
した播種移植片で行った。移植片を蒸溜水で洗い、ギル
のへマドキシリンで染色シた（フィッシャーサイエンテ
ィフィック社、フェアローン、ＮＪ）、蒸溜水で２＠洗
った後、移植片をスコツトの水道水代用液の中に１分間
浸した。

表面を蒸溜水および９５％エタノールで２回洗った。染
色した移植片をニコンのダイアフォト顕微鏡で試験した
。

走査型電子顕微鏡検鏡も行った。播種した表面を１％グ
ルタールアルデヒドで１時間、３％クルタールアルデヒ
ドで２時間固定した。それをタイロードのカコダイレー
ト緩衝液（ＰＨ７，４）ｒ２０分づつ３回洗った。サン
プルを１％０３０４で３０分間後固定し、タイロード緩
衝液で３回洗った。サンプルを臨界虚で乾燥し、金パラ
ジウムのスパッタで被覆した。覆われたサンプルをフィ
リップス走査型電子顕微鏡で検査した。

内皮細胞のインジウム標識化も行った。内皮細細胞を既
述のようにして微小血管から分離した。

１００Ｘｇで３分間遠沈することにより細胞をベレット
にし、ＰＢＳ（ＰＨ７，４）で１回洗った。細胞を標識
化前にＰ　Ｂ　Ｓ　Ｏ，５ｍｌに再懸濁した。細胞濃度
を２．５　Ｘ　１０細Ｐ　／　ｒｎ　Ｉに調節した。２
０マイクロキユリーのインジウム１１１（インジウム１
１１オキシンとして、メジーフィジイックス、エメリー
ヴイル、ＣＡ）を細胞懸濁液に加え、普通に攪拌しなが
ら、３０分１で細胞を標識化した。

洗う直前に、標識化効率を最終的に分析するため釦５μ
Ｉサンプルをとった。標識化細胞を完全組織培養培地を
用いて遠沈により３回洗った。最後にできたペレットを
、最終濃度２．５　Ｘ　１０細胞／ｍ１になるように完
全培養培地に再懸濁した。

放射性標識化ＥＣの粘着量を、次の操作法を用いテ測定
した。ビーム・カプセル（ポリサイエンシズ社、フォル
トワシントン、ＰＡ）に固定したダクロン被覆ＰＲＰ上
にそのＥＣを播種し、特定の時間（ｔ＝１０．２０，３
０，６０．１２０分）インキュベートした。各々の時間
でサンプルを調べた。培養培地を除去し、ＰＢＳをピペ
ットで表面全体に力強くふりかけた。ビームカプセル全
部を分析にかけた。各時点の平均僅を計算し、層大粘着
を時間に対するパーセントとしてプロットした。

フロー（ｆｌｏｗ）・スライド及び対照スライド上のＥ
Ｃのカウント数をＩＢＭ　　ＰＣＡＴおよびフレーム・
グラバ−に支持さし之マイクロ・コン７’　（Ｍ　１ｃ
ｒｏ　−Ｃｏｍｐ　）グレイン・カウンターを用いて計
数した。７０−分析で得られたデータを二重性で評価し
た。第一に、ＥＣ粘着性を、フロー後も〔流した後も〕
粘着した一！１に残っている細胞を対照スライドに比較
したパーセントとしてあられす。各時点は少くとも４観
察をあられし、８観察もあられす場合もある。これを剪
断応力に対してプロットし、この曲線で直線回帰分析を
行って、統計的有意性を検定した。第二には、最初の粘
着の比較をスチューデン）　（５ｔｕｄｅｎｔ　）のｔ
−テストを用−て行った。

ＥＣ粘着性はインジウム１１１標識建よって測定し、時
間に対してプロットした。各データ点は別個のニサンプ
ルの平均をあられ丁。

この試験では、脂肪組織を１３人の提供者から得た。そ
れには腎周囲および網脂肪源が含でれてぃた。ＥＣ分離
の３段階にかがった時間は、コラゲナーゼに２９．９±
３分（平均士平均の標準誤差）、パーコールに２０分洗
浄と細胞計数操作に３０分であった。湿脂肪の１ｇあた
りの平均ＥＣ収量ば】、２５±０．４５　Ｘ　１０細胞
であった。トリバンプルー染色排除によって調べた細胞
生育性は、すべての分離において９５％以上であった。

血漿被覆ダクロン上で１時間培養（インキュベーション
）後、光顕微鏡洸より評価した内皮細胞粘着は２．８±
１．５　Ｘ　１０細胞／ｃｍであった（ｎ＝９）。粘着
性を融合パーセントとして測定した。

これは１時間インキュベーション後の粘着内皮細胞の数
を数え、ｌＯでそれを割ることＫよって出した。それは
細胞の播種密度に熱間・係に融合単層中に存在するＥＣ
最大数である。統計的分析のために１提供者につき４回
粘着測定を行った。第６゛図に見られるように、個々の
提供者の粘着平均値の標準誤差は小さい。それに対して
、平均粘着は提供者＃２の１．１３　Ｘ　１０　ＥＣ７
ｃｍから、提供者＃９の４．］］Ｘｌ０ＥＣ−Ｆでに変
化した。提供者＃８および９は＃１．２．４．５．６．
７に比べて有意に高い初粘着性を示した（ｐ＜ｏ、ｏｏ
ｓ）。

そして＃３はスチューデント（５ｔｕｄｅｎｔ　）　ｔ
テストによると＃１１２．４．５．７とは有意差を示し
た。

微小血管内皮細胞の血漿処理ダクロンへの粘着の短時間
の経過も、この試験で調べた。インジウム１１１で放射
性標識化した微小血管内皮細胞を、血漿処理ダクａン上
にプレートし、１２０分間に亘って細胞粘着を分析した
（第７図参照）。左側のｙ軸は与えられた時点における
ＥＣ粘着数を、２時間インキュベーション後の（最大粘
着）ＥＣ粘着数で割ったものをパーセントであられして
いる。右側のｙ軸は与えられた時点におけるＥＣ粘着数
を最初に播種したＥＣ数（１０’　Ｅ　Ｃ／　ｃｍ２）
で割り、融合パーセントとしてあられした。粘着の二相
性が認めら九次；最初の６０分間の速い粘着速度の次に
、それから最後の１２０分１での比較的遅い速度が続く
。評価した最も早い時点、１０分の時点において、限ら
れているとはいえ著しい粘着が認められた。

フローを行った血漿ｗｌ覆ダクロンへの粘着をさらに調
へた。１時間インキュベーション後、ＥＣ播種表面をフ
ロー室に置き、一定の剪断条件にさらした。各−人の提
供者からのＥＣは唯一の剪断速度にさらした。第８図は
ダクロンへのＥＣ粘着に与える剪断応力の影響を示す。

データはダクロン移植片への粘着パーセントとしてあら
れされる。

これは２時間の実験後に表面に粘着したＥＣ数を数え、
それをインキュベーション前釦表面に粘着したＥＣ数で
割り、パーセントであられしたものである。１３人の提
供者からのＥＣを用いた。各々の剪断応力につき、−人
の提供者で４回観察を行った。２人の提供者からのＥＣ
を与えられた剪断応力（例えば２０．３０または５０　
ｄｙｎｅｓ／ｃｍ”）で個々に試験した時、細胞粘着性
の有意差は認められなかつ比。直線回帰分析は、ｙ軸を
横切る所が９）で、勾配−〇、３３、ｒ値−０，２６を
明らかにした。この統計分析は、分離したばかりの微小
血管ＥＣの粘着は８０　ｄｙｎｅｓ／ｃｍ　　までの剪
断応力には影響されない、という結論を支持する。

ＥＣ粘着性の定性的評価を走査型電子顕微鏡で行った。

細胞を１時間、表面に結合させ、その後２時間剪断する
場合、低パワー観察は種々の密度のＥＣｅ有する領域を
明らかにした。ダクロン表面は血漿かたまり（クロット
）によって一様におおわれ、細胞は、製織プロセス中に
できた山（たて糸）および谷（よこ糸）両方を覆う血漿
クロットの領域に粘着しているのが認めらｎた。低パワ
ー観察によると、“より限定された細胞結合をあられす
”と考えらｎた領域を、より高倍率にすると表面との結
合の種々の段階にあるＥＣが明らかにされた。細胞の形
態は、細胞表面領域に劇的な増加を示す平らな細胞から
、限局的に付着して丸いままでいる細胞までいろいろで
あった。それらの細胞はすべて剪断に抵抗した。

こ・つ・シてこの試験は、人工表面上に内皮を作り、先
行技術の人工表面の面枠形成性に起因する問題を避ける
ことができることを裏づける。この試験は更に、あらか
じめＥＣ培養をしないで、移植時に完全に内皮化する人
工移植片を提供する可能性を示す。このやり方は、微小
血管はほとんどすべての組織に高密度で普遍的に存在す
るのに、数の限られた大きい血管のみをＥＣ供与体とし
て使用するという問題を回避する。これらＥＣは脂肪組
織から比較的容易に分離され、太い血管に比べて組織１
ｇあたり多数のＥＣを与える。組織培養ではこれらＥＣ
は、大血管のＥＣの機能的および形態学的特徴の多くを
示す。最も重要なことは、それらが正常の大血管の内皮
の丸石（ｃｏｂｔｊｌｅｓｔｏｎｅ沙外観に全（よ（似
た、接触禁止（コンタクト・４ンヒビツト）融合単層を
形成することができることである。微小血管内皮細胞は
、移植片に速やかに内皮を形成できる細胞に要求される
多くを満足せしめる。その細胞は組織に普遍的に存在す
るところの大変な外科的措置なしにそして患者には最小
のリスクしか与えないで大量に採取できる提供組織であ
る脂肪組織に存在する。そのような細胞は大部分の患者
から６０〜９０分で容易かつ確実に分離さ几、混入平滑
筋細胞のない、そしてＰＲＰで前処理したダクロンまた
はその他の材料、例えば基礎膜に速く、しっかりと粘着
することのできる内皮細胞を多量に生産することができ
る。

それらはその上、融合細胞領域を確立することができ、
たった１時または２時間のインキュベーション後に生理
的剪断応力に抵抗し、かつまた、提供者の自家内皮細胞
である。

既述の試験は、種々のヒト提供者から採取した脂肪が１
．２５　　上帆４５　ｘ　１０’　ＥＣ／　ｇ脂肪を与
えること、そしてこれらＥＣの最初の粘着性がＰＲＰ処
理をした移植片上でさえも適用ＥＣの１０％〜４０％の
範囲であることを示す。患者の年金、疾患または社会的
行動に関して明確な傾向は確認されなかったが、ＥＣの
収量および粘着特性は個人個人で異なるという証拠があ
る。これらの差にも拘らず、これらの粘着変数は、採取
する脂肪量をふやすことＫよって埋め合わせられる。

記載の試験により、新たに分離し、播種したＥＣが生物
学的剪断応力に抵抗することができるというもう一つの
重要な必要条件をも調べた。大部分の試験管内の播種実
験と同様のシステムにおいて、内皮形成表面の、剪断に
対する抵抗性を調べた。これまでの研究で我々は、ＥＣ
がたとえ容易に融合単層を形成しなくても、表面にしつ
かり粘着できることを証明した。こうして、このモデル
は１個１個の細胞の、表面への粘着性を実際に測定し、
多分、流れにさらさｎる細胞の理想的環境よりより小さ
い粘着性を示す。だがＥＣ粘着性は５０％以上にとどま
り、大抵の場合遭遇するすべての剪断力レベルにおける
粘着性よりずっと太きかった。こｎは、ひとたび細胞と
表面との相互作用および付着がおきたならば、ＥＣは非
常にしつかり粘着することを意味する。このモデルには
多くの変数がある。その中には提供者の変数、血漿の変
数およびインキュベーション条件があり、これらはこの
プロセスをより完全に理解し、最適にするために研究さ
れる。

もう一つの重要な特注は、新たに分離さｎ播種さｎたＥ
Ｃが速かに完全な細胞・細胞間相互作用を形成すること
ができることである。これらの相互作用が付加的にＥＣ
を剪断応力から守り、細７抱の表面から剥離の防止を助
けるのは明白である。

細胞・細胞間結合は面食被覆ダクロン（テトロン）上で
は限らｎた程度におこるが、この後に説明する試験では
そのような細胞・細胞間相互作用を促進するより適した
表面が提供される。

上述の実験は、微小血管ＥＣが有する特性のためにＥＣ
が移植片内皮形成のために潜在的にすぐれていることを
実証する。分離操作並びにその後の表面粘着および細胞
・細胞間相互作用に含まれる変数をこの後により十分に
検討する。しかしながらここで論じた、およびこの後に
論じる操作法はすべて手術室の環境における自家ヒト組
織の操作と一致することを覚えておくべきである。

人工表面上の好ましい内皮細胞融合層の形成は、今では
最低三つの重要変数に依存すると考えられる。先づ、第
１に最初の細胞粘着は、少なくとも約５０％の初期表面
被覆を提供するに十分でなげｎばならない。少なくとも
約５０％の被覆をもたらすほどの大血管内皮細胞の調達
は不可能でないにしても非常にむづかしい。なぜならば
利用できる唯一の細胞源は患者自身の大血管であるから
である。大血管の細胞を分離し、培養して多数の細胞を
用意することができるとしても組織培養培地と関係した
明白な問題が提起されるであろう。微小血管化脂肪は、
播種するための内皮細胞の豊富な資源となる。患者の脂
肪２０ｇは１８０ｃｒｎ２の表面積（股動脈とひかがみ
動脈とをバイパスする°典型的移植片が示す表面積）に
播種するに十分な内皮細胞を提供する。

考慮すべき第二の変数は、内皮細胞が人工物表面で増殖
する能力である。５０％融合で適用した場合、融合した
細胞層を形成するには細胞が一度２倍になることが必要
である。第２表は、好ましい蛋白質被覆表面（音直小板
・血漿で被覆した）上で増殖因子を含む組織培養培地中
で細胞は少なくとも１旦は２倍になることを示している
。しかしながら体内ではこれらの増殖因子は多分に存在
しない。したがって融合でまたは融合の過剰で表面を処
理する能力があると好都合である。ここでもまた、ヒ）
ＭＢＣが多量に使用できれば移植時に融合単層に近いも
のを確立することのできる密度で内皮細胞を表面に適用
することができる。

こｎら二変数は前記のように蛋白質で前処理した人工物
表面、または蛋白質表面に匹敵するように加工さｎた表
面上にヒト内皮細胞を適用することにより十分に研究さ
ｎている。このような変形さｎた表面は、内皮細胞組織
培養技術者には十分よく知らｎている。別法として、内
皮細胞を移植片の内部および周囲に生成するフィブリン
（蛋白質）ゲルの中にあらかじめ凝固する。データはヒ
ト微小血管内皮細胞が蛋白質の網目構造の中でゲル化し
、培養培地においてインキュベーション後ゲルの表面に
移動することを示す。こｎは走査型電子顕微鏡により確
認された、そｎはヒト微小血管内皮細胞がヒト血漿中で
あらかじめ凝固した後に、ダクロンポリエステル移植片
の表面に融合単層を生成することを示した。

第三の重要な変数は「技術」および「基礎にある表面」
が組織、剪断抵抗および抗血栓形成性を含むＥＣ単層の
機能的特徴を持つことに、よる影響である。このような
機能的特徴を改善するために、ヒト成内皮細胞（以下Ｈ
ＡＥＣと呼ぶ）と、ヒト羊膜によって示される天然コラ
ーゲン表面との相互作用を研究した。走査型電子顕微鏡
による評価の結果、ＨＡＥＣは羊膜の基礎面（コラーゲ
ンＪＴ／Ｖ　）にも間質面（コラーゲンＩ／Ｉ　）にも
速かに粘着することがわかる。しかしながら細胞の粘着
は基礎膜表面の方が著しく大きい。その上、ＨＡＥＣは
間質性面に播種さｎた細胞に比較して、基礎膜面にすみ
やかにより密接な細胞・細胞間（ｃｅｌｌ　ｔｏ　ｃｅ
ｌｌ　）相互作用をおこす。これらの結果はもし表面を
内皮細胞が元々粘着する天然の基礎膜を模して作るなら
ば、内皮細胞のその人造表面への播種は容易になること
を示唆している。

上述のように最近の証拠は、内皮細胞が末−処理移植片
および／またはコラーゲン被覆人工物表面忙粘着し、少
くともゆるい細胞・細胞間相互作用をそｎとおこしてい
ることを示唆する。しかしながらこのような証拠からは
、そのような内皮細胞が本来のヒト血管に存在するよう
なち密な細胞・細胞間結合物を形成することは証明され
ない。しかしながらヒト内皮細胞と、普通は内皮細胞が
粘着する本来の基質との最初の相互作用は非常に重要で
ある。特に摘出ヒト羊膜は内皮細胞を剥ぎとった時には
正常なヒト血管の内皮細胞の下にある面と同じ化学構造
であるからである。標本化羊膜も天然の血管も、内皮細
胞表面を除けば■型、■型両方のコラーゲンの基礎膜と
その下にある■型および■型コラーゲン基質とからなる
。

主題の表面ができることを証明するためにジャレル等の
“ヒト成内皮細胞の培養増殖“Ｊ−ＶａｓｃＳｕｒｇｅ
　１　（６）巻７５７−６４ページ（１９８）に発表さ
れた操作法によってヒト成内皮細胞を分離し培養した。

これらの細胞を標本化羊膜上に播種し、本来のヒト血管
の基質をシミュレートした基質に対する内皮細胞の最初
の粘着を研究できるシステムを作った。光および走査型
電子顕微鏡により評価した。

新鮮なヒト胎盤からとったヒト羊膜を、リオツタ（Ｌｉ
ｏｔｔａ）等の”腫瘍侵入研究のための完全無傷ヒト基
礎膜の大きい面を作る新しい方法（ＮｅｗＭｅｔｈｏｄ
　Ｆｏｒ　Ｐｒｅｐｃｒｉｎｇ　Ｌａｒｇｅ　５ｕｒｆ
ａｃｅｓ　ｏｆ　ＬｎｔａｃｔＨｕｍａｎ　Ｂａｓｅｍ
ｅｎｔ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｆｏｒ　Ｔｕｍｏｒ　Ｌｎ
ｖａｓｉｏｎＳｔｕｄｉｅｓ　）、キャンサーレター、
１１巻１４１−１５２ページ（１９８０）に記された方
法の変法によって作成した。全ての操作は無菌条件下で
行われた。内側羊膜をゆっくりと大胆に繊毛膜から切り
裂き１００単位／　ｍ　Ｉのペニシリンと、０．２５ｍ
　ｃ　ｇ／ｍ　ｔのフンギシンを含む、氷冷−燐酸−緩
衝食塩液中で２回洗った。こｎに続きダルベツコの最小
必須培地で、４Ｃで１回洗い。１ｍＭＮ−エチルマレイ
ミドを含む蒸溜水で１時間４Ｃですすいだ。それから羊
膜を４％デオキシコレート溶液中で２０Ｃで２時間イン
キュベートし、下にある基礎膜の構造を損傷することな
く上皮細胞をばらばらにほぐす。ゴムのポリスマドでゆ
っくり攪拌すると上皮細胞は基礎膜からはぎ取られる。

基礎膜の統合性を墨汁染色によって確かめた。上皮細胞
の除去は形態学的に確認した。

上記のように用意し上皮を除去した羊膜を、ウィリアム
ズ等の”成ヒト内皮細胞の人工移植片材料との適合性”
Ｊ　ｓ　Ｓｕｒｇ　、Ｒｅｓ　（同上）に用いられたの
と同様のプラスチックカプセル中に固定した。これはそ
の後の内皮細胞の播種および増殖のための安定した。輪
郭をはっきりつげた羊膜表面（０，５ｃｒｎ２）ｔ−用
意した。羊膜の基礎膜も介在性コラーゲン側も細胞播種
のために準備した。組織培養研究に先立って、羊膜を含
むカプセルを５００ｍｃｇ　／　ｍｌペニシリン／スト
レプトマイシンおよび０．２５　ｍｃｇ　／　ｍｌフン
ギシンを含む完全培地に４Ｃで一晩つげた。

ヒト内皮細胞を脳死で心臓は動いている死体の腎供与体
から採取した血管組織から分離し、上に参照した公表さ
れている操作法によって培養した。

この研究では新鮮な腸骨静脈からのＥＣを用いた。

つまり、口径面をコラゲナーゼ（ウオーシントン■型、
ウオーシントン　ディアグノスチック　システムズ社　
フリーホルト、Ｎ、Ｊ）で処理することにより新鮮な腸
骨静脈から分離し、ゼラチン（１％）の培養培地溶液（
培地１９９　２０％加熱不活性化・ウシ胎仔血清、９０
μｇ　／ｍ　Ｉ　ヘパリン（プロジン）、２０μｇ　／
ｍ＋内皮細胞増殖因子）をあらかじめ被覆した２５ｍ２
組織培養フラスコにおいて増殖させた。羊膜播種実験に
用いる細胞は累積的集団倍加（ｃｕｍｕｒａｔｉｖｅ　
ｐｏｐｕｌｅｔｉｏｎ　ｄｏｕｂｌｉｎｇ）が１６〜２
５０間になるように計算した。集団倍加（ｐｏｐｕｌａ
ｔｉｏｎ　ｄｏｕｂｌｉｎｇ　）はＰ　Ｄ＝　ｌｏｇ２
　（収穫細胞数）／（播種細胞数×付着効率）により計
算し、合計して累積的集団倍加（ＣＰＤ。

）を与えた。これらの細胞のＥＣ同一性の確認は前に報
告した。そして第■因子関連抗原のための陽性染色、丸
石（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ）の形態およびＥＣ−％異
−プロスタグランジンおよびアンギオテンシン変換酵素
活性を含んでいた。

内皮細胞を播種した羊膜を２％グルタールアルデヒドで
一晩固定し、それから形成物を固定し、パラフィンに埋
め込み、ヘマトキシリンおよびエオシン染色用の切片を
作成した。染色した切片はニコン・ディアフオト・顕微
鏡で光を照射して明るくして調べた。

走査型電子顕微鏡では、ＥＣ播種羊膜を１％グルタール
アルデヒドで１時間、そｎからタイロード　力コデイレ
ート緩衝液ｐＨ＝７．４　　中で４回洗った（各２０分
づつ）。その羊膜をアセトンの段階的系列で脱水し、臨
界点で乾燥し、金−パラジウムで被覆した。この時点に
おいてプラスチックカプセルを播種羊膜サンプルから除
去した。こｎらサンプルをフィリップスの走査型電子顕
微鏡にとりつげ、検査した。

上述の方法によって作成したヒト羊膜は、剥離操作に抵
抗し得た。基にある基礎膜構造が維持されていることは
墨汁を用いる走査によって確められた。サンプルを光お
よび走査型電子顕微鏡を用いて検査した時、羊膜面が完
全無傷であったこと、すなわち表面に破損、または破れ
や裂けがなかったことから膜の完全性も証明された。そ
の上、播種しない、剥離した（露出）対照用の羊膜をＥ
Ｃなしのままであった時、脱上皮化処理の効率が証明さ
れた。

ヒト腸骨静脈内皮細胞（ＨＩＶＥ）を分離し樹立細胞系
として組織培養で増殖させた。細胞を羊膜の基礎膜か支
質コラーゲン成分かどちらかに融合密度で播種した。ど
ちら側に播種した細７＠サンプルにも、洗浄および固定
の前に２時間培養し、そｎからＥＣの基質への最初の粘
着を評価するための試験を行った。走査型電子顕微鏡に
よる観察はＩＶ／Ｍｌ（基礎膜）コラーゲンおよびＩ／
ＩＷ（介在）コラーゲン両方にかなり大きい最初の粘着
を示した。ＩＶ／Ｖコラーゲン上には融合したＥＣ層が
生成して維持されており、若干の細胞は表面とゆるく結
合しているのが認められたが多くの細胞は緊密な細胞・
細胞間結合を示すのが認めらｎた。Ｉ／ｌ［コラーゲン
基質上では細胞はＩＴ／Ｖコラーゲン上に見らｎたより
も小さい密度で、そしてよりゆるい細胞結合で粘着して
いた。組織培養７日後光顕微鏡倹鏡は細胞がＩ／ＩＩＩ
型および■／Ｖ型コラーゲン表百どちらにも粘着し、ひ
ろがっていることを示した。

主題の実験はこうして新鮮なヒト胎盤から得たヒト羊膜
を標本化して、天然の（本来の）ヒト基礎膜の大きい面
を提供することができることを示した。この計画はＥＣ
がヒト本来の血管で経５験するであろう表面を模した基
質の豊富な、容易に使える原料を提供する。こうして、
そｎは播種さｎたＨＡＥＣと試験管内にあるようなコラ
ーゲン表面との最初のおよび持続する相互作用を研究す
る理想的試験管内モデルである。羊膜を用いてＨＡＥＣ
は基質模および間質コラーゲン基質両方に結合の最初の
２時間以内に粘着することが証明された。しかし基礎膜
上の細胞の方が本来の血管におげろ内皮細胞の結合に似
たち密な細胞・細胞間相互関係を形成した。こｎは本来
のヒト基礎膜を模する物質がＥＣ移植片相互作用を高め
、移植片閉塞の発生を低下させることを示唆する。これ
らの結果は、アメリカン・ジャーナル・オフ・サージエ
リート５０巻　１９７〜２００ページ（１９８５年８月
）に掲載のべ一カー等の“ヒト成内皮細胞をもったヒト
コラーゲン表面の内皮形成”に報告さｔた。、この論文
の主題は、臨床血管外科学会の第１３回年金（ランチョ
　ミラーシュ、カリホルニャ。

１９８５年４月１０〜１４日）で講演された。この論文
および特に図（写真）（これらは本出願には都合よく再
生できない）はこの結果、参照だよって挿入される。

その後の研究は、内皮細胞と表面との最初の接触から単
層の形成までの短期間の事象の連続に焦点をあてて行わ
れた。培養したヒト成ＥＣを放射能で標識化し、ダクロ
ン上に播種し、烈しく洗った後に粘着を定量した。播種
ＥＣの７０％がしつかり粘着するまでにかかった時間は
、未処理ダクロンでは２時間、本発明によるコラーゲン
・ラミネート、（間質性Ｉ／ｌ［型）コラーゲン下層お
よび羊膜由来の基礎膜（ＩＶ／Ｖ型）コラーゲン表面層
であらかじめ処理したダクロ／では３０分間、血漿被覆
ダクロンでは１９分間であった。パラレル　サンプルを
走査型電子顕微鏡によって形態学的に調べ内皮細胞の表
面への粘着を評価した。単るダクロンに播種した内皮細
胞は限られた粘着性を示し、血漿処理ダクロン上の細胞
は限られた細胞・細胞間結合を示した。基礎膜で処理し
たダクロンでは３０分後までには内皮細胞は平らな形態
を示し、移植片表面を完全におおった。この時間わくは
、低時的内皮形成移植片の実現を可能にする血管処理法
の大部分と適合する。

自家播種を用いて融合を確立するための一時的事象系列
は小口径の移植片の短期間の開放性を改善するためには
特に重要である。ヒト以外の大部分の動物では、移植片
のかなりのパーセントが自然に内皮化されるには移植後
４〜６週間の期間が必要であると予想さｎる。この時間
わくが大部分のヒト下肢人工移植片臨床系列にあてはま
るならば、かなりのパーセントの移植片が血栓形成のた
めに移植後１ケ月以内に駄目になることがわかる。

こうして、短期間の開放性に顕著な改善を見るためには
移植時またはその近辺に移植片上に完全無傷の内皮の確
立が必要であるかまたは少くとも望ましい。

すぐｎた小口移植片を得るためには、多量の自家内皮細
胞、例えば微小血管性脂肪に由来するようなすぐ使える
原料が必要である。人工表面基質は内皮細胞を受は入れ
るものを選択するべきであり、その処理は付着に必要な
知識および、機能的並びに剪断抵抗のある単層を確実に
生成せしめるのに必要な一時パラメーターを用意して行
われるべきである。そこで、人工表面への内皮播種から
融合単層の生成までの短時間の事象連続が移植時にあら
かじめ内皮形成を可能とするほど十分に速いものである
ことを証明するために次の試験を行った。

以下の研究を行うにあたって、脳死で、心臓は動いてい
る死体の腎供与体から採取した血管組織から内皮細胞を
分離し、上述の操作法を用いて培・養した。この研究で
は、上述のようにして分離した成ヒト腸骨靜脈からの内
皮細胞を用いた。ヒト基礎膜も上述の操作法にしたがっ
て作った。異種間質性コラーゲンＩ／ＩＮ型はヒト胎盤
からマトリ（Ｍａｄ　ｒ　ｉ　）の”ｖ型コラーゲンの
調製”（Ｈ、Ｆｕｒｔｈｍａｙｒ編集、細胞外基質の免
疫化学、ボサラトンフロリダ：ＣＲＣプレス、１９８２
ｆｌ１巻７５〜９０ページ）の方法により調整した。こ
の報告はこの結果参照によって挿入される。つまり細切
し、凍結乾燥した胎盤をペプシン消化し、コラーゲンフ
ラクションを０．５Ｍ酢酸で可溶化した。Ｉ／ＩＮ型を
１．４　Ｍ　Ｎａｃｌ　　で沈澱させ、沈澱物を集め、
緩衝’ＭＫ対して大規模に透析した。白い毛羽のように
やわらかいコラーゲンを直ちに用いるか、または凍結乾
喋して使用時まで保存するかした。

本発明の好ましい実施例によると、移植片表面を次のよ
うにして作成した。織物のダクロン移植片の表面を、前
述のように調製した異種間質性コラーゲンＩおよび旧型
で被覆した。そのコラーゲンを０．（１１７４　Ｍ酢酸
中で安定化し、氷冷した培地１９９　およびＮａＨＣＯ
ｌで０．３２％コラーゲンに希釈する。移植片’ｉ２０
Ｃで一晩放置することにより沈着を促した。その後その
表面を帆２％グルタールアルデヒドで１分間おおい単培
地ですすいだ。

標本化した羊膜を、基礎膜面がダクロン面から離れる方
向に向けて移植片表面にかぶせた。これを３７Ｃで２時
間インキュベートして移植片と羊膜との粘着を促進する
。羊膜・被覆・移植片をプラスチック環（ビームカブス
ル　ポリサイエンシスＦＷ）内に固定し、Ｑ、５ｚ２表
面積を用意する。この点に関して用いる技術は、ウイア
ムズ等の”ヒト成内皮細胞と人工移植片材料との適合性
”Ｊ。

Ｓｕｒｇ　Ｒｅｓ　３８巻６１８〜６２９ページ（１９
８５）に記載されたものである。この論文はこｎによっ
て参照により挿、入される。

比較の目的のためにその他のダクロン移植片表面を多血
小板血漿（ＰＲＰ）によって処理した。

ＰＲＰはヒトドナーからの抗凝固（クエン酸ブドウ糖）
血液から作られた。ＰＲＰを移植処理の亘前に５０　ｍ
　Ｍ　ＣａＣ１□　と混ぜた。移植片をＰＲＰで処理し
、３７Ｃでフィブリンクロットを生成せしめた。そのク
ロットをＥＣ播種直前に培養培地で洗った。

走査型電子顕微鏡を用いて内皮細胞播種移植片を検査す
るために次の方法を用いた。腸骨静脈から分離したＥＣ
を２５ｃｒｒ１２　　フラスコ中で融合するまで増殖さ
せ、１：４分裂比で２回細胞通過後、細胞播種のために
用いた。ＥＣ４−ト！Ｊプシン溶液（正常食塩水中の帆
２５　％トリプシンと０．０９％ＥＤＴＡ）で簡単に（
１，５分）洗い培養培地で１回洗い移植片表面播種前に
完全培養培地に再懸濁した。ＥＣは、ゼラチン被覆プラ
スチック面上に１００％融合した細胞単層を作るのに十
分な細胞濃度で播種した。この密度はＩ　Ｘ　１０’細
胞／　ｃｍ２に等しい。

適当な時に、播種移植片表面に向けてパスツールピペッ
トから完全培養培地を強くかけることによって播種移植
片表面から粘着していな℃・、またはゆるく粘着した細
胞を洗いおとした。移植片表面を直ちに１％グルタール
アルデヒド中で固定し、走査型電子顕微鏡検査の準備を
した。

走査型電子顕微鏡検鏡を行う前に１％グルタールアルデ
ヒドで１時間、２％グルタールアルデヒドで２時間固定
し、タイロードカコジレート緩衝液（ｐＨ，７，４）で
３回洗い（２０分間の期間）アセトンの段階系列で脱水
した。移植片−まだプラスチック環に固定されている−
をそれから臨界点で乾かし金パラジウムで被覆した。と
りつけたサンプルをフィリップス走査型電子顕微鏡で調
べた。

内皮細胞はこのテストでは二つの別個の操作法を用いて
放射性標識化された。Ｔ−２５フラヌコ中の融合ＥＣを
トリプシン溶液で処理することによりチミジン標識化を
行った。これらの細胞をその後培養培地で洗い、計数し
、Ｔ−７５フラスコ上に１０’　ＥＣ／　’ｃｍ２で再
プレートする。２４時間増殖させた後、トリチウム化チ
ミジン（アメルシャム、アーリントンハイツ、Ｉ　Ｌ　
Ｌ　）　０．５μＣ１をフラスコに加え、２４時間イン
キュベートした。ＥＣｆ：、トリプシン溶液で処理し、
シンチレーションカウンターで計数した。２５　ｃｍ”
フラスコで融合するまで増殖させた内皮細胞にインジウ
ム標識化を行った。細胞を短時間トリプシン処理した。

放出した細胞を遠沈により（１００Ｘｇ：：３分）ベレ
ットにし燐酸緩衝食塩液で１回洗った（　ｐＨ７，４）
。

標識化する前に細胞を燐酸緩衝食塩液０．５　ｍｌに再
懸濁した。細胞濃度を２．５刈０５細胞／ｍｌに調節し
た。２０マイクロキユリーのインジウム（メジ　フィリ
ップス　エメリーウパイル　ＣＡ）を細胞懸濁液に加え
、細胞を洗い、５μｍ　サンプルをとり、標識化効率の
最終的分析を行った。標識化細胞を完全組織培養培地を
用いた遠沈により３回洗った。最終的ベレットを、最終
的濃度が２．５Ｘ１０’細胞／　ｍｌになるよ５に完全
組織培養培地に再懸濁した。

生成した放射性標識化内皮細胞を播種し、その粘着性を
次のように定量した。内皮細胞をビームカプセルに固定
した基質被覆・ダクロンに播種し特定の時間間隔インキ
ュベートした（ｔ＝１．５．１０．２０．３０．６０，
１２０分）。各時間間隔毎にサンプルを得た。第１のサ
ンプル（上澄みと呼ハｎるものはビームカプセルから上
澄液をピペットでとることにより得られる。第二のサン
プル（ゆるく粘着したと呼ばれるもの）はピペットで培
養培地を表面に強くかげることにより移植片表面を烈し
く洗うことによって得た。これらの洗浄を行５ために用
いた培地を集め、全試料を第二のサンプルとした。第三
のサンプル（粘着したと言われるもの）はすべての粘着
ＥＣｔ移植片面からとることによって得た。こｎは、Ｅ
ＣＣサンプルミ、２ｍ１０．３％ドデシル硫酸ナトリウ
ムに３回溶かし、生成した溶液をろ紙に移すことにより
行われた。各ろ紙５．を１０％氷冷ＴＣＡに移し、沈澱
物質を計数した。各サンプルのカウントは、三試料全部
の総カウント数のパーセントにして標準化し、各フラク
ションの％ＥＣ対時間（分）をプロットした。

トリチウム、化チミジンで標識化したＥＣｉシンチレー
ションカウンターで計数し、インジウム標識化ＥＣはガ
ンマ・カウンターで計数した。

上記の試験から次の結果が得られた。内皮細胞の粘着度
を定量的に評価した。内皮細胞のインジウム標識化細胞
への粘着性。これらの方法のどちらも細胞放射性標識化
方法が細胞粘着の動態に影響全厚えないことを示す同様
の結果をもたらした。

ヒト内皮細胞は第４図に示されるように未処理織物ダク
ロン移植片に時間に依存する粘着を示した。

１０分までに加えたａ３２＠の約３０％がダクロン表面
にしつかりとくつつくことが認められた。しっかりと粘
着する細胞の数は時間と共に徐々に増加して１時間まで
には５０％がしつかり粘着し、２時間までには加えた細
胞の８０％がしっかりと粘着した。ゆるく粘着した、ま
たは粘着しなかった細胞の同時定量の結果（第４図）移
植片表面にしっかりと粘着しなかった細胞の大部分は懸
濁液中に遊離していることがわかった。移植片表面との
結合２時間までにゆるく粘着した細胞と懸濁液に遊離し
ている細胞は移植片に加えた全細胞の約２０％であった
。移植片表面を前処理して多血小板血漿クロット表面か
またはヒト羊膜から調製した天然基礎膜表面を作った場
合、ヒト内皮細胞の結合速度は著しく加速さｎた（第５
図）。ＰＲＰクロットは内皮細胞の７０％がインキュベ
ーション１０分後にはしっかりと粘着した。多血小板血
漿に粘着した細胞数は２時間までに８０％の最大値に増
加した。ヒト基礎膜（羊膜）被覆ダクロンへのヒト成内
皮細胞の最初の粘着は未処理ダクロンとＰＲＰ処理ダク
ロンとの中間であった（第５図）。

粘着した細胞数は時間と共に増加し、羊膜に粘着した細
胞数は３０分〜６０分間の間にＰＲＰ処理ダクロンに粘
着した細胞数と同じになった。第５図に見られるように
すべての表面は、２時間のインキュベーション後にはほ
ぼ同じ粘着細胞数を示した。表面を形態的に評価した。

内皮細胞−移植片の定量分析から内皮細胞の表面への粘
着速度を分析できる。しかじ内皮細胞と移植片表面との
相互作１′用の形について疑問が残る。そこで我々は、
内皮細胞の基礎膜処理移植片表面、多血小板血漿処理移
植片表面および未処理のダクロンそのものに対する粘着
を形態学的に評価した。基礎膜処理移植片に対するヒト
成内皮細胞粘着の一時的経過を、走査型電子顕微鏡検査
によって調べた。内皮細胞の添加後移植片表面を１〜１
２０分間いくつかの間隔で洗い、走査型電子顕微鏡によ
って評価した。頂度１分後に丸い内皮細胞が比較的平滑
な羊膜表面にしつかり粘着するのが認められた。１０分
間インキュベーション後内皮細胞はまだ細胞性基礎表面
の限られた部分への焦点性粘着を示唆する丸い外観を保
っていた。

インキュベーション２０分後の、内皮細胞の基硫膜への
粘着の評価ではじめて細胞群の形の変化の証拠が得られ
た。球形の細胞がまだ存続する一方、比較的平らな形態
を有する細胞が認められた。

より圧迫された細胞群の端はまだ丸味を帯びておりそｎ
らの遠位表面では細胞の結合がまだ限らｎていることを
示唆している。２０分後の細胞粘着数の増加も明白であ
る。この時には羊膜表面に粘着する内皮細胞の形態が認
めらｎた。最も容易に確認さｎたのは一部および完全に
ひろがった内皮細胞にくっついた丸い細胞の存続である
。数は一番多いが最も確認しにくかったのは、元の羊膜
表面をほとんど完全におおった広く広がった内皮細胞で
あご。

内皮細胞播種羊膜表面の完全な形態学的成熟が見られた
のは、細胞結合がはじまってから１時間後である。内皮
細胞は羊膜をおおい膜のしわの消失が平滑な内皮細胞単
層表面を形成する。内皮細胞のち密な結合は細胞の境界
の確認をむづかしくしている。しかしながら不完全に薄
くなった細胞がところどころにあるので、これが下にあ
るダクロン繊維によりこの単層の細胞的性質を評価する
参考点となる。

多血小板血漿および未処理ダクロンに粘着した細胞の形
態も粘着６０分後に評価した。ＰＲＰ処理ダクロンへの
内皮細胞粘着は、細胞のない部分と、細胞が内皮細胞に
特徴的な細、抱・細胞間相互作用を示している部分とを
含む。遍平内皮細胞の表面にフィブリンが明らかに沈着
しているのも興味深い。このフィブリン層は播種前に形
成されたから、内皮細胞はそれらが完全に粘着し遍平に
なる前にフィブリン内張りの下に一部もぐり込むことが
できることを示していると考えられる。最も重要なこと
は内皮が全熱なく、したがってフィブリン層が露出して
いる領域が一般に見らｎることである。最後に６０分後
の未処理ダクロン表面の粘着では固定前の洗浄中、およ
び検鏡のだめのサンプル作成中に受ける力に抵抗するた
めに、一本一本のダクロン繊維にまきついたり、それを
横切ったりしている内皮細胞が見られる。未処理ダクロ
ン表面にはマルチ内皮細胞の斑点は見つからなかった。

理論的に＆止血管移植片内皮化は低密度の内皮細胞播種
とそれに続＜ＥＣ増殖、高密度ＥＣ播種、または移植後
表面にＥＣが自然に内生ずることによっておこる。移植
時に融合層を形成する高密度ＥＣ播種が、血栓形成の危
険性のある手術後、最初の数週間は非血栓形成性移植片
を提供する可能性の最も大きな方法である。前記の研究
は、高密度ＥＣ播種が手術室での血管処置と適合する時
間的パラメーター以内に形態学的に正常に見える内皮単
層を生成することができるかどうかを調べるために企て
らｎた。実験条件はＥＣ−移植片相互作用に関する我々
のこれまでの観察に基づいて選んだ。しかしながら我々
のこれまでの研究と異なり、トリプシンにさらす前に、
たった２で速（通過するＥＣだけを選んだ。研究のため
に別個の三方法を用いたのは、我々が以前接触禁止融合
単層に相当する細、胞数（すなわちｌ　０５Ｅ　Ｃ／ｃ
ｒｒ１２）は必ずしも走査型電子顕微鏡でみる融合単層
と相関関係にないことを観察したからである。トリチウ
ム化チミジンおよびインジウム両方用いて細、＠粘着を
定量する放射能測定は、表面に粘着していないか、しつ
かり粘着しているかまたは付着過程であるかのいづれか
の内皮細胞数を測定する正確な方法として用いられた。

これらの方法を用いて、血漿被覆ダクロンには３０分以
内にしっかりと粘着することを観察した。この速かな粘
着性にもかかわらず、形態的に正常に見える単層への増
殖は遅れる。６０分の内皮細胞はほとんど細胞・細胞間
相互作用を示し、丸石（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ）の形
態よりむしろ星状（ｓ＄ｅｌｌａｔｅ　）の形を示す。

この表面の非血栓形成特性は試験しなかったとはいえ、
この異常な形態学から、これら内皮細胞は理想的条件を
生成しないし、流れの作用に耐えないことが示唆される
。羊膜コラーゲン・被覆・ダクロン移植片に対する内皮
細胞粘着は、血漿−被覆−移植片より緩徐であったが、
融合への到達には著しい差があった。２０分までの早い
時期には粘着は焦点性であったが、内皮細胞は表面に多
くの付着点を形成しつつあり、遍平になり広がる過程に
あった。遍平化プロセスは３０分までに最大となり、多
くの細胞・細胞間相互作用があった。これは形態学的に
本来の血管内皮に似ている融合層を形成していた（走査
型電子顕微鏡で）。この興奮すべき観察は、短時間培養
した内皮細胞が血管移植片挿入前の外科的切刃時に合う
時間わく内に単層となる能力をもっていることを示唆す
る。こうして、処置の始めに移植片に播種すれば血流を
戻すまでに融合層になる。

羊膜／コラーゲン被覆ダクロンについての粘着研究は、
播種内皮細胞の７７％が３０分までに表面に粘着したこ
とを示す。こｎは、短時間培養したＥＣの大部分が表面
に粘着する能力を有し、十中へ九、特殊の付−着特性を
もったＥＣのサブグループは存在しないか必要ないこと
を示す。ＥＣは融合接触禁止単層密度（１０５ＥＣ／Ｃ
！ｒｔ２）と等価の密度で播種されたから、融合以下の
付着（すなわち７７％）でも形態的には融合した層を付
着せしめるということも注目すべきである。こうして、
増殖させずども移植片を完全におおうのに必要な播種Ｅ
Ｃの最小数は７．７Ｘ　１０’　ＥＣ／ｃ！ｎ２より小
サイ。

この研究における融合は、走査型電子顕微鏡で見て人工
物表面をＥＣが完全におおっていることと定義づけられ
る。細胞・細胞間結合は正常のように見える、しかし透
過性電子顕微鏡でさらに研究すれば、存在する接合の型
も、内皮細胞と移植片基質複合体との間の結合の型も知
ることができる。基質は細胞の形態および機能に影響全
有することがわかっており、確実な結論を引き出す前に
、実験的設定において調べなけｎばならない。その上移
植片の基質として羊膜の使用を研究することによりさら
に多くのことがわかるであろう。この生物学的に由来す
る材料は、現在は広い臨床的応用には使用できない。Ｉ
Ｖ／Ｖ型コラーゲンの他に、羊膜はフィブロネクチンお
よびラミニンの細胞付着因子を含む。血管移植片の大規
模生産のためにはＩ／ＩＩ型コラーゲンの中間層と、天
然基礎膜に似ているＩＶ／Ｖ型コラーゲンのてっぺん表
面層から成るラミネートを構成することが望ましい。所
望ならば、フィブロネクチンおよび／またはラミニンを
含む細胞付着因子の添加によってその膜全より一層似せ
ることができる。用いる基礎膜は天然性のものであろう
と、合成のものであろうと、そのような膜は全く非細胞
性であり、照射によって殺菌し、その後の使用のために
貯蔵し、モして／または輸送することができることを記
しておかなければならない。或いは合成人工物の面を、
所望のｆＶ／Ｖ型コラーゲンに化学的に似せることもで
きる。

前述の試験に由来するＥＣ単層は、形態学的に正常のよ
うに見えるとはいえ、その他の試験（以下に記す）を行
って、それが正常内皮のその他の機能的特性、特に非血
栓形成性に関する特性を有するかどうかを研−究した。

例えば単層が生理的動脈剪断応力に抵抗し、その粘着性
を保つことカ≦できることを証明することが望ましい。

これは、ＥＣ基礎膜粘着についてのみならず、基礎膜・
血管移植片相互作用、並びに内皮細胞と内皮細胞との付
着についても示された。しかしながら前記の研究から短
時間培養したヒト成犬血管内皮細１胞の大部分は、１０
分以内に血漿被覆ダクロンに、そして３０分以内に羊膜
／コラーゲン−被覆ダクロンに速やかに粘着する能力を
有することが結論づけられる。ダクロンそのものだけへ
の粘着の場合には顕著な粘着があられｎる前により長い
時間が必要である。羊膜／コラーゲン−被覆ダクロンの
粘着はより緩徐であるとはいえ、３０分後の正味の結果
は基質を完全におおい、走査型電子顕微鏡で正常な血管
内皮と同様に見える内皮細胞単層である。完全な移植片
被覆は、血漿被覆ダクロンまたはダクロンのみの上には
２時間のわく内にはおきなかった。羊膜／コラーゲン被
覆移植片で得たデータは、もしも受は入れる移植片−基
質−複合体が用いられるならば、手術室にある間に内皮
細胞単層の生成が可能であることを示唆するものである
。

羊膜上の高密度播種によって作られる内皮線、＠単層の
機能的特徴を確かめるために、そして微小血管の内皮細
胞を用いた時にこの処置が有効であることを証明するた
めに、羊膜被覆移植片表面を前述の如く作った。但し、
コラーゲン被覆のための面を作るために、先づ最初にグ
ロー放電血漿クリーナーを用いて前処理を施したダクロ
ン移植片表面を用いた。この操作法は人工物ヲノ・リフ
の血漿クリーナー中に５分間置くことを含む。この装置
で生成したグロー放電血漿は、移植片表面を腐蝕し、コ
ラーゲンと移植片との間により強い結合を作り出す。

この方法の可能性をイヌのモデルを使って証明した。羊
膜被覆ダクロン移植片にイヌ微小血管内皮細胞を播種し
、播種移植片をイヌの大静脈に外科的に移植した。２日
後その移植物？とり出し、表面を走査型電子顕微鏡で検
鏡した。この検査により、その表面は血球（白血球およ
び血小板）の結合を阻止する細胞層によっておおわれる
ことが判った。この検査は主題の移植片が不定の開放性
を持たないことを何らか示すことに失敗した。動脈の上
におかれた制御表面は、血にさらされた時に未処理ポリ
マーの通常のトロンボゲンの特性を禁止する。

以上のことかられかるように、本出願はヒト患者に移植
するための移植物を処理する新規な方法であって、合成
基質材料を提供することと、その材料ｔｌＶ／Ｖ型コラ
ーゲンで処理し、ヒト内皮細胞の粘着、増殖およびその
形態を改善することとから成る方法を開示する。好まし
い実施例において、前述のコラーゲンラミネートはヒト
繊毛尿膜に由来し非細胞性ヒト羊膜を含む。このコラー
ゲンラミネート（羊膜）を、結合した間質性コラーゲン
ベース層を備えた基質に適用する。ベース層はグルター
ルアルデヒドのような架橋剤はさら忙ベース層の表面を
活性化してコラーゲンラミネートをそのベース層に共有
結合させる。それから架橋剤は、緩衝食塩液に溶解性で
あるアミン、アミノ酸、またはリジンのようなアルデヒ
ド活性アミン基を有するペプチドによって安全に不活性
化される。洗って不活性化剤と残留架橋剤とを除去した
後、その移植片は微小血管内皮細胞の高密度播種を受は
入れる用意が整う。こｎらの微小血管内皮細胞ｆ　ｌ　
ｃｍ２につき最低５Ｘ１０’、好ましくは最低７．７　
Ｘ　１０’細胞の密度で播種し、播種から２時間以内に
移植片表面上に融合単層を形成せしめる。

現在のところ１α２につき範囲１−３または約２×１０
５細胞で播種することが好ましい。微小血管内皮細胞が
本発明の範囲内にあるとはいえ、２またはそれ以下の通
過で短時間培養されたヒト成内皮細＠ヲ（そのような細
胞が容易に手に入る場合には）使用することもできる。

生成した移植片は自家内皮細胞の内皮内張りを有するか
らその開放性特に移植後の重要な初期の時期における開
放性は著しく改善すると期待される。静脈移植物のため
に、およびそうでなければ開放性率ががっかりする程低
い直径４ｍｍ以下の血管（小口径移植片）に主題の移植
片を使用することが期待される。

“ダクローン”は、ＥＩデュポン・ドウ・ネマーズ・ア
ンド・カンパニー（ライリントン・デエラウエア）の商
標であり、そｎはメチルテレフタレートとエチレングリ
コールとの縮合産物である特殊のポリエチレン・テ゛レ
フタレートポリエステルを指すために用いらｎ、５゜一
般当業者の人々は、ここ知添付の特許請求の範囲により
詳しく定めらｒる本発明の範囲から逸脱することなくこ
こに記載の方法および操作法から種々の変更を行い得る
ことは当然である。

ここに用いた先方（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ）という語
は例えばウシ大動脈の培養内皮細胞があられす典型的対
称的な内皮細胞・細胞間（ｃｅｌｌ　−ｃｅｌｌ　）形
態（当業者は”　ｔｒｕｅ　ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ”
と言う場合もある）にも、細胞は一般に丸いが突起とか
その他の非対称的部分のある細胞形態にも用いらｎる。

特にこの出願に用いた場合先方（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎ
ｅ）という語は、ち密な細胞・細胞間（ｃｅｌｌ　ｔｏ
　ｃｅｌｌ）結合をした、すなわち下にある層を最大に
覆うように薄（のびる内皮細胞の集団を指す。

〔発明の効果〕

本発明によｎば、比較的質の良い移植物体を容易に提供
することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明にしたがって使用するためのヒト微小
血管内皮細胞を得るための段階を示す線図である。 第２Ａ図及び第２Ｂ図は、チミジン標識化ヒト成内皮細
胞（ＨＡＥＣ）の、未処理（２Ａ図）、および多血小板
血漿処理（２Ｂ図）のダクロンポリエステル移植片への
粘着を、移植時から２４時間に互って説明する図である
。 第３図は、■／Ｖ型コラーゲン表面層を備えたコラーゲ
ンラミネートヲ有する本発明の移植片を作る好ましい方
法を説明する線図である。 第４図はヒト成内皮細胞の、未処理ダクロン移植片への
粘着を示す図である；内皮細、ｌ＠を放射性標識化し、
細胞結合を二こに記載のように定量した。指示さｎた時
間に、上澄液に遊離している内皮細胞（三角形のプロッ
ト）を定量した。それから移植片の表面ビパスツールピ
ペットから培地を表面に強（かげることによって洗いゆ
る（結合している細胞（四角いプロット）およびしつか
り粘着している細胞（丸いプロット）全定量した。短時
間培養し最小にトリプシン消化された内皮細胞は、未処
理ダクロンに時間に依存して粘着した。 第５図は、ヒト成内皮細胞の、未処理ダクロン、多血小
板血漿処理ダクロンまたはヒト羊膜処理ダクロンへの粘
着を比較する特性図である。ダクロンに蛋白質面を作り
つけると、内皮細胞の表面への粘着は加速する。ＰＲＰ
プロットは、ダクロン上に多血小板血漿が凝固すること
により生成した面をあられす。ＡＭＮＩＯＮ（羊膜）プ
ロットは、非細胞性羊膜のダクロン表面への結合から生
じる表面を明らかにする。羊膜の基礎膜表面はダクロン
表面から離れた方に向いている。ＰＬＡＩＮプロットは
未処理ダクロン織物に関するものである。 細胞の粘着はここに記載のように定量した。 第６図は、血漿被覆ダクロンへの最初の粘着において提
供者毎に差のある微小血管内皮細胞の特性図である。新
たに分離した微小血管内皮細胞を血漿被覆ダクロンに１
時間播種した。簡単に洗った後移植片をギルのへマドキ
シンで染色し、粘着内皮細胞を数えた。提供者＃８およ
び＃９は＃１．２．４．５．６．７、に比べて統計的に
有意に増加した粘着全示し＃３は、５ｔｕｄｅｎｔ　ｔ
テストで検定した場合＃ｌ、２．４．５．７と異なる。 第７図は、インジウム１１１標識化微小血管ＥＣの血漿
被覆ダクロンへの粘着の一時的経過を示す特性図である
。ＥＣを示した時間移植片表面と結合させ°、その後こ
こに記されるように、粘着しなかった細＠を除去する。 放射能標識化細胞は６０分間は速い粘着速度を示し、そ
の後最後の１２０分の粘着測定までは速度が減少する。 データはサンプルの平均士標準偏差をあられす。 第８図は、血漿処理ダクロンに播種した微小血管内皮細
胞が、広範囲の剪断速度にさらされた後、移植片に永久
的に粘着して残っている部分を示す特性°−図である。 分離したばかりの微小血管内皮細胞を血漿被覆ダクロン
上に１時間播種した。簡単に洗った後、潅流液として培
養培地を用いて、移植片を２時間流れの条件にさらした
。移植片上に残った内皮細胞を数え、同じように播種し
たが流ｎにさらさなかった対照移植片と比較した。直線
回帰分析を用いる統計的評価はγ−値が一帆２６でｙ　
＝　９）−０．３３　ｘ　　をあられした。 Ａ・・・脂肪、Ｂ・・・細切片、Ｃ・・・血管ペレット
。 図面の浄書（内容に変更なし） 第１図 力ロ′ＬＴ−寿、田Ａ乞し′−タ寸ｊる０ム刀口えた糸
田月乞にり丁する　＃ｌ。 Ｍ３図 第４図 第５図 第６図 ドナー　プシバ− （才是Ｉ芹渚） 最大オど１のバー芝しト ーｙ　（１）　Ｊ％　ＩＪ′Ｉ　Ｃｎ　−”ψＯｏ　Ｏ
ｏ　ｏ　ｏ　ロ　０　ロ　ｏ　Ｏ。 ″　　　リ　　　〜　　　ω　　　ω ｏ　　′　　ｏ　Ｊ　　ｏ　　φ　　０　−箱涛（オｇ
＊　ＥｃＡｏ５）　ｘ　ｔｏ。

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト患者に移植するための人工移植物体であつて
   、 合成基質と表面層とを含んで成り、上記表面層がＩＶ／
   Ｖ型コラーゲンおよび／または少なくとも約５０％融合
   して存在するヒト内皮細胞から成るものであることを特
   徴とする人工移植物体。
2. （２）上記人工移植物体は、更に中間蛋白質層を含むも
   のである特許請求の範囲第１項記載の人工移植物体。
3. （３）上記蛋白・質層が、上記基質と上記ＩＶ／Ｖ型コ
   ラーゲンの表面層との間に位置する間質性コラーゲン層
   である特許請求の範囲第２項記載の人工移植物体。
4. （４）上記移植物体は、上記基質を上記表面層に結合す
   る結合剤を含んでいるものである特許請求の範囲第１項
   記載の人工移植物体。
5. （５）上記結合剤が、グルタールアルデヒドであり、上
   記グルタールアルデヒドの遊離アルデヒド基が、結合後
   著しく不活性化されるものである特許請求の範囲第４項
   記載の人工移植物体。
6. （６）上記間質性コラーゲン層および上記ＩＶ／Ｖ型コ
   ラーゲンの表面層がヒト漿尿膜から成る薄膜である特許
   請求の範囲第３項記載の人工移植物体。
7. （７）上記内皮細胞が、培養されない自家内皮細胞であ
   る特許請求の範囲第１項乃至第６項記載の人工移植物体
   。
8. （８）上記内皮細胞が、移植前に融合するものである特
   許請求の範囲第１項乃至第７項記載の人工移植物体。
9. （９）上記内皮細胞が、ほとんど平らで、且つ丸石（ｃ
   ｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ）の形態を示す自家内皮細胞であ
   る特許請求の範囲第１項乃至第８項記載の人工移植物体
   。
10. （１０）上記内皮細胞が、脂肪誘導内皮細胞である特許
    請求の範囲第１項乃至第９項記載の人工移植物体。
11. （１１）上記内皮細胞が、微小血管内皮細胞である特許
    請求の範囲第１項乃至第１０項記載の人工移植物体。
12. （１２）上記人工移植物体が、たつた約４ｍｍの内径を
    有する血管移植片の表面である特許請求の範囲第１項乃
    至第１１項記載の人工移植物体。
13. （１３）ヒト患者に移植するための移植物体を処理する
    方法であつて、 （ａ）合成基質材料を用意すること、 （ｂ）間質性コラーゲン層を上記基質材料に結合させる
    こと。 （ｃ）ＩＶ／Ｖ型コラーゲン表面層を上記間質性コラー
    ゲン層に結合せゼること。 （ｄ）上記ＩＶ／Ｖ型コラーゲン表面層にヒト内皮細胞
    を、移植前に少なくとも５０％の融合で粘着させること を含んでいることを特徴とする人工移植物体の製造方法
    。
14. （１４）上記コラーゲン層を、結合後および移植前は不
    活性化される結合剤を用いて結合する特許請求の範囲第
    １３項記載の人工移植物体の製造方法。
15. （１５）上記ＩＶ／Ｖ型コラーゲン表面層が、ヒト漿尿
    膜から成る薄膜を上記コラーゲン層に結合することによ
    つて結合されるものである特許請求の範囲第１３項記載
    の人工移植物体の製造方法。