JPH0392169A - 人工血管の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、医療技術分野、特に人工血管の分野に属す
るもので、より詳しくは、優れた生体適合性を有し、生
体に移植後も血漿戒分や血球或分を活性化せず、血管と
しての正常な機能を有する、人工血管の製造方法に関す
るものである。

〔従来の技術］ 人工血管はその設計思想から大きく３つに分類すること
ができる．第一は、血液成分の付着や血栓形戒を極力阻
止しようとするもの、第二は、血液成分の付着を積極的
に促進し、偽内膜（新生内膜）を形成させて血液との親
和性を付与しようとするもの、第三には、培養した血管
内皮細胞を利用するものである。

現在、臨床的に用いられている人工血管は、主として第
二の“偽内膜形或型”であり、比較的太い血管の場合は
、この方法がきわめて有効である．しかしながら、直径
が５閣以下の、特に静脈系の細い血管では、前記の方法
では血栓形戒による閉塞が大きな問題になっている。

比較的最近になって、細胞培養技術の進歩にともなって
、培養した血管内皮細胞自体を利用する方法が盛んに研
究されるようになってきた．しかし、血管内皮細胞と血
液戒分との相互作用に関する研究は、最近になってよう
やく基本的な事項が明らかになりつつある段階であって
、まだまだ未解明な点が多い．事実、動物実験に関する
研究報告がなされていても、実際に臨床的に使用できる
レベルにはまだ到達していないのが現状である。

もちろん、動物やヒトの種差による問題や免疫学的な障
壁も大きいが、さらに基本的には、内皮細胞と血液戒分
との相互作用に関して不明な点があまりにも多いことが
、これらの新しい技術の実用化を妨げる要因であるよう
に思われる。

［発明が解決しようとするＩｆｆ！！］内皮細胞を用い
た人工血管の場合でも、動物実験レベルですら、長期に
わたる生体内への埋め込みは完全な或功を納めていない
というのが実状である。その原因の一つには、流れの条
件下で内皮細胞が培養基材から剥離することによる血栓
形成の問題があり、もう一つはそれ以外の原因不明の血
栓形戒である。

本発明の目的は、流れの条件下でこのような血栓形成が
全く起こらず、安定した開存性を示す人工血管を提供す
ることにある。

（課題を解決するための手段〕 本発明者らは、内皮細胞と血液或分との相互作用に関す
る研究を進めるなかで、静置培養した内皮細胞にＰＲＰ
　（多血小板血漿）を接触させ、せん断を負荷すると、
流れの中で血小板が凝集するとともに、内皮細胞表面に
フィブリンと思われる繊維状物が析出するとともに、そ
こに血小板が粘着する現象を見出した．しかしながら、
培養液を用いて内皮細胞にせん断を負荷した後、ＰＲＰ
を用いて、せん断を負荷してもこのような現象が起こら
ないことを見いだし、さらに鋭意研究を進めて本発明を
完威させるに至ったものである．本発明は、チューブ状
の基材の内面に血管内皮細胞を単層培養した後、該チュ
ーブの内側に、せん断速度が５０　１７ｓから１０００
　１／ｓになるように液体を１分〜６０分間還流した後
、該液体を除去し、新しい該液体で内皮細胞表面を洗浄
することを特徴とする、血管内皮細胞を用いる人工血管
の製造方法に間するものである． 本発明において用いられるチューブ状の基材は、特に限
定されるものではなく、合戒高分子から或型された無孔
性のチューブ、不織布あるいは網目構造やミクロ多孔質
の材料からチューブ状に加工されたものなどを指す．し
かし、ポリエステルやフッ素系樹脂からなる市販の編組
人工血管や延伸加工したミクロ多孔質構造の人工血管な
どを用いることが好ましい。これらのチューブ状の基材
は、滅菌後そのままその内表面に内皮細胞を播種するこ
とも可能であるが、低温プラズマ処理やクロム酸などに
よる化学処理をした上で内皮細胞を培養する方が細胞の
接着力が向上するので好ましい．また、基材にコラーゲ
ンやファイブロネクチンなどの生体由来物質をコーティ
ングしておくことも細胞の接着性を向上させるうえで好
ましい．内皮細胞にせん断応力を負荷する場合、使用す
る液体の粘度は０．８〜１．　８ｍＰａ　−　ｓが好ま
しく、せん断速度は５０〜１０００　１／ｓが好ましい
。Ｉｎ　ｖｉｖｏで２００　１／ｓ　、毛細血管で８０
０　１／ｓといわれており、本発明におけるせん断速度
もほぼその範囲に属していることが好ましい． せん断応力を負荷するための液体としては、血液から血
球或分及びフィブリノーゲンを除去した血清、あるいは
細胞培養用の培養液が好ましい。

培養液としては特に限定はぜす、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕ
＋ａ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）　、Ｍ−１
９９（１９９一培地）など、内皮細胞の培養に汎用され
る培養液を用いることができる。

液体によって内皮細胞の表面にせん断応力を負荷した後
に、新しい該液体で内皮細胞表面を洗浄することが好ま
しい。その理由は、せん断応力によって内皮細胞から、
血液戒分である血小板や血漿蛋白を活性化する物質が放
出されている可能性が高いためである。それらの′＃質
については現段階においては特定されてはいないが、ご
く微量で血液成分を活性化する可能性が高いため、せん
断応力の負荷後には、内皮細胞表面からこれらの物質を
十分に除去しておく必要があると考えられる。

本発明における人工血管内面の内皮細胞表面にせん断応
力を負荷するための装置は、特に限定されるものではな
く、血液ポンプを用いてチューブ内に液体を還流するな
どの方法を用いることができる。このとき血流計などに
よって測定した流速とチューブの内径とから常法に従っ
てせん断速度を求めることが可能である。

以下、実施例によって本発明の有効性を詳細に軟質塩化
ビニル樹脂（住友ベークライト■製、スミコンＶＭＩ　
１７０Ｇ−５５）から成形した内径３ｍ，外径４ｎ、長
さ５Ｃ１１のチューブの内面に、雑種戒犬（ａ性、７ｋ
ｇ）の大動脈から物理的剥離法によって採取した血管内
皮細胞を、単層に培養した。

培養液としてはダルベッコＭＥ！Ｍ（Ｍｉｎｉｍｕｍ　
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉａｍ）に１０％の牛血清
を添加したものを用いた．また、チューブはアルゴンプ
ラズマによる低温プラズマ処理を３分間行った後にＥＯ
Ｇ　（エチレンオキサイドガス）で滅菌して使用した。

１×１　０　’　ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に調製した内
皮細胞を直径６０鴫のプラスチック製シャーレに前記の
チュ−０度ずつ回転させ合計二回転後にシャーレより取
り出し、チューブの外側に接着した内皮細胞をポリスマ
ン（細胞剥離用具）でかき取り、別の培養シャーレに静
かに移した．そのまま７日間培養後に、チューブ内画に
ほぼ内皮細胞がコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）
になったことを顕微鏡下に確認した。

次いで、別途に威型した内径４Ｍ、外径５閣、長さ約５
０ＣＩ１の前記と同じ塩化ビニル樹脂製のチューブを、
内皮細胞を培養したチューブの両端に接続した．この一
連のチューブに、培養液を１００＋＊１人れたガラス製
のリザーバとベリスクポンプ（血液ポンプ）を直列に接
続し、内皮細胞表面の平均せん断速度が約５００１／ｓ
になるようにしてポンプを３０分間回転させた． その後、クリーンベンチ内で内皮細胞を培養したチュー
ブを取り外し、１５創の培養液を入れた遠沈管内でビン
セットを用いて、チューブを静かに洗浄した。

このようにして内皮細胞を培養して人工血管と、対照と
してせん断応力を負荷せず内皮細胞を静置培養しただけ
のチューブとを、ハロセン麻酔下に一頭の雑種戒犬（雄
性、１０ｋｇ）の左右の頚静脈にそれぞれ一本ずつ埋人
した。せん断応力を負荷したチューブはその応力の方向
に血液が流れるように注意して埋入した。

一ケ月経過後に各チューブを取り出し、生理的食塩水で
静かにチューブを洗浄後、観察した。せん断応力を負荷
しなかったチューブ内腔は特に流入部が血栓でほとんど
閉塞しており、下流部では大半の内皮細胞の表面にフィ
プリン層が形成されていた．しかしながら、せん断応力
を負荷したチューブは、血液流入部にごく僅かの血餅の
付着が認められたに過ぎず、その他の部分には全く血液
戒分の付着は認められなかった．また、せん断応力を負
荷した方のチューブを２％グルタールアルデヒドを含む
燐酸緩衝液にて２４時間固定し臨界点乾燥した後、金蒸
着して電子顕微鏡にてその表面を観察した。チューブ両
端の一部には、内皮細胞が剥離した形跡があり血小板と
赤血球及びフィブリン状のものの付着がみられたが、そ
れ以外の大半の内皮細胞は血流の方向にわずかに配向し
たような形態を有し、その表面には何等付着物を認めな
かった。本発明の製造方法にて作威した人工血管は、ま
だ両端面に若干の問題点があるものの、単に内皮細胞を
培養しただけのものに比較して格段に優れた人工血管で
あることが明白である。

実施例２及び比較例２ 市販の人工血管（Ｇｏｒｅ社製、Ｇｏｒｅ−ｔｅｘ”　
、内径約３＋ｍｓ，長さ１０ＣＩＩＩに切断）に０．０
１％のコラーゲン（＠高研、タイブＩＶ）をコーティン
グ後、クリーンベンチ内で紫外線照射しながら１２時間
風乾することを３回繰り返した． 滅菌した小さなクリップで該人工血管の片端を挟み、実
施例１と同様にしてビーグル犬の大動脈から得た血管内
皮細胞を５　Ｘ　１　０’／＋Ｉｌｌの濃度で人工血管
の内側に注入し、人工血管内腔に空気が入らないように
注意して他端もクリップで挟んだ。

これを人工血管がたるまずまっすぐになるようにして５
０ｏ＋１の遠沈管に入れ、インキュベータ内で１０分間
培養後、１８０度回転して再びｌＯ分間培養した。その
後、遠沈管から人工血管を取り出し、両端のクリップを
外して、クリップをはさんでいた両端部分各々約■０程
度をクリーンベンチ内で切断して取り除いた。残りの人
工血管を直ちに直径６０ｍのシャーレ内に入れ４日間培
養した．培養液は実施例■と同様のものを用いた。

培養後、実施例ｌと基本的には同様にして、該人工血管
の内面に１　０　０　０　１／ｓ程度のせん断速度にな
るように培養液を１５分間還流した後、新しい培養液で
内腔面を軽く洗浄した．このようにして得た、本発明に
おける人工血管を、同サイズの市販の人工血管（Ｇｏｒ
ｅ社製Ｇｏｒｅｔｅｘ”　）そのものと性能を比較した
。各々の人工血管を、ハロセン麻酔下に一頭のビーグル
犬（ａ製、９ｋｇ）の頚動脈から頚静脈に左右交差して
バイパスさせるようにして移植し、約三ケ月後に摘出し
た。

その結果、市販の人工血管は下流部の内腔表面には電顕
レベルでの新生した内皮細胞様の細胞が認められたもの
の、流入部付近から中央部にかけてはかなり肥厚した層
状の擬内膜の形戒が認められ、内腔がかなり細くなって
閉塞寸前の状態であった．しかしながら、本発明の製造
方法で作成した人工血管は、流入部に若干の偽内膜の形
戒が認められたものの、全体としてはほぼ元の内腔の径
を保持したまま完全に開存しており、本発明がきわめて
有効であることが認められた． 〔発明の効果〕 このようにして作成した人工血管は、生体内に移植して
血液の流れに曝されても、正常な機能を有しながら、か
つ血液戒分をほとんど活性化させることなく、長期に安
定した血管の開存性を有するという、従来にないきわめ
て優れたものである．本発明は、静置培養した血管内皮
細胞にせん断応力を負荷することによって血液威分を活
性化する物質が放出される可能性を見出したことに基づ
いているが、重要なことは前記物質の放出が一過性であ
ることを見出した点にある．従って、前記物質をせん断
応力の負荷及び洗浄によって除去するという製法は、従
来に全くなかった新規な優れた人工血管の製造方法であ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）チューブ状の基材の内面の血管内皮細胞を単層培
   養した後、該チューブの内側の内皮細胞表面に液体を還
   流させて、せん断応力を負荷することを特徴とする人工
   血管の製造方法。