CN103285431A - 一种抗凝血丝素材料及其制备方法 - Google Patents

一种抗凝血丝素材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗凝血丝素材料,其组分包括丝素蛋白,还包括水蛭素;该抗凝血丝素材料的制备方法,步骤如下:(1)制备浓度为4~20%的丝素蛋白溶液;(2)将N-羟基丁二酰亚胺溶解于步骤(1)所述的丝素蛋白溶液中,搅拌均匀后静置,再加入水蛭素搅拌均匀得到混合溶液;(3)将步骤(2)得到的混合溶液固化后,用甲醇或乙醇溶液浸渍处理,再浸泡于去离子水中,最后取出风干得到抗凝血丝素材料。本发明优点在于,与未加入水蛭素的丝素材料相比,该含有微量水蛭素的丝素材料抗凝血性能显著提高,且抗凝血丝素材料中的水蛭素能直接与活化的丝素蛋白通过酰胺键稳定地共价结合,可更持久地发挥抗凝效果。

Description

一种抗凝血丝素材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种抗凝血材料及其制备方法,尤其是一种抗凝血丝素材料及其制备方法。
背景技术
心血管疾病已成为人类的头号杀手,严重威胁着人类身体健康。人工血管等与血液接触材料是目前生物医用材料及临床最迫切需求的材料。如目前医学上应用的人工血管产品主要是由涤纶、膨体聚四氟乙烯等合成材料制成的,在研发大中口径人工血管方面具有极大的应用,但这些合成材料细胞相容性差,不利于内皮化,容易形成血栓,远期通畅率较差,影响组织愈合。因此需要开发一种组织相容性好、与组织修复匹配的人工血管材料。
家蚕蚕丝是由家蚕合成与分泌的天然动物蛋白,来源广泛,丝素蛋白即丝芯蛋白,是蚕丝中主要的组成部分,约占蚕丝质量的70%~80%,其余为丝胶蛋白及少量的茧丝蜡、灰分、碳水化合物等。可通过蚕丝脱胶获取丝素。丝素蛋白具有良好的生物相容性,由20种人体可吸收的氨基酸组成,最终降解产物为氨基酸或小肽,易被细胞吸收或吞噬,不会引起明显的免疫反应。已有大量的文献研究表明丝素蛋白材料能够支持多种细胞的生长,在组织工程材料研究方面越来越深入,并取得了突破性的进展,近来,应用于血管组织工程上也越来越受到关注,我们已经开展了多年的蚕丝人工血管的构建及其生物学性能研究。
对于与血液直接接触的生物材料来说,不仅要具有良好的生物相容性,最重要是血液相容性,其中最主要的问题在于血液与材料接触后会产生凝固,因此抗凝血性研究成为了血液相容性研究的焦点。丝素蛋白用于构建小口径人工血管具有广阔的应用前景,为了提高丝素材料的抗凝血性能,国内外一些研究人员也关注到了改善丝素蛋白材料的抗凝血性能研究。
在本发明作出之前,对丝素蛋白的抗凝血改性主要报导了接枝具有抗凝的高分子及硫酸化或肝素化方法。如She等将肝素在温和的条件下加入丝素/壳聚糖支架中,增强了抗凝性(Polymer International, 2010, 59(1):55-61);Liu等利用静电纺丝技术将氯磺酸处理过的丝素蛋白制成丝素纳米支架,硫酸化纳米丝素支架的抗凝血性显著增强(Biomaterials, 2011, 32(15):3784-3793);Wang等利用静电纺丝技术制备了肝素改性丝素纳米材料,体外凝血测试结果表明改性后丝素纳米材料的抗凝血性远高于纯丝素(International Journal of Biological Macromolecules,2011, 48(2):345-353);用氯磺酸制备的硫酸化丝素蛋白的抗凝血活性要比硫酸制备的硫酸化丝素大大提高(Biomaterials, 2004, 25(3):377-383),但远远不及肝素。肝素改性丝素蛋白材料抗凝血性研究已存在知识产权(如抗凝血真皮支架的制备,申请号:CN200910223207.4;纳米纤维人工血管及制备方法,申请号:CN200910228843.6等),所以引入肝素是本发明作出前丝素材料抗凝血性改性的主要方法,但肝素属于一种凝血酶间接抑制剂,抗凝作用要依赖抗凝血酶和特定的辅因子,所以即使材料中共混或键合的肝素不一定能或都能发挥抗凝作用。
发明内容
本发明目的是:提供一种含有具有直接抗凝血功能成分的抗凝血丝素材料及其制备方法。
本发明的技术方案是:一种抗凝血丝素材料,其组分包括丝素蛋白,其特征在于,还包括水蛭素,该水蛭素直接与活化的丝素蛋白通过酰胺键共价结合。
优选地,所述水蛭素与所述丝素蛋白的质量比为0.5 ~20:10000。
更优选地,所述水蛭素与所述丝素蛋白的质量比为2~5:10000。
一种抗凝血丝素材料的制备方法,步骤如下:
(1)制备浓度为4~20%的丝素蛋白溶液;
(2)将N-羟基丁二酰亚胺溶解于步骤(1)所述的丝素蛋白溶液中,搅拌均匀后静置,再加入水蛭素搅拌均匀得到混合溶液;
(3)将步骤(2)得到的混合溶液固化后,用甲醇或乙醇溶液浸渍处理,再浸泡于去离子水中,最后取出风干得到抗凝血丝素材料。
优选地,所述步骤(1)中采用蚕丝或茧壳进行脱胶、溶解后,灌注于透析袋内,然后用去离子水透析,最后过滤浓缩得到浓度为4~20%的丝素蛋白溶液。
优选地,所述步骤(2)中N-羟基丁二酰亚胺、水蛭素分别与丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量比为:
N-羟基丁二酰亚胺:丝素蛋白=1000:10000;
水蛭素:丝素蛋白=0.5~20:10000。
优选地,步骤(3)中所述的混合溶液固化方法为于-80℃~-20℃温度下冷冻固化、置于通风橱内风干固化、湿纺纺丝固化、静电纺丝固化、静电分化固化或高温聚集固化。
更优选地,所述水蛭素与丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量比为2~5:10000。
本发明的优点是:
1.通过本发明制备的抗凝血丝素材料含有具有直接抑制凝血酶功能的水蛭素,水蛭素是一种不需要依赖特定的因子而直接发挥抗凝功效的抗凝试剂,且抗凝血丝素材料中的水蛭素能直接与活化的丝素蛋白通过酰胺键稳定地共价结合,可更持久地发挥抗凝效果;
2.通过本发明制备的抗凝血丝素材料为各种形貌的与血液直接接触的植入物(如人工血管、动脉支架、人工心脏瓣膜等)或医疗器械提供新材料。
具体实施方式
实施例一:一种抗凝血丝素材料的制备方法如下,将家蚕生丝或烘干分层的茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2 %的碳酸钠水溶液中,于98~100℃浸泡处理三次,每次处理30 分钟,然后用去离子水将家蚕生丝或茧壳充分清洗干净并拉松后,置于60℃烘箱内干燥,得到脱胶后的家蚕丝素纤维;称取脱胶后的家蚕丝素纤维按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩尔比1:2的氯化钙-乙醇的水溶液中,70℃溶解2小时得家蚕丝素溶解液;然后将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内,该透析袋壁为半透膜制成,截留分子量为12.0~16.0 kDa范围,将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内,每隔2小时更换新的去离子水,持续透析4天,得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液,并调整透析后的丝素蛋白溶液浓度为8%。
向上述丝素蛋白溶液中添加N-羟基丁二酰亚胺,该N-羟基丁二酰亚胺和丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量比为1:10,搅拌均匀后放置10分钟,然后加入水蛭素,该水蛭素和丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量比为0.5:10000,混合均匀后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中,于-80℃~-20℃温度下冷冻2~24小时后干燥,取出置于盛有80%乙醇的容器中浸渍2小时,然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡3天,每隔2小时更换一次容器内的去离子水,3天后取出风干,得到抗凝血丝素材料。
将制备好的抗凝血丝素材料剪成合适大小的小圆片或小方形状,按照溶血率测试方法测定该材料的溶血性能,取生理盐水稀释的新鲜血液与抗凝血丝素材料动态接触,测得该抗凝血丝素材料的溶血率为0.106%,完全符合非溶血性材料的标准(0-5%)。
将制备好的抗凝血丝素材料剪成合适大小的小圆片或小方形状,将新鲜血液离心收集富集血小板血浆,接种于抗凝血丝素材料上,测得血小板粘附率为未添加水蛭素(实施例六)的80%,减少了20%;血浆复钙时间为229秒。
实施例二:一种抗凝血丝素材料的制备方法,采用实施例一中的方法制备浓度为8%的丝素蛋白溶液,向该丝素蛋白溶液中添加N-羟基丁二酰亚胺,该N-羟基丁二酰亚胺和丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量比为1:10,搅拌均匀后放置10分钟,然后加入水蛭素,该水蛭素和丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量比为0.5:10000,混合均匀后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中,并将该聚苯乙烯平皿置于通风橱内风干固化,取出置于盛有80%乙醇的容器中浸渍2小时,然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡3天,每隔2小时更换一次容器内的去离子水,3天后取出风干,得到抗凝血丝素材料。
将制备好的抗凝血丝素材料剪成合适大小的小圆片或小方形状,按照溶血率测试方法测定材料的溶血性能,取生理盐水稀释的新鲜血液与抗凝血丝素材料动态接触,测得抗凝血丝素材料的溶血率为0.105%,完全符合非溶血性材料的标准(0-5%)。
将制备好的抗凝血丝素材料剪成合适大小的小圆片或小方形状,将新鲜血液离心收集富集血小板血浆,接种于抗凝血丝素材料上,测得血小板粘附率为未添加水蛭素(实施例六)的78%,减少了22%;血浆复钙时间为231秒,比实施例六的对照稍有延长。
实施例三:一种抗凝血丝素材料的制备方法,采用实施例一中的方法制备浓度为8%的丝素蛋白溶液,向上述丝素蛋白溶液中添加N-羟基丁二酰亚胺,该N-羟基丁二酰亚胺和丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量比为1:10,搅拌均匀后放置10分钟,然后加入水蛭素,该水蛭素和丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量比为2:10000,混合均匀后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中,于-80℃~-20℃温度下冷冻2~24小时后干燥,取出置于盛有80%乙醇的容器中浸渍2小时,然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡3天,每隔2小时更换一次容器内的去离子水,3天后取出风干,得到抗凝血丝素材料。
将制备好的抗凝血丝素材料剪成合适大小的小圆片或小方形状,按照溶血率测试方法测定该材料的溶血性能,取生理盐水稀释的新鲜血液与抗凝血丝素材料动态接触,测得该抗凝血丝素材料的溶血率为0.125%,完全符合非溶血性材料的标准(0-5%)。
将制备好的抗凝血丝素材料剪成合适大小的小圆片或小方形状,将新鲜血液离心收集富集血小板血浆,接种于抗凝血丝素材料上,测得血小板粘附率为未添加水蛭素(实施例六)的67%,减少了33%;血浆复钙时间为241秒,长于实施例六的对照。
实施例四:一种抗凝血丝素材料的制备方法,采用实施例一中的方法制备浓度为8%的丝素蛋白溶液,向上述丝素蛋白溶液中添加N-羟基丁二酰亚胺,该N-羟基丁二酰亚胺和丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量比为1:10,搅拌均匀后放置10分钟,然后加入水蛭素,该水蛭素和丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量比为4:10000,混合均匀后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中,于-80℃~-20℃温度下冷冻2~24小时后干燥,取出置于盛有80%乙醇的容器中浸渍2小时,然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡3天,每隔2小时更换一次容器内的去离子水,3天后取出风干,得到抗凝血丝素材料。
将制备好的抗凝血丝素材料剪成合适大小的小圆片或小方形状,按照溶血率测试方法测定该材料的溶血性能,取生理盐水稀释的新鲜血液与抗凝血丝素材料动态接触,测得该抗凝血丝素材料的溶血率为0.136%,完全符合非溶血性材料的标准(0-5%)。
将制备好的抗凝血丝素材料剪成合适大小的小圆片或小方形状,将新鲜血液离心收集富集血小板血浆,接种于抗凝血丝素材料上,测得血小板粘附率为未添加水蛭素(实施例六)的51%,减少了49%;血浆复钙时间为256秒,长于实施例六的对照。
实施例五:一种抗凝血丝素材料的制备方法,采用实施例一中的方法制备浓度为8%的丝素蛋白溶液,向该丝素蛋白溶液中添加N-羟基丁二酰亚胺,该N-羟基丁二酰亚胺和丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量比为1:10,搅拌均匀后放置10分钟,然后加入水蛭素,该水蛭素和丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量比为4:10000的水蛭素,混合均匀后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中,并将该聚苯乙烯平皿置于通风橱内风干固化,取出置于盛有80%乙醇的容器中浸渍2小时,然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡3天,每隔2小时更换一次容器内的去离子水,3天后取出风干,得到抗凝血丝素材料。
将制备好的抗凝血丝素材料剪成合适大小的小圆片或小方形状,按照溶血率测试方法测定材料的溶血性能,取生理盐水稀释的新鲜血液与抗凝血丝素材料动态接触,测得抗凝血丝素材料的溶血率为0.127%,完全符合非溶血性材料的标准(0-5%)。
将制备好的抗凝血丝素材料剪成合适大小的小圆片或小方形状,将新鲜血液离心收集富集血小板血浆,接种于抗凝血丝素材料上,测得血小板粘附率为未添加水蛭素(实施例六)的53%,减少了47%;血浆复钙时间为248秒,长于实施例六的对照。
实施例六:一种丝素材料的制备方法,采用实施例一中的方法制备浓度为8%的丝素蛋白溶液,将该丝素蛋白溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中,于-80℃~-20℃温度下冷冻2~24小时后干燥,或者倒入一平整的聚苯乙烯平皿中,并将该聚苯乙烯平皿置于通风橱内风干固化,取出置于盛有80%乙醇的容器中浸渍2小时,然后取出放入盛有去离子水的容器内浸泡3天,每隔2小时更换一次容器内的去离子水,3天后取出风干,得到丝素材料。
将制备好的丝素材料剪成合适大小的小圆片或小方形状,按照溶血率测试方法测定该材料的溶血性能,取生理盐水稀释的新鲜血液与该材料接触,以生理盐水稀释的血液为阴性对照、以蒸馏水稀释的血液为阳性对照。
将冻干或风干好的丝素材料剪成合适大小的小圆片或小方形状,将新鲜血液离心收集富集血小板血浆,接种于丝素材料上,测定血小板粘附率;测得血浆复钙时间分别为223s和226s,正常人血浆复钙时间约3min,材料与血液接触时会刺激诱发血小板聚集,所以生物材料的血浆复钙时间应该比正常人血浆复钙时间长些,在适度范围内,血浆复钙时间越长,抗凝血效果越好。
综上所述,本发明提供的抗凝血丝素材料属于非溶血性材料,具有比未用水蛭素改性的丝素材料更好的抵抗血小板粘附能力,当水蛭素添加量仅为丝素蛋白质量的万分之四左右时,抵抗血小板粘附能力提高了近1倍,并适度延长了血浆复钙时间,说明本发明制备的含微量水蛭素丝素蛋白材料显著地提高了丝素的抗凝血性能。
抗凝血性能不是越高越好,不凝血恰恰是与易形成血栓同样危害生命的一种疾病,以上所述,仅为发明的具体实施方式。本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种抗凝血丝素材料,其组分包括丝素蛋白,其特征在于,还包括水蛭素,该水蛭素直接与活化的丝素蛋白通过酰胺键共价结合。
2.根据权利要求1所述的抗凝血丝素材料,其特征在于,所述水蛭素与所述丝素蛋白的质量比为0.5 ~20:10000。
3.根据权利要求2所述的抗凝血丝素材料,其特征在于,所述水蛭素与所述丝素蛋白的质量比为2~5:10000。
4.一种抗凝血丝素材料的制备方法,其特征在于,步骤如下:
(1)制备浓度为4~20%的丝素蛋白溶液;
(2)将N-羟基丁二酰亚胺溶解于步骤(1)所述的丝素蛋白溶液中,搅拌均匀后静置,再加入水蛭素搅拌均匀得到混合溶液;
(3)将步骤(2)得到的混合溶液固化后,用甲醇或乙醇溶液浸渍处理,再浸泡于去离子水中,最后取出风干得到抗凝血丝素材料。
5.根据权利要求4所述的抗凝血丝素材料的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中采用蚕丝或茧壳进行脱胶、溶解后,灌注于透析袋内,然后用去离子水透析,最后过滤浓缩得到浓度为4~20%的丝素蛋白溶液。
6.根据权利要求4所述的抗凝血丝素材料的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中N-羟基丁二酰亚胺、水蛭素分别与丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量比为:
N-羟基丁二酰亚胺:丝素蛋白=1000:10000;
水蛭素:丝素蛋白=0.5~20:10000。
7.根据权利要求4所述的抗凝血丝素材料的制备方法,其特征在于,步骤(3)中所述的混合溶液固化方法为于-80℃~-20℃温度下冷冻固化、置于通风橱内风干固化、湿纺纺丝固化、静电纺丝固化、静电分化固化或高温聚集固化。
8.根据权利要求6所述的抗凝血丝素材料的制备方法,其特征在于,所述水蛭素与丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量比为2~5:10000。
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