CN105521520B - 一种家蚕丝素止血材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种家蚕丝素止血材料的制备方法,包括以下步骤:1):将家蚕蚕丝或蚕茧进行脱胶、溶解后,灌注于透析袋内并用去离子水透析,过滤浓缩为浓度为4~10%的家蚕丝素蛋白溶液;2):向1)得到的家蚕丝素蛋白溶液中加入亲水性胶黏剂搅拌均匀,‑80℃温度下冷冻24~48小时,取出冷冻干燥,得到丝素蛋白多孔材料;3):向2)得到的丝素蛋白多孔材料中加入氯化钙溶液,冷冻干燥,再用去离子水浸渍去除氯离子,得到家蚕丝素止血材料;本发明的优点在于,具有优良的生物相容性和吸水性,没有细胞毒性,同时稳定地结合钙离子,遇到血液后部分钙离子可以释放出来,具有优异的综合止血性能,且可以制备成各种形貌应用于体内、体外各种止血要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种止血材料的制备方法,尤其是涉及一种家蚕丝素止血材料的制备方法。
背景技术
出血是创伤后的主要症状,出血过多会引起休克,无法控制的出血甚至会导致死亡。因此快速有效的止血是挽救患者的关键。直接压迫、电灼止血和结扎是常用的传统止血方法,随着材料科学的发展,相继出现了止血材料的研究,如高膨胀止血绵、凡士林纱、明胶海绵、藻酸钙敷料、壳聚糖、止血绫、纤维蛋白胶、ɑ-氰基丙烯酸酯类粘合剂、胶原、氧化再生纤维素和氧化纤维素等等,广泛应用在口腔科拔牙、鼻腔出血、神经外、泌尿科和胸外科等。
作为止血材料,不仅要具有快速止血功能,还要具有良好的皮肤亲和性和力学性能。棉纱布和明胶海绵较早应用于止血。几种常用的止血材料中,明胶海绵组织相容性好,无毒副作用,吸收血液后体积膨大有助于堵住伤口,但对神经组织可能产生压迫,而且材料本身没有止血作用;止血纱布也是常用的止血材料,虽然较柔软,但没有弹性,吸湿性小。藻酸钙材料柔软,止血效果较好,但接触水后迅速液化,韧性和弹性较差。
家蚕丝素是由家蚕合成与分泌的天然蛋白质材料,国内外大量的研究表明,丝素蛋白没有明显的细胞毒性,在医药领域中的研究越来越得到关注,如生物传感器、细胞外基质、药物载体、组织修复支架等等。基于良好的生物相容性,以及丝素蛋白肽链分布有大量的亲水性基团有利于快速吸水,所以丝素蛋白将是一种理想的创面止血材料,尤其是制备可吸收的体内创伤或外科手术用止血材料。但目前以丝素蛋白作为基材的止血材料的研究报导极其稀少,如只有蚕丝蛋白表面用蜡涂层粘连伤口止血敷料(International Journalof Biological Macromolecules.2013,55:88-97.)、丝素蛋白/聚丙交酯静电纺丝膜伤口止血材料(International Journal of Pharmaceutics.2014,473:345-355.)和丝素蛋白与明胶双层止血材料(International Journal of Pharmaceutics.2012,436:141-153.)。
发明内容
本发明目的是:提供一种家蚕丝素止血材料的制备方法,采用该方法制得的家蚕丝素止血材料,具有优良的生物相容性和吸水性,没有细胞毒性,同时稳定地结合钙离子,遇到血液后部分钙离子可以释放出来,诱导止血机制,不仅具有优异的综合止血性能,且可以制备成各种形貌应用于体内、体外各种止血要求。
本发明的技术方案是:一种家蚕丝素止血材料的制备方法,具体包括以下步骤:
步骤1):将家蚕蚕丝或蚕茧进行脱胶、溶解后,灌注于透析袋内并用去离子水透析,过滤浓缩为浓度为4~10%的家蚕丝素蛋白溶液;
步骤2):向步骤1)得到的家蚕丝素蛋白溶液中加入亲水性胶黏剂搅拌均匀,-80℃温度下冷冻24~48小时,取出冷冻干燥,得到丝素蛋白多孔材料;
步骤3):向步骤2)得到的丝素蛋白多孔材料中加入氯化钙溶液,冷冻干燥后,再用去离子水浸渍去除氯离子,最后得到家蚕丝素止血材料。
作为优选的技术方案,步骤1)中所述脱胶的具体方法如下:
将家蚕生丝或烘干分层的茧壳按1:50g/mL的浴比放入浓度为0.2%的碳酸钠水溶液中,在98~100℃温度下处理三次,每次处理30分钟,然后用去离子水清洗干净,拉松,置于60℃烘箱内干燥,得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
作为优选的技术方案,步骤1)中所述溶解的具体方法如下:
称取脱胶后的家蚕丝素纤维,按1:10g/mL的浴比溶解于摩尔比为1:2的氯化钙-乙醇的水溶液中,70℃温度下溶解2小时得到家蚕丝素溶解液。
作为优选的技术方案,步骤1)中所得到的家蚕丝素蛋白溶液的浓度为6%。
作为优选的技术方案,步骤2)中所述的亲水性胶黏剂选自聚乙二醇二缩水甘油醚,且所述聚乙二醇二缩水甘油醚的质量为所述家蚕丝素蛋白溶液中丝素蛋白质量的40%。
作为优选的技术方案,步骤3)中所述家蚕丝素止血材料中的钙离子与丝素蛋白的质量比为1:18.5~56。
本发明的优点是:本发明的技术方案和创造性在于利用丝素蛋白带有大量的负电荷静电吸引带有正电荷的钙离子、以及钙离子与丝素蛋白上的羟基形成螯合物的原理,将钙离子结合到丝素蛋白上。遇到血液后,(1)部分钙离子(静电吸引的钙离子)释放到伤口,激活凝血蛋白加速血小板凝血;(2)丝素蛋白多孔材料能迅速吸收血液的水分、提高血液浓度而加速血液凝固;(3)同时吸入丝素蛋白多孔材料中的血液在丝素蛋白螯合的钙离子的诱导下加速血小板凝血。因此,本发明家蚕丝素止血材料兼具物理性止血和生理性止血的综合效果,具有优异的快速止血功能。同时本发明方法制备得到的家蚕丝素止血材料具有很好的柔韧性和可压缩性,不溶解不粘连,可降解。
具体实施方式
实施例一:
步骤1):将家蚕生丝或烘干分层的茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2%的碳酸钠水溶液中,于98~100℃温度下处理三次,每次处理30分钟,然后用去离子水将丝充分清洗干净,拉松,置于60℃烘箱内干燥,得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
步骤2):称取脱胶后的家蚕丝素纤维,按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩尔比1:2的氯化钙-乙醇的水溶液中,70℃温度下溶解2小时得家蚕丝素溶解液。
步骤3):将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内,透析袋壁是半透膜,截留分子量为12.0~16.0kDa范围,将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内,每隔1~2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水,持续透析4天,得到纯化后的家蚕丝素蛋白溶液,最后调整透析后的家蚕丝素蛋白溶液浓度为4%和6%。
步骤4):向家蚕丝素蛋白溶液中添加质量为家蚕丝素蛋白溶液中丝素蛋白质量的40%的聚乙二醇二缩水甘油醚,搅拌均匀,倒入一平整的聚苯乙烯平皿或圆柱形的模具中,-80℃冷冻24~48小时后冻干,得丝素蛋白多孔材料。
步骤5):制备形状相同和重量相等的丝素蛋白多孔材料,分别浸渍于去离子水中测定样品的快速吸水率。浸渍5秒钟,浓度4%制备的丝素蛋白多孔材料的吸水率为370%,浓度6%制备的丝素蛋白多孔材料的吸水率达400%以上,是明胶海绵的2.5倍。浸渍5秒后丝素蛋白多孔材料吸水率基本达到饱和,明胶海绵的吸水率随着时间而增加,15秒钟后超过400%。但是丝素蛋白多孔材料短时间的快速吸水性很好,有利于快速止血。
步骤6):制备形状相同和重量相等的丝素蛋白多孔材料,分别用Instron-3365材料试验机进行压缩性能测试,分别检测从材料表面向下压6mm所用的力。浓度为4%和6%制备的丝素蛋白多孔材料具有较好的可压缩性能。浓度4%制备的丝素蛋白多孔材料的载荷量为2.8N左右,浓度6%制备的丝素蛋白多孔材料的载荷量为4N。明胶海绵为3.5N左右。浓度4%制备的丝素蛋白多孔材料压缩后回复性较差,浓度6%制备的丝素蛋白多孔材料压缩后能完全回复,有利于堵住出血口。
实施例二:
步骤1):将家蚕生丝或烘干分层的茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2%的碳酸钠水溶液中,于98~100℃温度下处理三次,每次处理30分钟,然后用去离子水将丝充分清洗干净,拉松,置于60℃烘箱内干燥,得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
步骤2):称取脱胶后的家蚕丝素纤维,按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩尔比1:2的氯化钙-乙醇的水溶液中,70℃温度下溶解2小时得家蚕丝素溶解液。
步骤3):将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内,透析袋壁是半透膜,截留分子量为12.0~16.0kDa范围,将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内,每隔1~2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水,持续透析4天,得到纯化后的家蚕丝素蛋白溶液,调整透析后的家蚕丝素蛋白溶液浓度为8%和10%。
步骤4):向家蚕丝素蛋白溶液中添加质量为家蚕丝素蛋白溶液中丝素蛋白质量的40%的聚乙二醇二缩水甘油醚,搅拌均匀,倒入一平整的聚苯乙烯平皿或圆柱形的模具中,-80℃冷冻24~48小时后冻干,得丝素蛋白多孔材料。
步骤5):制备形状相同和重量相等的丝素蛋白多孔材料,分别浸渍于去离子水中测定样品的快速吸水率。浸渍5秒钟,浓度8%制备的丝素蛋白多孔材料的吸水率为380%,浓度10%制备的丝素蛋白多孔材料的吸水率为310%,均高于明胶海绵的160%左右。这两种浓度制备的丝素蛋白多孔材料浸渍5秒后的吸水率也基本达到饱和,没有显著性的增加,短时间的快速吸水性很好。
步骤6):制备形状相同和重量相等的丝素蛋白多孔材料分别用Instron-3365材料试验机进行压缩性能测试,分别检测从材料表面向下压6mm所用的力。浓度8%制备的丝素蛋白多孔材料的载荷量为9N左右,浓度10%制备的丝素蛋白多孔材料的载荷量为12N左右,材料偏硬,可压缩性不如4%和6%制备的丝素蛋白多孔材料。
实施例三:
步骤1):将家蚕生丝或烘干分层的茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2%的碳酸钠水溶液中,于98~100℃温度下处理三次,每次处理30分钟,然后用去离子水将丝充分清洗干净,拉松,置于60℃烘箱内干燥,得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
步骤2):称取脱胶后的家蚕丝素纤维,按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩尔比1:2的氯化钙-乙醇的水溶液中,70℃温度下溶解2小时得家蚕丝素溶解液。
步骤3):将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内,透析袋壁是半透膜,截留分子量为12.0~16.0kDa范围,将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内,每隔1~2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水,持续透析4天,得到纯化后的家蚕丝素蛋白溶液。在实施例一和二的基础上,选择家蚕丝素蛋白溶液浓度为6%的多孔材料用于加载钙离子。
步骤4):向家蚕丝素蛋白溶液中添加质量为家蚕丝素蛋白溶液中丝素蛋白质量的40%的聚乙二醇二缩水甘油醚,搅拌均匀,倒入一平整的聚苯乙烯平皿或圆柱形的模具中,-80℃冷冻24~48小时后冻干,得丝素蛋白多孔材料。
步骤5):将丝素蛋白多孔材料制备一定体积的正方形或立方体或圆柱体,测定其饱和吸水能力(体积V),按体积V及氯化钙与丝素蛋白质量比为1:20(钙离子:丝素蛋白≈1:56,质量比)配置氯化钙水溶液,缓慢加入到丝素蛋白多孔材料中,于-80℃冷冻24小时后冻干,再用去离子水浸渍去除氯离子,冷冻干燥得家蚕丝素止血材料。
步骤6):对制备的加载钙离子的丝素蛋白多孔材料进行血液凝固试验,血液凝固试验方法:家蚕丝素止血材料0.05g,加入1ml新鲜兔血血小板血浆,放到37℃水浴至凝固。结果显示:以氯化钙与丝素蛋白质量比为1:20(钙离子:丝素≈1:56,质量比)加载钙离子的丝素蛋白多孔材料处理血浆后的凝固物量与明胶海绵相近,小于藻酸钙,但比没有加载钙离子的丝素蛋白多孔材料增加一倍。丝素蛋白加载钙离子后凝血性能显著提高。
步骤7):对制备的加载钙离子的丝素蛋白多孔材料进行兔耳朵止血试验,兔耳朵止血试验方法:用手术刀在兔耳部密集分布有血管部位划开皮肤,伤口均为1cm,深度相同,迅速将材料覆盖于伤口处,直至伤口处无血液再流即为止血,记录止血时间。结果显示:以氯化钙与丝素蛋白质量比为1:20(钙离子:丝素≈1:56,质量比)加载钙离子的丝素蛋白多孔材料止血时间为38s,与明胶海绵38s相同,比藻酸钙24s时间长,比没有加载钙离子的丝素蛋白多孔材料的49s短得多。丝素蛋白加载钙离子后凝血性能明显提高。
实施例四:
步骤1):将家蚕生丝或烘干分层的茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2%的碳酸钠水溶液中,于98~100℃温度下处理三次,每次处理30分钟,然后用去离子水将丝充分清洗干净,拉松,置于60℃烘箱内干燥,得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
步骤2):称取脱胶后的家蚕丝素纤维,按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩尔比1:2的氯化钙-乙醇的水溶液中,70℃温度下溶解2小时得家蚕丝素溶解液。
步骤3):将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内,透析袋壁是半透膜,截留分子量为12.0~16.0kDa范围,将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内,每隔1~2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水,持续透析4天,得到纯化后的家蚕丝素蛋白溶液。在实施例一和二的基础上,选择家蚕丝素蛋白溶液浓度为6%的多孔材料用于加载钙离子。
步骤4):向家蚕丝素蛋白溶液中添加质量为家蚕丝素蛋白溶液中丝素蛋白质量的40%的聚乙二醇二缩水甘油醚,搅拌均匀,倒入一平整的聚苯乙烯平皿或圆柱形的模具中,-80℃冷冻24~48小时后冻干,得丝素蛋白多孔材料。
步骤5):将丝素蛋白多孔材料制备一定体积的正方形或立方体或圆柱体,测定其饱和吸水能力(体积V),按体积V及氯化钙与丝素蛋白质量比为1:10(钙离子:丝素蛋白≈1:28,质量比)配置氯化钙水溶液,缓慢加入到丝素蛋白多孔材料中,于-80℃冷冻24小时后冻干,再用去离子水浸渍去除氯离子,冷冻干燥得家蚕丝素止血材料。
步骤6):对制备的加载钙离子的丝素蛋白多孔材料进行血液凝固试验,血液凝固试验方法:家蚕丝素止血材料0.05g,加入1ml新鲜兔血血小板血浆,放到37℃水浴至凝固。结果显示:以氯化钙与丝素蛋白质量比为1:10(钙离子:丝素≈1:28,质量比)加载钙离子的丝素蛋白多孔材料处理血浆后的凝固物量为明胶海绵和藻酸钙的2倍和1.6倍,为没有加载钙离子的丝素蛋白多孔材料的4.5倍左右。丝素蛋白加载钙离子后凝血性能显著提高。
步骤7):对制备的加载钙离子的丝素蛋白多孔材料进行兔耳朵止血试验,兔耳朵止血试验方法:用手术刀在兔耳部密集分布有血管部位划开皮肤,伤口均为1cm,深度相同,迅速将材料覆盖于伤口处,直至伤口处无血液再流即为止血,记录止血时间。结果显示:以氯化钙与丝素蛋白质量比为1:10(钙离子:丝素≈1:28,质量比)加载钙离子的丝素蛋白多孔材料止血时间为25s,明显短于明胶海绵,与藻酸钙24s时间相当,为没有加载钙离子的丝素蛋白多孔材料止血时间的一半。丝素蛋白加载钙离子后凝血性能显著提高。
实施例五:
步骤1):将家蚕生丝或烘干分层的茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2%的碳酸钠水溶液中,于98~100℃温度下处理三次,每次处理30分钟,然后用去离子水将丝充分清洗干净,拉松,置于60℃烘箱内干燥,得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
步骤2):称取脱胶后的家蚕丝素纤维,按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩尔比1:2的氯化钙-乙醇的水溶液中,70℃温度下溶解2小时得家蚕丝素溶解液。
步骤3):将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内,透析袋壁是半透膜,截留分子量为12.0~16.0kDa范围,将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内,每隔1~2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水,持续透析4天,得到纯化后的家蚕丝素蛋白溶液。在实施例一和二的基础上,选择家蚕丝素蛋白溶液浓度为6%的多孔材料用于加载钙离子。
步骤4):向家蚕丝素蛋白溶液中添加质量为家蚕丝素蛋白溶液中丝素蛋白质量的40%的聚乙二醇二缩水甘油醚,搅拌均匀,倒入一平整的聚苯乙烯平皿或圆柱形的模具中,-80℃冷冻24~48小时后冻干,得丝素蛋白多孔材料。
步骤5):将丝素蛋白多孔材料制备一定体积的正方形或立方体或圆柱体,测定其饱和吸水能力(体积V),按体积V及氯化钙与丝素蛋白质量比为3:20(钙离子:丝素蛋白≈1:18.5,质量比)配置氯化钙水溶液,缓慢加入到丝素多孔材料中,于-80℃冷冻24小时后冻干,再用去离子水浸渍去除氯离子,冷冻干燥得家蚕丝素止血材料。
步骤6):对制备的加载钙离子的丝素蛋白多孔材料进行血液凝固试验,血液凝固试验方法:家蚕丝素止血材料0.05g,加入1ml新鲜兔血血小板血浆,放到37℃水浴至凝固。结果显示:以钙离子与丝素蛋白质量比约为1:18.5加载钙离子的丝素蛋白多孔材料处理血浆后的凝固物量为明胶海绵和藻酸钙的2.6倍和2.1倍,为没有加载钙离子的丝素蛋白多孔材料的5.7倍左右。丝素蛋白加载钙离子后凝血性能显著提高。
步骤7):对制备的加载钙离子的丝素蛋白多孔材料进行兔耳朵止血试验,兔耳朵止血试验方法:用手术刀在兔耳部密集分布有血管部位划开皮肤,伤口均为1cm,深度相同,迅速将材料覆盖于伤口处,直至伤口处无血液再流即为止血,记录止血时间。结果显示:以钙离子与丝素蛋白质量比约为1:18.5加载钙离子的丝素蛋白多孔材料止血时间为24s,明显短于明胶海绵,与藻酸钙24s时间相当,为没有加载钙离子的丝素蛋白多孔材料止血时间的一半,与以钙离子与丝素蛋白质量比约为1:28加载钙离子的丝素蛋白多孔材料变化不大。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (2)
1.一种家蚕丝素止血材料的制备方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
步骤1):将家蚕蚕丝或蚕茧进行脱胶、溶解后,灌注于透析袋内并用去离子水透析,过滤浓缩为浓度为4~10%的家蚕丝素蛋白溶液;
其中脱胶的具体方法如下:将家蚕生丝或烘干分层的茧壳按1:50g/mL的浴比放入浓度为0.2%的碳酸钠水溶液中,在98~100℃温度下处理三次,每次处理30分钟,然后用去离子水清洗干净,拉松,置于60℃烘箱内干燥,得到脱胶后的家蚕丝素纤维;
其中溶解的具体方法如下:称取脱胶后的家蚕丝素纤维,按1:10g/mL的浴比溶解于摩尔比为1:2的氯化钙-乙醇的水溶液中,70℃温度下溶解2小时得到家蚕丝素溶解液;
步骤2):向步骤1)得到的家蚕丝素蛋白溶液中加入亲水性胶黏剂搅拌均匀,-80℃温度下冷冻24~48小时,取出冷冻干燥,得到丝素蛋白多孔材料,其中所述的亲水性胶黏剂选自聚乙二醇二缩水甘油醚,且所述聚乙二醇二缩水甘油醚的质量为所述家蚕丝素蛋白溶液中丝素蛋白质量的40%;
步骤3):向步骤2)得到的丝素蛋白多孔材料中加入氯化钙溶液,冷冻干燥后,再用去离子水浸渍去除氯离子,最后得到家蚕丝素止血材料,所述家蚕丝素止血材料中的钙离子与丝素蛋白的质量比为1:18.5~56。
2.根据权利要求1所述的家蚕丝素止血材料的制备方法,其特征在于,步骤1)中所得到的家蚕丝素蛋白溶液的浓度为6%。
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