DE69307305T2 - Mit fibrin beschichtete polymeroberfläche - Google Patents
Mit fibrin beschichtete polymeroberflächeInfo
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
- Arterielle Verschlußkrankheit wird üblicherweise durch Legen eines Bypasses für das verschlossene Gefäß behandelt. Die erfolgreichste Behandlung wird durch die Verwendung körpereigener Venentranspiantate erzielt. Wenn Vene jedoch nicht verfügbar ist, wird sie durch synthetische Transplantate ersetzt, die aus solchen Materialien wie gerecktem Tetrafluorethylen oder Polyethylenterephthalat hergestellt sind.
- Die chirurgische Anwendung synthetischer Gefäßimplantate mit kleinem Durchmesser für mittlere oder kleine Gefäßbypasse ist beschränkt durch häufigen Gefäßverschluß aufgrund der thrombogenen Natur gegenwärtig verfügbarer Transplantatmaterialien. In kleinen Gefäßtransplantaten ist der Blutdurchfluß verringert und es tritt eine schnelle Adsorption und Akkumulation von Blutproteinen auf der Transplantatoberfläche auf. Kurz nach der Implantation in einen Patienten heilt die luminale Seite eines prothetischen Gefäßtransplantats durch die Bildung einer Oberfläche aus Fibrin, die als die Pseudointima bezeichnet wird. Thrombin bindet sich an diese Fibrin-Pseudointima, wo es zu Blutplättchenaktivierung und der Bildung von an Blutplättchen reichen Thromben beitragen kann. Gebundenes Thrombin kann auch zu weiterer Fibrin-Akkretion führen, die ihrerseits zu distaler Embolie führt.
- Das Beimpfen von Gefäßtransplantaten mit Endothelzellen ist als eine Lösung für das Problem der Thrombogenität vorgeschlagen worden (im überblick dargestellt von Mosquera und Goldman, Br. J. Surg. 78: 656-660, 1991). Obgleich das endotheliale Beimpfen von Transplantaten vor einem experimentellen Hintergrund nützliche Ergebnisse gezeigt hat, ist die Technologie nicht bis zu dem Punkt fortgeschritten, daß beimpfte Transplantate, die für Routineanwendung geeignet sind, hergestellt werden können.
- EP-A-366 546 offenbart medizinische Materialien, die mit einer polymerisierten Proteinschicht beschichtet sind.
- C.A. 107, 233 225 beschreibt biolegisierte Polymere für kardiovaskuläre Anwendungen.
- Es besteht ein deutliches Bedürfnis in der Technik nach biologisch verträglichen, synthetischen Materialien mit verringerter Thrombogenität. Solche Materialien sollten gegenüber der Abscheidung von Blutproteinen und dem Anhaften von Blutplättchen resistent sein. Diese Materialien wären nützlich als Gefäßtransplantate, synthetische Herzklappen, künstliche Organe und bei jeder prothetischen Anwendung, bei der das Material Blut ausgesetzt sein wird und ein Potential für Thrombogenese besteht. Die vorliegende Erfindung liefert solche Materialien und Verfahren zur Herstellung der Materialien. Materialien, die gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt sind, sind auch nützlich als experimentelle Modelle beim Studium thrombogener und fibrinolytischer Prozesse.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen polymerer Materialien mit Fibrinogen und Fibrin. In einer Ausführungsform ist das polymere Material Polyethylen, Polyethylenterephthalat oder gerecktes Polytetrafluorethylen und kann in der Form eines Gefäßtransplantates vorliegen.
- Gemäß einem Aspekt der. Erfindung wird ein polymeres Material. in einer Fibrinogen-Lösung bei einer Temperatur von wenigstens 56ºC, aber weniger als 100ºC, vorzugsweise etwa 70ºC, inkubiert, um ein mit Fibrinogen beschichtetes Material herzustellen. In einer Ausführungsform enthält die Lösung zwischen 0,5 und 3,0 mg/ml Fibrinogen, vorzugsweise etwa 1 mg/ml Fibrinogen. In einer anderen Ausführungsform ist das Fibrinogen Humanfibrinogen.
- Gemäß einem verwandten Aspekt der Erfindung wird ein mit Fibrinogen beschichtetes polymeres Material, das hergestellt ist, wie oben offenbart, mit Thrombin behandelt, um Fibrin- Monomere zu erzeugen. In einer Ausführungsform wird diese Behandlung durch Einwirken einer Lösung, die etwa 1 µg/ml Thrombin enthält, auf eine mit Fibrinogen beschichtete Oberfläche durchgeführt. In einer anderen Ausführungsform wird die mit Thrombin behandelte Oberfläche einer zweiten Lösung ausgesetzt, die Faktor XIII und zusätzliches Fibrinogen umfaßt, wodurch das zusätzliche Fibrinogen zu Fibrin umgewandelt und mit der mit Fibrin beschichteten Oberfläche quervernetzt wird. Die Konzentration von Faktor XIII in der zweiten Lösung beträgt vorzugsweise 0,25-5,0 µg/ml. In einer verwandten Ausführungsform umfaßt die zweite Lösung außerdem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Endothelzellen-Wachstumsfaktor, α&sub2;-Macroglobulin, Vitronectin, Fibronectin oder ein zellbindendes Fragment von Fibronectin. In einer anderen Ausführungsform umfaßt die zweite Lösung Endothelzellen. In einer verwandten Ausführungsform wird die quervernetzte mit Fibrin beschichtete Oberfläche mit Endothelzellen beimpft.
- Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin polymere Materialien zur Verfügung, die gemäß den oben offenbarten Verfahren hergestellt sind.
- Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden bei Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen deutlich werden.
- Figur 1 veranschaulicht die Beziehung zwischen der Konzentration an Fibrinogen, das auf einer Oberfläche über thermische Denaturierung abgeschieden ist, und der Konzentration an Fibrinogen in der Ausgangslösung.
- Figur 2 veranschaulicht die Blutplättchen-Adhäsion an nichtbeschichtetem Polyethylen und Polyethylen, das mit thermisch denaturiertem Fibrinogen oder adsorbiertem Fibrinogen beschichtet ist.
- Figur 3 veranschaulicht die Adhäsion von Blutplättchen an Fibrin-Beschichtungen, die unter Verwendung ansteigender Mengen von Faktor XIII hergestellt sind.
- Figur 4 veranschaulicht die Inhibition der Fibrin-Akkretion durch verschiedene gerinnungshemmende Mittel in einem 10-Minuten-Test.
- Figur 5 veranschaulicht die Inhibition der Fibrin-Akkretion durch verschiedene gerinnungshemmende Mittel in einem 30-Minuten-Test.
- Figur 6 veranschaulicht die Wirkung eines synthetischen Hirudin-Derivates auf die Fibrin-Akkretion auf mit Fibrin beschichtetem Polyethylen.
- Figur 7 veranschaulicht die Ergebnisse eines Tests zur Thrombinverschiebung unter Verwendung von mit Fibrin beschichtetem Polyethylen.
- Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Beschichtung einer Oberfläche eines polymeren Materials, wie etwa Polyethylen, Polyethylenterephthalat (z.B. Dacron ) oder gerecktes Polytetrafluorethylen (z.B. Gore-Tex , W.L. Gore, Flagstaff, Arizona), mit Fibrinogen zur Verfügung. Die beschichtete Oberfläche kann mit Thrombin weiterbehandelt werden, gefolgt von Inkubation mit zusätzlichem Fibrinogen in der Gegenwart von Faktor XIII. Mit Fibrin beschichtete Oberflächen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt sind, stellen Substrate für das Wachstum von Endothelzellen, prothetische Einheiten (einschließlich Gefäßtransplantaten) mit verringerter Thrombogenität und Testsysteme für das Studium von Thrombogenese und Fibrinolyse zur Verfügung.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Oberfläche eines polymeren Materials durch ein Verfahren der Wärmedenaturierung mit Fibrinqgen beschichtet. Es ist festgestellt worden, daß die Adhäsion von Fibrinogen an polymeren Oberflächen durch thermische Denaturierung des Fibrinogens bei einer Temperatur, die ausreichend ist, um die D-Domäne von Fibrinogen zu denaturieren, nicht aber die E-Domane, in großem Maße erhöht werden kann. Somit wird Wärmedenaturierung bei einer Temperatur von wenigstens 56º0, aber weniger als 100ºC durchgeführt. Allgemein ist es bevorzugt, eine Temperatur von etwa 70ºC zu verwenden, obgleich die Fachleute auf diesem Gebiet erkennen werden, daß die tatsächliche Temperatur innerhalb des obengenannten Bereiches variiert werden kann, um sie an das bestimmte verwendete Polymer anzupassen. Die Temperatur wird ausreichend hoch sein, um das gesamte Polymer auf wenigstens 56ºC zu erwärmen, ohne das Pqlymer zu schmelzen oder in anderer Weise zu schädigen. Eine derartige Temperaturbestimmung liegt im Bereich der üblichen Fähigkeiten in der Technik. Bei einem typischen Beschichtungsverfahren wird Polyethylenschlauchmaterial mit Methanol abgespült, um jegliche Lipid-Verunreinigungen zu entfernen, gefolgt von einer Spülung in TBS (0,05 M Tris pH 7,4, 0,1 M NaCl). Das abgespülte Schlauchmaterial kann dann in TBS aufbewahrt werden. Das Schlauchmaterial wird abtropfen gelassen und mit einer Lösung von Fibrinogen (0,5-3,0 mg/ml) in einem Puffer mit pH 6,0-8,0, der eine physiologische Konzentration von NaCl enthält (z.B. TBS), gefüllt, anschließend in einen Ofen bei 70ºC für zehn bis dreißig Minuten gegeben. Das Schlauchmaterial wird dann mit 40 Schlauchvolumina TBS gespült.
- Mit Fibrinogen beschichtete Oberflächen, die hergestellt sind, wie oben beschrieben, können durch Behandlung mit Thrombin, Faktor XIII und zusätzlichem Fibrinogen stabilisiert werden. Es ist von den Erfindern festgestellt worden, daß Faktor XIII das abgeschiedene Fibrin stabilisiert, wobei es dieses gegenüber den hohen Fluidscherrate widerstandsfähig macht, denen Gefäßtransplantate unterworfen sind. Die vorliegende Erfindung stellt somit Polymerschläuche mit einer dünnen, gleichformigen Beschichtung aus polymerisiertem Fibrin zur Verfügung, die als ein reproduzierbares Modell von Neointima auf Gefäßtransplantaten dienen kann.
- Um die Fibrinogen-Beschichtung zu stabilisieren, wird die mit Fibrinogen beschichtete Oberfläche, die hergestellt ist, wie oben offenbart, mit α-Thrombin behandelt. In einem typischen Verfahren wird eine Lösung von Human-α-Thrombin (0,5-10 µg/ml) in einer hypotonischen (0,04-0,065 M NaCl) Lösung mit pH 6,0- 8,0 (z.B. 0,025 M Tris, 0,05 M NaCl, pH 7,4) auf die mit denaturiertem Fibrinogen beschichtete Oberfläche bei einer Temperatur von etwa 18ºC bis etwa 37ºC für etwa 5-10 Minuten aufgebracht. Das Thrombin spaltet Fibrinopeptid Avom abgeschiedenen Fibrinogen ab und überführt das Fibrinogen in Fibrin-Monomere. Die Einwirkung einer Lösung, die Fibrinogen und Faktor XIII enthält, auf das resultierende Fibrin führt zur Umwandlung des zusätzlichen Fibrinogens in Fibrin durch Thrombin, das auf der abgeschiedenen Fibrin-Schicht adsorbiert ist. Faktor XIII katalysiert dann die Quervernetzung des Fibrins, was zur Bildung einer dünnen, gleichförmigen Beschichtung aus polymerisiertem Fibrin führt. Im allgemeinen wird eine Fibrinogen-Konzentration von etwa 0,5 bis 5,0 mg/ml in einem physiologischen Puffer (pH 6,0-8,0), der 2 bis 10 mM CaCl&sub2; enthält, vorzugsweise etwa 2 mM CaCl&sub2;, verwendet werden. Faktor XIII wird in einer bevorzugten Konzentration von etwa 0,25 bis 20 µg/ml oder mehr, bevorzugter etwa 0,25 -1,0 µg/ml einbezogen. Auf diese Weise hergestellte Oberflächen stellen ein reproduzierbares Modell für Neointima auf Gefäßtransplantaten zur Verfügung. Die Oberflächen sind stabil, wenn sie, unter Bedingungen hoher Wandscherraten, mit Pufferlösungen, Zellsuspensionen und Plasma perfundiert werden. Oberflächen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, sind nützlich beim Studium von Thrombogenese und Fibrinolyse auf Gefäßtransplantaten.
- Die Dicke der guervernetzten Fibrin-Beschichtung ist proportional zu der Zeit, für die das Schlauchmaterial der Fibrinogen-Faktor- XIII-Lösung ausgesetzt wird. Die Beziehung zwischen Zeit und Beschichtungsdicke für jede bestimmte Oberfläche oder jeden bestimmten Satz von Reaktionsbedingungen kann ohne weiteres empirisch bestimmt werden. In einem typischen Verfahren wird ein segment von mit Fibrinogen beschichtetem Polymerschlauchmaterial mit einer 1 µg/ml-Lösung von Human-α-Thrombin in 0,5x TBS gefüllt und bei etwa 23ºC für etwa fünf Minuten stehengelassen. Das Schlauchmaterial wird dann mit 20 Schlauchvolumina 0,Sx TBS gespült. Das gespülte Schlauchmaterial wird dann mit einer Lösung von 1 mg/ml Fibrinogen in TBS, die 2 mM CaCl&sub2; und 0,5 µg/ml Faktor XIII enthält, gefüllt. Die Mischung wird im Schlauchmaterial belassen, bis die gewünschte Dicke an quervernetztem Fibrin erreicht ist, typischerweise etwa fünf Minuten. Das Schlauchmaterial wird dann ausgiebig mit TBS gespült. Zusätzliche Quervernetzung kann durch weitere Inkubation des gespülten Schlauchmaterials erreicht werden (z.B. 30 Minuten-24 Stunden bei 37ºC). Quervernetzung des Fibrins wird durch Faktor XIII katalysiert, der in der Beschichtung gebunden ist. Die Thrombogenität der mit Fibrin beschichteten Poiymeroberfläche wird durch Erhöhung des Vernetzungsgrades signifikant verringert, da Blutplättchen-Adhä-. sion verringert wird. Diese Testverfahren können verwendet werden, um Reaktionsbedingungen (z.B. Zeit, Temperatur und Proteinkonzentration) für die Herstellung verschiedener Dicken von Fibrinbeschichtungen und verschiedener Vernetzungsgrade zu bestimmen. In einigen Fällen wird es wünschenswert sein, von den bevorzugten Bereichen von Bedingungen, die oben offenbart sind, abzuweichen.
- Mit Fibrin beschichtete Polymeroberflächen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt sind, können mit Endothelzellen beimpft werden. Endothelzellbeimpfung von Gefäßtransplantaten und anderen Oberflächen, die Blut ausgesetzt sind, liefert prothetische Materialien, die aktiv antithrombotisch sind und erhöhte Widerstandsfähigkeit gegenüber Okklusion zeigen. Die Stabilität der Fibrinbeschichtung macht sie zw einem hervorragenden Substrat für Endothelzellbe impfung.
- Endothelzellen werden mit Standardverfahren aus der Umbilicalvene, Rosenvene oder anderen Quellen erhalten. Siehe zum Beispiel Balconi et al., Med. Biol. 64: 231-245, 1986; Ryan et al., Tissue Cell 17: 171-176, 1985; Budd et al., Br J. Surg. 76: ¹²&sup5;9-1261, 1989. Zellen können mit mechanischen oder, vorzugsweise&sub1; enzymatischen Verfahren geerntet werden. Kurz gesagt werden die Venen gespült, um Blut zu entfernen, und mit einer Collagenase-Lösung gefüllt, um die Endothelzellen abzulösen. Die Zellen werden gesammelt und in einem herkömmlichen Medium kultiviert. Zur Beimpfung..werden die Zellen auf der mit Fibrin beschichteten Oberfläche in der Gegenwart von Kulturmedium kultiviert, im allgemeinen bei etwa 37ºC in einer Atmosphäre mit 5% CO&sub2;. Befriedigende Bindung wird im allgemeinen innerhalb von ein bis zwei Stunden erreicht. Alternativ werden kultivierte Endothelzellen zur Faktor XIII/Fibrinogen-Lösung zugegeben, wodurch sie in der Beschichtung eingefangen werden. Das beschichtete Material wird anschließend inkubiert, um zu ermöglichen, daß sich die Zellen reproduzieren.
- In einer Ausführungsform der Erfindung werden zusätzliche Proteine zur Fibrin-Beschichtung zugegeben, um die Endothelzell- Bindung und/oder -Chemotaxis zu verstärken. Proteine, die in dieser Hinsicht geeignet sind, schließen Wachstumsfaktoren ein, wie etwa basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (basischen FGF) und Endothelzellen-Wachstumsfaktor (Gefäßendothelzellen-Wachstumsfaktor), α&sub2;-Macroglobulin, Vitronectin, Fibronectin und Fibronectin-Fragmente, die Bindungsdeterminanten für Endothelzellen enthalten. Die Herstellung dieser Proteine und Proteinfragmente liegt innerhalb des Könnens des Durchschnittsfachmanns auf diesem Gebiet. Siehe zum Beispiel Gospodarowicz et al., U.S. Patents Nos. 4,785,079 und 4,902,782; Obara et al., FEBS Lett. 213: 261-264, 1987; Dufour et al., EMBO J. 7: 2661-2671, 1988; Tischer et al., WO 91/02058; Boel et al., Biochemistry 29: 4081-4087, 1990; Ruoslahti et al., U.S. Patent No. 4,614,517; Pierschbacher et al., U.S. Patent No. 4,589,881; und Suzuki et al., EMBO J. 4: 2519-2524, 1985. Diese Proteine werden im allgemeinen in der Fibrinogen/Faktor XIII-Lösung bei Konzentrationen zwischen etwa 0,5 und 10 µg/ml eingeschlossen sein.
- Fibrinogen wird gemäß bekannten Verfahren hergestellt, wie etwa demjenigen von Straughn et al., Thromb. Diath. Haemorrhag. 16: 198, 1966, unter Verwendung sequentieller β-Alanin-Ausfällung. Weitere Reinigung wird erreicht unter Verwendung von DEAE-Cellulose-Chromatographie (Lawrie et al., Biochem. Soc. Trans. 7: 693-694, 1979). Autologes Fibrinogen, das außerdem Faktor XIII und Fibronectin enthalten kann, kann hergestellt werden, wie offenbart in den U.S. Patents Nos. 4,298,598 und 4,627,879.
- Faktor XIII zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung kann aus Plasma hergestellt werden gemäß bekannten Verfahren, wie etwa denjenigen, die offenbart sind von Cooke und Holbrook (Biochem. J. 141: 79-84, 1974) und Curtis und Lorand (Methods Enzymol. 45: 177-191, 1976), die hierin durch Bezugnahme miteinbezogen sind. Die a&sub2;-Dimerform von Faktor XIII kann aus Placenta hergestellt werden, wie offenbart in U.S. Patents 3,904,751; 3,931,399; 4,597,899 und 4,285,933, die hierin durch Bezugnahme miteinbezogen sind. Es ist jedoch bevorzugt, rekombinanten Faktor XIII zu verwenden, um die Verwendung von aus Blut oder Gewebe gewonnenen Produkten zu vermeiden, die das Risiko einer Krankheitsübertragung tragen, und um Kontamination mit anderen Proteinen zu vermeiden.
- Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Faktor XIII sind in der Technik bekannt. Siehe zum Beispiel Davie et al., EP 268,772 und Grundmann et al., AU-A-69896/87, die hierin durch Bezugnahme in ihrer Ganze miteinbezogen sind. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Faktor XIII-a&sub2;-Dimer zytoplasmatisch in der Hefe Saccharomyces cerevisiae hergestellt, wie in der mitanhängigen United States Patent Application Serial No. 07/741,263 offenbart. Die Zellen werden geerntet und lysiert und ein geklärtes Lysat wird hergestellt. Das Lysat wird durch Anionenaustauschchromatographie bei neutralem bis leicht alkalischem pH unter Verwendung einer Säule aus derivatisierter Agarose, wie etwa DEAE Fast-Flow Sepharose (Pharmacia) oder dergleichen, fraktioniert. Faktor XIII wird anschließend aus dem Säuleneluat durch Konzentration des Eluats und Einstellen des pHs auf 5,2-5,5, wie etwa durch Diafiltration gegen Ammoniumsuccinat-Puffer, ausgefällt. Der Niederschlag wird anschließend gelöst und unter Verwendung herkömmlicher chromatographischer Techniken, wie etwa Gelfiltrations- und Hydrophobie-Wechselwirkungs-Chromatographie, weiter gereinigt.
- Obgleich es bevorzugt ist, das Faktor XIII-a&sub2;-Dimer bei der vorliegenden Erfindung zu verwenden, können andere Zymogen- Formen von Faktor XIII verwendet werden (z.B. a&sub2;b&sub2;-Tetramer) Zymogener Faktor XIII wird durch auf der Fibrinoberfläche vor handenes Thrombin aktiviert. Jedoch kann auch aktivierter Faktor XIII (Faktor XIIIA) verwendet werden.
- Proteine zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung (einschließlich Thrombin, Fibrinogen und Faktor XIII) konnen aus einer Vielzahl von Säugerzellen erhalten werden, wie etwa Mensch, Rind, Schwein und Schaf. Wie von den Fachleuten auf diesem Gebiet anerkannt werden wird, ist es bei prothetischen Anwendungen bevorzugt, Proteine zu verwenden, die mit dem Patienten syngen sind, um das Risiko der Induktion einer Immunantwort zu verringern. Nicht-menschliche Proteine sind besonders nützlich bei der Herstellung von Materialien für Veterinäranwendung oder für Verwendung in experimentellen Modellen.
- Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind nützlich bei der Herstellung von Gefäßtransplantaten, künstlichen Herzklappen, Herzunterstützungseinheiten und anderen prothetischen Einheiten, die Blutdurchfluß ausgesetzt sind. Oberflächen solcher Einheiten werden hergestellt, wie hierin offenbart, und die Einheiten werden gemäß chirurgischen Standardtechniken implantiert. Zusätzlich stellen die mit Fibrinogen beschichteten Polymeroberflächen der vorliegenden Erfindung ein nützliches in-vitro-Modell für das Studium von Fibrin-Akkretion, Blutplättchen-Adhäsion und anderen pHänömenen, die mit dem Versagen von Gefäßtransplantaten in Zusammenhang stehen sowie für Tests potentieller antithrombotischer Mittel zur Verfügung.
- Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung, nicht zur Beschränkung angeboten.
- Polyethylenschlauchmaterial (Intramedic PE240, Innendurchmesser 0,17 cm, Intramedic PE320, Innendurchmesser 0,27 cm, Clay Adams, Parsippany, NJ) wurde mit Methanol gereinigt und mit destilliertem entionisierten Wasser gespült. Die Schläuche wurden über Nacht in TBS (0,05 M Tris pH 7,4, 0,1 M NaCl) inkubiert. Die Schläuche wurden in Längen von 24 cm geschnitten.
- Die Schläuche wurden dann mit Human-Fibrinogen (Grade L, Kabi Vitrum, Stockholm, Schweden) beschichtet. Das Fibrinogen wurde gegen TBS dialysiert und mit DEAE-Cellulose-Chromatographie weiter gereinigt, im wesentlichen wie beschrieben von Lawrie et al. (Biochem. Soc. Trans. 7: 693-694, 1979). Das gereinigte Material war > 96% Thrombin-koagulierbar. Die Schläuche wurden mit variierenden Konzentrationen von Fibrinogen in TBS gefüllt. Die Lösungen enthielten 1% des Fibrinogens als mit ¹²&sup5;I- markiertes Protein (markiert mit dem Festphasen-Lactoperoxidase-Glucoseoxidase-Verfahren unter Verwendung von Enzymobead- Reagens, Bio-Rad Ltd., Mississauga, Ontario, gemäß den Anweisungen der Lieferfirma). Die Schläuche wurden in einen Ofen bei 70ºC für 10 Minuten gegeben, anschließend ausgiebig mit destilliertem Wasser gewaschen, um nicht-gebundenes Fibrinogen zu entfernen. Die Menge an gebundenem Fibrinogen wurde anschließend durch Auszählen der Radioaktivität in den Schläuchen bestimmt. Wie in Figur 1 dargestellt, war die Oberflächenkonzentration an Fibrinogen direkt abhängig von der Konzentration der Fibrinogen-Lösung.
- Um Prot.einadsorption auf Schläuchen, die mit denaturiertem Fibrinogen beschichtet sind, mit derjenigen auf nicht-beschichteten Schläuchen zu vergleichen, wurden Schlauchmaterialstücke Lösungen ausgesetzt, die variierende Konzentrationen von mit ¹²&sup5;I markiertem Fibrinogen und Human-Thrombin (Sigma) und mit 1311 markiertem Rinderalbumin (Boehringer Mannheim Canada) enthielten, alle markiert unter Verwendung von Enzymobead-Reagens (Bio-Rad Ltd.). Die Schläuche wurden mit Fibrinogen oder Albumin für 3 Stunden bei 23ºC oder mit Thrombin für 15 Minuten bei 23ºC inkubiert. Die Schläuche wurden anschließend dreimal mit TBS gespült, wobei jede waschung aus 20 Schlauchvolumina bestand, die langsam -durch den Schlauch gezogen wurden. Die an die Schläuche gebundene Radioaktivität wurde anschließend gemessen. Die Adsorption von sowohl Fibrinogen als auch Albumin an die thermisch denaturierte Fibrinogen- Oberfläche war viel geringer als an nicht-beschichtetes Polyethylen.
- Blutplättchen-Adhäsion an thermisch denaturiertes Fibrinogen (TDF) wurde anschließend bestimmt. Suspensionen von gewaschenen Kaninchen-Blutplättchen wurden gemäß dem Verfahren von Ardlie et al. (Br. J. Haemat. 19: 7-17, 1970; Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 136: 1021-1023, 1971) hergestellt und mit Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4; (Du Pont-New England Nudear, Boston, Ma., 200-500 mCi pro mg Chrom) für 30 Minuten in der ersten Waschlösung markiert. Die Blutplättchen wurden anschließend einmal in calciumfreier Tyrode-Lösung (136 mM NaCl, 0,1% Glucose, 1 mM MgCl&sub2;, 2 mM CaCl&sub2;, mit NaHCO&sub3; und NaH&sub2;PO&sub4; auf pH 7,35 gepuffert), die 4% Albumin enthielt, gewaschen und bei 500.000/µl in Eagle-Medium resuspendiert, das 4% Albumin, Apyrase und 5 mM HEPES-Puffer (pH 7,35) enthält. Unmittelbar vor der Messung der Blutplättchen- Adhäsion wurden gewaschene rote Blutkörperchen durch Zentrifugation gepackt und zur Blutplättchen-Suspension zugegeben, um einen 40%igen Hämatokrit zu erhalten (Cazenave et al., J. Lab. Clin. Med. 93: 60-70, 1979). Die Blutplättchen:rote Blutkörperchen-Suspensionen wurden für 10 Minuten bei 37ºC durch Polyethylenschlauchmaterial (PE 240) umgewälzt, das entweder nicht-beschichtet, mit thermisch denaturiertem Fibrinogen (1 mg/ml in TBS) beschichtet oder mit adsorbiertem nicht-denaturierten Fibrinogen (1 mg/ml in TBS, 3 Stunden, 22ºC) beschichtet war. Der Durchfluß wurde bei Raten von entweder 2,5 ml/min oder 15 ml/min unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe mit variabler Geschwindigkeit gehalten. Diese Durchflußraten entsprechen Wandscherraten von 90 s&supmin;¹ bzw. 550 s&supmin;¹, unter Bedingungen einer vollständig entwickelten Laminarströmung. Nach dem Waschen der Schläuche mit modifizierter Tyrode-Lösung (weggelassenes Calcium), die 0,01 M EDTA und 0,1% Glucose enthielt, wurden sie in Segmente von 2 cm geschnitten und auf Radioaktivität ausgezählt.
- Blutplättchen-Adhäsion unter niedrigen (90 s&supmin;¹) und hohen (550 s&supmin;¹) Wandscherraten ist in Figur 2 dargestellt. Es besteht eine signifikante Abnahme, bei beiden Scherraten, in der Blutplättchen-Adhäsion an das thermisch denaturierte Fibrinogen, verglichen mit dem adsorbierten Fibrinogen (p< 0,01). Blutplättchen-Adhasion an das nicht-beschichtete Polyethylen war nichtnachweisbar.
- Um die Stabilität von thermisch denaturiertem Fibrinogen gegenüber Elution zu bestimmen, wurde PE 320-Schlauchmaterial -mit thermisch denaturiertem Fibrinogen unter Verwendung einer 1 mg/ml-Fibrinogen-Lösung beschichtet, zu der ein radioaktiv markierter Fibrinogen-Tracer zugesetzt worden war. Das Schlauchmaterial wurde anschließend für 24 Stunden mit TBS bei 37ºC und einer Durchflußrate von 20 mumm perfundiert. Segmente von 4 cm wurden in stündlichen Intervallen entfernt, um die Stabilität der Fibrinogen-Schicht unter diesen Durchflußbedingungen zu bestimmen. In einigen Experimenten- wurden gepooltes Human-Plasma als das Perfusat verwendet, bei niedrigen und hohen Durchflußraten (20 und 100 mumm.) bei 37ºC für 2 Stunden. Segmente von 4 cm wurden nach 5, 10, 15, 60 und 120 Minuten entfernt, um die Stabilität der Fibrinogen-Schicht in der Gegenwart von Plasma zu bestimmen.
- Es gab keine signifikante Abnahme in der Radioaktivität im Zusammenhang mit der TDF-Oberfläche, wenn sie strömendem TBS bei 20 ml/Minute für einen Zeitraum von 4 Stunden ausgesetzt wurde. In ähnlicher Weise gab es, wenn die Perfusion für 24 Stunden fortgesetzt wurde, keine Abnahme in der Fibrinogen- Menge in der Schicht (Daten nicht dargestellt). Einwirkung von citriertem Human-Plasma auf mit thermisch denaturiertem Fibrinogen beschichtetes Polyethylen bei sowohl niedrigen als auch hohen Wandscherraten senkte die Oberflächen-Radioaktivität über einen zweistündigen Zeitraum nicht (Daten nicht dargestellt), was darauf hindeutet, daß die Qberflächenbeschichtung stabil ist und selbst unter Strömungsbedingungen einer Desorption widersteht.
- Polyethylen-Schlauchmaterial (Intramedic PE 240, Clay Adams) wird mit Methanol gespült, gefolgt von TBS, und über Nacht bei Raumtemperatur in TBS inkubiert. Das Schlauchmaterial wird anschließend abtropfen gelassen und mit einer Lösung von gereinigtem Fibrinogen (1 mg/ml) in TBS gefüllt. Das Schlauchmaterial wird in einen 70ºC heißen Ofen für zehn Minuten gegeben, um das Fibrinogen zu denaturieren Das Schlauchmaterial wird aus dem Ofen entnommen und mit vierzig Schlauchvolumina TBS gespült.
- Das beschichtete Schlauchmaterial wird anschließend mit Thrombin behandelt. Das Schlauchmaterial wird mit einer 1 µg/ml- Lösung von Human-OL-Thrombin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 0,5x TBS (-hypotonisches TBS) gefüllt. Di Schläuche werden bei Raumtemperatur für fünf Minuten inkubiert, anschließend mit zwanzig Schlauchvolumina hypotonischem TBS gespült.
- Eine zusätzliche Schicht aus Fibrin wird anschließend an die Beschichtung quervernetzt. Das mit Thrombin behandelte Schlauchmaterial wird für fünf Minuten bei 37ºC in einer Lösung von 1 mg/ml Fibrinogen und variierenden Konzentrationen (0-5 µg/ml) rekombinantem Faktor XIII in TBS, enthaltend 2 mM CaCl&sub2;, inkubiert. Das Schlauchmaterial wird anschließend mit TBS gespült.
- Blutplättchen-Adhäsion an Schlauchmaterial, das auf diese Weise hergestellt ist, wurde bestimmt. Suspensionen aus mit &sup5;¹Cr markierten Blutplättchen und RBC wurden durch das Schlauchmaterial umgewälzt, wie beschrieben in Beispiel 1. Wie in Figur 3 dargestellt, nahm die Blutplättchen-Adhäsion mit ansteigen- den Mengen an Faktor XIII ab.
- Mit Fibrin beschichtetes Polyethylen wurde verwendet, um die Wirksamkeit von Heparin und den von Antithrombin III unabhängigen Thrombin-Inhibitoren Hirudin, Hirulog-1 und D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginyl-chlormethylketon (PPACK) bei der Inhibition der Fibrin-Akkretion aus Plasma, das von den von Vitamin K abhängigen Gerinnungsfaktoren frei ist, auf eine Fibrin- Thrombin-Oberfläche zu vergleichen. Alle-Lösungen wurden im TBS he-rgestellt, sofern nicht anders angegeben. Standard-Heparin aus Schweine-Darmmucosa (Grade II) wurde von Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. erhalten und PPACK wurde von Calbiochem Corp., San Diego, California, erhalten. PPACK wurde in 10&supmin;³ M HCl hergestellt. Rekombinantes Hirudin war ein Geschenk von Dr. H. Grossenbacher, Ciba-Geigy Ltd., Biotechnology Department, Basel, Schweiz (Charge RHHS-7033/#A19). Diese Molekül ist ein einzelkettiges Polypeptid mit 65 Aminosäuren mit drei Disulfidbrücken. Es besitzt dieselbe Aminosäuresequenz und Struktur wie natives Hirudin, Variante HV-1. Hirulog-1, ein synthetisches Hirudin-Derivat, war ein Geschenk von Dr. John Maraganore, Biogen Inc., Cambridge, Massachusetts. Rekombinantes Hirudin und Hirulog-1 wurden hergestellt in TBS, das 6 mg/ml Polyethylenglykol 8000 (PEG 8000) enthielt, um Wandeffekte zu vermeiden (Degryse et al., Thromb. Res. 61: 87, 1991).
- Vollblut, gesammelt in Säure-Citrat-Dextrose von 15 gesunden Spendern, wurde vom Canadian Red Cross erhalten. Die Zellkomponenten wurden durch Zentrifugation entfernt und die von Vitamin K abhängigen Gerinnungsfaktoren wurden durch die Zugabe von 100 ml 1 M BaC1&sub2; pro Liter Plasma entfernt. Nach vorsichtigem Rühren für 1 Stunde bei 4ºC wurde das unlösliche Bariumcitrat durch Zentrifugation entfernt und das überstehende Plasma wurde über Nacht gegen 0,15 M NaCl dialysiert. HEPES-Puffer wurde auf eine Endkonzentration von 50 mM zugegeben und der pH wurde auf 7,4 eingestellt. Das Plasma wurde bei -70ºC aufbewahrt. Die Fibrinogen-Konzentration, wie bestimmt durch die Messung von koagulierbarem Protein (Ratnoff et al., J. Lab. Clin. Med. 37: 316, 1951), betrug 2,2 mg/ml. Die ATIII- und Heparin-Cofaktor-II(HCII)-Spiegel wurden auf einem Automated Coagulation Laboratory (ACL 300, Instrumentation Laboratory, Mailand, Italien) gemäß den Vorschriften der Lieferfirma (Diagnostica Stago, Asnieres, Frankreich) gemessen, und es wurde festgestellt, daß sie 0,98 U/ml bzw. 0,67 U/ml betrugen. Plasma-Prothrombin, bestimmt unter Verwendung von Kaninchenhirn- Thromboplastin und Faktor II-defizientem Plasma (Owren, J. Clin. Lab. Invest. 1: 81, 1949), betrug weniger als 0,01 U/ml. Die Zugabe von CaCl&sub2; zu diesem Plasma (Endkonzentration 2 mM) führte nicht zu Gerinnselbildung, wenn es über Nacht bei -37ºC stehengelassen wurde.
- Polyethylen-Schlauchmaterial (Intramedic PE 240, Clay Adams) wurde mit Fibrinogen beschichtet (gereinigt aus citriertem Humanplasma unter Verwendung sequentieller β-Alanin-Ausfällung, wie offenbart von Straughn und Wagner, Thromb. Diath. Haemorrhag. 16: 198, 1966). Das Schlauchmaterial wurde zunächst mit Methanol und TBS gewaschen, anschließend mit TBS gefüllt, das 1 mg/ml Fibrinogen enthielt, und für 10 Minuten auf 70ºC erhitzt. Das Schlauchmaterial wurde anschließend mit 50 Schlauchvolumina TBS gewaschen. Die Schläuche wurden abtropfen gelassen und mit einer Lösung gefüllt, die 1 µg/ml Human-α-Thrombin enthielt (erhalten von Dr. J. Fenton II, New York State Department of Health, Albany, NY), in hypotonem TBS. Nach Inkubation für fünf Minuten bei Raumtemperatur wurden die Schläuche mit 10 Schlauchvolumina hypotonischem TBS gewaschen, anschließend mit 10 Schlauchvolumina TBS, das 1 mg/ml Human-Fibrinogen und 2 mM CaCl&sub2; enthielt. Die Schluche wurden bei 37ºC für 10 Minuten inkubiert, anschließend mit 100 Schlauchvolumina 0,05 M Na&sub2;HPO&sub4;, pH 6,5 gewaschen.
- Die Menge und Gleichförmigkeit der resultierenden Fibrinogen- Thrombin-Oberfläche wurde bestimmt unter Verwendung von radioaktiv markierten Tracer-Proteinen (¹²&sup5;I-Thrombin, ¹³¹I-Fibrinogen) in beiden Lösungen, die verwendet wurden, um die Oberfläche herzustellen. Die Mengen an Fibrin und Thrombin, die an die Oberfläche gebunden waren, wurden durch Messung der Radioaktivität gleichgroßer Segmente, die vom Schlauchmaterial abgeschnitten wurden, in einem Gammazähler (Minaxi gamma, Auto-gamma 5000 Reihe, Canberra-Packard Canada, Ltd., Mississauga, Ont.) gemessen. Die Variation der Menge Fibrin und Thrombin auf den Oberflächen betrug weniger als 10% zwischen den getesteten Segmenten.
- Um außerdem die Gleichförmigkeit und die morphologischen Eigenschaften der mit Fibrin beschichteten Oberfläche zu bestimmen, wurden Segmente in 4%igem Paraformaldehyd fixiert, gefolgt von 1% Osmiumtetroxid in 0,1 M- Natriumcacodylat-Puffer, durch Qualitäts-Ethanol hindurch dehydratisiert und in einem Trockner mit CO&sub2; am-kritischen Punkt (Bomar SPC-900) getrocknet. Die Schläuche wurden anschließend auf Aluminium-Probennasen befestigt, mit Goldsputter beschichtet und in einem Abtastelektronenmikroskop Philips 501-B mit schwacher (40x) und starker (2500x) Vergrößerung untersucht. Es bestand eine gleichförmige dünne Schicht aus polymerisiertem Fibrin, die entlang der Länge der luminalen Seite des Schlauchmaterials anhaftete. Das Verhältnis von Oberfläche zu Masse des Fibrins auf der Oberfläche wurde zu 67 cm²/mg Fibrin berechnet.
- Segmente von mit Fibrin beschichteten Schläuchen wurde in der Länge unterteilt und in einer Lösung gekocht, die 8M Harnstoff, 2% Natriumdodecylsulfat (SDS), 100 TNM β-Mercaptoethanol enthielt, für 1 Stunde bei 100ºC. Analyse des verdauten Oberflächenmaterials unter Verwendung von SDS-PAGE (Laemmli, Nature 227: 680, 1970) zeigte, daß dieses Material gamma-gamma- Dimere enthielt, was konsistent war mit dem Vorliegen von quervernetztem polymerisierten Fibrin.
- Die äquivalenten Antithrombin-Konzentrationen der gerinnungshemmenden Mittel der Studie wurden unter Verwendung einer Modifikation der Verfahren von Hatton- (Biochem. J. 131: 799, 1973) bestimmt. In einem Rohr aus Borsilikatglas (12 x 85 mm) wurden 200 µl Ringers Laktat und 100 µl des Testplasmas bei 37ºC für 3 Minuten inkubiert, anschließend wurden 100 µl gekühltes TBS, das Human-β-Thrombin enthielt, zugegeben. Die Gerinnungszeit wurde unter Verwendung des Kipprohrverfahrens bestimmt. Die zugesetzte Thrombinmenge wurde berechnet, um eine Basislinie für die Thrombin-Gerinnungszeit von 20 Sekunden zu ergeben. Die gerinnungshemmenden Mittel des Tests wurden anschließend zum Plasma in variierenden Konzentrationen zugegeben und der Gerinnungszeittest wurde mit identischen Mengen an zugegebenem Thrombin wiederholt. Durch Auftragen der Konzentration des gerinnungshemmenden Mittels gegen den log der Gerinnungszeit konnte eine Extrapolation auf aquivalente Antithrombin-Konzentrationen, die die Basislinie des Gerinnungskipptestes um das 2-fache verlängerte (40 s), für jedes der Medikamente durchgeführt werden. Die aufgezeichneten Beobachtungen wurden auf den Mittelwert von vier Ablesungen gegründet, die an zwei getrennten Tagen vorgenommen wurden.
- Inhibition von Thrombin durch Hirulog-1 wurde ebenfalls bestimmt durch Inkubation von Human-α-Thrombin (42 nM, 1,5 µg/m1) mit Hirulog-1 (42 nM, 0,12 µg/ml und 420 nM, 1,2 µg/ml) in TBS mit 6 mg/ml PEG 8000 (37ºC). Aliquote des Inkubats (100 µl) wurden in variierenden Zeitintervallen entnommen und wurden zu Plasma zugegeben, um die Gerinnungszeit zu bestimmen, wie oben beschrieben.
- - Die äquivalenten Antithrombin-Konzentrationen der gerinnungshemmenden Mittel der Studie, die die Gerinnungszeit des Test- plasmas von einer Basislinie von 20 Sekunden auf 40 Sekunden verlängerten, waren: rekombinantes Hirudin, 25 nM (0,17 ijg/ml); Hirulog-1, 42 nM (0,12 µg/ml); PPACK, 65 nM; Heparin, 0,23 U/ml.
- PE-Schläuche (6 cm), die mit Fibrin-Thrombin beschichtet sind, wurden mit 1 ml Plasma gewaschen, hergestellt wie oben beschrieben. Das Plasma enthielt die gerinnungshemmenden Mittel des Tests in variierenden Konzentrationen, mit ¹²&sup5;I markiertes Fibrinogen (markiert mit dem Festphasen-Lactoperoxidase-Glucoseoxidase-Verfahren) als einem Tracer-Protein und 2 mM CaCl&sub2; Die Schläuche wurden bei 37ºC für variierende Zeitintervalle inkubiert und anschließend mit TBS auf einer Rollenpumpe (Harvard Apparatus Variable Speed Peristaltic Pump, Harvard Apparatus Inc., South Natick, Mass.) bei 10 ml/min für 10 Minuten (Scherrate 365 s&supmin;¹) bei 37ºC perfundiert. Die 1 cm langen Endsegmente wurden verworfen und die Radioaktivität des restlichen Schlauchmaterials wurde gemessen, um die Menge an akretiertem Fibrin zu bestimmen.
- Das mit ¹²&sup5;I markierte Fibrin an der Oberfläche, das aus Testplasma (30 min Inkubation, 37ºC) bei Vorhandensein und Nichtvorhandensein von Hirulog-1 (42 nm) auf den PE-Schläuchen akkretiert wurde, wurde in 1 ml 8 M Harnstoff, 2% SDS, 100 mM β-Mercaptoethanol für 1 Stunde bei 100ºC verdaut. Gleiche Volumina des verdauten Materials wurden durch Gelelektrophorese auf SDS-Polyacrylamin untersucht. Nach Trocknung des Gels wurde es einem Kodak-X-ARS-Film ausgesetzt, und die Banden, die sich bildeten, wurden densitometrisch unter Verwendung eines LKB Ultrascan XL Laser Densitometer (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden) untersucht.
- Wie in Figur 4 veranschaulicht, waren alle gerinnungshemmenden Mittel, nach 10 Minuten Inkubation des Testplasmas mit dem mit Fibrin beschichteten PE-Schlauchmaterial, in der Lage, Fibrin- Akkretion zu inhibieren, verglichen mit dem Kontroll-Plasma, mit Ausnahme von Hirulog-1. Sowohl rekombinantes Hirudin als auch PPACK waren signifikant wirksamer als entweder die Kontrolle (p< 0,001, Student's t-test), Hirulog-1 (p< 0,001) oder Heparin (p< 0,001) bei der Inhibition der Fibrin-Akkretion. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen der Inhibition der Fibrin-Akkretion zwischen den gerinnungshemmenden Mitteln rekombinantes Hirudin und PPACK.
- Nach 30 Minuten Inkubation (Figur 5) betrug der Inhibitionsgrad der Fibrin-Akkretion der mit Fibrin beschichteten Schläuche durch die gerinnungshemmenden Mittel weniger als 10 Minuten. Sowohl rekombinantes Hirudin als auch PPACK verringerte die Akkretion, verg-lichen mit dem Kontrollversuch (p< 0,001), aber Heparin tat dies nicht (p< 0,02). Außerdem gab es einen Anstieg in der auf der Fibrin-Thrombin-Oberfläche bei Vorhandensein des gerinnungshemmenden Mittels Hirulog-1 akkretierten Fibrinmenge, verglichen mit dem Kontroll-Plasma (p(0,02). In einem getrennten Experiment, in dem die Fibrin-Akkretion auf mit Fibrin-Thrombin beschichteten PE-Schläuchen bei Vorhandensein und Nichtvorhandensein von Hirulog-1 bestimmt wurde (Figur 6), inhibierten niedrige Konzentrationen von Hirulog-1 (42 nM) die Fibrin-Akkretion für 4 Minuten und hohe Konzentrationen (420 nM) inhibierten die Fibrin-Akkretion für 8 Minuten, verglichen mit dem Kontroliversuch. Diese Konzentrationen stellten einen 3- und 30-fachen molaren Überschuß von Hirulog-1 dar, relativ zur Menge an α-Thrombin, das an die mit Fibrin beschichtete Oberfläche gebunden ist (3,2 ng Thrombin/cm², 15 nM/cm²). Nach diesen Zeitpunkten gab es jedoch einen progressiven Anstieg in der akkretierten Fibrinmenge bei beiden Konzentrationen von Hirulog-1 in Plasma, verglichen mit Kontroll- Plasma (30 min Inkubation Hirulog-1; 18,4 i 3,5 ijg Fibrin/cm², Kontrollversuch; 11,7 ± 2,0 µg Fibrin/cm², p< 0,001). SDS-PAGE und Autoradiographie mit densitrometrischer Analyse des radioaktiv markierten akkretierten Fibrins, das verdaut worden war (8 M Harnstoff, 2% SDS, 100 mM β-Mercaptoethanol, 1 Stunde, 100ºC), bestätigten, daß die bei Vorhandensein von Hirulog-1 akkretierte Menge erhöht war und daß das Fibrin gamma-gamma- Dimere enthielt, was konsistent war mit akkretiertem polymerisierten quervernetzten Fibrin und nicht-adsobiertem Fibrinogen (Verhältnis gamma-gamma-Peak Hirulog-1:Kontrolle; 1,3).
- Mit Fibrin beschichtetes PE-Schlauchmaterial wurde hergestellt, wie oben beschrieben, unter Verwendung von ¹²&sup5;I-Thrombin (markiert mit dem Festphasen-Lactoperoxidase-Glucoseoxidase-Verfahren). Das Schlauchmaterial wurde anschließend mit TBS gespült, das die ATIII-unabhängigen Thrombin-Inhibitoren enthielt, bei Konzentrationen, die das 5-fache derjenigen betrugen, die erforderlich ist, um die Basislinie des Gerinnungskipptestes auf das 2-fache zu verlängern. Nach einem Inkubationszeitraum von 10 Minuten (23ºC) wurden die Schläuche mit hypotonischem TBS auf einer Rollenpumpe (10 ml/min, 10 min) gespült. Die mit jedem Schlauch zusammenhängende Radioaktivität wurde gemessen, um die- übriggebliebene Menge an Oberflächen-Thrombin zu bestimmen. Figur 7 zeigt die Wirkung der ATIII-unabhängigen Thrombin-Inhibitoren auf die Verdrängung von Thrombin von der Fibrin-Oberfläche. Während PPACK keine Verdrängung bewirkte, senkten sowohl rekombinantes Hirudin als auch Hirulog-1 die Oberflächenkonzentrationen des Thrombins, das an das polymerisierte Fibrin gebunden ist, signifikant, verglichen mit dem Kontroll-Puffer (p< 0,001).
- Obgleich bestimmte Ausführungsformen der Erfindung zu Veranschaulichungszwecken im Detail beschrieben worden sind, wird es den Fachleuten auf diesem Gebiet ohne weiteres deutlich sein, daß die Verfahren und Zusammensetzungen, die hierin beschrieben sind, modifiziert werden können, ohne vom Geist und Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. Demgemäß ist die Erfindung mit Ausnahme durch die beigefügten Ansprüche nicht beschränkt.
Claims (25)
1. Ein Verfahren zur Beschichtung einer Oberfläche eines
polymeren Materials mit Fibrinogen, welches umfaßt, daß
besagtes Material in einer Fibrinogen-Lösung bei einer
Temperatur von wenigstens 56ºC, aber weniger als 100ºC
inkubiert wird, um eine mit Fibrinogen beschichtete
Oberfläche herzustellen.
2. Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Temperatur etwa
70ºC beträgt.
3. Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lösung zwischen
0,-5 mg/ml und 3,0 mg/ml Fibrinogen enthält.
4. Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lösung etwa 1
mg/ml Fibrinogen enthält.
5. - Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Fibrinogen
Human-Fibrinogen ist.
6. Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Material
Polyethylen, Polyethylenterephthalat oder gerecktes
Polytetrafluorethylen ist.
7. Ein Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Material in der
Form eines Gefäßtransplantats vorliegt.
8. Ein Verfahren zur Beschichtung einer Oberfläche eines
polymeren Materials mit Fibrin, welches umfaßt:
daß besagtes Material in einer Fibrinogen-Lösung bei
einer Temperatur von wenigstens 56ºC, aber weniger als
100ºC
inkubiert wird, um eine mit Fibrinogen beschichtete
Oberfläche herzustellen; und
daß die mit Fibrinogen beschichtete Oberfläche mit
Thrombin behandelt wird, um Fibrin-Monomere herzustellen.
9. Ein Verfahren nach Anspruch 8, wobei der
Behandlungsschritt umfaßt, daß die mit Fibrinogen beschichtete
Oberfläche einer Lösung ausgesetzt wird, die etwa 1 µg/ml
Thrombin enthält.
10. Ein Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Temperatur etwa
70ºC beträgt.
11. Ein Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Lösung zwischen
015 mg/ml und 3,0 mg/ml Fibrinogen enthält.
12. Ein Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Lösung etwa 1
mg/ml Fibrinogen enthält.
13. Ein Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Fibrinogen
Human-Fibrinogen ist.
14. Ein Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Material
Polyethylen, Polyethylenterephthalat oder gerecktes
Polytetrafluorethylen ist.
15. Ein Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Material in der
Form eines Gefäßtransplantates vorliegt.
16. Ein Verfahren nach-Anspruch 8, welches weiterhin den
Schritt enthält, daß die mit Thrombin behandelte
Oberfläche einer zweiten Lösung ausgesetzt wird, die Faktor XIII
und zusätzliches Fibrinogen umfaßt, wodurch das
zusätzliche Fibrinogen zu Fibrin umgewandelt und an die mit
Fibrin beschichtete Oberfläche quervernetzt wird.
17. Ein Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Faktor XIII-
Konzentration in der zweiten Lösung von- 0,25-20 µg/ml
beträgt.
18. Ein Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Faktor XIII-
Konzentration in der zweiten Lösung von 0,25-5,0 µg/ml
beträgt.
19. Ein Verfahren nach Anspruch 16, wobei die
Fibrinogen-Konzentration in der zweiten Lösung von 0,5-5,0 mg/ml
beträgt.
20. Ein Verfahren nach Anspruch 16, wobei besagte zweite
Lösung weiterhin basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor,
Endothelzellen-Wachstumsfaktor, α&sub2;-Macroglobulin,
Vitronectin, Fibronectin oder ein zellbindendes Fragment von
Fibronectin umfaßt.
21. Ein Verfahren nach Anspruch 16, wobei besagte zweite
Lösung Endothelzellen umfaßt.
22. Ein Verfahren nach Anspruch 16, welches weiterhin den
Schritt umfaßt, daß das quervernetzte Fibrin mit
Endothelzellen beimpft wird.
23. Ein polymeres Material, das gemäß dem Verfahren nach
Anspruch 1 hergestellt ist.
24. Ein polymeres Material, das gemäß dem Verfahren nach
Anspruch 8 hergestellt ist.
25. Ein polymeres Material, das gemäß dem Verfahren nach
Anspruch 16 hergestellt ist.
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