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STAND DER
TECHNIK FÜR
DIE ERFINDUNG
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1. Gebiet
der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft ein Gewebebeklebungsmittel. Sie ist insbesondere
auf ein Beklebungsmittel gerichtet, mit welchem Verletzungen verschlossen,
Blutverlust verringert, die Hämostase
aufrechterhalten und die Heilung einer verletzten Stelle auf der
Hautoberfläche,
von Organen oder dergleichen beschleunigt werden kann.
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2. Beschreibung des Standes
der Technik
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Kurz
nachdem eine Verletzung aufgetreten ist, beginnt deren Heilung,
d.h. die Wiederherstellung der Läsion,
mit der Adhäsion
und Agglutinierung von Blutplättchen
oder Thrombocyten an der Verletzung. Dabei ist es erforderlich,
die aufeinander folgenden konjugierten Funktionen von verschiedenen
Zellen und die Abbau- und Regenerationsvorgänge genau zu kontrollieren.
Diese umfassen die Bildung von Fibrinklümpchen, die Absorption von
Blutklümpchen
und die Epithelialisierung. Die Heilung einer Verletzung umfasst
die Bildung von vielen Blutkapillaren, aktiven Fibroblasten und
Collagenfibrillen, auf welche aber nicht die Bildung einer bestimmten
Hautstruktur folgt.
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Der
Vorgang der Heilung einer Verletzung beginnt mit der Adhäsion und
Agglutinierung von Blutplättchen
an dem verletzten Gewebe und mit Thromboplastin, das zeitgleich
von den verletzten Zellen freigesetzt wird. Thromboplastin aktiviert
Gerinnungsfaktoren und wandelt schließlich Prothrombin in Thrombin
um. Durch die katalysierende Wirkung von Thrombin werden die Fibrinopeptide
A und B aus Fibronogen freigesetzt, wobei sich Fibrinmonomere bilden.
Die Monomere aggregieren, wobei sich Fibrinfilamente bilden. Thrombin
aktiviert auch den Blutgerinnungsfaktor XIII (Faktor XIII), der
eine Isopeptidbildung zu kovalent vernetzten Fibrinfilamenten katalysiert.
Danach wird α-Antiplasmin
an Fibrinfilamente durch den aktivierten Faktor XIII gebunden, wodurch
ein Abbau der Fibrinfilamente durch Plasmakomponenten verhindert
wird.
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Die
an der verletzten Stelle anhaftenden und agglutinierten Plättchen setzen
PDGFs frei. PDGFs umfassen den Plättchen entstammenden Wachstumsfaktor
(PDGF), den Plättchen
entstammenden angiogenen Faktor (PDAF), den transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β) und den
Plättchenfaktor-4
(PF-4).
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PDGF
ist ein Mitogen und stimuliert die Proteinsynthese in aus dem Mesenchym
stammenden Zellen wie Fibroblasten und glatte Muskelzellen. PDGF
ist ein Amitose-Attraktant für
Endothelzellen.
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TGF-β ist ein
Attraktant für
Makrophagen und Monocyten. TGF-β stimuliert
oder inhibiert verschiedene Zellen in Abhängigkeit von Vorhandensein
oder Abwesenheit anderer Wachstumsfaktoren. So erhöht beispielsweise,
in vivo angewendet, TGF-β die
Zugfestigkeit der ausgeheilten Haut auf einer Verletzung. Weiterhin
stimuliert TGF-β die
Synthese von Collagen und Glucosaminglycan.
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Ein
von den Plättchen
freigesetzter Wachstumsfaktor ist bei der spezifischen Förderung
der Heilung einer Verletzung und der Wiederherstellung von Gewebe
potentiell nützlich.
Dabei ist experimentell festgestellt worden, dass der Verschluss
von Verletzungen, das Wachstum von Blutgefäßen oder dergleichen durch
das Aufbringen eines extrinsischen Wachstumsfaktors auf eine verletzte
Stelle erleichtert werden. Deshalb besteht das sicherste Verfahren
für einen
lebenden Körper
darin, Wachstumsfaktoren zu nutzen, die von den Plättchen freigesetzt
werden, die an der verletzten Stelle anhaften und agglutinieren.
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Als
Zusammensetzung zu dem Bekleben einer verletzten Stelle, der Verringerung
des Blutverlusts und dem Aufrechterhalten der Hämostase sind chirurgische Klebstoffe
und Gewebebeklebungsmittel, die Plasmaproteine enthalten, bekannt
und werden beim Bekleben von verletzten Stellen auf der Hautoberfläche oder
eines intrakorporalen Organs verwendet. Ein solches Beklebungsmittel
enthält
im Allgemeinen einen oder mehrere Blutgerinnungsfaktoren und andere
Plasmaproteine. So ist beispielsweise im europäischen Patent Nr. 0 068 047
ein wasserfreies pulverförmiges
Material offenbart, das von einer auf konzentrierten Plasmafraktion abgeleitet
worden ist, die Fibrinogen, Fibrinolyseinhibitoren und Thrombin
oder Prothrombin enthält.
Jedoch kann dieses Material nur pulverförmig verwendet werden, da sich
unmittelbar nach Wasserzugabe Blutklümpchen bilden. Weiterhin ist
in AU-A75097/87 ein Einkomponenten-Klebstoff offenbart, der Fibrinogen,
den Faktor XIII, einen Thrombininhibitor wie Antithrombin III, einen
Prothrombinfaktor, Calciumionen und wahlweise einen Plasmininhibitor
enthält.
In den US-Patenten 4 427 650 und 4 427 651 ist ein angereichertes
Plasmaderivat offenbart, das Fibrinogen, Thrombin und/oder Plasmin
und Fibrinolyseinhibitoren und wahlweise andere Komponenten wie
Plättchenextrakte
enthält.
In den US-Patenten
Nr. 4 627 879 und 4 928 603 ist eine kryopräzipitierte Suspension, die
Fibrinogen und den Faktor XIII enthält, und ihre Verwendung bei
der Herstellung eines Fibrinleims oder eines Fibrinklebstoffs offenbart.
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Der
Fibrinklebstoff wird als ein Fibrinbeklebungsmittel bezeichnet und
wurde ursprünglich
für eine
klinische topische Verwendung formuliert und zum Stillen von Blutungen
und zur Heilung von Verletzungen verwendet. Der Fibrinklebstoff
wird aus Plasma hergestellt, und die genaue Zusammensetzung eines
bestimmten Fibrinklebstoffs ist von der speziellen Plasmafraktion
abhängig,
die als Ausgangsmaterial verwendet wird. Im Allgemeinen enthält der Fibrinklebstoff
ein Proteingemisch, das, wenn es mit Thrombin vermischt wird, Blutklümpchen bilden
kann. So kann beispielsweise der Fibrinklebstoff durch Kryopräzipitation
von Plasma und Fraktionieren des Präzipitats hergestellt werden,
wobei eine Zusammensetzung erhalten wird, die ein Beklebungsmittel
oder Blutklümpchen
bilden kann, wenn sie mit Thrombin oder einem Thrombinaktivator
vermischt wird. Das Fraktionieren der Plasmakomponenten kann durch
Standardverfahren der Proteinreinigung, beispielsweise Präzipitation
mit Ethanol, Polyethylenglykol oder Ammoniumsulfat, Ionenaustausch
oder Gelfiltrationschromatographie, durchgeführt werden. Im Allgemeinen
umfasst der Fibrinklebstoff ein Fibrinogenkonzentrat, das Fibronektin,
den Faktor XIII, den Von-Willebrand-Faktor und getrocknetes humanes
oder Rinderthrombin enthält.
Er wird in gefriergetrockneter Form hergestellt und kurz vor Verwendung
mit Calciumchlorid vermischt. Nach dem Vermischen werden die Komponenten
auf der Gewebeoberfläche
aggregiert, wobei sich vernetzte Fibrine enthaltende Blutklümpchen bilden.
Der Faktor XIII ist in dem Fibrinogenkonzentrat enthalten und katalysiert
die Vernetzungsreaktion. Der Fibrinklebstoff verschließt die Gewebeoberfläche und
verhindert, dass Luft oder Flüssigkeit
austritt, wodurch eine Hämostase
herbeigeführt
wird. Der Fibrinklebstoff fördert
die Heilung einer Verletzung durch die Funktionen eine Blutung zu
stoppen und das Austreten von Blut aus der Verletzung zu verhindern.
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Jedoch
besitzt ein solcher herkömmlicher
Fibrinklebstoff per se nicht die Eigenschaft, eine Verletzung zu
kurieren oder auszuheilen. Deshalb wäre es wünschenswert, einen Fibrinklebstoff
zu entwickeln, der auf eine Verletzung der Hautoberfläche oder
eines intrakorporalen Gewebes aufgebracht werden kann und nützlich ist,
die Hämostase
aufrechtzuerhalten und das Kurieren oder Ausheilen einer Verletzung
zu fördern.
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In
WO 97/44015 ist ein Mikroteilchen-Fibrinbeklebungsmittel, das sich
aus Fibrinogen und Thrombin zusammensetzt, zur Unterstützung der
Wundheilung beschrieben. Diese Zusammensetzung kann mit absorbierenden
Materialien formuliert werden. Ein geeignetes Absorptionsmaterial
ist Carboxymethylcellulose oder Mannit, die (das) aufgrund ihres
(seines) Absorptionsvermögens
wirkt.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Deshalb
liegt der Erfindung als Aufgabe zugrunde, ein Gewebebeklebungsmittel
bereitzustellen, das die Hämostase
und die Heilung einer Verletzung der Haut oder eines inneren Organs,
die Endothelbildung bei einem Blutgefäß, die zelluläre Adhäsion an
tierischen Zellen wie Endothelzellen oder Fibroblasten in vitro
und die Adhäsion
und Agglutinierung von Blutplättchen
befördern
kann. Das heißt,
der Erfindung liegt als Aufgabe zugrunde, ein Gewebebeklebungsmittel
bereitzustellen, das die Heilung einer Verletzung, die Endothelbildung oder
die zelluläre
Adhäsion
von tierischen Zellen durch Aufbringen des Gewebebeklebungsmittels
fördern kann,
das in der Lage ist, Plättchen
oder Thrombocyten an einem verletzten Gewebe, einem Blutgefäß oder an
tierischen Zellen wie Endothelzellen oder in in vitro kultivierten
Fibroblasten zu agglutinieren, um den Kontakt von Wachtstumsfaktoren,
die von Blutplättchen
oder Thrombocyten induziert worden sind, mit dem verletzten Gewebe,
dem Blutgefäß oder den
Tierzellen über
einen langen Zeitraum lang aufrechtzuerhalten.
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Weitere
erfindungsgemäße Aufgaben
und Vorteile werden in der folgenden Beschreibung erläutert.
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Erfindungsgemäß wird ein
Gewebebeklebungsmittel bereitgestellt, das Thrombin, Fibrinogen
und ein Alkalimetall- oder
Erdalkalimetallsalz der Carboxymethylcellulose umfasst, wobei das
Carboxymethylcellulosesalz einen Veretherungsgrad von 0,5 bis 1,5
besitzt.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNG
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In 1 ist
der Einfluss von Natriumcarboxymethylcellulose auf die Aggregierungsreaktion
von Fibrinmonomeren gezeigt.
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BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Das
erfindungsgemäße Gewebebeklebungsmittel
kann beispielsweise durch Vermischen von Thrombin und einem Alkalimetall-
oder Erdalkalimetallsalz der Carboxymethylcellulose mit aus Plasmaproteinen
erhaltenem Fibrinogen hergestellt werden. Das Gewebebeklebungsmittel
kann auf eine Verletzung aufgebracht werden, um in situ Blutklümpchen zu
bilden, wobei als Ergebnis die Verletzung verschlossen, der Blutverlust verringert
und die Hämostase
aufrechterhalten wird.
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Die
Carboxymethylcellulose, die erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist
ein Alkalimetallsalz oder Erdalkalimetallsalz davon (anschließend mitunter
auch als Carboxymethylcellulosesalz bezeichnet) und ist ein Alkalimetallsalz
oder Erdalkalimetallsalz des polyfunktionellen Carboxymethylethers.
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Der
Grad der Veretherung mit Carboxymethylgruppen beträgt 0,5 bis
1,5, vorzugsweise 0,6 bis 0,95, und am meisten bevorzugt 0,6 bis
0,8, um eine geeignete Wasserlöslichkeit
sicherzustellen. Die Stellung der zu verethernden Hydroxygruppe
ist nicht besonders beschränkt,
d.h. es können
eine oder mehrere Hydroxygruppen in 2-, 3- und/oder 6-Stellung verethert werden.
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Das
mittlere Molekulargewicht des Carboxymethylcellulosesalzes ist nicht
besonders beschränkt,
beträgt
aber vorzugsweise 100 bis 100 000 kD, besonders bevorzugt 100 bis
2 000 kD, und am meisten bevorzugt 200 bis 1 000 kD. Ein Carboxymethylcellulosesalz
mit niedrigem Molekulargewicht kann durch Verethern einer Cellulose
mit niedrigem Molekulargewicht und wahlweise Umwandeln der veretherten
Cellulose in ein Salz davon oder allgemein durch Verethern einer
Cellulose mit hohem Molekulargewicht und Abbau der veretherten Cellulose
vor oder nach einer wahlweisen Umwandlung in das Salz hergestellt
werden. Der Abbau kann durch ein bekanntes Verfahren wie Bestrahlung
mit Elektronenstrahlen oder γ-Strahlen
durchgeführt
werden. Dabei ist der Abbau durch Elektronenstrahlung oder γ-Strahlung
bevorzugt, da das Produkt so gleichzeitig sterilisiert wird.
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Der
Gehalt an dem Alkalimetall oder Erdalkalimetall in der Carboxymethylcellulose
oder dem Salz davon, die (das) erfindungsgemäß verwendet wird, ist nicht
besonders beschränkt,
beträgt
aber vorzugsweise 5 bis 13 Gew.-%, besonders bevorzugt 5 bis 10
Gew.-%, und am meisten bevorzugt 6 bis 8 Gew.-%. Das Alkalimetall
ist beispielsweise Natrium, Kalium oder Lithium und das Erdalkalimetall
ist beispielsweise Calcium oder Magnesium. Die Carboxymethylcellulose
oder das Salz davon, die (das) erfindungsgemäß verwendet wird, kann ein
oder mehrere Alkalimetalle oder Erdalkalimetalle wie zuvor genannt
enthalten.
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Für das erfindungsgemäße Gewebebeklebungsmittel
kann ein Fibrinogen und Thrombin verwendet werden, die in einem
herkömmlichen
Fibrinbeklebungsmittel oder Fibrinklebstoff verwendet werden. Das
heißt, dass
ein kommerziell erhältliches
Fibrinogen oder ein Fibrinogen, das durch ein bekanntes Verfahren
(wie die Kryopräzipitation)
aus Plasma hergestellt wird, verwendet werden kann. Weiterhin kann
ein kommerziell erhältliches
Thrombin oder ein Thrombin, das durch ein bekanntes Verfahren (wie
das Extrahieren) aus Plasma isoliert worden ist, verwendet werden.
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Das
erfindungsgemäße Gewebebeklebungsmittel
kann beispielsweise durch Zugabe von Thrombin zu Fibrinogen, das
durch Kryopräzipitation
von Plasma erhalten worden ist, und anschließende Zugabe von Carboxymethylcellulose
oder einem Salz davon hergestellt werden. Das erfindungsgemäße Gewebebeklebungsmittel
kann auch durch Zugabe von Carboxymethylcellulose oder einem Salz
davon zu Fibrinogen, das durch Kryopräzipitation von Plasma erhalten
worden ist, und Zugabe von Thrombin kurz vor Verwendung hergestellt
werden. Weiterhin kann das erfindungsgemäße Gewebebeklebungsmittel auch
durch Zugabe von Carboxymethylcellulose oder einem Salz davon zu
einem kommerziell erhältlichen
Fibrinklebstoff wie dem Fibrinklebstoff von IMMUNO AG (Österreich)
oder BEHRINGWERKE AG (Deutschland) hergestellt werden.
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Während des
Verfahrens zur Herstellung des erfindungsgemäßen Gewebebeklebungsmittels
oder vor dessen Verwendung ist es bevorzugt, eine Sterilisation
oder Inaktivierung der pathogenen Kontaminanten wie Viren durchzuführen. Das Inaktivierungsverfahren
ist dem Fachmann bekannt und ist beispielsweise eine Behandlung
mit einem Lösungsmittel-Waschmittel.
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Die
Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Gewebebeklebungsmittels
ist nicht begrenzt, solange die erfindungsgemäßen Aufgaben gelöst werden
können.
Jedoch beträgt
die Konzentration der Gesamtproteine vorzugsweise 5 bis 150 mg/ml,
besonders bevorzugt 7 bis 35 mg/ml, und am meisten bevorzugt 17 bis
28 mg/ml, bezogen auf das gesamte Gewebebeklebungsmittel. Die Fibrinogenkonzentration
beträgt
vorzugsweise 4 bis 135 mg/ml, besonders bevorzugt 6 bis 30 mg/ml,
und am meisten bevorzugt 15 bis 25 mg/ml, bezogen auf das gesamte
Gewebebeklebungsmittel. Die Konzentration der Carboxymethylcellulose
oder des Salzes davon variiert mit dem Molekulargewicht oder dem
Veretherungsgrad oder mit dem Salzgehalt der Carboxymethylcellulose,
beträgt
aber vorzugsweise 1 μg/ml
bis 100 mg/ml, besonders bevorzugt 100 μg/ml bis 100 mg/ml, und am meisten
bevorzugt 5 mg/ml bis 20 mg/ml, bezogen auf das gesamte Gewebebeklebungsmittel.
Die Thrombinkonzentration variiert mit der Konzentration des verwendeten
Fibrinogens, beträgt
aber im Allgemeinen 1 bis 100 NIH-Einheiten/ml, besonders bevorzugt
5 bis 50 NIH-Einheiten/ml, und am meisten bevorzugt 13 bis 30 NIH-Einheiten/ml.
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Das
erfindungsgemäße Gewebebeklebungsmittel
kann zusätzlich
zu Fibrinogen, Thrombin und Carboxymethylcellulose oder einem Salz
davon beispielsweise eine oder mehrere Verbindungen, die in der
Lage sind, das Heilen einer Verletzung zu beschleunigen, eine oder
mehrere Verbindungen, die in der Lage sind, die biologischen Aktivitäten von
von Plättchen
oder Thrombocyten entstammenden Wachstumsfaktoren in dem Gewebebeklebungsmittel
zu verstärken,
zu stimulieren oder zu vermitteln, eine oder mehrere Verbindungen,
die in der Lage sind, eine oder mehrere Komponenten des Gewebebeklebungsmittels,
die möglicherweise
die biologischen Aktivitäten
von von Plättchen
oder Thrombocyten entstammenden Wachstumsfaktoren in dem Gewebebeklebungsmittel
inhibieren oder blockieren können,
zu inhibieren oder mit ihnen zu wechselwirken, oder eine oder mehrere
Verbindungen, die in der Lage sind, eine oder mehrere Komponenten
des Gewebebeklebungsmittels, die die Aktivitäten der Carboxymethylcellulose
oder eines Salzes davon inhibieren können, zu inhibieren oder mit
ihnen zu wechselwirken, enthalten. Von diesen Verbindungen wird
eine bestimmte Verbindung wie eine inhibierende Verbindung durch
ein Verfahren zur Untersuchung der biologischen Aktivitäten von
von Plättchen
oder Thrombocyten entstammenden Wachstumsfaktoren in dem Gewebebeklebungsmittel
experimentell bestimmt.
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Insbesondere
kann das erfindungsgemäße Gewebebeklebungsmittel
beispielsweise ein Antibiotikum, aktiviertes Protein C, Heparin,
Prostacyclin (PGI3), Antithrombin III, ADPase, ein Antikoagulationsmittel
wie einen Plasminogenaktivator, ein entzündungshemmendes Steroid wie
Dexamethason, ein kardiovaskuläres
Mittel wie ein die Calciumkanäle
blockierendes Mittel, ein Attraktant und ein Lokalanästhetikum
wie Bupivacain enthalten.
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Das
erfindungsgemäße Gewebebeklebungsmittel
kann außerdem
polyklonale, monoklonale oder chimäre Antikörper oder funktionelle Derivate
bzw. Fragmente davon enthalten. Diese können Antikörper sein, die das Wachstum
eines glatten Muskels oder das Wachstum unerwünschter Zellen in oder an der
Stelle hemmen, auf welche das Gewebebeklebungsmittel aufgebracht
worden ist, wie ein Antikörper
gegenüber
PDGF und/oder TGF-β.
Diese Antikörper
sind unter Bedingungen nützlich,
unter welchen eine antitumorale, entzündungshemmende oder Antiplättchenaktivität erforderlich
ist. Im Allgemeinen können
beliebige Antikörper,
die in der Lage sind, eine ökonomische
oder eine Wirkungsverbesserung durch eine ortsspezifische Abgabe
herbeizuführen,
für das
erfindungsgemäße einen
Fibrinklebstoff abgebende System verwendet werden.
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Das
erfindungsgemäße Gewebebeklebungsmittel
kann auf eine Läsion
in einer für
den Verwendungszweck geeigneten Form aufgebracht werden. So kann
das Gewebebeklebungsmittel beispielsweise flüssig oder pulverförmig sein.
Wird ein flüssiges
Gewebebeklebungsmittel hergestellt, kann Wasser oder ein Puffer als
Lösungsmittel
verwendet werden.
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Das
erfindungsgemäße Gewebebeklebungsmittel
kann als ein Träger
fungieren, der es einem oder mehreren von Plättchen freigesetzten Wachstumsfaktoren
erlaubt, eine Läsion
zu erreichen. Weiterhin hat das erfindungsgemäße Gewebebeklebungsmittel Haft-
und Adsorptionseigenschaften und kann den Kontakt mit der Läsion einen
Zeitraum lang aufrechterhalten, der ausreicht, um sicherzustellen,
dass das eine zugesetzte Carboxymethylcellulose enthaltende Gewebebeklebungsmittel
die Heilung einer Verletzung fördert.
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Das
erfindungsgemäße Gewebebeklebungsmittel
kann eine Matrix bereitstellen, um einen Spalt aufzufüllen, der
für den
Transfer von Zellkomponenten und die Auslösung der Induktion eines Knochens
in einem lebenden menschlichen Körper
erforderlich ist. Deshalb ist es bevorzugt, das Beklebungsmittel
aus Proteinen (beispielsweise Fibrinogen und Faktor XIII), Enzymen
(beispielsweise Thrombin und Plasmin) und Carboxymethylcellulose
auf eine solche Weise zu formulieren, dass eine vorübergehende
Gerüststruktur
wie zuvor so lange wie möglich
erhalten bleibt. Obwohl alle Komponenten des erfindungsgemäßen Gewebebeklebungsmittels
biologisch abbaubar sind, wird von dem Beklebungsmittel vorzugsweise
ein unzerstörbares
Gerüst
während
der Knochenbildung derart bereitgestellt, dass die Gestalt eines
neu zu bildenden Knochens festgelegt werden kann. Wie weiter oben
kann eines der Probleme beim Knochenwachstum, d.h. das Hineinfallen
von weichem Gewebe in eine Fehlstelle aus unverbundenem Knochen,
vermieden werden.
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Das
erfindungsgemäße Gewebebeklebungsmittel
kann für
eine beliebige Verletzung, d.h. ein beliebiges verletztes Gewebe
in einem lebenden Organismus, verwendet werden. Das verletzte Gewebe
kann ein intrakorporales Gewebe wie die Mageninnenwand, eine Fraktur
oder dergleichen, die Hautoberfläche
oder dergleichen, ein weiches Gewebe wie die Milz oder ein hartes
Gewebe wie ein Knochen sein. Die Verletzung kann eine Läsion, ein
Trauma bzw. eine Wunde oder durch eine Infektion oder eine chirurgische
Operation gebildet sein.
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Das
erfindungsgemäße Gewebebeklebungsmittel
bildet, wenn es verwendet wird, Fibrin durch die Wirkung von Thrombin
und Fibrinogen.
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Wenn
die Erfindung durchgeführt
wird, werden ein Fibrinklebstoff und ein Carboxymethylcellulosesalz für die Stelle
ausgewählt,
auf welche sie aufgebracht werden sollen. Die Zusammensetzung des
erfindungsgemäßen Gewebebeklebungsmittel
ist nicht kritisch, solange es in vivo als Gewebebeklebungsmittel
und als ein Medium für
den Kontakt des Carboxymethylcellulosesalzes mit einem verletzten
Gewebe oder einem blutigen Implantat wirkt und so die Heilung einer
Verletzung oder die Bildung des Endothels beschleunigt. Der Fibrinklebstoff,
der als Träger
für Wachstumsfaktoren
verwendet wird, enthält
als Komponenten Fibrinogen, Fibronektin, den Faktor XIII und den
Von-Willebrand-Faktor.
Dabei wird der Anteil eines jeden zugesetzten Wachstumsfaktors durch
Tests mit verschiedenen Konzentrationen und Auswahl einer Konzentration,
die für den
gewünschten
Zweck und die Stelle, auf welche er aufgebracht werden soll, nützlich ist,
experimentell bestimmt.
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Beispiele
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Die
Erfindung wird anschließend
anhand der folgenden Beispiele näher
erläutert.
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Herstellungsbeispiel 1:
Herstellung von CMC-Na mit niedrigem Molekulargewicht
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Carboxymethylcellulosenatriumsalze
(CMC-Na) mit verschiedenen Molekulargewichten wurden durch eine
Bestrahlung mit Elektronenstrahlen hergestellt. Insbesondere wurde
feste Natriumcarboxymethylcellulose (Veretherungsgrad = 0,8, Natriumgehalt
= 8 Gew.-%) einer Elektronenstrahlung mit 20 kGy, 40 kGy, 60 kGy, 80
kGy oder 100 kGy bei 10 MeV durch einen linearen CIRCE-II-Beschleuniger
(CGR-McV) ausgesetzt.
Die Einheit "Gy" bedeutet Gray, eine
Einheit der Strahlungsenergie, und 1 Gy entspricht 1 J/kg.
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Nicht
bestrahlte oder bestrahlte Natriumcarboxymethylcellulose wurde in
destilliertem Wasser gelöst und
gefriergetrocknet. Danach wurde das gefriergetrocknete Produkt in
einem Mörser
zermahlen und das erhaltene Pulver zur Bestimmung des Molekulargewichts
und in den folgenden Beispielen verwendet.
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Das
Molekulargewicht wurde wie folgt bestimmt.
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Das
Pulver aus der unbestrahlten oder bestrahlten Natriumcarboxymethylcellulose
wurde in 50 mM Tris-HCl-Puffer, der 0,15 M NaCl enthielt, gelöst und auf
eine Sepharose-CL-6B-Säule aufgegeben,
die mit demselben Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war,
um eine Molekularsiebchromatographie durchzuführen. Die Natriumcarboxymethylcellulose
wurde durch ein Phenol-Schwefelsäure-Verfahren detektiert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.
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In
Tabelle 1 ist gezeigt, dass Natriumcarboxymethylcellulose durch
die Bestrahlung mit Elektronenstrahlen zu einer Verbindung mit niedrigem
Molekulargewicht abgebaut werden kann.
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Herstellungsbeispiel 2:
Herstellung eines Gewebebeklebungsmittels
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Humanes
Vollblut wurde zentrifugiert, um ein Plasma zu erhalten. Das erhaltene
Plasma wurde mindestens 12 Stunden lang bei –80 °C eingefroren. Danach wurde
das gefrorene Plasma bei 4 °C
langsam aufgetaut und das Zentrifugierröhrchen erneut in einer gekühlten Zentrifuge
zentrifugiert. Der Überstand
wurde sorgfältig
abdekantiert. Das Kryopräzipitat
wurde in dem übrig
gebliebenen Plasma durch Antippen des Röhrchens resuspendiert. Zu der
erhaltenen Suspension des Kryopräzipitats
wurde ein kommerziell erhältliches Thrombin,
um einen Fibrinklebstoff herzustellen, und anschließend die
pulverförmige
unbestrahlte oder bestrahlte Natriumcarboxymethylcellulose (CMC-Na),
die im Herstellungsbeispiel 1 hergestellt worden war, mit einer
Konzentration von 10 mg/ml zugegeben, um ein Gewebebeklebungsmittel
herzustellen. Das erhaltene Gewebebeklebungsmittel, d.h. ein Fibrinklebstoff,
der zugesetzte CMC-Na enthielt, enthielt 0,1 mg/ml Gesamtprote ine,
0,02 NIH-Einheiten/ml Thrombin und 4 mg/ml Fibrinogen.
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Referenzbeispiel 1: Aktivität zum Aggregieren
von Fibrinmonomeren
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Die
pulverförmige
unbestrahlte oder bestrahlte Natriumcarboxymethylcellulose (CMC-Na),
die im Herstellungsbeispiel 1 hergestellt worden war, wurde in einem
20 mM Imidazolpuffer, der 0,15 M NaCl enthielt, bis auf eine Konzentration
von 10 mg/ml gelöst.
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Zu
0,5 ml der erhaltenen Lösung
wurden 20 μl
einer Fibrinmonomerlösung
(A280 nm = 6), die durch Lösen
von Fibrinmonomeren in 20 mM Essigsäure hergestellt worden war,
zugegeben und 5 Sekunden lang vermischt. Danach wurde das Gemisch
in eine Quarzzelle mit einer optischen Weglänge von 1 cm gefüllt. Nach 20
Sekunden Zugabe von Fibrinmonomeren wurden alle 30 Sekunden über 25 Minuten
der Absorptionsgrad bei 350 nm gemessen. Als Kontrollversuch wurde
derselbe Vorgang wiederholt, außer
dass die pulverförmige Natriumcarboxymethylcellulose
nicht verwendet wurde. Der Absorptionsgrad wurde mit einem UV-VIS-Spektralphotometer
(U-3210, Hitachi Ltd.) gemessen. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt,
wobei die Kurve 1 das Ergebnis des Vorhandenseins von CMC-Na,
die nicht mit Elektronenstrahlen bestrahlt worden war, Kurve 2 das
Ergebnis des Vorhandenseins von CMC-Na, die mit 10 kGy bestrahlt
worden war, Kurve 3 das Ergebnis des Vorhandenseins von
CMC-Na, die mit 20 kGy bestrahlt worden war, Kurve 4 das
Ergebnis des Vorhandenseins von CMC-Na, die mit 40 kGy bestrahlt
worden war, Kurve 5 das Ergebnis bei Vorhandensein CMC-Na, die
mit 60 kGy bestrahlt worden war, Kurve 6 das Ergebnis bei
Vorhandensein von CMC-Na, die mit 80 kGy bestrahlt worden war, und
Kurve 7 das Ergebnis bei Vorhandensein von CMC-Na, die
mit 100 kGy bestrahlt worden war, ist. Weiterhin zeigt Kurve C das
Ergebnis des Kontrollversuchs.
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In 1 ist
gezeigt, dass von der Natriumcarboxymethylcellulose die Aggregation
von Fibrinmonomeren unabhängig
von der Bestrahlung mit Elektronenstrahlen, d.h. innerhalb ihres
breiten Molekulargewichtsbereichs, deutlich beschleunigt wird.
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Beispiel 1: Wachstum von
humanen Endothelzellen der Nabelvene im Gewebebeklebungsmittel
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Das
Wachstum humaner Endothelzellen einer Nabelvene im Gewebebeklebungsmittel
(enthielt 10 mg/ml Natriumcarboxymethylcellulose mit einem Molekulargewicht
von 200 kD), das im Herstellungsbeispiel 2 hergestellt worden war,
wurde untersucht. Humane Endothelzellen der Nabelvene wurden mit
einer Dichte von 1106 Zellen/ml in das Gewebebeklebungsmittel
eingebettet. Das verwendete Kulturmedium war M299 (Sigma Chemical),
das 10 % Rinderfötusserum,
10 μg/ml
Streptomycin, 100 U/ml Penicillin, 1 mg/ml sauren Fibroblastenwachstumsfaktor
und 10 U/ml Heparin enthielt.
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Die
in dem Gewebebeklebungsmittel eingebetteten Zellen wurden innerhalb
von 6 Stunden schmal und mehrfüßig und,
wenn sie miteinander in Berührung
kamen, bildeten sich Zellnetzwerke. Das Wachstums wurde mindestens
3 Tage lang aufrechterhalten. Als Kontrollversuch wurde derselbe
Vorgang wiederholt, außer
dass ein Gewebebeklebungsmittel verwendet wurde, das wie im Herstellungsbeispiel
2, aber ohne Natriumcarboxymethylcellulose hergestellt worden war.
Im Kontrollversuch waren die Zellen kugelförmig und es bildeten sich keine
Zellnetzwerke. Dieser Zustand dauerte mindestens 3 Tage lang an.
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Aus
dem Vorhergehenden geht hervor, dass, wenn Natriumcarboxymethylcellulose
zugesetzt wird, Endothelzellen wachsen.
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Beispiel 2: Heilung einer
Verletzung in vivo
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Es
wurde die Wirkung des Fibrinklebstoffs mit zugesetzter CMC-Na auf
die Heilung von Verletzungen bei diabetischen Mäusen untersucht. Zwei Verletzungen
(etwa 1 cm × etwa
1 cm, Tiefe = etwa 6 mm) wurden jeweils auf der Rückenhaut
der sechs Mäuse
angebracht. Das Gewebebeklebungsmittel (enthielt 10 mg/ml Natriumcarboxymethylcellulose
mit einem Molekulargewicht von 200 kD), das im Herstellungsbeispiel
2 hergestellt worden war, wurde in eine der Verletzungen gefüllt, während ein
Gewebebeklebungsmittel, das wie im Herstellungsbeispiel 2, aber
ohne Natriumcarboxymethylcellulose (Fibrinklebstoff ohne CMC-Na)
hergestellt worden war, in die andere Verletzung gefüllt wurde.
Nach 9 Tagen wurde Gewebeschnitte (Dicke = 5 μm) von den zwei Verletzungen
und einer normalen Haut ohne Verletzung (zur Kontrolle) entnommen
und mit Hämatoxylin
und Eosin angefärbt.
Der Heilungsgrad der Verletzungen in den Gewebeschnitten wurde von
drei Analytikern in einem Blindversuch bewertet. Insbesondere wurde
der Heilungs grad der Verletzungen in 16 Stufen (0 Punkte bedeutet
nicht verheilt bis zu 15 Punkten, die eine komplette Heilung bedeuten)
in Bezug auf die Abscheidung von Collagen, die Regeneration der
Epithelzellen, die Dicke von teilchenförmigen Geweben und Dichte der
entzündeten
Zellen, der Fibroblasten und Kapillargefäße bewertet. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 2 aufgeführt.
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Tabelle
2 ist zu entnehmen, dass die Gewebeschnitte, die von den Verletzungen
angefertigt wurden, die mit dem Fibrinklebstoff, der kein CMC-Na
enthielt, behandelt worden waren, immer eine geringe Punktzahl aufwiesen,
während
die Gewebeschnitte, die von der normalen Haut und den Verletzungen
angefertigt wurden, die mit dem Fibrinklebstoff, der CMC-Na enthielt,
behandelt worden waren, hohe Punktzahlen erreichten.
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Beispiel 3: Heilungseffekt
bei Verletzungen
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Es
wurde der Heilungseffekt bei Verletzungen eines Natriumcarboxymethylcellulose
enthaltenden Fibrinklebstoffs untersucht.
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Die
Leber von 10 Mäusen
wurde durch eine Bauchoperation freigelegt, und es wurden zwei quadratische
Teile (jeweils 1 cm × 1
cm) aus der Oberfläche
jeder Leber herausgeschnitten, um Wunden zu erzeugen. Eine Verletzung
wurde mit dem Gewebebeklebungsmittel (das 10 mg/ml Natriumcarboxymethylcellulose
mit einem Molekulargewicht von 200 kD enthielt), das in Beispiel
2 hergestellt worden war, bedeckt, während die andere Verletzung
mit einem Gewebebeklebungsmittel, das wie in Herstellungsbeispiel
2, aber ohne Natriumcarboxymethylcellulose (Fibrinklebstoff ohne
CMC-Na) hergestellt worden war, bedeckt wurde. Danach wurde der
Bauchbereich verschlossen. Nach einem Monat wurde die Leber erneut
freigelegt und ein Gewebeschnitt von dem Teil angefertigt, der mit
dem Fibrinbeklebungsmittel bedeckt war. Der Heilungsgrad wurde bewertet.
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Es
wurde festgestellt, dass die Verletzungen, die mit dem Fibrinklebstoff,
der Natriumcarboxymethylcellulose enthielt, behandelt worden waren,
vollständig
ausgeheilt waren und keine Entzündung
beobachtet werden konnte, während
viele Leukocyten und eine sehr schwere Entzündung bei den Verletzungen
beobachtet wurden, die mit dem Fibrinklebstoff, der keine Natriumcarboxymethylcellulose
enthielt, behandelt worden waren.
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Beispiel 4: Anhaftungs-
und Agglutinierungseigenschaften von Blutplättchen
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Die
Anhaftungs- und Agglutinierungseigenschaften von Blutplättchen an
dem Fibrinklebstoff, der Natriumcarboxy methylcellulose enthielt,
wurden untersucht. Eine Lage aus dem Gewebebeklebungsmittel (enthielt
10 mg/ml Natriumcarboxymethylcellulose mit einem Molekulargewicht
von 200 kD), das im Herstellungsbeispiel 2 hergestellt worden war,
und eine Lage eines Gewebebeklebungsmittels, das wie im Herstellungsbeispiel
2, aber ohne Natriumcarboxymethylcellulose (Fibrinklebstoff ohne
CMC-Na) hergestellt worden war, wurde auf einer 96-Loch-Titerplatte
angeordnet, wonach eine humane Vollblutprobe darauf gefüllt wurde.
Die Adhäsion
wurde durch das Verfahren von Haverstick, D.M. et al. (Blood, 66,
946 (1985)) gemessen.
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Es
wurde festgestellt, dass bei dem Gewebebeklebungsmittel, das keine
Natriumcarboxymethylcellulose enthielt, Adhäsion und Agglutinierung von
Blutplättchen
selten beobachtet wurde, während
bei dem Gewebebeklebungsmittel, das Natriumcarboxymethylcellulose
enthielt, eine beträchtliche
Anzahl von Plättchen anhaftete
und agglutinierte. Weiterhin wurden von Plättchen entstammende Wachstumsfaktoren
wie PDGF, TGF-β und
dergleichen in dem Überstand
detektiert, der durch Füllen
einer humanen Vollblutprobe auf das Gewebebeklebungsmittel, das
Natriumcarboxymethylcellulose enthielt, und 24 Stunden langes Stehenlassen
bei 37 °C
erhalten worden war, detektiert.
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Wie
weiter oben kann das erfindungsgemäße Carboxymethylcellulose enthaltende
Gewebebeklebungsmittel den Kontakt mit einer Verletzung oder mit
in vitro kultivierten Zellen über
einen langen Zeitraum aufrechterhalten und einen engen Kontakt mit
den Blutplättchen
verstärken.
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Das
erfindungsgemäße Gewebebeklebungsmittel
kann direkt auf ein verletztes Gewebe durch ein beliebiges Mittel,
beispielsweise auf eine Verletzung der Hautoberfläche beschichtet,
aufgebracht werden. Weiterhin kann das erfindungsgemäße Gewebebeklebungsmittel
direkt auf eine intrakorporale Verletzung während einer Operation auf einen
Knochen oder dergleichen aufgebracht werden.
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Das
erfindungsgemäße Gewebebeklebungsmittel
ist nützlich
zur Förderung
der Heilung einer Verletzung, die sich schwierig heilen lässt, wie
einer Verletzung bei einem Diabetiker, und ist besonders nützlich als Medium,
das es einem oder mehreren von Blutplättchen freigesetzten Wachstumsfaktoren
erlaubt, eine Läsion durch
Anhaften und Agglutinieren der Blutplättchen zu erreichen und anschließend den
Kontakt einer intrakorporalen Verletzung mit Wachstumsfaktoren über eine
lange Zeit aufrechtzuerhalten. So kann beispielsweise das erfindungsgemäße Beklebungsmittel
verwendet werden, um die Heilung einer intrakorporalen Verletzung wie
eines Bruchs oder eines Magengeschwürs zu beschleunigen oder zu
verstärken.
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Das
erfindungsgemäße Gewebebeklebungsmittel
ist biologisch abbaubar und kann von einem Gewebe assimiliert werden.
Weiterhin ermöglicht
es Wachstumsfaktoren, mit ihren Rezeptoren über eine lange Zeit in Berührung zu
kommen, und erlaubt das Hervorrufen potenter biologischer Effekte.
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Mit
dem erfindungsgemäßen Gewebebeklebungsmittel
ist es möglich,
die Konzentration von Gesamtproteinen und Fibrinogen, im Vergleich
mit einem herkömmlichen
Beklebungs mittel, zu verringern. Aufgrund der niedrigen Konzentration
können
tierische Zellen in das erfindungsgemäße Gewebebeklebungsmittel wandern,
hindurchgehen und wachsen, weshalb es die Verfestigung von dem benachbarten
Gewebe und benachbarten Zellen durch Protease unterstützen kann.
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Weiterhin
kann das erfindungsgemäße Gewebebeklebungsmittel
in flüssiger
Form hergestellt werden und somit besser und ausgedehnter als ein
herkömmliches
Abgabesystem eine Oberfläche
bedecken. Deshalb kann das Carboxymethylcellulose enthaltende Fibrinbeklebungsmittel
das Innere, das Äußere und
die Poren eines Blutgefäßes bedecken
und somit eine Thrombusbildung und die Entwicklung einer Antigenität verringern.
