DE60121826T2

DE60121826T2 - Fibrinmaterial und verfahren zu seiner herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE60121826T2
Application number: DE60121826T
Authority: DE
Inventors: Yves Delmotte; James Antioch DIORIO
Original assignee: Baxter International Inc
Current assignee: Baxter International Inc
Priority date: 2001-05-09
Filing date: 2001-05-09
Publication date: 2007-02-22
Anticipated expiration: 2021-05-10
Also published as: WO2002089868A1; EP1387703A1; EP1387703B1; DE60121826D1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Fibrinhydrogelmaterials und insbesondere eines Fibringhydrogelmaterials, das als Arzneistoffabgabevehikel und zur Verhinderung einer postchirurgischen Adhäsion geeignet ist.
Eines der Hauptprobleme bei der intraabdominalen Chirurgie ist die Vermeidung postoperativer Adhäsionen. Es ist bekannt, dass Adhäsionen zu Schmerz, einer Immobilität, einer verzögerten Wundheilung und insbesondere sogar zu einem Darmverschluss, der lebensbedrohlich sein kann, beitragen. In dem Gebiet der gynäkologischen Chirurgie können postchirurgische Adhäsionen, welche die weiblichen Fortpflanzungsorgane betreffen, zu einer Unfruchtbarkeit führen.
Jedes chirurgische Verfahren erzeugt zwangsläufig verschiedene Formen eines Traumas, wenn der Bauchraum oder eine andere menschliche Kavität für eine Untersuchung geöffnet wird. Physiologisch beginnt der Prozess des Wundverschlusses dann, wenn das Bluten nach der Bildung eines hämostatischen Gerinnsels an Stellen, bei denen Blutgefäße verletzt sind, aufhört. Das Gerinnsel, das zunächst vorwiegend Plättchen umfasst, wird durch ein Fibrinnetzwerk verfestigt, das aus der Aktivierung einer Enzymkaskade resultiert, die Thrombin, Faktor XIII und Calcium umfasst. Weitere Schritte auf dem Weg zum Verschluss der Wunde sind ein Zurückziehen des hämostatischen Gerinnsels, eine Invasion verschiedener Zelltypen, einschließlich Fibroblasten, in den Wundbereich, und schließlich die Lyse des Fibrinnetzwerks. Es wird davon ausgegangen, dass die Bildung von Adhäsionen beginnt, wenn das Fibringerinnsel, das eine Verletzung bedeckt, mit einer blutenden angrenzenden Oberfläche in Kontakt kommt und das neue Bindegewebe, das von den Fibroblasten erzeugt wird, die beiden Oberflächen aneinander bindet.
Die mit Adhäsionen zusammenhängenden Probleme erfordern häufig einen weiteren operativen Vorgang zur Entfernung/Lyse der Adhäsionen, was als Adhäsiolyse bezeichnet wird, der wie die erste Operation im Prinzip das Risiko der Bildung zusätzlicher Adhäsionen birgt.
Demgemäß ist die Prävention einer Adhäsionsbildung medizinisch wichtig. Von den verschiedenen Ansätzen zur Prävention einer Adhäsionsbildung umfasst ein Ansatz die Verwendung von Materialien als physikalische oder biomechanische Barriere für die Trennung oder Isolierung von traumatisierten Geweben während des Heilungsprozesses. Als Barriere gegen die Adhäsionsbildung wurden sowohl synthetische Materialien als auch natürliche Materialien verwendet. Permanente inerte Implantate, wie z.B. chirurgische Gore Tex^®-Membranen, die aus geschäumtem Polytetrafluorethylen (PTFE) bestehen, erfordern im Allgemeinen einen zweiten operativen Vorgang, um sie zu entfernen, während andere, wie z.B. chirurgische Membranen aus oxidierter regenerierter Cellulose, biologisch abbaubar sind, bezüglich derer jedoch angenommen wird, dass sie eine Entzündungsreaktion auslösen, die schließlich zur Adhäsionsbildung führt (A.F. Haney und E. Doty, Fertility and Sterility, 60, 550-558, 1993).
Fibrindichtmittel und -kleber sind zur Verwendung bei der Hämostase, der Gewebeabdichtung und der Wundheilung bekannt und seit mehr als einem Jahrzehnt kommerziell erhältlich. Die Verwendung für eine Antiadhäsion und als Arzneistoffabgabevehikel bei der Glaukomchirurgie ist ein Beispiel. Fibrinkleber ahmen den letzten Schritt der Gerinnungskaskade nach und werden üblicherweise als Kits verkauft, die zwei Hauptkomponenten umfassen. Die erste Komponente ist eine Lösung, die Fibrinogen mit oder ohne Faktor XIII umfasst, während die zweite Komponente eine Thrombin-Calcium-Lösung ist. Nach dem Mischen der Komponenten wird das Fibrinogen durch Thrombin proteolytisch gespalten und so in Fibrinmonomere umgewandelt. Faktor XIII wird ebenfalls durch Thrombin in dessen aktivierte Form (FXIIIa) gespalten. FXIIIa vernetzt die Fibrinmonomere zur Bildung eines dreidimensionalen Netzwerks, das üblicherweise als „Fibringel" bezeichnet wird.
Wie es in der veröffentlichten PCT-Patentanmeldung WO 96/22115 des vorliegenden Anmelders beschrieben ist, kann ein selbsttragendes, blattartiges Material aus vernetztem Fibrinmaterial als biomechanische Barriere bei der Behandlung innerer traumatischer Läsionen, insbesondere zur Prävention einer Adhäsionsbildung als postoperative Komplikation verwendet werden. Die '115-Anmeldung beschreibt das Mischen einer Thrombin- und Calcium-enthaltenden Lösung mit einer Fibrinogen- und Faktor XIII-enthaltenden Lösung. Durch die Verwendung hoher Thrombinkonzentrationen zur Katalyse der Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin wurde gefunden, dass das resultierende Fibrinmaterial ausreichend steif ist, so dass es selbsttragend ist, und dass es eine ausreichend geringe Porengröße aufweist, um das Eintreten von Fibroblasten zu verhindern, das die Bildung von Adhäsionen verursacht. Das resultierende Fibrinmaterial konnte jedoch nicht leicht Wasser zurückhalten. Tatsächlich konnte Wasser durch Komprimieren des Materials mit der Hand leicht aus dem Fibrinmaterial ausgetrieben werden. Folglich konnte dieses Fibrinmaterial des klassischen Typs nicht verwendet werden, um Arzneistoffe zu einer Wundstelle zu transportieren, während es im Verlauf des fibrinolytischen Prozesses in den Körper reabsorbiert wird.
Diese Erfindung beseitigt diese und andere Mängel bei den Gegenständen des Standes der Technik. Hydrogelfibrin weist eine dichte Struktur auf, die aus dünnen Fasern aufgebaut ist, die durch eine geringe Porengröße definiert sind. Wasser wird in dem „Hohlraumvolumen" der Struktur eingeschlossen. Das „Hohlraumvolumen" ist klein, regelmäßig und über das gesamte Folienmaterial homogen verteilt. Wasser kann die Folienstruktur aufgrund ihrer inneren Energie nicht verlassen und wird von der Fibrinstruktur abhängig von der fibrinolytischen Geschwindigkeit des Biopolymers freigesetzt. Die Freisetzung eines Arzneistoffs, der in das Wasser oder einen Puffer einbezogen ist, wird durch passive Diffusion und abhängig von dem Molekulargewicht, der Löslichkeit und dem fibrinolytischen Prozess reguliert.
Die Entfernung von Calcium aus dem Prozess der Bildung einer Fibrinstruktur ergibt keine lateralen Assoziationen von Protofibrillen. Der Mangel an Assoziationen von Protofibrillen entspricht einer großen Anzahl von dünnen Fasern pro Einheitsvolumen, wodurch der Fibrinstruktur eine geringe Porengröße verliehen wird. Diese geringe Porengröße ermöglicht es Wasser, in dem „Hohlraumvolumen" eingeschlossen zu bleiben.
Andere Vorteile und Aspekte der vorliegenden Erfindung ergeben sich beim Lesen der folgenden Beschreibung der Zeichnungen und der detaillierten Beschreibung der Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Fibrinhydrogelmaterials bereit, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: das Bereitstellen eines Fibrinogenreagens; das Bereitstellen eines Phosphatpuffer-Calciumchelatisierungsmittels; das Bereitstellen von Thrombin, das im Wesentlichen frei von Calcium ist; und das Mischen des Fibrinogens, des Phosphatpuffer-Chelatisierungsmittels und von Thrombin unter Bildung eines Fibrinhydrogelmaterials, wobei das Fibrinhydrogelmaterial ein Fibrinmaterial mit einem Wassergehalt von mindestens 90 Gew.-%, bezogen auf das Material, umfasst, und wobei das Material mindestens 80 % des Wassers nach Kompression mittels einer Kraft von 156 G zurückbehält.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein ex-vivo-Verfahren zum Befördern von Fibrinhydrogel auf eine Oberfläche bereit, umfassend die Schritte: das Bereitstellen einer flüssigen Lösung von Fibrinogen; das Bereitstellen einer flüssigen Lösung von Thrombin, im wesentlichen frei von Calcium; das Bereitstellen einer flüssigen Lösung eines Phosphatpuffer-Calciumchelatisierungsmittels; das Bereitstellen einer Sprüheinheit in fluider Verbindung mit der Fibrinogenlösung, der Thrombinlösung und dem Phosphatpuffer-Chelatisierungsmittel, wobei die Sprüheinheit befähigt ist, die Fibrinogenlösung, die Thrombinlösung und das Phos phatpuffer-Chelatisierungsmittel in ein Aerosol mit mindestens einer Energiequelle von einer flüssigen Energie, einer mechanischen Energie, einer Vibrationsenergie und einer elektrischen Energie zu atomisieren; das Sprühen der Fibrinogenlösung auf die Oberfläche mit der Sprüheinheit; das Sprühen des Phosphatpuffer-Chelatisierungsmittels auf die Oberfläche mit der Sprüheinheit; das Sprühen der Thrombinlösung auf die Oberfläche mit der Sprüheinheit und das Mischen der Fibrinogenlösung, des Phosphatpuffer-Chelatisierungsmittels und der Thrombinlösung, wobei das Fibrinhydrogel ein Fibrinmaterial mit einem Wassergehalt von mindestens 90 Gew.-%, bezogen auf das Material, umfasst, und wobei das Material mindestens 80 % des Wassers nach Kompression durch eine Kraft von 156 G zurückbehält.
Es ist auch ein medizinischer Gegenstand, der mit den Verfahren erhältlich ist, zur Prävention einer postchirurgischen Adhäsionsbildung und zur gesteuerten Freisetzung von Arzneistoffen im Menschen und in nicht-menschlichen Arten beschrieben. Der Gegenstand umfasst ein Fibrinhydrogelmaterial mit einem Wassergehalt von mindestens etwa 90 Gew.-% des Hydrogels. Das Fibrinhydrogel weist eine Porengröße im Bereich von weniger als 1 μm und vorzugsweise weniger als 0,1 μm und eine Transparenz von weniger als etwa 1,0 AUFS, mehr bevorzugt von weniger als etwa 0,8 AUFS auf, gemessen mit einem Spektrophotometer bei 800 nm. Das Fibrinhydrogel ist im Wesentlichen frei von einer Vernetzung.
Während diese Erfindung in vielen verschiedenen Ausführungsformen vorliegen kann, ist in den Zeichnungen und hier eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung detailliert beschrieben, wobei beachtet werden sollte, dass die vorliegende Offenbarung als Beispiel der Prinzipien der Erfindung verstanden werden soll und den breiten Aspekt der Erfindung nicht auf die veranschaulichten Ausführungsformen beschränken soll.
Eine bevorzugte Form der vorliegenden Offenbarung stellt ein selbsttragendes, biologisch abbaubares Fibrinhydrogelmaterial bereit, das durch Mischen von Fibrinogen- und Thrombinlösungen, die mit einem gelösten Stoff verdünnt sind, der die Wirkung von Calcium auf Fibrinogen in einem Medium mit hoher Ionenstärke inhibiert, und die beide frei von Calcium sind, erhalten wird. Der Stand der Technik beschreibt, dass Calcium eine kritische Komponente zur Bildung eines Fibrinmaterials ist. Das resultierende Hydrogelmaterial weist dünne Fasern und eine geringe Porengröße auf und ist zur Verwendung als Antiadhäsionsbarriere geeignet.
I. Fibrinhydrogelmaterial
Vorzugsweise weist das Fibrinhydrogelmaterial für Antiadäsionsanwendungen eine Porengröße von 1 bis 5 μm und mehr bevorzugt von 0,1 bis 3 μm auf. Das Fibrinhydrogelmaterial behält nach einer Kompression vorzugsweise auch leicht Wasser zurück. Vorzugsweise sollte das Hydrogel 80 bis 90 % von dessen Wassergehalt nach Kompression des Materials mit einer Kraft von 1 bis 14 psi zurückbehalten.
Das Hydrogelmaterial weist einen ausreichend hohen Elastizitätsmodul auf, so dass es selbsttragend ist. Mit selbsttragend ist gemeint, dass ein Fibrinhydrogelmaterial mit einer Länge von 5 cm, einer Breite von 5 cm und einer Dicke von 5 mm an einem Ende gehalten werden kann, ohne dass sich das zweite Ende bezüglich des gehaltenen Endes um mehr als 10° nach unten biegt.
Es ist auch bevorzugt, dass das Fibrinhydrogel relativ optisch transparent ist, und es sollte in einer bevorzugten Form eine optische Dichte, gemessen mit einem Spektrophotometer bei 800 nm, von 0,1 bis 0,2, mehr bevorzugt von 0,1 bis 0,5 und insbesondere von 0,1 bis 0,4 aufweisen. Wie es aus der 1 ersichtlich ist, weist das Fibrinhydrogel ein Netzwerk von Fasern 10 auf, die einen durchschnittlichen Durchmesser in einer bevorzugten Form von weniger als etwa 5,0 µm, mehr bevorzugt von weniger als etwa 2,0 µm und insbesondere von weniger als etwa 1,0 µm oder von jedwedem Bereich oder jedweder Kombination von Bereichen darin aufweisen sollten.
Das Fibrinhydrogel ist ein einschichtiges Material.
In bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Dicke des Fibrinbarrierematerials mindestens 200 µm, wenn die Barriere im feuchten Zustand vorliegt. Vorzugsweise beträgt die Dicke etwa 50 µm und insbesondere bis zu 10000 µm, obwohl davon ausgegangen wird, dass selbst ein Material mit einer Dicke von weniger als 100 µm für die beschriebenen Zwecke geeignet sein kann.
Das Hydrogelmaterial muss auch in den Körper reabsorbierbar oder bioresorbierbar sein. Vorzugsweise wird abhängig von der Konzentration von Fibrinogen und der angewandten Menge ein Fibrinhydrogel von 3 cm × 3 cm × 1 cm innerhalb von 14 Tagen, mehr bevorzugt innerhalb von 10 Tagen und insbesondere innerhalb von 5 Tagen vollständig vom Körper absorbiert worden sein.
Das Fibrinhydrogel kann von klassischem Fibrinmaterial auf verschiedene Arten unterschieden werden. Erstens kann das Fibrinhydrogel eine geringere Porengröße aufweisen als klas sisches Fibrinmaterial mit der gleichen Thrombinkonzentration. Das Fibrinhydrogel weist ungeachtet der eingesetzten Thrombinkonzentration eine geringere Porengröße auf. Dies weist dahingehend einen Vorteil gegenüber klassischen Fibrinmaterialien auf, dass der fibrinolytische Prozess über physiologischen Konzentrationen aufrechterhalten oder verstärkt wird.
Klassische Fibrinmaterialien nutzen große Mengen an Calcium, wodurch der fibrinolytische Prozess behindert wird. Der fibrinolytische Prozess wird durch die Gegenwart von gammagamma-Vernetzungen in dem Fibrinmaterial, die durch die Gegenwart von überschüssigem Calcium verursacht werden, verlangsamt. Die niedrigere Konzentration von Calcium in dem Fibrinhydrogelmaterial inhibiert die Vernetzung, wodurch ein schnellerer Abbau des Fibrinhydrogelmaterials ermöglicht wird.
Die längere Zeit, die für den Abbau von klassischen Fibrinmaterialien erforderlich ist, kann auch zu einem höheren Adhäsionsgrad führen. Es wird davon ausgegangen, dass die Antiadhäsionsqualitäten des Fibrinhydrogels auf den Thrombingehalt zurückzuführen sind. Der Thrombingehalt des Fibrinhydrogels ermöglicht eine höhere fibrinolytische Geschwindigkeit als klassische Fibrinmaterialien.
Ein weiterer Unterschied ist das Vermögen des Fibrinhydrogels, Wasser unter Kompressionskräften zurückzubehalten. Der Grad der Wasserretention in dem Fibrinhydrogel übersteigt die Wasserretention der klassischen Fibrinmaterialien stark. Dieser Permeabilitätsfaktor ist ein primärer Unterschied zwischen dem Fibrinhydrogel der vorliegenden Erfindung und klassischen Fibrinmaterialien. Die niedrige Geschwindigkeit der Wasserfreisetzung durch das Fibrinhydrogelmaterial ermöglicht es, dass das Hydrogel durch die Freisetzung von Wasser als Schmiermittel wirkt, wodurch dessen Antiadhäsionseigenschaften weiter verstärkt werden.
II. Verfahren zur Bildung eines Fibrinhydrogels
Von den Erfindern der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass ein Fibrinhydrogelmaterial in der Abwesenheit einer Calcium-enthaltenden Lösung und in der Abwesenheit einer Faktor XIII-enthaltenden Lösung gebildet werden kann, von denen bisher angenommen wurde, dass es sich um essentielle Komponenten handelt. In einer bevorzugten Form der Erfindung wird ein Fibrinhydrogel durch Mischen einer Fibrinogen-enthaltenden Lösung mit einer Thrombin-enthaltenden Lösung erhalten. Die Fibrinogenlösung sollte 1,5 bis 100 mg/ml, mehr bevorzugt 3 bis 70 mg/ml und insbesondere 45 mg/ml Fibrinogen aufweisen, das in einer Lösung gelöst ist, die Komponenten enthält, welche Calcium chelatisieren können. Die Chelatisierungskomponente sollte auch nicht-toxisch sein und ist in einer bevorzugten Form der Erfindung eine Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) mit physiologisch akzeptablen Konzentrationen. Das Chelatisierungsmittel sollte ein Antagonist für die Fibrinopeptid-Transmidationsreaktion bei 5 IU bis 300 IU sein.
Ebenfalls im Gegensatz zu den Lehren im Stand der Technik bestimmt die Thrombinkonzentration der gemischten Komponenten nicht die Porengröße des Hydrogelfibrinmaterials. Wie es nachstehend diskutiert wird und in den 1 bis 5 gezeigt ist, wurden Fibrinhydrogelmaterialien mit relativ identischer Porengröße trotz der Verwendung von Thrombinkonzentrationen von 1 IU bis 300 IU gebildet. Es wurde gefunden, dass die Konzentration von Thrombin nach wie vor die Geschwindigkeit der Bildung eines Fibrinhydrogels steuert.
Es ist bekannt, dass das Mischen einer ersten Lösung, die Fibrinogen mit Faktor XIII enthält, und einer zweiten Lösung von Thrombin mit Calcium zur Bildung eines Fibrinmaterials mit einer ausgeprägten lateralen Assoziation und einer beträchtlichen Vernetzung zwischen dessen dicken Fasern führt. Es ist auch bekannt, dass Thrombin als Protease wirkt, die Fibrinopeptid A und B von dem Fibrinogenmolekül abspaltet und es in Fibrin umwandelt. Es wurde berichtet, dass die Fibrinopeptide von Wirbeltierarten eine große negative Nettoladung aufweisen. Die Gegenwart dieser und anderer negativ geladener Gruppen in den Fibrinopeptiden sind wahrscheinlich Faktoren beim Auseinanderhalten von Fibrinogen. Deren Freisetzung durch Thrombin verleiht Fibrinmonomeren ein unterschiedliches Oberflächenladungsmuster, was zu ihrer spezifischen Aggregation führt. Insbesondere ändert die Entfernung der Fibrinopeptide die Nettoladung der zentralen globulären Einheit von –8 auf +5. Jede der endständigen globulären Einheiten weist eine Nettoladung von –4 auf. Folglich stabilisieren die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen den endständigen und den zentralen globulären Einheiten möglicherweise die Struktur von Fibrin.
Es ist auch bekannt, dass Calciumionen eine wichtige Rolle bei der Dissoziation der Faktor XIII-Untereinheit A von der Faktor XIII-Untereinheit B spielen, wenn Faktor XIII in dessen aktivierte Form, Faktor XIIIa, umgewandelt wird. Ferner ist bekannt, dass Faktor XIIIa für die Vernetzung von Fibrinmonomeren kritisch ist. Es ist auch bekannt, dass die Breiten der Fasern, die das Fibrinmaterial umfassen, durch Erhöhen des pH-Werts und der Ionenstärke der Verdünnungsmittel vermindert werden können.
Durch Entfernen von (chelatisierenden) Calciumionen, die an Fibrinogen gebunden sind, waren die Erfinder in der Lage, die Fibrinstruktur zu modifizieren, um weitere Ausführungsformen des Fibrinhydrogels zu erhalten. Demgemäß nutzt die vorliegende Erfindung eine Lösung, die Calciumionen, die mit den Fibrinogenmolekülen assoziiert sind, einfangen kann. In einer bevorzugten Form der Erfindung ist die Lösung eine Phosphatpufferlösung mit einer Konzentration, die physiologisch akzeptablen Konzentrationen entspricht. Die Erfinder schlagen vor, dass die resultierenden strukturellen Modifizierungen des Fibrinhydrogels als Ergebnis eines „Ladungseffekts" stattfinden, der die vorstehend genannten elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen den endständigen und den zentralen globulären Einheiten verändert, wodurch die laterale Assoziation von Fibrin inhibiert wird. In weiteren Ausführungsformen des Fibrinhydrogels verändert die Modifizierung der Faktor XIII-Konzentration, die bei der Fibrinsynthese eingesetzt wird, die Vernetzungseigenschaften des fertigen Fibrinmaterials. Folglich haben die Erfinder in weiteren Ausführungsformen der Erfindung ein Fibrinhydrogel entwickelt, das mit niedrigen Konzentrationen von Thrombin und bezüglich der lateralen Assoziation und der Faserdicke der resultierenden Fibrinhydrogelstruktur gemäß den Spezifikationen des Endanwenders synthetisiert werden kann.
Während der Bildung eines Fibrinhydrogels ist es bevorzugt, dass das gesamte Fibrinogen in Fibrin umgewandelt wird, da Restmengen von Fibrinogen zur Adhäsionsbildung bei der Reaktion mit Thrombin führen können, das im Körper vorliegt. Demgemäß umfasst das Fibrinhydrogel in weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ferner weniger als 5 Gew.-% Fibrinogen, vorzugsweise weniger als 4 Gew.-% Fibrinogen, vorzugsweise weniger als 3 Gew.-% Fibrinogen, vorzugsweise weniger als 2 Gew.-% Fibrinogen und insbesondere weniger als 1 Gew.-% Fibrinogen, bezogen auf das Gesamttrockengewicht des Fibrinogens plus Fibrin. Für die Zwecke der Bestimmung des Fibrin- und Fibrinogengehalts der Fibrinfolie können SDS-PAGE-Verfahren (SDS-Gelelektrophorese) verwendet werden.
Die medizinischen Gegenstände, die in der 6 gezeigt und weiter in dem US-Patent 5,989,215 des vorliegenden Anmelders beschrieben sind, können topisch, bei einer Chirurgie des offenen Typs (z.B. einer laparotomischen Chirurgie) oder bei einer minimal invasiven Chirurgie (z.B. einer laparoskopischen Chirurgie) eingesetzt werden. Selbstverständlich gibt es andere Typen einer Chirugie des offenen Typs und einer minimal invasiven Chirurgie, wie es dem Fachmann bekannt ist. Die medizinische Vorrichtung 20 kann zur Bildung eines Fibrinhydrogelmaterials innerhalb und außerhalb des tierischen Körpers verwendet werden.
Es ist auch ein Verfahren zur Herstellung einer selbsttragenden Fibrinhydrogelmatrix oder -folie außerhalb des Körpers beschrieben, welches die Schritte umfasst:

(a) Mischen eines Stroms einer ersten, Fibrinogen-enthaltenden Lösung, die in PBS gelöst ist, mit einem Strom einer zweiten, Thrombin-enthaltenden PBS-Lösung;
(b) Aufbringen des erhaltenen Gemischs auf einen festen Träger oder Mischen der Komponenten des festen Trägers; und
(c) Inkubieren des Gemischs zur Bildung der Hydrogelmatrix.

Um im Schritt (a) ein möglichst homogenes Gemisch (und folglich ein homogenes Endprodukt) zu erhalten, wird ein Strom einer ersten, Fibrinogen-enthaltenden Lösung mit einem Strom einer zweiten, Thrombin-enthaltenden Lösung durch gleichzeitiges Abgeben der Komponenten gemischt. Es ist auch möglich, eine Komponente auf eine Oberfläche abzugeben, worauf die andere Komponente folgt. Vorzugsweise werden gleiche Volumina der ersten und der zweiten Lösung gemischt. Wenn die verschiedenen Volumina der ersten und der zweiten Lösung gemischt werden sollen, ist es bekannt, welche Maßnahmen ergriffen werden müssen, um sicherzustellen, dass ein homogenes Gemisch erhalten wird.
Unter Verwendung der vorstehend genannten Abgabevorrichtung wird das resultierende Gemisch über der Oberfläche eines festen Trägers, wie z.B. einer Petrischale oder dergleichen, die geneigt ist, ausgebreitet, so dass vor dem Beginn der Bildung des Hydrogelmaterials möglichst die gesamte Oberfläche bedeckt wird.
Zum Zwecke der Herstellung eines Fibrinhydrogels auf Säugergewebe schlagen die Erfinder ein Verfahren vor, das die Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen einer ersten Phosphatpufferlösung, die Fibrinogen enthält;
(b) Bereitstellen einer zweiten Phosphatpufferlösung, die Thrombin enthält;
(c) Mischen der ersten Lösung und der zweiten Lösung vor oder nach dem Anordnen des Gemischs auf einem tierischen Gewebe;
(d) und Erhalten eines Fibrinhydrogelmaterials mit einer dichten Struktur und einer geringen Porengröße, das für die postchirurgische Adhäsionsprävention geeignet ist.

Die Fibrinogen- und Thrombinlösungen können zu Beginn in einer Abgabevorrichtung gemischt werden oder sie können zu einem Spray atomisiert bzw. zerstäubt und in der Form von Spraytröpfchen, während sie sich in der Luft befinden oder bei einem ersten Kontakt mit der Gewebeoberfläche oder während sie durch einen Mehrfachlumenkatheter abgegeben werden, gemischt werden.
Das Fibrinhydrogel kann unter Verwendung der Bestandteile eines Kits gebildet werden. Eine bevorzugte Ausführungsform des Fibrinhydrogelkits umfasst:

(a) Einen Behälter mit Proteinen, die Fibrinogen umfassen;
(b) einen Behälter mit Thrombin;
(c) einen Behälter mit einer Phosphatpufferlösung, die als Verdünnungsmittel dient; und
(d) eine geeignete periphere Misch- und Aufbringvorrichtung, einschließlich unter anderem Spritzen und Katheter.

Eine weitere Ausführungsform des Fibrinhydrogelkits umfasst einen Behälter, der den Proteincocktail enthält, wobei der Proteingehalt nicht weniger als 30 mg/ml beträgt. Eine weitere Ausführungsform des Fibrinhydrogelkits umfasst einen Behälter, der den Proteincocktail enthält, wobei der Faktor XIII-Gehalt im Bereich von 0 IU/ml bis 80 IU/ml liegt. Eine weitere Ausführungsform des Fibrinhydrogelkits umfasst einen Behälter, der Thrombin enthält, wobei die Konzentration von Thrombin zwischen 0,1 IU/ml und 1000 IU/ml liegt. In einer weiteren Ausführungsform des Fibrinhydrogelkits sind die bereitgestellten Bestandteile vorformuliert, um sicherzustellen, dass dann, wenn sie gemischt werden, das erhaltene Hydrogel eine homogene Struktur mit geringen Porengrößen aufweisen wird, die als Prophylaxe für die Adhäsionsbildung geeignet ist.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Fibrinhydrogelkits umfasst vorformulierte Bestandteile, die bereitgestellt sind, um sicherzustellen, dass das erhaltene Hydrogel beim Mischen eine homogene Struktur mit geringen Porengrößen aufweisen wird, die als Prophylaxe für die Adhäsionsbildung und als Arzneistoffabgabesystem geeignet ist. Eine mangelnde Adhäsion kann bei Fibrinogen festgestellt werden, das frei von FXIII oder einer entsprechend wirkenden Verbindung ist. Das Fibrinhydrogelkit umfasst einen Behälter mit Fibrinogen, das mit inaktiviertem Thrombin gemischt ist, einen Behälter mit einem geeigneten Puffer, eine periphere Vorrichtung, eine Vorrichtung, die mit einer Lichtleitfaser zur Photoaktivierung des Thrombins ausgestattet ist, und eine Lichtquelle. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Fibrinhydrogelkits befinden sich das Fibrinogen, inaktiviertes Thrombin, ein geeigneter Puffer und eine periphere Vorrichtung in einer einteiligen Abgabevorrichtung. Die 7 veranschaulicht eine weitere bevorzugte Ausführungsform, bei der ein mit Druck beaufschlagter Behälter Fibrinogen und Thrombin als Pulver in separaten Beuteln enthält. Der Behälter kann aufgeschraubt werden, um eine Rehydratisierung des Fibrinogens und des Thrombins zu ermöglichen. Ein Erhöhen des Drucks ermöglicht es, dass beide Komponenten durch ein Doppelrohrsystem oder durch konzentrische Kanäle gesprüht werden. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform, 8, nutzt ein Doppelspritzensystem mit Volumina von jeweils weniger als 100, 50 und 20 ml, mehr bevorzugt von jeweils weniger als 20 ml und ins besondere jeweils weniger als 10 ml, jedoch mehr als 3,0 ml. Dieses Doppelspritzensystem ist mit einer Y-förmigen Verbindung ausgestattet, um einen Schlauch einzubringen. Solche Vorrichtungen können für tiermedizinische Anwendungen eingesetzt werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann das Fibrinhydrogelmaterial zu Gegenständen verarbeitet werden, die aus der Gruppe bestehend aus Folien, Schläuchen und Pellets ausgewählt sind. Diese Fibrinhydrogelmaterialien können unter Verwendung von Techniken, die aus der Gruppe von Extrusion, Formen und Thermoformen ausgewählt sind, zu Gegenständen ausgebildet werden. Diese Fibrinhydrogelmaterialien können bei einer Temperatur von unterhalb 0°C durch Gammastrahlung sterilisiert, bei einer Temperatur von unterhalb 0°C gelagert und nach Bedarf verwendet werden. Die Sterilisation mittels Gammastrahlung findet unterhalb von –25°C bei einer Dosis von mindestens 25 kGy statt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Fibrinhydrogelkits enthält der Verdünnungsmittelbehälter eine Phosphatpufferlösung. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Fibrinhydrogelkits enthält der Verdünnungsmittelbehälter einen Puffer mit hoher Ionenstärke, der das mit Calcium verknüpfte Fibrinogen einfangen kann. Andere geeignete Lösungen umfassen Natriumcitrat-, Kaliumcitrat-, EDTA-, EGTA-, Chloridlösungen, Phosphatlösungen oder andere Ionenlösungen mit einer starken Affinität für Calcium. Fibrinogen, Thrombin und andere Proteine, wie z.B. Fibronectin und FXIII können von einem Einzeldonator, mehreren Donatoren, gepoolten Donatoren, einer Cohn I-Fraktion stammen oder rekombinant sein. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Fibrinhydrogelkits enthält der Verdünnungsmittelbehälter einen Puffer, der exogenes Calcium chelatisieren kann.
III. Therapeutisches Fibrinhydrogel
Es ist ein Fibrinhydrogel beschrieben, das ein Verdünnungsmittel oder ein therapeutisches Mittel freisetzbar zurückbehält. Das therapeutische Mittel wird innerhalb der Poren des Hydrogelmaterials zurückbehalten und wird, wenn es im Körper eines Säugers angeordnet wird, im Zeitverlauf freigesetzt, wenn das Fibrinhydrogel in den Körper reabsorbiert wird.
Das bzw. die therapeutische(n) Mittel, das bzw. die dafür vorgesehen ist bzw. sind, durch die therapeutische Hydrogelschicht freisetzbar zurückbehalten zu werden, umfasst bzw. umfassen unter anderem pharmazeutische Verbindungen, Antibiotika, fibrinolytische Mittel und Mittel zur Modifizierung einer biologischen Reaktion, insbesondere Cytokine und Wundheilungspromotoren, vorzugsweise in einer Menge bis zu 1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamttrockengewicht von Fibrin plus Fibrinogen. Aufgrund der chemotaktischen Eigenschaften von Thrombin ist für die Zwecke einer Antiadhäsion eine niedrige Thrombinkonzentration bevorzugt. Höhere Konzentrationen von Thrombin können jedoch zur Verkürzung der Gerinnungs zeit erforderlich sein. Die Gerinnungszeit wurde mit einer halbautomatischen BFT II-Vorrichtung von Dade Behring mit Fibrinogen bei 25 mg/ml mit variierenden Thrombinkonzentrationen von 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 und 10,0 IU/ml bestimmt. PBS wurde als Verdünnungsmittel für Fibrinogen und Thrombin verwendet. Die Gerinnungszeiten sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.
Beispiele für fibrinolytische Mittel umfassen t-PA, μ-PA, Streptokinase, Staphylokinase, Plasminogen und dergleichen. Diese Verbindungen fördern die Fibrinolyse und können folglich zur Steuerung der Geschwindigkeit des Fibrinfolienabbaus in vivo verwendet werden. Der Ausdruck „Mittel zur Modifizierung einer biologischen Reaktion" soll sich auf Substanzen beziehen, die an der Modifizierung einer biologischen Reaktion, wie z.B. der Wundheilung, in einer Weise beteiligt sind, die den gewünschten therapeutischen Effekt verstärkt. Beispiele umfassen Cytokine, Wachstumsfaktoren und dergleichen. Aufgrund ihrer intrinsischen mechanischen Eigenschaften erfordert die Fibrinfolie der Erfindung keinerlei zusätzliches Vernetzungsmittel, das toxische Effekte auf den menschlichen oder tierischen Körper haben könnte. Aufgrund der starken Verdünnung kann das Fibrinhydrogel Wasser einfangen bzw. einschließen und freisetzen. Dies ist für die Hydratisierung von Geweben oder für die Funktion als Gleitmittel zur Unterstützung der Antiadhäsionseigenschaften des Fibrinhydrogels nützlich.
Das therapeutische Mittel kann in das Fibrinhydrogelmaterial während der Bildung des Hydrogels einbezogen werden. Das therapeutische Mittel kann entweder wasserlöslich oder wasserunlöslich sein, es kann sich um einen Antikörper, ein antimikrobielles Mittel, ein Mittel zur Verbesserung der biologischen Verträglichkeit, Proteine, entzündungshemmende Verbindungen, Verbindungen zur Verminderung einer Transplantatabstoßung, lebende Zellen, Zellwachstumsinhibitoren, ein Mittel zur Stimulation von Endothelzellen, Antibiotika, Antiseptika, Analgetika, antineoplastische Mittel, Polypeptide, Proteaseinhibitoren, Vitamine, Cytokine, Cytotoxine, Mineralstoffe, Interferone, Hormone, Polysaccharide, genetisches Material, Wachstumsfaktoren, Zellwachstumsfaktoren, Substanzen gegen Cholesterin, Schmerzmittel, Kollagene, Stromazellen, Knochenvorläuferzellen, Polylactat, Alginat, C₂-C₂₄-Fettsäuren und Gemische davon handeln. Die Abgabe des therapeutischen Mittels wird entweder durch die passive Diffusion oder die fibrinolytische Geschwindigkeit oder durch beides reguliert. Das therapeutische Mittel kann in einer der Thrombin- oder Fibrinogenlösung oder in beiden gelöst werden. Das therapeutische Mittel wird durch das Hydrogelmaterial zurückbehalten, wenn sich dieses aus der Mischlösung bildet.
Es ist auch bevorzugt, dass die Fibrinogenlösung eine Viskosität aufweist, die es erlaubt, dass die Lösung versprüht und vorzugsweise unter Verwendung von Drücken versprüht wird, die unter Verwendung einer handbetriebenen Spritze erzeugt werden. Die Fibrinogenlösung sollte eine Viskosität von weniger als 20 Centipoise, mehr bevorzugt von weniger als 10 Centipoise und insbesondere von 1 bis 5 Centipoise oder jedwede Kombination oder Unterkombination dieser Bereiche aufweisen. Die Thrombin-enthaltende Lösung sollte eine Thrombinkonzentration von weniger als 10000 IU Thrombin aufweisen. Der Fibrinkleber wurde vorzugsweise durch Mischen der Fibrinogen-enthaltenden Lösung mit einem gleichen Volumen einer Thrombin-enthaltenden Lösung von mindestens 50 IU Thrombin, vorzugsweise von mindestens 150 IU Thrombin und insbesondere von mindestens 300 IU Thrombin hergestellt.
Andere vorgesehene Ausführungsformen umfassen:

1. Kügelchen eines Hydrogelmaterials zwischen 0,1 mm und 3 mm.
2. Ein anatomisch geformtes Hydrogelmaterial.

Es ist auch ein Fibrinhydrogel beschrieben, das einen höheren Wasseranteil als gegenwärtig erhältliche Fibrinmaterialien zurückbehält. Der höhere Wasserretentionsgrad ist für die therapeutische Anwendung des Hydrogels besonders nützlich. Die Wasserretention ist für die Steuerung der Konzentration an therapeutischen Mitteln erforderlich, die innerhalb des Fibrinhydrogels enthalten sind, sowie für die effektive Freisetzung dieser therapeutischen Mittel und Additive.
Das Vermögen von Fibrinhydrogelen, Wasser zurückzubehalten, während sie Kompressionskräften ausgesetzt sind, wurde getestet und mit dem Wasserzurückbehaltungsvermögen eines klassischen Fibrinmaterials verglichen. Insbesondere wurde eine Kompression durch Zentrifugieren der Materialien bei verschiedenen Drehzahlen durchgeführt und die Menge an zurückbehaltenem Wasser wurde gemessen. Mit einer gekühlten Zentrifuge (Sorvall RT 6000B) wurden Fibrinhydrogele mit unterschiedlichen Drehzahlen zentrifugiert:
1000 U/min für 30 min, entsprechend 156 G
2000 U/min für 30 min, entsprechend 625 G
3000 U/min für 30 min, entsprechend 1428 G
Es wurde ein Amicon-Filter des Typs „Centricon 30" verwendet, der einer Membransperrgrenze von 30000 entspricht und durch eine maximalen Rotationszeit von 30 min und einem Beschleunigungskraftvermögen von 5000 G gekennzeichnet ist. Der Amicron-Filter ist aus zwei Einheiten zusammengesetzt. Die obere Einheit enthält die Filterkomponente selbst und kann an die zweite Einheit des Amicron-Filters angebracht werden. Die zweite oder untere Einheit ist der Bodenbecher. Der Bodenbecher erlaubt das Sammeln von Wasser, das aus dem Fibrinmaterial ausgetrieben wird, das auf dem Filter der oberen Einheit abgeschieden ist. Das in dem Bodenbecher gesammelte Wasser wird zur Messung der Wassermenge verwendet, die von den Fibrinmaterialien bei den verschiedenen Drehzahlen freigesetzt wird. Sobald Fibrinogen- und Thrombinlösungen hergestellt worden sind, wurde ein Volumen von etwa 1 ml Fibrin auf den Filter aufgebracht. Um das Fibrinogen- und Thrombingemisch vollständig und einheitlich zu machen, ist eine geeignete Mischvorrichtung erforderlich.
Der obere und der untere Teil werden vor der Fibrinmaterialabscheidung und nach jedem Zentrifugationsschritt separat gewogen. Ein Korrekturfaktor wird berechnet, um zu berücksichtigen, dass 1 g Fibrin auf dem Filter verteilt worden ist.
Separate Experimente wurden durchgeführt, um die Effekte von Verdünnungsmitteln zu testen. Die Verfahrensschritte für jedes Experiment waren wie folgt:

1) Der Filter und der Bodenbecher des Amicon-Filters werden separat gewogen, dann wird das Fibrinmaterial, das durch Mischen jeder Fibrinogenlösung mit einer 20 IU/ml Thrombinlösung erhalten wird, auf den Filter aufgebracht.

Ein Korrekturfaktor wird berechnet, um zu berücksichtigen, dass 1 g Fibrin auf dem Filter verteilt worden ist.
Der Filter wird 30 min bei 1000 U/min zentrifugiert.
Am Ende des Zentrifugationszyklus wird der Bodenbecher vorsichtig entfernt, gewogen und die erhaltenen Daten werden aufgezeichnet.

2) Der Bodenbecher wird mit dem Filter verbunden und 30 min bei 2000 U/min zentrifugiert, am Ende des Zyklus wird der Bodenbecher gewogen und der kumulative Wert wird aufgezeichnet.
3) Der Bodenbecher wird erneut mit dem Filter verbunden und 30 min bei 3000 U/min zentrifugiert, und am Ende des Zyklus wird der Bodenbecher gewogen.

In dem ersten Experiment wurde der Fibrinogenbehälter mit 3,5 ml destilliertem Wasser rekonstituiert, um eine Endkonzentration von 100 mg/ml Fibrinogen zu erhalten. Verdünnungen des Fibrinogens wurden mit Wasser durchgeführt, um jeweils zu erhalten:
Verdünnung 1:2 (50 mg/ml) in Wasser
Verdünnung 1:4 (25 mg/ml) in Wasser
Verdünnung 1:6 (16,6 mg/ml) in Wasser
Verdünnung 1:8 (12,5 mg/ml) in Wasser
Thrombin (Baxter Hyland) wurde mit 3,5 ml 40 mmol CaCl₂ rekonstituiert, um eine Konzentration von 300 IU/ml zu erhalten. Eine Verdünnung wurde mit CaCl₂ durchgeführt, um eine Thrombinkonzentration von 20 IU/ml zu erhalten.
Fibrinogenlösungen wurden dann mit einem gleichen Volumen von Thrombin (20 IU/ml) gemischt, um eine Endkonzentration von „Fibrinogen" von jeweils
Probe 1: 1:4 verdünnt (25 mg/ml)
Probe 2: 1:8 verdünnt (12,5 mg/ml)
Probe 3: 1:12 verdünnt (8,3 mg/ml)
Probe 4: 1:16 verdünnt (6,25 mg/ml)
zu erhalten.
Für die Probe 1 betrug der Wasserverlust 9,5 %, 25 % und 45 % bei 1000, 2000 bzw. 3000 U/min. Die Probe 2 zeigte einen Wasserverlust von 18 %, 40 % und 70 % bei 1000, 2000 bzw. 3000 U/min. Der Wasserverlust in der Probe 3 betrug 20 %, 40 % und 80 % bei 1000, 2000 bzw. 3000 U/min. Die Probe 4 zeigte einen Wasserverlust von 20 %, 72 % und 90 % bei 1000, 2000 bzw. 3000 U/min. Vgl. die nachstehende Auftragung 1.
Auftragung 1 Fibrinogen und Thrombin in Wasser
Das zweite Experiment war ein Vergleich der Wasserretention zwischen Fibrin, das durch Mischen von Fibrinogen und Thrombin erhalten wurde, die jeweils in PBS rekonstituiert und verdünnt wurden, und Fibrinogen, das in PBS rekonstituiert und verdünnt wurde, und mit Thrombin, das in 40 mmol Calciumchlorid rekonstituiert und verdünnt wurde.
Bei diesen Vergleichen wurde ein Behälter mit Fibrinogen mit 3,5 ml PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH = 7,2) rekonstituiert, so dass eine Endkonzentration von 100 mg/ml Fibrinogen erhalten wurde.
Verdünnungen wurden aus diesem Behälter durchgeführt, um Fibrinogenkonzentrationen von
Probe 1: 1:2 (50 mg/ml) in PBS
Probe 2: 1:4 (25 mg/ml) in PBS
Probe 3: 1:6 (16,6 mg/ml) in PBS
Probe 4: 1:8 (12,5 mg/ml) in PBS
zu erhalten.
Im Experiment 2A wurde Thrombin (Baxter Hyland) mit 3,5 ml PBS rekonstituiert, um eine Konzentration von 300 IU/ml zu erhalten. Eine Verdünnung wurde mit PBS durchgeführt, um eine Thrombinkonzentration von 20 IU/ml zu erhalten.
Im Experiment B wurde Thrombin (Baxter Hyland) mit 3,5 ml 40 mmol CaCl₂ (Calciumchlorid) rekonstituiert, um eine Konzentration von 300 IU/ml zu erhalten. Eine Verdünnung wurde mit CaCl₂ durchgeführt, um eine Thrombinkonzentration von 20 IU/ml zu erhalten.
Die Fibrinogenlösungen wurden dann mit einem gleichen Volumen von Thrombin (20 IU/ml) gemischt, um Endkonzentrationen von Fibrinogen von
Probe 1: 1:4 verdünnt (25 mg/ml) in PBS
Probe 2: 1:8 verdünnt (12,5 mg/ml) in PBS
Probe 3: 1:12 verdünnt (8,3 mg/ml) in PBS
Probe 4: 1:16 verdünnt (6,25 mg/ml) in PBS
zu erhalten.
Bei dem Experiment 2A zeigte die Probe 1 einen Wasserverlust von 6 %, 10 % und 14 % bei 1000, 2000 bzw. 3000 U/min. Die Probe 2 zeigte einen Wasserverlust von 10 %, 21 % und 35 % bei 1000, 2000 bzw. 3000 U/min. Der Wasserverlust in den Proben 3 und 4 lag nahezu identisch bei 11 %, 20 % und 35 % bei 1000, 2000 bzw. 3000 U/min. Vgl. die nachstehende Auftragung 2A.
Auftragung 2A PBS-Verdünnungsmittel für Fibrinogen und Thrombin
Das Einbringen von Calcium in die Fibrinformulierung durch das Verdünnungsmittel, das für die Thrombinverdünnungen im Experiment 2B verwendet wurde, beeinflusste die Wasserretention direkt. Der Wasserverlust war bei 1000 U/min für die Proben nicht signifikant, jedoch nahmen die Wasserverluste für die Proben 2 bis 4 auf etwa 40 % bei 2000 U/min signifikant zu. Bei 3000 U/min nahm der Wasserverlust für die Proben 2 und 3 auf etwa 65 % zu. Ein Wasserverlust von 80 % für die Probe 4 wurde wie bei dem Ergebnis, das für Fibrin erhalten wurde, das im Beispiel 1 beschrieben worden ist, bei 3000 U/min erhalten. Die Ergebnisse dieser Experimente stützen die Hypothese, dass Fibrinstrukturen, die im Wesentlichen frei von Calciumionen sind, auch dichter und kompakter sind und eine höhere Beständigkeit gegen einen Wasserverlust aufgrund von Kompressionskräften aufweisen. Vgl. die nachstehende Auftragung 2B.
Auftragung 2B PBS-Verdünnungsmittel für Fibrinogen CaCl₂ für Thrombin (20 IU)
Als Mittel zur Verifizierung der Rolle von Phosphonat als Komplexierungsmittel der verbleibenden Calciumionen auf Fibrinogenmolekülen wurden Wiederholungen des vorstehend beschriebenen PBS-Experiments durchgeführt, wobei in einem Versuch PBS durch EDTA und in einem zweiten Versuch PBS durch Kaliumcitrat ersetzt wurde. Die Muster des Wasserverlusts sowohl für den EDTA-Versuch als auch für den Kaliumcitrat-Versuch waren mit den Ergebnissen von dem Experiment unter Verwendung von PBS als Rekonstitutionsmittel konsistent, vgl. die nachstehenden Auftragungen 3A und 3B. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass verbleibendes Calcium auf Fibrinogen mit Phosphationen reagiert, wodurch eine kollaterale Assoziation von Protofibrillen verhindert wird, wodurch eine dichte Fibrinstruktur erzeugt wird, die gegen einen Wasserverlust beständiger ist als Fibrinstrukturen, die Calciumionen zurückbehalten.
Auftragung 3A Fibrinogen (EDTA 50 mM)
Auftragung 3B Kaliumcitrat als Verdünnungsmittel für Fibrinogen und Thrombin
Es wurde ein weiteres Experiment durchgeführt, um den Einfluss des FXIII, der in der Formulierung vorliegt, auf das Kompaktierungsvermögen des mit PBS als Verdünnungsmittel sowohl für Fibrinogen als auch für Thrombin erhaltenen Fibrinmaterials zu bestimmen. In diesem Experiment wird ein Behälter mit Fibrinogen (Tisseel von Baxter Hyland-Immuno, Charge P5488797D) mit 4,0 ml PBS (Verdünnung 1:2) rekonstituiert, um eine Endkonzentration von 50 mg/ml Fibrinogen zu erhalten.
Verdünnungen werden aus diesem Behälter durchgeführt, um eine Fibrinogenkonzentration von jeweils
Verdünnung 1:2 (50 mg/ml) in PBS
Verdünnung 1:4 (25 mg/ml) in PBS
Verdünnung 1:6 (16,6 mg/ml) in PBS
Verdünnung 1:8 (12,5 mg/ml) in PBS
zu erhalten.
Thrombin (Baxter Hyland) wird mit 3,5 ml PBS rekonstituiert, um eine Konzentration von 300 IU/ml zu erhalten. Eine Verdünnung wird mit PBS durchgeführt, um eine Thrombinkonzentration von 20 IU/ml zu erhalten. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass zwischen dem Baxter-Fibrindichtmittel, das FXIII enthält (Experiment 2) und dem Baxter Hyland Immuno, das frei von FXIII ist, wenn diese dem Kompaktierungstest unterzogen werden, kein Unterschied besteht. Die aus den Kompaktierungstests erhaltenen Ergebnisse zeigen das gleiche Verhalten für das FXIII-freie Dichtmittel. Vgl. die nachstehende Auftragung 4.
Auftragung 4 PBS als Verdünnungsmittel für Fibrinogen (kein FXIII) und Thrombin 20 IU
Eine Tabelle, welche die Wasserretentionsdaten zusammenfasst, ist nachstehend angegeben.
Tabelle 5
Es wurde postuliert, dass die Ionenstärke von Thrombin die Porengröße einer Fibringerinnungsstruktur reguliert. Durch die Verwendung von Thrombinlösungen mit hoher Ionenstärke kann ein Fibringerinnsel mit einer geringeren Porengröße als mit Thrombinlösungen mit niedrigerer Konzentration erreicht werden. Das vorliegende Beispiel zeigt ein Verfahren zur Herstellung eines Fibringerinnselmaterials, wobei die Konzentration nicht die Porengröße des Fibringerinnsels bestimmt. Wie es vorstehend beschrieben worden ist, beeinflusst die Calciumkonzentration bei der Verwendung eines Chelatisierungsmittels zur Bindung an Calcium die Porengröße nicht. Selbst wenn eine Thrombinkonzentration von 4 IU/ml und eine Thrombinkonzentration von 250 IU/ml verwendet wurden, wies das resultierende Fibrinmaterial im Wesentlichen die gleiche Porengröße auf. Die Ionenstärke wurde mit einem Osmometer gemessen und korrelierte mit der Messung der Trübung bei 800 nm mit einem Spektrophotometer. Die Untersuchung der Netzwerkstruktur der Probe wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie durchgeführt. Die nachstehende Tabelle 6 fasst die Korrelation zwischen der Endosmolarität der Fibrinproben und ihren jeweiligen optischen Dichten zusammen. Die Ergebnisse dieses Experiments veranschaulichen, dass die Ionenstärke, wie sie sich durch die Osmolarität zeigt, die Struktur des Fibringerinnsels nicht reguliert.
Klassische Fibrinmaterialien, die unter Verwendung von Wasser (0 mosm) als Verdünnungsmittel für Fibrinogen und CaCl₂ für Thrombin (4 IU/ml) erhalten wurden, weisen z.B. eine Endosmolarität von 539 mosm auf. Dies ist ein Ergebnis bezüglich Fibrinogen, das mit Wasser bei einer Konzentration von 90 mg/ml (610 mosm) rekonstituiert worden ist, kombiniert mit Thrombin, das mit CaCl₂ bei einer Kitkonzentration von 4 IU/ml (468 mosm) rekonstituiert worden ist. Das resultierende klassische Fibrinmaterial ist lichtundurchlässig mit einer optischen Dichte von 2,8 AUFS, gemessen mit einem Spektrophotometer bei 800 nm.
Fibrinmaterialien, die mit PBS (286 mosm) erzeugt worden sind, weisen eine Endosmolarität von 445 mosm auf. Dies ist ein Ergebnis bezüglich Fibrinogen, das mit PBS bei einer Konzentration von 25 mg/ml (588 mosm) rekonstituiert und verdünnt worden ist, kombiniert mit Thrombin, das mit PBS bei einer Konzentration von 10 IU/ml (315 mosm) rekonstituiert und verdünnt worden ist. Das resultierende Fibrinmaterial ist optisch klar mit einer optischen Dichte von 0,5 AUFS, gemessen mit einem Spektrophotometer bei 800 nm.
Fibrinmaterialien, die mit einem Citratpuffer bei 0,033 M (100 mosm) erzeugt worden sind, weisen eine Endosmolarität von 224 mosm auf. Dies ist ein Ergebnis bezüglich Fibrinogen, das mit Citrat bei einer Konzentration von 50 mg/ml (336 mosm) rekonstituiert und verdünnt worden ist, kombiniert mit Thrombin, das mit Citrat bei einer Konzentration von 20 IU/ml (112 mosm) rekonstituiert und verdünnt worden ist. Das resultierende Fibrinmaterial ist optisch klar mit einer optischen Dichte von 0,45 AUFS, gemessen mit einem Spektrophotometer bei 800 nm. Das Fibrinhydrogelmaterial in diesem Experiment ist klar und aus dünnen Fasern mit einer Ionenstärke van weniger als 300 mosm zusammengesetzt, wobei davon ausgegangen wird, dass es sich um ein physiologisches Niveau handelt. Fibrin, das durch Mischen von Fibrinogen bei 12,5 mg/ml mit Thrombin bei 10 IU erhalten wird, bleibt klar (0,8 AUFS) und weist eine Osmolarität von 167 mosm auf.
Fibrinmaterialien, die mit einem Citratpuffer bei 0,066 M (190 mosm) erzeugt worden sind, weisen eine Endosmolarität von 317 mosm auf. Dies ist ein Ergebnis bezüglich Fibrinogen, das mit Citrat bei einer Konzentration von 50 mg/ml (435 mosm) rekonstituiert und verdünnt worden ist, kombiniert mit Thrombin, das mit Citrat bei einer Konzentration von 20 IU/ml (200 mosm) rekonstituiert und verdünnt worden ist. Das resultierende Fibrinmaterial ist optisch klar mit einer optischen Dichte von 0,23 AUFS, gemessen mit einem Spektrophotometer bei 800 nm. Das Fibrinhydrogelmaterial in diesem Experiment ist ebenfalls klar und aus dünnen Fasern mit einer Ionenstärke von weniger als 300 mosm zusammengesetzt, wobei davon ausgegangen wird, dass es sich um das physiologische Niveau handelt. Fibrin, das durch Mischen von Fibrinogen bei 12,5 mg/ml mit Thrombin bei 10 IU erhalten wird, bleibt klar (0,5 AUFS) und weist eine Osmolarität von 260 mosm auf.
Tabelle 6
Die Puffer spielen auch eine aktive Rolle bei der Permeabilität, dem Faserdurchmesser und dem Verhältnis Masse:Länge des Fibrinmaterials. Signifikante Unterschiede können zwischen PBS und NaCl (0,15 M) festgestellt werden. Diese Puffer weisen die gleiche Osmolarität auf, jedoch weisen ihre Effekte auf Fibrinmaterialien beträchtliche Unterschiede auf, vgl. die nachstehende Tabelle 7. Bei einer Thrombinkonzentration von 2 IU/ml, die mit NaCl bei 0,15 M rekonstituiert worden ist, beträgt die Permeabilität des Fibrins 30,6 × 10^–12 bei einer Fibrinogenkonzentration von 25 mg/ml und 136 × 10^–12 bei einer Fibrinogenkonzentration von 12,5 mg/ml. Die Verwendung von PBS als Puffer führt zu einer Fibrinpermeabilität von 6,9 × 10^–12 bei einer Fibrinogenkonzentration von 25 mg/ml und von 39,5 × 10^–12 bei einer Fibrinogenkonzentration von 12,5 mg/ml. Dieses Experiment zeigt, dass das Fibrinmaterial, bei dem PBS als Puffer eingesetzt wird, nahezu fünfmal weniger permeabel ist als klassische Fibrinmaterialien, wodurch es mehr Wasser zurückbehalten kann. Die Durchmesser der Fasern werden ebenfalls durch den ausgewählten Puffer beeinflusst. Bei einer Thrombinkonzentration von 2 IU/ml, die mit NaCl bei 0,15 M verdünnt worden ist, weisen die Fasern einen Durchmesser von 0,107 µm bei einer Fibrinogenkonzentration von 25 mg/ml und von 0,14 µm bei einer Fibrinogenkonzentration von 12,5 mg/ml auf. Die Verwendung von PBS als Puffer führt zu Fasern mit einem Durchmesser von 0,051 µm bei einer Fibrinogenkonzentration von 25 mg/ml und von 0,075 µm bei einer Fibrinogenkonzentration von 12,5 mg/ml. Zusätzlich wird auch das Verhältnis von Masse:Länge durch den zur Rekonstitution von Fibrinogen und Thrombin ausgewählten Puffer beeinflusst. Bei einer Thrombinkonzentration von 2 IU/ml, die mit NaCl bei 0,15 M gepuffert worden ist, beträgt das Verhältnis von Masse:Länge 8,1 × 10¹² bei einer Fibrinogenkonzentration von 25 mg/ml und 13,9 × 10¹² bei einer Fibrinogenkonzentration von 12,5 mg/ml. Die Verwendung von PBS als Puffer führt zu Fasern mit einem Verhältnis von Masse:Länge von 1,83 × 10¹² bei einer Fibrinogenkonzentration von 25 mg/ml und von 4,03 × 10² bei einer Fibrinogenkonzentration von 12,5 mg/ml, wobei es sich um eine vierfache Verminderung unter dem Wert von NaCl bei 0,15 M handelt.
Bei einer Thrombinkonzentration von 250 IU/ml (Tabelle 8), die mit NaCl bei 0,15 M verdünnt worden ist, beträgt die Permeabilität des Fibrins 14,24 × 10^–12 bei einer Fibrinogenkonzentration von 25 mg/ml und 47,7 × 10^–12 bei einer Fibrinogenkonzentration von 12,5 mg/ml. Die Verwendung von PBS als Puffer führt zu einer Fibrinpermeabilität von 8,9 × 10^–12 bei einer Fibrinogenkonzentration von 25 mg/ml und von 41 × 10^–12 bei einer Fibrinogenkonzentration von 12,5 mg/ml. Dieses Experiment zeigt, dass das Fibrinmaterial, bei dem PBS als Puffer eingesetzt wird, weniger permeabel ist als klassische Fibrinmaterialien, wodurch es mehr Wasser zurückbehalten kann. Die Durchmesser der Fasern werden ebenfalls durch den ausgewählten Puffer beeinflusst. Bei einer Thrombinkonzentration von 250 IU/ml, die mit NaCl bei 0,15 M verdünnt worden ist, weisen die Fasern einen Durchmesser von 0,073 µm bei einer Fibrinogenkonzentration von 25 mg/ml und von 0,083 µm bei einer Fibrinogenkonzentration von 12,5 mg/ml auf. Die Verwendung von PBS als Puffer führt zu Fasern mit einem Durchmesser von 0,057 µm bei einer Fibrinogenkonzentration von 25 mg/ml und von 0,077 µm bei einer Fibrinogenkonzentration von 12,5 mg/ml. Zusätzlich wird auch das Verhältnis von Masse:Länge durch den zur Rekonstitution von Fibrinogen und Thrombin ausgewählten Puffer beeinflusst. Bei einer Thrombinkonzentration von 250 IU/ml, die mit NaCl bei 0,15 M gepuffert worden ist, beträgt das Verhältnis von Masse:Länge 3,78 × 10¹² bei einer Fibrinogenkonzentration von 25 mg/ml und 4,83 × 10¹² bei einer Fibrinogenkonzentration von 12,5 mg/ml. Die Verwendung von PBS als Puffer führt zu Fasern mit einem Verhältnis von Masse:Länge von 2,36 × 10¹² bei einer Fibrinogenkonzentration von 25 mg/ml und von 4,24 × 10¹² bei einer Fibrinogenkonzentration von 12,5 mg/ml.
Diese Experimente veranschaulichen, dass der Typ des verwendeten Puffers den Permeabilitätsfaktor unterschiedlich beeinflusst, wie es für NaCl und PBS gezeigt worden ist (Tabellen 7 und 8). Diese Experimente zeigen, dass die Konzentration von Thrombin keinen Effekt auf den Permeabilitätsfaktor, den Faserdurchmesser und auch auf das Verhältnis von Masse:Länge aufweist, wenn PBS und nicht NaCl der Puffer ist. PBS ist ein Gemisch, das aus 0,13 M NaCl (800 mg/Liter), KCl (20 mg/Liter), wasserfreiem Na₂HPO₄ (115 mg/Liter) und KH₂PO₄ zusammengesetzt ist. Folglich enthält PBS-Puffer NaCl bei einer Molarität nahezu von derjenigen des 0,015 M NaCl-Puffers, der in den Tabellen 7 und 8 beschrieben ist. Gemäß den Daten ist Phosphat daher das Komplexierungsmittel des endogenen Calciums. Die nachstehenden Tabellen 7 und 8 fassen diese Experimente zusammen.
Tabelle 7 – Thrombin 2 IU/ml
Tabelle 8 – Thrombin 250 IU/ml
Berechnung der Permeabilität (Ks): Fluss (ml/s) × Gerinnungszeit × Viskosität (102)/Druck × Oberfläche des Gerinnsels
Berechnung des Faserdurchmessers: D2 = 44,1 × Ks × Fibrinogenkonzentration (X1,3736)
Berechnung des Verhältnisses von Masse:Länge: μ = Π × D2 × C/4X, wobei C = 4,36 g/cm3
Die Rolle von PBS als Komplexierungsmittel zeigt sich auch durch Gelelektrophoreseuntersuchungen von Fibrinmaterialien. Wenn ein elektrischer Strom an eine SDS-Polyacrylimid-Gelelektrophorese angelegt wird, die ein mit PBS hergestelltes Fibrinhydrogelmaterial enthält, ist nur eine geringe oder keine gamma-gamma-Bandenbildung sichtbar, während eine Fibronectinbande sichtbar ist. Dies zeigt, dass PBS Calcium komplexiert, so dass Calcium nicht zur kollateralen Assoziierung von Fibrin durch eine Vernetzung zur Verfügung steht. Klassische Fibrinmaterialien zeigen eine unterscheidbare starke gamma-gamma-Bande und keine Fibronectinbande, wenn sie mit Wasser oder NaCl als Puffer hergestellt werden. Ein NaCl-Puffer mit einer Molarität von 0,15 kann die Wirkung von Calcium nicht blockieren. Das Unvermögen des NaCl-Puffers zur Blockierung der Wirkung von Calcium ermöglicht es, dass Calcium dessen herkömmliche Rolle bei der kollateralen Assoziierung von Fibrin spielt, wodurch Thrombin die Porengröße des Fibrinmaterials beeinflussen kann. Dadurch, dass sie als Komplexierungsmittel für endogenes Calcium wirkt, entfernt PBS das Vermögen von Thrombin wesentlich, die Porengröße zu beeinflussen. Die nachstehende 9 veranschaulicht das klassische Fibrinmaterial bei der Gelelektrophorese. Die nachstehende 10 veranschaulicht das Fibrinhydrogelmaterial bei der Gelelektrophorese.
Es wurde auch festgestellt, dass Fibrinhydrogelmaterialien Antiadhäsionseigenschaften aufweisen. Die nachstehenden Tabellen 9 und 10 veranschaulichen die Antiadhäsionseigenschaften der Fibrinhydrogelmaterialien. Die Tabelle 9 zeigt die Ergebnisse einer Flanken-Modellstudie bei Ratten. Der Blinddarm und die verbindende Parietalwand wurden ausreichend abgetragen, so dass eine Blutung verursacht wurde. Die blutenden Oberflächen wurden kauterisiert, um das Bluten auf den verletzten Oberflächen sowohl bei Kontroll- als auch bei Testtieren zu stoppen. Zwei Typen von Fibrinhydrogelmaterialien wurden zwischen den verletzten Oberflächen ausgebildet. Die Fibrinfolie 1 (FF1) unterscheidet sich von der Fibrinfolie 2 (FF2) dahingehend, dass FF2 komprimiert wurde, um etwas Wasser freizusetzen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Wunden, die entweder mit normalem Fibrinhydrogelmaterial (FF1) oder komprimiertem Fibrinhydrogelmaterial (FF2) behandelt worden sind, keine Adhäsionen zwischen der Blinddarmoberfläche und der Parietaloberfläche aufweisen. Die Kontrollgruppe für die Tabelle 9 wies kein aufgebrachtes Fibrinhydrogelmaterial auf, was zu Adhäsionen vom Niveau 3 (dem schwerwiegendsten Grad) zwischen der Blinddarmoberfläche und der Parietaloberfläche führt.
Die Tabelle 10 zeigt die Antiadhäsionseigenschaften von Hydrogelfibrinklebermaterial. Dieses Hydrogelmaterial polymerisiert innerhalb des Körpers des Tiers beim Aufbringen unter Verwendung einer Abgabevorrichtung, wie sie z.B. in der 6 gezeigt ist. Der Fibrinhydrogelkleber wurde direkt auf die Wunde auf der Blinddarmoberfläche sowie auf die Parietaloberfläche aufgebracht. Alle Tiere, die diese Fibrinhydrogelkleberbehandlung erhielten, waren frei von Adhäsionen. In einem zweiten Versuch wurde ein vorgegossenes Fibrinhydrogelmaterial zwischen verletzten Oberflächen positioniert. Die Verwendung eines vorgegossenen Fibrinhydrogelmaterials zeigte ebenfalls signifikante Antiadhäsionseigenschaften.
Tabelle 9
Tabelle 10

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Fibrinhydrogelmaterials, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: das Bereitstellen eines Fibrinogenreagens; das Bereitstellen eines Phosphatpuffer-Calciumchelatisierungsmittels; das Bereitstellen von Thrombin, das im wesentlichen frei von Calcium ist; und das Mischen des Fibrinogens, des Phosphatpuffer-Chelatisierungsmittels und von Thrombin unter Bildung des Fibrinhydrogelmaterials, wobei das Fibrinhydrogelmaterial ein Fibrinmaterial mit einem Wassergehalt von mindestens 90 Gew.-%, bezogen auf das Material, umfaßt, und wobei das Material mindestens 80% des Wassers nach Kompression mittels einer Kraft von 156 G zurückbehält.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Fibrinogenreagens Fibrinogen, getragen in einem ersten Verdünnungsmittel, umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das erste Verdünnungsmittel eine Phosphat-gepufferte Salzlösung ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Fibrinogen eine Konzentration von 1,5 mg/ml bis 100 mg/ml aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Thrombinreagens Thrombin, getragen in einem zweiten Verdünnungsmittel, umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das zweite Verdünnungsmittel eine Phosphat-gepufferte Salzlösung ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Thrombin eine Konzentration von 1 IU/ml bis 1000 IU/ml aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Fibrinhydrogelmaterial in Gegenstände, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Folien, Schläuche und Pellets, verarbeitet werden kann.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das Fibrinhydrogelmaterial unter Verwendung von Techniken, ausgewählt aus der Gruppe von Extrusion, Formen und Thermoformen, in Gegenstände verarbeitet werden kann.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das Fibrinhydrogelmaterial bei einer Temperatur von unterhalb 0°C mittels Gammastrahlung sterilisiert, bei einer Temperatur von unterhalb 0°C gelagert und nach Bedarf verwendet werden kann.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Sterilisation mittels Gammastrahlung unterhalb von –25°C, bei einer Dosis von mindestens 25 kGy, ist.
Ex-vivo-Verfahren zum Befördern von Fibrinhydrogel auf eine Oberfläche, umfassend die Schritte: das Bereitstellen einer flüssigen Lösung von Fibrinogen; das Bereitstellen einer flüssigen Lösung von Thrombin, im wesentlichen frei von Calcium; das Bereitstellen einer flüssigen Lösung eines Phosphatpuffer-Calciumchelatisierungsmittels; das Bereitstellen einer Sprüheinheit in fluider Verbindung mit der Fibrinogenlösung, der Thrombinlösung und dem Phosphatpuffer-Chelatisierungsmittel, wobei die Sprüheinheit befähigt ist, die Fibrinogenlösung, die Thrombinlösung und das Phosphatpuffer-Chelatisierungsmittel in ein Aerosol mit mindestens einer Energiequelle von einer flüssigen Energie, einer mechanischen Energie, einer Vibrationsenergie und einer elektrischen Energie zu atomisieren; das Sprühen der Fibrinogenlösung auf die Oberfläche mit der Sprüheinheit; das Sprühen des Phosphatpuffer-Chelatisierungsmittels auf die Oberfläche mit der Sprüheinheit; das Sprühen der Thrombinlösung auf die Oberfläche mit der Sprüheinheit und das Mischen der Fibrinogenlösung, des Phosphatpuffer-Chelatisierungsmittels und der Thrombinlösung, wobei das Fibrinhydrogel ein Fibrinmaterial mit einem Wassergehalt von mindestens 90 Gew.-%, bezogen auf das Material, umfaßt, und wobei das Material mindestens 80% des Wassers nach Kompression durch eine Kraft von 156G zurückbehält.
Ex-vivo-Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das Phosphatpuffer-Chelatisierungsmittel PBS ist.
Ex-vivo-Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der Schritt des Sprühens der Fibrinogenlösung auf die Oberfläche gleichzeitig mit dem Schritt des Sprühens der Thrombinlösung auf die Oberfläche erfolgt.
Ex-Vivo-Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der Schritt des Mischens der Fibrinogenlösung und der Thrombinlösung ein im wesentlichen homogenes Gemisch vor Inkontakttreten mit der Oberfläche definiert.
Ex-Vivo-Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der Schritt des Sprühens der Fibrinogenlösung auf die Oberfläche und der Schritt des Sprühens der Thrombinlösung auf die Oberfläche nacheinander erfolgt.