DE10134514A1 - Gemisch aus Knochenmaterial und Collagen zur Reparatur von verletzten Gelenken - Google Patents

Abstract

Das Erzeugnis aus mineralischem Knochenmaterial zur Verwendung bei der Behandlung von miteinander kombinierten Knorpel- und Knochendefekten in Gelenken umfaßt in Teilchenform vorliegendes poröses mineralisches Knochenmaterial, erhalten aus natürlichen Knochen mit einer Kristallstruktur, die im wesentlichen der von natürlichen Knochen entspricht und praktisch frei ist von sämtlichem endogenen organischen Material, wobei die Teilchen zumindest an ihrer Oberfläche Fasern aus resorbierbarem, physiologisch kompatiblem Collagen II aufweisen, wobei das Gewichtsverhältnis der Collagen II-Fasern zu den porösen Teilchen des mineralischen Knochenmaterials wenigstens ca. 1 : 40 beträgt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Reparatur verletzter oder defekter Gelenke.

Gelenke sind bei Säugern von einem Gelenkknorpel überzogen, der den direkten Kontakt gegenüberliegender Knochenflächen verhindert und eine reibungslose wechselseitige Bewegung der miteinander gelenkig verbundenen Knochen ermöglicht.

Es wurde bereits eine Reihe von Vorschlägen für die Reparatur von Verletzungen und Defekten von Gelenkknorpeln gemacht. Die­ se umfassen die Implantierung gezüchteter Chondrocyten an der Stelle der Knorpelverletzung und das Abdecken der Verletzung mit einem Collagenkissen.

Manchmal reicht die Verletzung bzw. der Defekt in einem Gelenk tiefer, d. h. bis unter den Knorpel in den darunter liegenden Knochen hinein. Es besteht daher weiterhin ein Bedarf an Stof­ fen und Verfahren zur Reparatur von Gelenken, bei denen eine Verletzung oder ein Defekt durch den Knorpel hindurch in den Knochen hineinreicht.

Das erfindungsgemäße Erzeugnis aus mineralischem Knochenmaterial zur Verwendung bei der Behandlung von mitein­ ander kombinierten Knorpel- und Knochenverletzungen oder Defekten in Gelenken umfaßt in Teilchenform vorliegendes porö­ ses mineralisches Knochenmaterial, erhalten aus natürlichen Knochen mit einer Kristallstruktur, die im wesentlichen der von natürlichen Knochen entspricht und praktisch frei ist von endogenem organischen Material, wobei die Teilchen zumindest an ihrer Oberfläche Fasern aus resorbierbarem, physiologisch kompatiblem Collagen II aufweisen, wobei das Gewichts­ verhältnis der Collagen II-Fasern zu den porösen Teilchen des mineralischen Knochenmaterials wenigstens ca. 1 : 40 beträgt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt einen zum Teil schematischen Aufriß eines Endes eines gesunden Knochengelenks.

Fig. 2 zeigt einen zum Teil schematischen Aufriß eines Endes eines Knochengelenks, bei dem ein durch den Knorpel hindurch bis in den Knochen reichender Defekt vorliegt.

Fig. 3 zeigt einen zum Teil schematischen Aufriß, bei dem eine erfindungsgemäße Matrix aus mineralischem Knochenmaterial und Collagen in einen Defekt am Ende eines Knochengelenks einge­ fügt wurde.

Fig. 4 zeigt einen teilweise schematischen Aufriß, bei dem eine Collagenmembran oder eine synthetische Membran einen Gelenkdefekt überzieht, der mit der erfindungsgemäßen Matrix aus Knochenmaterial und Collagen gefüllt wurde.

Fig. 5 zeigt eine schematische Seitenansicht einer Membran zur Verwendung entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung.

Fig. 6 zeigt eine schematische Seitenansicht einer anderen Membran zur Verwendung entsprechend einer zweiten Ausführungs­ form der Erfindung.

Die vorliegende Erfindung eignet sich für die Rekonstruktion von Gewebedefekten, und zwar sowohl von Knorpeldefekten, als auch von Knochendefekten, insbesondere bei Gelenken wie Knie und Wirbelsäule.

Das erfindungsgemäße Erzeugnis aus mineralischem Knochenmate­ rial, das aus porösem Knochenmaterial und Collagen II-Fasern besteht, ergibt ein Substrat, welches das Einwachsen nativer Chondrocyten wie nativer Osteocyten in die Matrix zur Beein­ flussung der Knorpel- und Knochenregeneration gewährleistet. Die Collagen II-Matrix des erfindungsgemäßen Erzeugnisses ver­ leiht außerdem dem spröden mineralischen Knochenmaterial Festigkeit.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein gereinigtes, in Teil­ chenform vorliegendes Erzeugnis aus mineralischem Knochenmate­ rial für die Verwendung in der Medizin, wobei die Teilchen des mineralischen Materials von sämtlichem endogenem organischen Material frei sind und wenigstens an der Oberfläche resorbier­ bares, physiologisch verträgliches Collagen II-Material auf­ weisen.

Knochen aus geschlachteten Tieren stellen ein billiges Aus­ gangsmaterial dar, das in großen Mengen zugänglich ist. Sie enthalten 50-60% sehr feinkristallisierten Hydroxylapatit, der durch Collagengewebe gebunden ist und beträchtliche Mengen an Proteinstoffen und anderen Stoffen enthält, sowie damit verbundenes Fett- und Muskelgewebe. Aufgrund seiner biologisch gebildeten Kristallstruktur ist es außerdem ein hochbiokompa­ tibles prothetisches Knochenersatzmaterial. Aufgrund seiner hohen spezifischen Oberfläche kann es schließlich z. B. als Adsorbens oder als Träger für die Slow release-Medikation ver­ wendet werden.

Natürliches mineralisches Knochenmaterial enthält hydroxyapa­ titähnliche Kristallite mit einem spezifischen Kristallini­ tätsgrad, Habitus sowie Größe (unregelmäßige blättchenförmige Morphologie, 5-10 mm dick und 10-50 mm lang) sowie mit einem Oberflächenchemismus, der sich aus dem Verhältnis von Calcium Phosphat (37.5-38.0% Calcium und 15.5-19.0% Phosphat) er­ gibt. Das natürliche mineralische Knochenmaterial enthält au­ ßerdem geringe Mengen an nichtkristallinen Anteilen und einer anderen kristallinen Calciumphosphatphase einschließlich der Minerale Brushit und Nihitlockit sowie Octacalciumphosphat. Die anorganische Phase des Knochens weist Porosität auf ein­ schließlich ultrastruktureller interstitieller Räume (10-100 mm) zwischen den Kristalliten, die auf natürliche Weise ent­ stehen oder sich durch Entfernung der organischen Phase bil­ den, sowie mikroskopisch kleine Zwischenräume (1-20 mm) ein­ schließlich der Osteocytenlakunen, Canaliculi, Gefäßkanäle, Volkmann-Kanäle und Kanäle der Haver'-Systeme (100-500 mm). Die spezifische Oberfläche, die ein Maß für die Porosität ist, liegt, Hg-porosimetrisch ermittelt, in einem Bereich zwischen 50 und 100 m²/g. Die Kristallinität des mineralischen Knochenmaterials kann durch Röntgenbeugung er­ mittelt werden und die Porosität sowie die Kristallitmorpholo­ gie und -größe durch Elektronenmikroskopie. Thermogravi­ metrisch können geringe Mengen an nichtapatitischen Kristalli­ ten nachgewiesen werden.

Die Zusammensetzung und Struktur von natürlichem mineralischem Knochenmaterial kann nicht durch in vitro erzeugte Produkte oder durch vorgängig hergestellte, natürlich vorkommende Hy­ droxyapätite ersetzt werden. Bisher wurden zwei Verfahren zur Reinigung des natürlichen mineralischen Knochenmaterials vor­ geschlagen, und zwar das Glühen und die Lösungsmittelextrak­ tion.

Die für die Verbrennung der organischen Komponenten der Kno­ chen während des Glühens erforderliche Temperatur ist ziemlich hoch. Dies führt zu einer starken Umkristallisation des mine­ ralischen Anteils unter Bildung stark vergröberter Kristalle. Das auf diese Weise gebildete Material zeigt nur eine relativ geringe spezifische Oberfläche. Es kann somit nicht ohne wei­ teres bei der Implantation zur Bildung eines neuen Knochens modelliert werden oder die Implantate können unbegrenzt lange unmodelliert bleiben, obwohl dies für manche Zwecke akzeptabel sein kann.

Bei den Extraktionsprozessen werden die Proteine mit einem geeigneten Lösungsmittel aus dem Knochen extrahiert. Das auf diese Weise erhaltene mineralische Knochenmaterial wird dann zur Entfernung des Lösungsmittels gewaschen.

In beiden Fällen bleibt nach Entfernung der organischen Ver­ unreinigungen aus dem natürlichen Knochen lediglich das mine­ ralische Knochenmaterial zurück, wobei dessen Festigkeit stark eingeschränkt ist und die einzelnen Stücke des gereinigten mineralischen Knochenmaterials extrem spröde sind. Dies erschwert die Verarbeitung des Materials und kann zu uner­ wünschten Wirkungen bei der Implantation führen.

Die US-PS No. 5.573.771, auf die hier eigens Bezug genommen wird, beschreibt ein medizinisch verwendbares mineralisches Knochenmaterialerzeugnis, bei dem der mineralische Knochenan­ teil durch eine Matrix verfestigt wird, die aus Collagen Typ I (Collagen I) oder einem Gemisch aus Collagen I Collagen und Typ III (Collagen III) hergestellt wird.

Collagen kommt in einer Reihe von Formen im tierischen Körper vor und die einzelnen Gewebe enthalten unterschiedliche Mengen der einzelnen Collagentypen. Schwammiges Collagenmaterial, wie es in der Medizin und in der Kosmetik verwendet wird, stammt im allgemeinen aus der Haut und aus Sehnen und besteht vorwie­ gend aus Collagen I und/oder Collagen III. Knochencollagen enthält vorwiegend Collagen I und Collagen II.

Das vorliegende Collagenmaterial kann zusätzlich noch prak­ tisch reines Collagen II, unterschiedliche Mengen an Collagen I, Collagen III und Gemische davon mit Collagen II enthalten. So z. B. kann das Collagen II-Material mit ca. 0.1-10 Gew.-%, vorzugsweise ca. 0.1-5 Gew.-% Collagen III und/oder ca. 1-50 Gew.-% Collagen I gemischt sein.

Das erfindungsgemäße Collagen IT-Material kann jedes der ein­ zelnen Teilchen zur Verbesserung der Verarbeitungseigenschaf­ ten des Erzeugnisses bei der Herstellung und bei seinem Ein­ satz tränken. In diesem Falle liegt das Gewichtsverhältnis Collagen II-Material : gereinigtes mineralisches Knochen­ material vorteilhafterweise bei über 1 : 40, vorzugsweise bei über 1 : 8 und unter 4 : 1 und vorzugsweise bei unter 1 : 2.

Vorteilhafterweise enthält das Collagen II-Material ca. 1-30 Gew.-%, vorzugsweise ca. 5-15 Gew.-% des erfin­ dungsgemäßen mineralischen Knochenmaterialerzeugnisses. Das Collagen II-Material dringt in die poröse Struktur des mineralischen Knochenmaterials ein und ersetzt wirksam einen Teil des natürlichen Eiweißstoffes, der ursprünglich im natür­ lichen Knochen enthalten war, wodurch einerseits Festigkeit gewährleistet wird, aber auch bei der Implantation des minera­ lischen Knochenmaterials immunologische Gewebereaktionen er­ möglicht werden.

Das Collagen II-Material kann zur Bildung einer Matrix für das in Teilchenform vorliegende mineralische Knochenmaterial ver­ wendet werden, aus dem dann Formerzeugnisse hergestellt werden können. In diesem Fall ist es möglich, das Collagen II zusam­ men mit einer gelbildenden makromolekularen Substanz wie Gela­ tine zu verwenden. Das Gewichtsverhältnis des faserförmigen Materials zum mineralischen Knochenmaterial kann z. B. in ei­ nem Bereich von 1 : 40 bis 3 : 20 liegen und z. B. ca. 1 : 10 betra­ gen. Die Gelphase macht vorteilhafterweise 2-20 Gew.-%, wie z. B. ca. 5%, des mineralischen Knochenmaterials aus. Wird als Gelphase Gelatine verwendet, kann diese z. B. mit 0.2% Formal­ dehyd leicht vernetzt werden.

Das mineralische Knochenmaterial stammt vorzugsweise aus der Spongiosa der Knochen und wird mit den Collagen II-Fasern ver­ bunden, um die physikalische Festigkeit der Matrix zu erhöhen. Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen wird das erfindungs­ gemäße Erzeugnis aus mineralischem Knochenmaterial und Colla­ gen als Matrix zur Regenerierung von Knorpeldefekten bei Ge­ lenken, die außerdem noch einen Verlust an Knochensubstanz aufweisen verwendet.

Das erfindungsgemäße Erzeugnis aus mineralischem Knochenmate­ rial kann zum Wiederaufbau von Knorpeln bei Knieen, Füßen, Wirbelsäule usw. sowie zur Modellierung von Implantaten oder prothetischem Knochenersatz wie z. B. in der orthopädischen Chirurgie, Hüftkorrekturen eingeschlossen, Ersatz von Knochen­ verlusten wie z. B. in der Traumatologie, Modellierung in der Gesichts- und Kieferchirurgie oder bei der Füllung von Peri­ odontaldefekten oder bei Zahnextraktionstaschen, einschließ­ lich der Knochenkammvergrößerung verwendet werden.

Das erfindungsgemäße, in Teilchenform vorliegende getränkte Material kann auf diese Weise zur Füllung einer Vielzahl von Knochenhohlräumen verwendet werden, wobei seine verminderte Sprödigkeit erheblich zur Erleichterung der Verarbeitung und Füllung beiträgt.

Gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Material aus dem mineralischen Knochenprodukt und Collagen II in einen Kno­ chendefekt eingefügt, wonach das Produkt aus dem mineralischen Knochenmaterial und Collagen II und der Knochendefekt mit ei­ ner Collagenmembran zur Geweberekonstruktion überzogen werden. Geeignete Collagenmembranen sind aus dem Stand der Technik bekannt und können eine aus einer einzigen Schicht bestehende Collagen II-Membran darstellen, wie dies in der WO 96/25961 (US-PA No. 08/894,517) gelehrt wird, eine doppelte Oberflä­ chenmembran aus Collagen I und III, wie dies in der US-PS No. 5,837,278) gelehrt wird, mit einer kompakten, glatten, nichtporösen äußeren Sperrfläche und einer gegenüberliegenden weichen faserförmigen Fläche oder eine mehrschichtige Membran aus einer offenen schwammigen Matrixschicht aus Collagen II und wenigstens einer Sperrschicht aus Collagen I, Collagen III oder einem Gemisch davon, wie dies in der US-PS No. 09/545,465, eingereicht am 7. April 2000, die der PCT/GB 98/02976 entspricht, dargelegt wird, usw. darstellen. Auf die oben angeführten Druckschriften wird hier eigens Bezug genommen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist die Membran eine äußere glatte Sperrfläche auf, welche das Haftenbleiben von Zellen verhindert und als Sperre für den Durchtritt von Zellen dient, sowie eine gegenüberliegende Membranfläche, die faser­ förmig ist und weich, um darauf ein Zellwachstum zu ermögli­ chen. Ein solches Erzeugnis ist Bio-Gide® der Fa. Ed. Geist­ lich Söhne AG für chemische Industrie, Schweiz. Fig. 5 zeigt das Produkt Bio-Gide® mit der glatten äußeren Sperrfläche 20 und der weichen faserförmigen Fläche 22. Beim erfindungsgemä­ ßen Einsatz wird die weiche faserförmige Fläche auf den Defekt aufgebracht, wobei die glatte äußere Fläche nach außen gewandt ist. Bio-Gide® wird in der oben zitierten US-PS No. 5,837,278 beschrieben und besteht zu ca. 95-99% aus Collagen I und zu ca. 1-5% aus Collagen III.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine Mehrschichtmembran erfindungsgemäß wie in der oben zitierten US-PA No. 09/545,465 verwendet. Eine derartige Mehrschichtmem­ bran kann durch Aufbringen einer Aufschlämmung von Collagen II auf die weiche faserförmige Oberfläche des oben beschriebenen Produktes von Bio-Gide® gebildet werden. Ein derartiges Er­ zeugnis ist in Fig. 6 dargestellt und umfaßt eine äußere Sperrfläche 20 und eine Matrixschicht vorwiegend aus Collagen II mit einer offenen schwammigen Textur 24, die in Form einer Aufschlämmung auf die weiche faserförmige Schicht 22 aufge­ bracht und dann getrocknet wird. Bei erfindungsgemäßer Verwen­ dung eines in Fig. 6 dargestellten Erzeugnisses wird die offe­ ne schwammige Collagen II-Schicht 24 auf den Defekt aufge­ bracht, wobei die glatte äußere Sperrfläche 20 nach außen ge­ richtet ist.

Wie oben angegeben, ist die Erfindung insbesondere für die Regeneration von Gelenkdefekten verwendbar, bei denen sowohl der Knorpel, als auch der darunter liegende Knochen geschädigt sind. Das erfindungsgemäße Erzeugnis aus mineralischem Kno­ chenmaterial und Collagen kann zur Füllung im Bereich von Kno­ chenschädigungen verwendet werden, wobei der gefüllte Bereich des Knochendefekts dann mit einer Collagenmembran überzogen wird.

Zur Verbesserung der Regeneration können extrazellulär gezüch­ tete Chondrocyten der erfindungsgemäßen Matrix aus minerali­ schem Knochenmaterial und Collagen vor der Implantation zuge­ setzt werden, wonach dann die mit Chondrocyten beschickte Matrix während eines offenen chirurgischen Eingriffs oder im Verlaufe der Arthroskopie implantiert werden kann. Als Alter­ native oder zusätzlich kann die implantierte Matrix mit einer Collagenmembran aus Collagen I, II und/oder III oder mit einer synthetischen Membran überzogen werden. Eine solche Collagen­ membran oder synthetische Membran kann alternativ oder zusätz­ lich mit extrazellulär gezüchteten Chondrocyten beschickt wer­ den, wobei die Membran auf das eingebrachte Knochenimplantat durch offenen chirurgischen Eingriff oder Arthroskopie aufge­ bracht wird.

Das gereinigte Knochenmaterial kann z. B. ein Produkt sein, wie es in der Internationalen Patentanmeldung WO 86/07265 (PCT/GB86/00310) beschrieben wird. Derartige Pro­ dukte können durch sorgfältige Entfettung von in Teilchenform vorliegenden Knochen wie z. B. von Rinderoberschenkelknochen und durch Behandlung mit Ammoniak oder einem organischen Amin zum Abbau des Restproteins unter nachfolgender intensiver Wä­ sche mit Wasser hergestellt werden. Ein derartiges Material bleibt nach der Implantierung resorbierbar und unterstützt das Modellierungsverfahren.

Es ist aber auch möglich, gereinigtes mineralisches Knochenma­ terial durch Glühen der Spongiosa oder Corticalis des Knochens in Teilchenform z. B. bei 900°C während 24 Stunden herzustel­ len. Derartiges geglühtes mineralische Knochenmaterial kann verwendet werden, wenn dauerhafte nichtresorbierbare Implanta­ te erforderlich sind wie z. B. bei der Knochenkamm­ vergrößerung. In jedem Falle ist der Knochen nach Entfernung des organischen Materials sehr spröde und seine Festigkeit wird durch die erfindungsgemäße Behandlung erheblich verbes­ sert.

Soll der Knochen als Arzneimittelträger verwendet werden, kann, wie in der obigen Internationalen Patentanmeldung ange­ geben, das mineralische Knochenmaterial vorteilhafterweise ein oder mehrere absorbierte Arzneimittel oder andere physiolo­ gisch wirksame Substanzen tragen. Gemäß einer Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Erzeugnis wenigstens eine absor­ bierte pharmazeutisch oder biologisch wirksame Substanz oder Mesenchymstammzellen mit der Fähigkeit zur Differenzierung zu Zellen zur Regenerierung von Knorpeln oder Knochen.

Physiologisch aktive Substanzen, die auf dem mineralischen Knochenmaterial adsorbiert werden können, sind vorzugsweise wenigstens teilweise wasserlöslich und umfassen antibakteriell wirksame Substanzen wie Antibiotika wie z. B. Penicilline, Cephalosporin, Aminoglycoside usw., Sulfonamide und insbeson­ dere Kondensationsprodukte von Formaldehyd mit Taurinamid oder N-substituiertem Taurinamid. Die zuletzt genannten Verbindun­ gen haben die Formel

worin R¹ Wasserstoff oder eine C_1-4-Alkylgruppe und R² Wasser­ stoff oder eine Gruppe der Formel

bedeuten, worin R¹ die obige Bedeutung hat.

Die Verbindung der Formel I, in der R¹ und R² jeweils H bedeu­ ten, ist Taurultam, während die Verbindung, in der R¹ H bedeu­ tet und R² die Formel II hat, Taurolidin ist. Diese Verbindun­ gen wirken als Methylolübertragungsmittel und töten nicht nur gram-negative und -positive Bakterien ab, sondern inaktivieren auch die von den Bakterien produzierten Endo- und Exotoxine. Weitere geeignete physiologisch wirksame Substanzen sind Pro­ teine und Polypeptide, die zur Knochenregeneration beizutragen vermögen, insbesondere aus Knochenmatrix und -zellen erhaltene nichtcollagene Proteine. Diese umfassen Lymphozytentransforma­ tionsfaktoren wie den Skelettwachstumsfaktor sowie morphogene und angiogene Faktoren und außerdem den Knochenwachstumstrans­ formationsfaktor. Wachstumsfaktoren aus der natürlichen Kno­ chenmatrix wie Osseln und insbesondere Osteopoietin sind be­ sonders vorteilhaft.

Gemäß einer Ausführungsform wird eine pharmazeutisch wirksame Substanz ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus morphogenen Knochenproteinen (BMP) wie BMP-2-8 oder anderen Skelettmatrix­ molekülen sowie Signalpeptiden wie dem Transformationswachs­ tumsfaktor-β TGF-β, Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF), insu­ linähnlichem Wachstumsfaktor (IGF), Parathyroid hormone rela­ ted protein (PTHrP) und Thrombozytenwachstumsfaktor (PDGF). Das erfindungsgemäße Erzeugnis kann außerdem als Träger für Stammzellen fungieren, die für eine bestimmte Differenzie­ rungsrichtung wie Gelenkknorpel oder Knochen vorgesehen sind. Solche Stammzellen können in vitro zur Steigerung ihrer Anzahl gezüchtet werden und dann auf die Reparaturstellen in den Trä­ germatrices gegebenenfalls mit Wachstumsfaktoren aufgebracht werden.

Es muß festgestellt werden, daß alternativ oder zusätzlich in die makromolekulare Substanz wie z. B. in die getränkte Gela­ tine physiologisch wirksame Substanzen aufgenommen werden kön­ nen. Dies ist besonders geeignet für Proteine wie die oben erwähnten Knochenwachstumsfaktoren.

Das mineralische Knochenmaterial liegt gewöhnlich in Form von Teilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 0,1-10 mm vor. Die Teilchen für die Aufnahme in die Col­ lagen II-Fasern stammen vorzugsweise aus der Spongiosa und ihre Größe liegt gewöhnlich in einem Bereich von 0,1-5 mm, vorzugsweise von 0,5-2 mm. Für die dichte Packung der Teil­ chen des mineralischen Knochenmaterials kann es von Vorteil sein, ein Gemisch aus zwei oder mehreren Teilchengrößen wie z. B. 0,25-1 mm und 1-2 mm oder einen breiten Bereich wie z. B. 0,25-2 mm zu verwenden.

Das gereinigte mineralische Knochenmaterial kann z. B. nach dem in der obigen Internationalen Patentanmeldung beschriebe­ nen Verfahren erhalten werden. So z. B. können Fette unter Verwendung eines oder mehrerer üblicher Fettlösungsmittel wie Ether wie z. B. Dimethylether, Ketone wie z. B. Aceton oder Kohlenwasserstoffe oder Halogenkohlenwasserstoffe wie z. B. Heptan oder Methylcyclohexan oder Toluol entfernt werden. Von Vorteil kann es sein, ein Extraktionsmittel wie Toluol durch eine intermediäre Extraktion mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel vor der weiteren Behandlung zu ent­ fernen. Das Collagenmaterial kann unter Verwendung proteolyti­ scher Mittel wie Basen wie z. B. NaOH in Glycerin oder organi­ scher Basen wie Amine, z. B. Ethylendiamin, oder von Amiden wie Formamid, vorzugsweise bei erhöhten Temperaturen gelöst werden. Derartige Mittel sind vorzugsweise mit Wasser misch­ bar, um die Entfernung durch Waschen mit Wasser zu erleich­ tern. Besonders gute Ergebnisse lassen sich mit Knochen erzie­ len, die unter Rückflußbedingungen mit Ethylendiamin extra­ hiert wurden.

Die Extraktion kann vorteilhafterweise auf jeder Stufe fort­ gesetzt werden, ggf. auch unter Wechsel des Lösungsmittels, bis kein weiteres Material mehr extrahiert wird, wie z. B. während ein bis zwei Wochen. Von Vorteil kann es auch sein, den Knochen nach der anfänglichen Proteinentfernung zu zer­ kleinern, da auf dieser Stufe das Zerbrechen einfacher ist als vor der Extraktion. Nach der Basenbehandlung werden die über­ schüssigen Lösungsmittel sorgfältig entfernt wie z. B. durch Abdampfen und/oder ggf. durch Waschen mit Wasser.

Das Material wird gewöhnlich einer Trocknungsstufe unterwor­ fen. Es kann sich als zweckmäßig erweisen, das Material auf dieser Stufe zu sterilisieren wie z. B. durch Hitzebehandlung, was zu einer weiteren Reinigung beitragen kann. Die Absorption und/oder Adsorption der physiologisch wirksamen Substanz er­ folgt vorzugsweise durch Eintauchen des behandelten minerali­ schen Knochenmaterials in ihre wäßrige Lösung, vorzugsweise unter sterilen Bedingungen. Die Wirksubstanzkonzentration ist vorzugsweise relativ hoch, um die Adsorption und/oder Absorp­ tion zu begünstigen und hängt teilweise von der Solubilisier­ barkeit des aktiven Materials ab.

Die Erfindung wird nachfolgend an Hand von Zeichnungen näher beschrieben:

Fig. 1 zeigt ein Ende eines ein Gelenk aufweisenden Knochens 10 mit einem Knorpel 12, der gesund ist und keinen Defekt auf­ weist.

Fig. 2 zeigt einen ein Gelenk aufweisenden Knochen 10 mit ei­ nem Knorpel 12, an dem sich ein Defekt 14 durch den Knorpel 12 hindurch in den Knochen 10 erstreckt.

Fig. 3 zeigt die erfindungsgemäße Matrix 16 aus dem minerali­ schen Knochenmaterial und Collagen, die ggf. mit Chondrocyten beschickt sein kann und mit der der Defekt 14 im Knorpel 12 und im Knochen 10 gefüllt ist.

Fig. 4 zeigt ein Collagen- bzw. synthetisches Kissen 18, das ggf. mit Chondrocyten beschickt sein kann und den mit der neu­ en erfindungsgemäßen Matrix aus mineralischem Knochenmaterial und Collagen gefüllten Defekt 14 überzieht, zur Regenerierung der Verletzung sowohl des Knorpels 12, als auch des Knochens 10. Das Kissen 18 kann mit beliebigen geeigneten Mitteln 19 wie Nähten, chirurgischen Nägeln oder mit Hilfe eines Kleb­ stoffs befestigt werden.

Die nachfolgenden Beispiele illustrieren lediglich die Erfin­ dung.

Beispiel 1

Rinderoberschenkelknochen wurden in heißem Wasser solange ge­ kocht, bis sie vollständig gereinigt waren, dann bis zu einer Teilchengröße von 5-10 mm zerkleinert und unter Rückflußbe­ dingungen mit Toluol während 24 St. in einem Sohxlet extra­ hiert. Das Material wurde dann mit Ethanol weiterextrahiert, um das Toluol zu entfernen, und schließlich bei erhöhter Tem­ pratur mit einem Azeotropgemisch aus Ethylendiamin und Wasser (85 : 15) 8 Tage lang unter mehrmaligem Wechsel des Lösungsmit­ tels extrahiert, bis praktisch kein weiteres organisches Mate­ rial mehr extrahiert wurde. Das Produkt wurde dann bei 100°C luftgetrocknet.

Das getrocknete Produkt wurde dann bis zu einer durchschnitt­ lichen Teilchengröße von 0,2-2 mm weiter zerkleinert und in einem Autoklaven sterilisiert. Stücke der Spongiosa des Ober­ schenkelknochens von Rindern, gewöhnlich mit einem Durchmesser von 10 mm, wurden auf dieselbe Weise gereinigt, wobei man die abschließende Granulierung wegließ.

Beispiel 2

Eingefrorene Knorpel von frisch geschlachteten Schweinen wur­ den in kaltes Wasser getaucht, sorgfältig gewaschen und mecha­ nisch von Fleischresten und Knochen und harten Teilen befreit. Anschließend wurde das Material 30 Min. lang unter fließendem Wasser gewaschen.

Anschließend wurde das Material dreimal in einem Homogenisator zerkleinert. Die optimale Teilchengröße am Ende der Größenre­ duzierung betrug ca. 8 mm.

Die Knorpelstücke wurden dann durch viermaliges Waschen mit Aceton jeweils während 8 St. entwässert. Danach wurde der Knorpel durch vierfache Extraktion mit n-Hexan entfettet. Jede Behandlung dauerte mindestens 8 St. Das Verhältnis Hexan: Knorpel betrug 1 : 10.

Nach der Entfettung ließ man den Knorpel in Trinkwasser quel­ len. Das Verhältnis betrug 10 : 1. Die Behandlungsdauer betrug 24 St.

Das Material wurde dann mit 5 Gew.-% NaOH behandelt, wobei das Verhältnis Knorpel : Flüssigkeit 1 : 4 betrug, und die Behandlungsgsdauer 32 St. Während der Behandlung wurden die Knorpelstücke gut gerührt. Anschließend wurde das Alkali aus dem Knorpel ausgewaschen. Dadurch wurde der ursprüngliche pH von 14 auf einen Wert von 9-11 herabgesetzt. Die gelösten Verunreinigungen wurden dann ausgewaschen und vom Knorpel ab­ getrennt. Die aus der Alkalibehandlung stammende Flüssigkeit wurde dann zur Rückgewinnung des Glycosaminoglycans gesammelt. Das Collagenmaterial wurde dann mit starker HCl (ca. 3 Gew.-%) anfänglich bei einem pH-Wert von unter 1,0 behandelt. Die Be­ handlungsdauer betrug 4-6 St.

Das Material wurde dann solange mit kaltem Wasser gewaschen, bis der pH auf 3-3,5 angestiegen war. Es wurden sämtliche Verunreinigungen entfernt, wonach das Produkt eine salzfreie Collagenmasse darstellte, die für die Erzeugung eines schwam­ migen oder anderen Collagenmaterials geeignet war. Zu diesem Zweck kann die Collagenmasse je nach dem beabsichtigten Zweck entgast, eingefroren oder gefriergetrocknet werden.

Beispiel 3

Der Extrakt aus der Alkalibehandlung in Beispiel 2 enthielt Glycosaminoglycan, Alkali, denaturierte Proteine und Salze. Der Extrakt wurde zuerst mit HCl neutralisiert, wonach der pH einem Wert von 6 entsprach. Der Extrakt wurde dann mit einem Filtrierhilfsmittel, und zwar mit Kieselgur, behandelt, durch das die denaturierten Proteine entfernt werden konnten. Dem Extrakt wurden 0,5 Gew.-% Kieselgur zugesetzt und dann durch Filtration zusammen mit dem denaturierten Protein entfernt. Der Überstand wurde dann mit einer Membran mit einem Molmasse­ cut-off-Wert von ca. 1000 Dalton ultrafiltriert. Auf diese Weise wurden die Salze entfernt, wobei gereinigtes Glycosami­ noglycan zurückblieb.

Die auf diese Weise erhaltene Glycosaminoglycanlösung wurde mit dem Collagenmaterial von oben gemischt, wodurch man eine Glycosaminoglycan enthaltende Collagen II-Matrix erhielt.

Beispiel 4

2,0 g Collagen II-Material aus Beispiel 3 wird mit Hilfe von 500 g destilliertem Wasser in einem Mischer zerkleinert. Diese Dispersion wird dann zentrifugiert, wonach das überstehende Wasser entfernt wird. Der erhaltenen Collagenfaseraufschläm­ mung werden dann 17,5 g nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gereinigte granulierte Rinder-Corticalis zugesetzt, wonach sorgfältig gemischt wird und das Wasser durch Absaugen (70 mm) entfernt wird. Der granulierte Knochen hat eine Teil­ chengröße von 0,5-1,0 mm. Nach Entfernung des Wassers werden 5 ml einer wäßrigen 9%-igen (Gew./Gew.) Gelatinelösung (ver­ netzt mit 0,6% von 35%-igem wäßrigen Formaldehyd) zugesetzt, wonach das Gemisch erneut durch Absaugen getrocknet wird. Die schwammige Masse wird in Stücke geschnitten und im Vakuum bei 60°C getrocknet. Danach werden die Stücke in Polyethylen­ behälter verpackt und durch Gamma-Bestrahlung sterilisiert.

Claims (15)

1. In Teilchenform vorliegendes Erzeugnis aus mineralischem Knochenmaterial für die Reparatur von miteinander kombinierten Knorpel- und Knochendefekten, wobei das Erzeugnis in Teilchen­ form vorliegendes poröses mineralisches Knochenmaterial, er­ halten aus natürlichen Knochen mit einer Kristallstruktur, die im wesentlichen der von natürlichen Knochen entspricht und praktisch frei ist von sämtlichem endogenen organischen Mate­ rial, wobei die Teilchen zumindest an ihrer Oberfläche Fasern aus resorbierbarem, physiologisch kompatiblem Collagen II auf­ weisen, wobei das Gewichtsverhältnis der Collagen II-Fasern zu den porösen Teilchen des mineralischen Knochenmaterials wenig­ stens ca. 1 : 40 beträgt, umfaßt.

2. Erzeugnis nach Anspruch 1, bei dem die Teilchen einen mitt­ leren Durchmesser im Bereich von ca. 0,1- ca. 5 mm aufweisen.

3. Erzeugnis nach Anspruch 1, das außerdem noch mindestens eine absorbierte, pharmazeutisch oder biologisch wirksame Sub­ stanz oder Mesenchymstammzellen mit der Fähigkeit zur Diffe­ renzierung zu Zellen zur Regenerierung von Knorpeln oder Kno­ chen umfaßt.

4. Erzeugnis nach Anspruch 3, bei dem die pharmazeutisch wirk­ same Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Taurolidin, Taurultam und einem Gemisch davon.

5. Erzeugnis nach Anspruch 1, das außerdem noch Gelatine in einer Gelphase umfaßt, wobei die Collagen II-Fasern in der Gelphase vorliegen und diese ca. 20 Gew.-% des Knochenmateri­ als ausmacht.

6. Verfahren zur Behandlung eines Menschen oder eines Tiers, wobei ein Erzeugnis aus mineralischem Knochenmaterial, wie es in Beispiel 1 beansprucht wird, in einen kombinierten Knorpel- und Knochendefekt implantiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der kombinierte Knorpel- und Knochendefekt sich am Gelenkende eines ein Gelenk aufwei­ senden Knochens befindet.

8. Verfahren nach Anspruch 6, das außerdem noch die Einführung des Erzeugnisses aus mineralischem Knochenmaterial in einen Knochendefekt und die nachfolgende Beschichtung des Erzeugnis­ ses aus mineralischem Knochenmaterial sowie des Knochendefekts mit einer Collagenmembran umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Collagenmembran eine Schicht aus Collagen II umfaßt.

10. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Membran, die eine Matrixschicht, die vorwiegend aus Collagen II besteht und eine offene schwammige Textur aufweist, und wenigstens eine Colla­ gen-Sperrschicht mit kompakter glatter Sperrfläche umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Sperrschicht vor­ wiegend aus Collagen I, Collagen III oder einem Gemisch davon hergestellt ist.

12. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Membran eine Matrixschicht, vorwiegend aus Collagen II und mit einer offe­ nen schwammigen Textur, umfaßt, die auf eine weiche faserför­ mige Schicht einer Membran aus Collagen I/III mit einer kom­ pakten glatten Sperrfläche gegenüber der Matrixschicht aufge­ bracht ist.

13. Erzeugnis nach Anspruch 3, bei dem die pharmazeutisch wirksame Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus knochenmorphogenetischen Proteinen (BMP), anderen Skelettma­ trixmolekülen und Signalpeptiden.

14. Erzeugnis nach Anspruch 13, bei dem die pharmazeutisch wirksame Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus BMP-2-8, TGF-β, TGF-β1, VEGF, IGF, PTHrP und PDGF.

15. Erzeugnis nach Anspruch 3, das außerdem noch Gelenkknor­ pel- oder Knochenstammzellen umfaßt.