PL208538B1 - Produkt zawierający ziarnisty materiał kostny oraz zastosowanie produktu mineralnego kości - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest produkt zawierający ziarnisty materiał kostny oraz zastosowanie produktu mineralnego kości.

Połączenia stawowe u ssaków są pokryte chrząstką stawową, która zapobiega przed bezpośrednim kontaktem między przeciwległymi powierzchniami stawowymi i umożliwia płynny ruch jednej z koś ci wzglę dem drugiej.

Zaproponowano kilka podejść do naprawy uszkodzeń i ubytków chrząstki stawowej. Obejmują one wszczepianie hodowanych chondrocytów w miejsce uszkodzenia chrząstki i pokrywanie uszkodzenia „łatą” z kolagenu.

Niekiedy uszkodzenie albo ubytek połączenia stawowego rozciąga się głębiej niż chrząstka stawowa, w głąb kości. Pozostaje zapotrzebowanie na materiały i metody służące do naprawy połączeń stawowych, w których uszkodzenie albo ubytek rozciąga się przez chrząstkę w głąb kości.

Wynalazek dotyczy produktu zawierającego ziarnisty materiał kostny do naprawy złożonego urazu chrząstki i kości, który zawiera porowate cząstki minerału kostnego pochodzące z naturalnej kości, o strukturze zasadniczo identycznej ze strukturą naturalnej kości i zasadniczo pozbawione endogennej substancji organicznej, przy czym cząstki mają na powierzchni możliwe do resorpcji. fizjologicznie zgodne włókna kolagenu II, przy czym stosunek wagowy włókien kolagenowych do porowatego minerału kostnego wynosi przynajmniej 1:40.

Korzystnie cząstki mają przeciętną średnicę w zakresie od 0,1 do 5 mm.

Korzystnie produkt dalej obejmuje przynajmniej jedną adsorbowaną substancję farmaceutycznie albo biologicznie czynną.

Bardziej korzystnie substancja biologicznie czynna jest wybrana z grupy obejmującej taurolidynę, tauraltam i ich mieszaniny.

Bardziej korzystnie substancja farmaceutycznie czynna jest wybrana z grupy obejmującej białka morfogenetyczne kości (BMP), inne cząsteczki macierzy kostnej i peptydy sygnałowe, a najkorzystniej z grupy obejmującej BMP-2-8. TGF-β, TGF-βΙ, VEGF, IGF, PTHrH i PDGF.

Bardziej korzystnie produkt dalej obejmuje komórki macierzyste chrząstki albo kości.

Korzystnie produkt dalej obejmuje żelatynę w fazie żelowej, przy czym włókna kolagenu II występują w tej fazie żelowej, zaś faza żelowa obejmuje od 2% do 20% wagowych materiału kostnego.

Korzystnie kolagen pochodzi z chrząstki.

Korzystnie stosunek wagowy włókien kolagenu wynosi około 1:20.

Korzystnie produkt ponadto zawiera żelatynę w fazie żelu, przy czym włókna kolagenu II są obecne w fazie żelowej, która zawiera 2-8% wagowych materiału kostne

Korzystnie obejmuje mezenchymalne komórki macierzyste o zdolności do różnicowania w komórki do regeneracji chrząstki lub kości.

W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie produktu mineralnego kość według wynalazku do wytwarzania wyrobu chirurgicznego do stosowania w sposobie leczenia ludzi lub osobnika zwierzęcego, u którego ten wyrób jest wszczepiany do połączonego ubytku chrząstki i kości u pacjenta.

Korzystnie ubytek chrząstki i kości jest zlokalizowany na zakończeniu kości stawowej.

Korzystnie obejmuje wprowadzenie wyrobu do ubytku kostnego, a następnie pokrycie produktu mineralnego i ubytku kostnego membraną kolagenową.

Bardziej korzystnie membrana kolagenowa obejmuje warstwę kolagenu II.

Korzystnie membrana obejmuje warstwę macierzy głównie z kolagenu II o otwartej, gąbczastej fakturze oraz przynajmniej jednej warstwie barierowej o zwartej, gładkiej powierzchni barierowej.

Bardziej korzystnie warstwa barierowa jest głównie zbudowana z kolagenu I, kolagenu III albo ich mieszaniny.

Korzystnie membrana obejmuje warstwę macierzy głównie z kolagenu II o otwartej, gąbczastej fakturze nałożonej na miękką, włóknistą warstwę błony kolagenu I/III o zwartej, gładkiej powierzchni barierowej przeciwległej do warstwy macierzy.

Krótki opis rysunków

Fig. 1 stanowi rzut pionowy, częściowo schematyczny, zakończenia zdrowej kości stanowiącej część połączenia stawowego.

Fig. 2 stanowi rzut pionowy, częściowo schematyczny, zakończenia kości stanowiącej część połączenia stawowego, w której występuje uszkodzenie, rozciągające się przez chrząstkę w głąb kości.

PL 208 538 B1

Fig. 3 stanowi rzut pionowy, częściowo schematyczny, kości, w której dokonano wypełnienia macierzą mineralną kości/kolagenem według wynalazku, w miejscu ubytku na zakończeniu kości stanowiącej połączenie stawowe.

Fig. 4 stanowi rzut pionowy, częściowo schematyczny, zakończenia kości, w której kolagenem lub membraną syntetyczną pokryto wypełnienie ubytku macierzą mineralną kości/kolagenem według wynalazku.

Fig. 5 stanowi schematyczny widok boczny membrany do zastosowania według jednego z wykonań wynalazku.

Fig. 6 stanowi schematyczny widok boczny innej membrany do zastosowania według drugiego wykonania wynalazku.

Wynalazek jest przydatny do rekonstrukcji ubytków tkanki obejmujących uszkodzenia chrząstki i kości, szczególnie po łączeń stawowych, takich jak staw kolanowy albo kręgosłup.

Produkt mineralny kości według wynalazku obejmujący cząstki porowatego minerału kostnego i wł ókna kolagenu II, zapewnia substrat dla wrastania zarówno natywnych chondrocytów, jak i natywnych osteocytów w głąb macierzy, w celu regeneracji chrzą stki i kości.

Macierz kolagenu II produktu według niniejszego wynalazku zapewnia również odporność kruchemu materiałowi kostnemu.

Według niniejszego wynalazku, oczyszczony subtelnie rozdrobniony minerał kostny dostarcza się w celu zastosowania w medycynie, przy czym cząstki tego minerału są zasadniczo wolne od endogennego materiału organicznego, oraz przynajmniej mają na powierzchni możliwy do resorpcji. fizjologicznie zgodny materiał kolagenu II.

Kości zwierząt rzeźnych stanowią tani naturalny materiał w znacznych ilościach. Zawierają one od 50% do 60%o bardzo drobnokrystalicznego hydroksyapatytu połączonego kolagenem i zawierającego znaczne ilości substancji białkopodobnych i innych, jak również powiązanych z tłuszczem i tkanką kostną. W świetle biologicznie ukształtowanych struktur krystalicznych można je uważać za niezwykle zgodny biologicznie materiał do protezowania kości. Dzięki olbrzymiej powierzchni właściwej można go również zastosować jako, przykładowo, adsorbent albo podłoże do kontrolowanego uwalniania leków.

Naturalny minera! kości zawiera hydroksyapatyt w postaci krystalicznej, o pewnym stopniu krystaliczności. zachowaniu i wielkości (morfologia nieregularna, płatkowata, 5-10 mm grubości, 10-50 mm długości) i powierzchniowej budowie chemicznej spowodowanej stosunkiem wapnia do fosforanu (37,5-38,0%) wapnia do 15,5-15,9% fosforu). W naturalnym minerale kości występują również niewielkie ilości związków niekrystalicznych i innych krystalicznych związków wapniowo-fosforanowych, w tym, minerały bruszyt i whitlockit oraz fosforany oktawapniowe. Faza nieorganiczna kości jest porowata, przy czym jej porowatość obejmuje ultrastrukturalne odstępy (10-100 mm) między kryształami występującymi naturalnie i wytworzonymi przez usunięcie fazy organicznej oraz mikroskopowe przestrzenie (1-20 mikronów, w tym zatoki, osteocytów. kanaliki, kanały naczyniowe, kanały Volkmanna i kanały Haversa (100-500 mm). Pole powierzchni właściwej, stanowią cej miarę porowatości jest w zakresie 50-100 m²/g według porosymetrii rtęciowej. Krystaliczność minerału kostnego można scharakteryzować przez dyfrakcję promieni rentgenowskich, zaś porowatość i morfologię kryształów oraz ich wielkość można określić metodą mikroskopii elektronowej. Niewielkie ilości kryształów nieapatytowych można określić metodą analizy termograwimetrycznej.

Jednakże, skład i budowa naturalnego minerału kostnego nie może być odtworzona przez produkty wytworzone in vitro albo przez naturalnie występujące hydroksyapatyty wytworzone uprzednio. Zaproponowano dwie metody oczyszczania naturalnego minerału kostnego, mianowicie kalcynację i ekstrakcję rozpuszczalnikiem.

Temperatura konieczna przy kalcynacji do spopielania składników organicznych kości jest raczej wysoka. Prowadzi to do silnej rekrystalizacji składnika mineralnego z tworzeniem znacznie bardziej kruchych kryształów. Tak wytworzony materiał wykazuje względnie małą powierzchnię właściwą. Tak więc, taki materiał nie ulega przebudowie z wytworzeniem nowej kości po wszczepie, zaś w szczepy mogą pozostać nie przebudowane, jakkolwiek mogą być użyteczne do innych celów.

W procesie ekstrakcji, białko ulega ekstrakcji z odtłuszczonej kości przy uż yciu odpowiedniego rozpuszczalnika. Powstały minerał kostny jest następnie płukany w celu usunięcia rozpuszczalnika.

W obu przypadkach, gdy zanieczyszczenia organiczne są usuwane z naturalnej kości pozostawiając wyłącznie minerał kostny, wytrzymałość materiału jest znacznie zmniejszona, zaś poszczególne

PL 208 538 B1 części oczyszczonego minerału kostnego są niezwykle kruche. Powoduje to problemy z manipulowaniem tym materiałem i może prowadzić do niepożądanych efektów po wszczepieniu.

Patent USA nr 5,573,771 ujawnia produkty mineralne kości, w których materiał kostny jest wzmocniony przez macierz utworzoną przez kolagen typu I albo mieszaninę kolagen typu I i typu III.

Kolagen występuje w wielu postaciach w organizmie zwierzęcym, a różne tkanki zawierają różne proporcje odpowiednich typów. Gąbka kolagenowa stosowana w medycynie i kosmetyce pochodzi zasadniczo ze skóry i ścięgien i obejmuje zasadniczo kolagen I i/lub kolagen III. Kolagen kości zawiera głównie kolagen I i kolagen II.

Materiał kolagenu II obejmuje, oprócz zasadniczo czystego kolagenu II, różne domieszki kolagenu I. kolagenu III i ich mieszaniny domieszane do kolagenu II. Przykładowo, kolagen II może być zmieszany z ok. 0,1-10% (wagowymi) (korzystnie ok. 0,1-5%o wagowych kolagenu III i/lub 1-50% wagowych kolagenu I).

Materiał kolagenu II może impregnować każdą z poszczególnych cząstek polepszając właściwości manipulowania produktem podczas wytwarzania i zastosowania. W takim przypadku, stosunek wagowy kolagenu II do oczyszczonego materiału kostnego korzystnie jest większy niż 1:40. korzystnie wynosi więcej niż 1:8 i mniej niż 4:1. korzystnie mniej niż 1:2. Korzystnie, kolagen II obejmuje ok. 1-30% wagowych produktu kostnego według wynalazku, korzystnie ok. 5-15%. Kolagen II penetruje do porowatej struktury minerału kostnego i skutecznie zastępuje niektóre białkopodobne substancje występujące w naturalnej kości, które chociaż zapewniają odporność, powodują również reakcję odpornościową tkanki po wszczepieniu minerału kostnego.

Kolagen II można zastosować dla zapewnienia macierzy dla minerału kostnego, z którego można kształtować potrzebne wyroby.

W tym przypadku, można zastosować kolagen II wraz z wielkocząsteczkową substancją tworzącą żel, taką jak żelatyna. Stosunek wagowy materiału włóknistego do minerału kostnego może być, na przykład, w zakresie od 1:40 do 3:20, np. około 1:10. Faza żelowa korzystnie obejmuje od 2 do 20% wagowych minerału kostnego, np. około 5%. Gdy stosuje się żelatynę jako fazę żelową, może być ona nieco usieciow7ana, np. przy użyciu 0,28% formaldehydu.

Minerał kostny korzystnie pochodzi z kości gąbczastej i jest połączony z włóknami kolagenu II w celu zapewnienia macierzy wytrzymał o ś ci Fizycznej. W korzystnych wykonaniach, produkt obejmujący minerał kostny/kolagen według wynalazku stosuje się jako macierz do regeneracji ubytków chrząstki połączeń stawowych, gdzie dodatkowo występuje utrata kości.

Produkt zawierający materiał kostny według wynalazku można zastosować do regeneracji chrząstki w kolanach kolanowych, stopach i kręgosłupie oraz jako ulegający przebudowie wszczep albo proteza kostna, przykładowo w chirurgii ortopedycznej, w tym w operacji stawu biodrowego, uzupełnianiu ubytków kostnych, przykładowo w traumatologii, przebudowie w chirurgii szczękowotwarzowej albo do wypełniania ubytków przyzębia i zębodołów, w tym do wzmacnianie krawędzi. Impregnowany subtelnie rozdrobniony materiał z produktu według wynalazku można więc zastosować do wypełniania różnorodnych jam kostnych, zaś jego zmniejszona kruchość jest istotna podczas procedury manipulowania i pakowania.

W jednym z zastosowań wedł ug wynalazku, produkt zawierają cy minerał kostny/kolagen II wprowadza się w miejsce ubytku kostnego, po czym pokrywa się membraną kolagenową w celu zrekonstruowania tkanki. Odpowiednie membrany kolagenowe są znane w dziedzinie i mogą to być jednowarstwowe membrany kolagenu II, jak opisane w WO 96/25961 (zgłoszenie patentowe USA nr 08/894,517), dwustronne membrany kolagenu I/III, opisane w patencie USA nr 5,837,278, mające zwartą, gładką, nieporowatą powierzchnię zewnętrzną i miękką, włóknistą powierzchnię przeciwległą albo membrany wielowarstwowe, obejmujące otwartą, gąbczastą warstwę macierzy kolagenu II i przynajmniej jedną warstwę barierową kolagenu I. kolagenu III albo ich mieszaniny, jak opisano w zgłoszeniu patentowym USA nr 09/545,465, z 7 kwietnia, 2000, odpowiadającemu PCT/GB98/02976 itp. W korzystnym wykonaniu, membrana ma zewnętrzną gładką powierzchnię barierową, która hamuje adhezję komórek i działa jak bariera zapobiegająca przechodzeniu przez nią komórek, oraz przeciwległą powierzchnię, która jest włóknista i miękka, przez co umożliwia porastanie jej komórkami. Produktem takim jest Bio-Gide®, sprzedawany przez Ed. Geistlich Sohne AG fur Chemische Industrie ze Szwajcarii. Na Fig. 5 pokazano produkt Bio-Gide®, z gładką zewnętrzną powierzchnią barierową 20 i miękką włóknistą powierzchnią 22. Przy stosowaniu według wynalazku, miękką, włóknistą powierzchnię stosuje się od strony ubytku, zaś gładką, zewnętrzną warstwę barierową zewnętrznie. Produkt

PL 208 538 B1

Bio-Gide® opisany jest w patencie USA nr 5,837,278 (wyżej) i składa się z około 95-99% kolagenu I i okoł o 1-5% kolagenu III.

W innym korzystnym wykonaniu, stosuje się membranę wielowarstwową , jak opisano w cytowanym zgłoszeniu patentowym USA nr 09/545,465. Taką membranę wielowarstwową można wytworzyć przez nałożenie papki kolagenu II na miękką włóknistą powierzchnię produktu Bio-Gide® opisanego wyżej. Taki produkt pokazano na Fig. 6 i obejmuje on warstwę zewnętrzną 20 i warstwę macierzy, głównie z kolagenu II o otwartej, gąbczastej strukturze 24, którą nałożono w postaci papki na miękką powierzchnię włóknistą 22 i następnie wysuszono. Gdy produkt pokazany na Fig. 6 wykorzystuje się według wynalazku, otwarta, gąbczasta warstwa kolagenu II 24 nakładana jest na ubytek, podczas gdy gładka warstwa barierowa 20 jest skierowana na zewnątrz.

Jak zaznaczono wyżej, wynalazek jest szczególnie możliwy do zastosowania do regeneracji ubytków połączeń stawowych, w których uszkodzenie dotyczy zarówno chrząstki jak i kości. Produkt obejmujący minerał kostny/kolagen według wynalazku można wykorzystywać do wypełniania obszaru uszkodzenia kości, zaś wypełnioną powierzchne ubytku kostnego można pokrywać membraną kolagenową.

W celu zwiększenia regeneracji, do macierzy minerału kostnego/kolagenu można przed wszczepieniem dodawać hodowane zewnątrzkomórkowo chondrocyty, zaś wypełnioną chondrocytami macierz można wszczepiać podczas zabiegu na otwartym stawie, albo podczas zabiegu artroskopowego. Alternatywnie albo dodatkowo, wszczepiana macierz może być powleczona membraną kolagenową zawierająca kolagen I, II i/lub III albo membraną syntetyczną. Taka membrana kolagenowa albo syntetyczna może być alternatywnie wypełniona hodowanymi zewnątrzkomórkowo chondrocytami. po czym stosowana do pokrycia wypełniającego wszczepu podczas zabiegu chirurgicznego albo artroskopowego.

Oczyszczonym minerałem kostnym może być przykładowo, produkt opisany w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 86/07265 (PCT/GB86/00310). Takie produkty można wytworzyć przez dokładne odtłuszczenie kości, np. bydlęcej kości udowej i traktowanie amoniakiem albo aminą organiczną w celu degradacji białka, a następnie dokładne płukanie wodą. Taki materiał po wszczepieniu pozostaje resorbowalny, co ułatwia proces przebudowy.

Można również wytworzyć oczyszczony minerał kostny przez prażenie subtelnie rozdrobnionej kości gąbczastej lub zbitej np. w 900°C przez 24 godziny. Taki wyprażony minerał kostny można stosować w przypadku, gdzie potrzebny jest trwały, nieulegający resorpcji wszczep, na przykład, w wzmocnieniu krawędzi. W obu przypadkach, po usunięciu materiału organicznego, kość jest nadmiernie krucha, zaś jej wytrzymałość ulega znacznej poprawie przez zastosowanie produktu według wynalazku.

W przypadku, gdy kość jest stosowana jako nośnik leku, jak zaznaczono w wyżej cytowanym, międzynarodowym zgłoszeniu patentowym, minerał kostny może nieść jeden albo wiele zaadsorbowanych leków albo innych substancji fizjologicznie czynnych. Według jednego z wykonań, produkt według wynalazku obejmuje przynajmniej jedną farmaceutycznie albo biologicznie czynną substancję albo komórki macierzyste mezenchymy o zdolności do różnicowania w komórki regenerujące chrząstkę albo kość.

Fizjologicznie czynne substancje, które można adsorbować na minerale kostnym są korzystnie, przynajmniej częściowo rozpuszczalne w wodzie i obejmują substancje antybakteryjne, takie jak antybiotyki np. penicyliny, cefalosporyny, aminoglikozydy itp. sulfonamidy, zaś w szczególności, produkty kondensacji formaldehydu z taurynamidem albo N-podstawionym taurynamidem.

Te ostatnie związki można przedstawić jak na wzorze 1. w którym R¹ oznacza wodór albo grupę C1-4 alkilową, a R² oznacza wodór albo grupę o wzorze 2, w której R¹ oznacza wodór albo grupę C1-4 alkilową.

Związkiem o wzorze 1, w którym R¹ i R² oznaczają wodór jest taurultam, zaś związkiem, w którym R¹ oznacza wodór, a R² ma wzór 2 jest taurolidyna. Związki te działają jako czynniki przenoszące metylol i nie tylko skutecznie niszczą bakterie gram-ujemne i gram-dodatnie, ale również inaktywują endotoksyny i egzotoksyny wytwarzane przez bakterie.

Inne przydatne fizjologicznie czynne substancje obejmują białka i polipeptydy zdolne do ułatwiania regeneracji kości, zwłaszcza białka niekolagenowe, pochodzące z macierzy kostnej i komórek kości. Obejmują one czynniki mitogenne, takie jak czynnik wzrostu szkieletu oraz czynniki morfogenetyczne i angiogenne, jak również transformujący czynnik wzrostu kości. Szczególnie korzystne są czynniki wzrostowe naturalnej macierzy kostnej, takie jak osseina. zaś jeszcze korzystniej osteopoetyna.

PL 208 538 B1

Według jednego wykonania, substancja farmaceutycznie czynna jest wybrana z grupy obejmującej białka morfogenetyczne kości (BMP), takie jak BMP-2-8 albo inne cząsteczki macierzy szkieletu, jak również peptydy sygnałowe, takie jak transformujący czynnik wzrostu β TGF-β, TGF-βΙ, śródbłonkowy naczyniowy czynnik wzrostu (VEGF), insulinopodobny czynnik wzrostu (IGF), białko pokrewne hormonu przytarczyc (PTHrP) i płytkowy czynnik wzrostu (PDGF).

Produkt według wynalazku może działać jako nośnik dla komórek macierzystych należących do konkretnej linii rozwojowej różnicowania, jak chrząstka stawowa albo kość. Takie komórki macierzyste można hodować in vitro w celu zwiększenia ich liczby i stosować w miejscach naprawy w matrycy nośnika z albo bez czynników wzrostowych.

Należy zauważyć, że substancje fizjologicznie czynne mogą alternatywnie lub dodatkowo dodawać być wbudowane w substancje wielkocząsteczkowe, np. impregnowaną żelatynę. Jest to szczególnie przydatne dla białek, takich jak czynniki wzrostu kości przedstawione wyżej.

Minerał kostny normalnie jest w postaci cząstek o przeciętnej średnicy w zakresie 0,1 - 10 mm. Cząstki do włączania do włókien kolagenu II korzystnie są z kości gąbczastej i na ogół są w zakresie wielkości 0,1-5 mm. korzystnie 0,5 - 2 mm. Korzystne może być ścisłe upakowanie cząstek minerału kostnego do zastosowania w mieszaninie dwóch albo więcej wielkości cząstek, np. 0,25 do 1 mm i 1 do 2 mm, albo w szerokim zakresie np. 0,25 do 2 mm.

Oczyszczony minerał kostny można uzyskać, na przykład, metodą opisaną w powyższym zgłoszeniu patentowym. Tak więc. na przykład, można usuwać tłuszcze stosując jeden albo wiele konwencjonalnych rozpuszczalników tłuszczy, takich jak etery, np. eter dimetylowy; ketony, np. aceton; albo węglowodory albo chlorowcowane węglowodory, np. heptan albo metylocykloheksan albo toluen.

Korzystne może być usuwanie rozpuszczalnika, takiego jak toluen przez natychmiastową ekstrakcję rozpuszczalnikiem rozpuszczalnym w wodzie, takim jak etanol, przed dalszymi etapami. Kolagen można rozpuszczać stosując czynniki proteolityczne, takie jak zasady, np. wodorotlenek potasu w glicerolu albo organiczne zasady, takie jak aminy. np. etylenodiaminę albo amidy, takie jak formamid, korzystnie w podwyższonych temperaturach. Takie czynniki korzystnie mają zdolność mieszania się z wodą, aby ułatwić ich usuwanie przez płukanie w wodzie. Szczególnie dobre wyniki uzyskano stosując kość ekstrahowaną etylenodiamina z odpływem.

Ekstrakcję można korzystnie prowadzić na każdym etapie, jeżeli konieczne ze zmianami rozpuszczalnika, do całkowitej ekstrakcji materiału, np. przez okres jednego do dwóch tygodni. Korzystne może być dalsze rozdrobnienie po początkowym usuwaniu białka, ponieważ na tym etapie kość łatwiej pęka. niż przed ekstrakcją. Po traktowaniu zasadą, nadmiar rozpuszczalników usuwa się dokładnie np. przez odparowanie i/lub, jeżeli to konieczne, płukanie wodą.

Normalnie materiał poddaje się etapowi suszenia. Dogodne może być sterylizowanie materiału na tym etapie, np. przez traktowanie gorącem, co może wpływać na dalsze oczyszczanie. Absorpcję i/lub adsorpcję substancji fizjologicznie czynnych korzystnie przeprowadza się przez zanurzenie traktowanego minerału kostnego w roztworze wodnym substancji, korzystnie w warunkach sterylnych. Stężenie substancji czynnej jest korzystnie względnie duże co ułatwia absorpcję i/lub adsorpcję i zależy od rozpuszczalności substancji czynnej.

Wynalazek opisany jest w odniesieniu do następujących Figur.

Na Fig. 1 pokazano zakończenie stawowe kości 10 z chrząstką 12, która jest zdrowa i bez ubytku.

Na Fig. 2 pokazano kość stawową 10 z chrząstką 12, w której ubytek 14 rozciąga się przez chrząstkę 12 do kości 10.

Na Fig. 3 pokazano macierz minerału kostnego/chrząstki 16 według wynalazku, którą można wypełniać albo nie, chondrocytami. i wypełnić nią ubytek 14 w chrząstce 12 i kości 10.

Na Fig. 4 pokazano łatę kolagenową albo syntetyczną 18, która może ale nie musi być wypełniona chondrocytami, pokrywającą ubytek 14 wypełniony macierzą minerału kostnego/chrząstki 16 według wynalazku, w celu naprawy uszkodzenia zarówno chrząstki 12, jak i kości 10. Łatę 18 można przyłączyć dowolnym odpowiednim sposobem 19, takim jak szew, gwoździe chirurgiczne albo klej.

Poniższe Przykłady podano w celu zilustrowania wynalazku:

P r z y k ł a d 1

Kości udowe bydła gotowano w gorącej wodzie do czysta, rozdrabniano na cząstki wielkości

5-10 mm i ekstrahowano z odprowadzeniem toluenem przez 24 godziny w urządzeniu Sohxlet. Materiał dalej ekstrahowano etanolem w celu usunięcia toluenu, a następnie ekstrahowano w podwyższonej temperaturze mieszaniną azeotropową etylenodiaminy i wody (85:15) przez 8 dni, z kilkoma zmianami

PL 208 538 B1 rozpuszczalnika, do zakończenia wypłukiwania materiału organicznego. Następnie produkt suszono powietrzem w temperaturze 100°C.

Wysuszony produkt dalej rozdrabniano do średniej wielkości cząstek 0,2 - 2 mm i sterylizowano w autoklawie. Cząstki kości gąbczastej bydlęcej kości udowej, o typowej średnicy około 10 mm. oczyszczano tą samą techniką, pomijając końcowy etap granulowania.

P r z y k ł a d 2

Mrożoną chrząstkę ze świeżo ubitych świń zanurzono w zimnej wodzie, dokładnie przepłukano i oczyszczono mechanicznie z resztek mię sa, kości i twardych fragmentów. Następnie materiał płukano przez 30 minut pod bieżącą wodą.

Następnie materiał trzykrotnie mielono w mikserze. Optycznie, wielkość cząstek na zakończenie została zmniejszona do około 8 mm.

Fragmenty chrząstki odwadniano przez 4-krotne płukanie w acetonie, po 8 godzin za każdym razem. Następnie, chrząstkę odtłuszczono przez 4-krotną ekstrakcję n-heksanem, każde traktowanie trwało przynajmniej 8 godzin. Stosunek heksanu do chrząstki wynosił 1:10.

Po odtłuszczeniu, chrząstkę rozmiękczono w wodzie pitnej. Stosunek wody do materiału wynosił 10:1. Czas traktowania wynosił 24 godziny.

Następnie materiał traktowano NaOH (5% wagowych), przy czym stosunek chrząstki do cieczy wynosił 1:4, a czas traktowania wynosił 32 godziny. Podczas traktowania, fragmenty chrząstki dobrze mieszano. Następnie, z chrząstki wypłukano zasadę. Początkowo, pH wynosiło 14, po czym zmniejszono je do 9-11. Rozpuszczone zanieczyszczenia opłukano i oddzielono od chrząstki. Ciecz pozostałą po traktowaniu zasadą zebrano w celu odzyskania glikozaminoglikanów.

Następnie materiał kolagenowy traktowano stężonym HCl (około 3% wagowych) w początkowym pH równym poniżej 1.0. Traktowanie prowadzono przez 4-6 godzin.

Następnie, materiał przepłukano zimną wodą, na tyle długo aby wartość pH wzrosła do 3-3.5. Wszystkie zanieczyszczenia usunięto, zaś produkt stanowiła bezsolna masa kolagenu, odpowiednia do wytwarzania gąbki albo innego materiału kolagenowego. W tym celu, masą chrzestna może być zależnie od przeznaczenia, odgazowana, zamrożona i liofilizowana.

P r z y k ł a d 3

Ekstrakt powstały po traktowaniu zasadą z Przykładu 2, zawierał glikozaminoglikan, zasadę, zdenaturowane białka i sole. Po pierwsze ekstrakt neutralizowano HCl, wartość pH po neutralizacji wynosiła 6. Następnie, ekstrakt filtrowano przez urządzenie filtrujące, z dodatkiem ziemi okrzemkowej, która powodowała usunięcie denaturowanych białek. Do ekstraktu dodano 0,5% wagowego ziemi okrzemkowej i usunięto przez filtrowanie wraz z denaturowanym białkiem.

Supernatant poddano ultrafiltracji stosując membranę o ciężarze odcięcia równym około 10000 Da. W ten sposób usunię to sole pozostawiają c oczyszczone glikozaminoglikany.

Tak uzyskany roztwór glikozaminglikanów zmieszano z materiałem kolagenowym otrzymując macierz kolagu II zawierającą glikozaminoglikany.

P r z y k ł a d 4

2,0 g materiału kolagenu II z Przykładu 3 rozdrobniono z 500 g wody destylowanej w mikserze. Tę dyspersję odwirowano i usunięto supernatant wodny. Do pozostałej papki dodano 17,5 g granulowanej zbitej kości bydlęcej oczyszczonej według procedury z Przykładu 1, a następnie dokładnie wymieszano i usunięto wodę przez odsysanie (70 mm). Granulowana kość miała średnicę cząstek około 0,5-1,0 mm. Po usunięciu wody, dodano 5 ml 9% wodnego roztworu żelatyny (usieciowanej 0,6% roztworem 35% wodnego roztworu formaldehydu) i ponownie osuszono mieszaninę przez odsysanie.

Gąbczastą masę cięto na fragmenty i suszono pod próżnią w temperaturze 60°C. Fragmenty gąbki pakowano do polietylenowych pojemników i sterylizowano promieniowaniem gamma.

Claims (19)

1. Produkt zawierający ziarnisty materiał kostny do naprawy złożonego urazu chrząstki i kości, znamienny tym, że zawiera porowate cząstki minerału kostnego pochodzące z naturalnej kości, o strukturze zasadniczo identycznej ze strukturą naturalnej koś ci i zasadniczo pozbawione endogennej substancji organicznej, przy czym cząstki mają na powierzchni możliwe do resorpcji, fizjologicznie zgodne włókna kolagenu II, przy czym stosunek wagowy włókien kolagenowych do porowatego minerału kostnego wynosi przynajmniej 1:40.

PL 208 538 B1

2. Produkt według zastrz. 1, znamienny tym, że cząstki mają przeciętną średnicę w zakresie od 0,1 do 5 mm.

3. Produkt według zastrz. 1, znamienny tym, że dalej obejmuje przynajmniej jedną adsorbowaną substancję farmaceutycznie albo biologicznie czynną.

4. Produkt według zastrz. 3, znamienny tym, że substancja biologicznie czynna jest wybrana z grupy obejmują cej taurolidynę , tauraltam i ich mieszaniny.

5. Produkt według zastrz. 1, znamienny tym, że dalej obejmuje żelatynę w fazie żelowej, przy czym włókna kolagenu II występują w tej fazie żelowej, zaś faza żelowa obejmuje od 2% do 20% wagowych materiału kostnego.

6. Produkt według zastrz. 3, znamienny tym, że substancja farmaceutycznie czynna jest wybrana z grupy obejmującej białka morfogenetyczne kości (BMP), inne cząsteczki macierzy kostnej i peptydy sygnał owe.

7. Produkt według zastrz. 6, znamienny tym, że substancja farmaceutycznie czynna jest wybrana z grupy obejmującej BMP-2-8, TGF-β, TGF-βΙ, VEGF, IGF, PTHrH i PDGF.

8. Produkt według zastrz. 3, znamienny tym, że dalej obejmuje komórki macierzyste chrząstki albo kości.

9. Produkt według zastrz 1, znamienny tym, że kolagen pochodzi z chrząstki.

10 Produkt według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek wagowy włókien kolagenu wynosi około 1:20.

11. Produkt według zastrz. 1, znamienny tym, że ponadto zawiera żelatynę w fazie żelu, przy czym włókna kolagenu II są obecne w fazie żelowej, która zawiera 2-8% wagowych materiału kostnego.

12. Produkt według zastrz. 1, znamienny tym, że dalej obejmuje mezenchymalne komórki macierzyste o zdolności do różnicowania w komórki do regeneracji chrząstki lub kości.

13. Zastosowanie produktu mineralnego kości określonego w zastrz. 1 do wytwarzania wyrobu chirurgicznego do stosowania w sposobie leczenia ludzi lub osobnika zwierzęcego, u którego ten wyrób jest wszczepiany do połączonego ubytku chrząstki i kości u pacjenta.

14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że ubytek chrząstki i kości jest zlokalizowany na zakończeniu kości stawowej.

15. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że obejmuje wprowadzenie wyrobu do ubytku kostnego, a następnie pokrycie produktu mineralnego i ubytku kostnego membraną kolagenową.

16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że membrana kolagenowa obejmuje warstwę kolagenu II.

17. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że membrana obejmuje warstwę macierzy głównie z kolagenu II o otwartej, gąbczastej fakturze oraz przynajmniej jednej warstwie barierowej o zwartej, gładkiej powierzchni barierowej.

18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że warstwa barierowa jest głównie zbudowana z kolagenu I, kolagenu III albo ich mieszaniny.

19. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że membrana obejmuje warstwę macierzy głównie z kolagenu II o otwartej, gąbczastej fakturze nałożonej na miękką, włóknistą warstwę błony kolagenu I/III o zwartej, gładkiej powierzchni barierowej przeciwległej do warstwy macierzy.