KR101158473B1

KR101158473B1 - 연골줄기세포를 유효성분으로 포함하는 골질환 치료용 또는 항염증용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR101158473B1
Application number: KR1020100004106A
Authority: KR
Inventors: 김경숙; 정재준; 윤현수; 이준호; 구세광
Original assignee: 코아스템(주)
Priority date: 2009-01-15
Filing date: 2010-01-15
Publication date: 2012-06-20
Also published as: WO2010082787A3; WO2010082787A2; KR20100084142A; US20120121545A1; EP2377542A2; EP2377542A4

Abstract

본 발명은 연골줄기세포를 유효성분으로 포함하는 골질환 치료용 또는 항염증용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 연골줄기세포를 유효성분으로 이용하여 골질환 및 염증질환의 새로운 세포치료 영역(regimen)을 제공한다. 본 발명의 연골줄기세포를 관절낭 내에 투여하는 경우, 투여된 연골줄기세포는 투여된 부위에서 연골세포로 증식 또는 분화되고, 항염증 활성을 나타냄으로써 골질환 및 골염증질환을 치료하는 데 매우 유효하다. 본 발명의 연골줄기세포는 조직이나 장기 이식에서 거부반응을 일으키는 조직적합항원을 발현하지 않으며, 골질환 및 항염증 치료를 위한 세포이식(transplantation) 시 자가세포 또는 타가세포를 이용할 수 있는 장점이 있다.

Description

연골줄기세포를 유효성분으로 포함하는 골질환 치료용 또는 항염증용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Compositions for Treatment of Bone Disease or Anti-inflammatory Compositions Comprising Cartilage Stem Cell}

본 발명은 연골줄기세포를 유효성분으로 포함하는 골질환 치료용 또는 항염증용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

뼈(bone)는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호한다. 또한 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다.

인체를 구성하는 뼈 사이에는 관절이 존재한다. 관절은 두개골이나 이의 치근처럼 서로 접하는 두 개의 뼈나 연골 사이에 가동성이 거의 또는 전혀 없는 부동성관절과, 동물의 팔?다리의 뼈나 턱뼈처럼 양쪽 뼈 사이에 결합조직이 많고 가동성이 큰 가동관절, 연합관절 및 반관절로 나뉜다. 일반적으로 관절이라 하는 것은 가동관절을 말하며, 이 가동관절은 양쪽의 뼈가 인대만으로 결합되어 있는 인대결합과 활액막성 결합으로 나뉜다. 활액막성 결합은 관절이 결합조직성의 주머니(관절낭)로 쌓여 있는 것으로, 관절낭의 안쪽은 윤활유의 성격을 하는 활액을 분비하고 외부에는 많은 인대가 부착되어 있어 관절을 보강한다.

줄기세포는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포, 즉 ‘미분화’세포이다. 분화란 발생 초기 단계의 세포가 각 조직으로서의 특성을 갖게 되는 과정을 말하는데, 하나의 세포가 뼈, 심장, 피부 등의 다양한 조직 세포로 만들어지기 위해서는 ‘분화’가 일어나야 하는 것이다. 이러한 미분화 상태에서 적절한 조건을 맞춰주면 줄기세포는 다양한 조직의 세포로 분화할 수 있다. 따라서 줄기세포의 이러한 분화능력을 이용하여, 손상된 관절 조직을 재생 및 항염증 등의 치료에 응용하기 위하여 중간엽 줄기세포 연구에 대하여 보고되고 있다(미국특허등록번호 제6835377호). 또한, 손상된 연골 치료용으로 사용 가능한 세포로서는 환자의 자가 연골세포 이외의 대체 세포 자원으로 골수줄기세포 (Majumdar M. K. et al., J. Cell. Physiol. 185: 98-106, 2000), 제대혈(Gang E. J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 321: 102-108, 2004), 그리고 활액막(Fickert S. et al., Osteoarthritis Cartilage 11: 790-800, 2003) 등이 연구되고 있다.

그러나 현재 줄기세포를 이용한 골질환 또는 항염증 치료에 있어서 큰 효과를 나타내지 못하고 있으며, 특히 연골줄기세포를 이용한 골질환 또는 항염증 치료에 관하여 보고된 바 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 골질환 또는 골염증을 효과적으로 치료할 수 있으며 인체 면역반응을 일으키지 않는 줄기세포를 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과 연골 조직에서 수득한 연골줄기세포가 골질환 및 염증을 치료하는 데 매우 유효하다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 골질환(bone disease)의 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 항염증용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, (i) CD29, CD44, CD49C, CD73 및 CD105로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 표면항원에 대하여 양성의 면역학적 특성; 및 (ⅱ) 표면 항원인 CD34 또는 CD45에 음성의 면역학적 특성을 가지며, 그리고 (ⅲ) Oct3/4, Nanog, Rex-1, Sox 2, Sox 5, Sox 6 및 Sox 9로 구성된 군으로부터 선택되는 미분화 줄기세포 표지 단백질의 최소 1종을 세포에서 발현하는 연골줄기세포의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 골질환(bone disease) 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (i) CD29, CD44, CD49C, CD73 및 CD105로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 표면항원에 대하여 양성의 면역학적 특성; 및 (ⅱ) 표면 항원인 CD34 또는 CD45에 음성의 면역학적 특성을 가지며, 그리고 (ⅲ) Oct3/4, Nanog, Rex-1, Sox 2, Sox 5, Sox 6 및 Sox 9로 구성된 군으로부터 선택되는 미분화 줄기세포 표지 단백질의 최소 1종을 세포질에서 발현하는 연골줄기세포의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항염증용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 골질환 또는 골염증을 효과적으로 치료할 수 있으며 인체 면역반응을 일으키지 않는 줄기세포를 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과 연골 조직에서 수득한 연골줄기세포가 골질환 또는 골염증을 치료하는 데 매우 유효하다는 것을 규명하였다.

줄기세포는 크게 두 종류로 구별된다: 배아줄기세포 (ES) 및 배아생식세포 (EG)를 포함하는 전능성 줄기세포 (pluripotent stem cell)와 다능성 줄기세포 (multipotent stem cell). 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 연골줄기세포(chondrogenic stem cell 또는 cartilage stem cell)는 다능성 줄기세포의 일종이며, 연골조직으로부터 유래된다. 본 발명의 연골줄기세포는 성체줄기세포의 일종으로서 연골조직으로 분화될 수 있는 능력을 갖으며, 자가재생산(self-renewal) 능력을 갖는다.

본 발명의 연골줄기세포는 줄기세포 표지 표현 항원인 CD29, CD44, CD49C, CD73 및 CD105로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종, 바람직하게는 최소 2종, 보다 바람직하게는 최소 3종, 보다 더 바람직하게는 최소 4종, 가장 바람직하게는 5종의 표면항원에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 연골줄기세포는 표지 표면 항원 CD29, CD44, CD49C, CD73 및 CD105를 80-100% 발현하며, 보다 바람직하게는 90-100% 발현하고, 가장 바람직하게는 100% 발현한다.

한편, 본 발명의 연골줄기세포는 조혈줄기세포 표지 표면 항원인 CD34 및/또는 CD45는 음성의 면역학적 특성을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 연골줄기세포는 조혈줄기세포 표지 표면 항원인 CD34 및/또는 CD45를 0-10% 발현하며, 보다 바람직하게는 0.1-5% 발현하고, 가장 바람직하게는 0.19-1.82% 발현한다.

상기 표면항원의 발현율을 언급하면서 사용되는 단위 “%”는 분석 대상의 세포들에서 표면항원을 발현하는 세포의 비율을 의미한다. 예를 들어, CD29 표면항원의 발현율이 100%라는 것은 분석 대상의 세포 시료에서 모든 세포가 CD29 표면항원을 발현한다는 것을 의미한다.

본 발명의 연골줄기세포는 Oct3/4, Nanog, Rex-1, Sox 2, Sox 5, Sox 6 및 Sox 9로 구성된 군으로부터 선택되는 미분화 줄기세포 표지 단백질의 최소 1종, 바람직하게는 최소 2종, 보다 바람직하게는 최소 4종, 보다 더 바람직하게는 최소 6종, 가장 바람직하게는 7종을 세포에서 발현한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 연골줄기세포는 세포배가시간(population doubling time)이 15-30시간이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 연골줄기세포는 상기 세포배가시간이 17-27시간이며, 보다 더 바람직하게는 19-25시간이고, 가장 바람직하게는 21-23시간이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 연골줄기세포는 조직적합항원 HLA-DR(MHC class Ⅱ)을 발현하지 않는다. 따라서, 본 발명의 연골줄기세포는 조직이나 장기 이식에서 거부반응을 일으키지 않으며, 골질환 및 항염증 치료할 수 있다. 또한, 이러한 특성에 의해 자가 연골줄기세포뿐만 아니라 타가 연골줄기세포도 거부반응 없이 이용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 연골줄기세포는 세포질에서 세포골격 표지단백질인 비멘틴(vimentin) 및/또는 세포연접 단백질인 CD54(intercellular cell adhesion molecule-1: ICAM-1)를 발현하며, 세포막에서 세포연접 단백질인 CD44(homing cell adhension molecule, HCAM)을 발현하는 특성을 나타낸다.

바람직하게는, 본 발명에서 이용하는 연골줄기세포는 포유동물의 연골조직에서 수득할 수 있다. 보다 바람직하게는 인간, 돼지, 소, 양, 토끼, 마우스(mouse) 또는 랫트(rat), 보다 더 바람직하게는 인간, 돼지 또는 마우스, 가장 바람직하게는 인간의 연골조직에서 수득할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 연골줄기세포는 하기의 실시예에 기재된 방식으로 수득할 수 있다. 예를 들어, 연골조직을 절단하고 절단된 연골조직을 직접 배양하여 세포를 성장(outgrowth)시킨다. 이어, 상기 성장된 세포를 계대 배양함으로써, 연골줄기세포를 수득한다. 상기 배양 과정에서 이용되는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다. 상기 배양 과정에서 이용되는 배지는 바람직하게는 혈청(예컨대, 우태아혈청)과 알라닌과 글루타민을 추가적으로 포함한다.

상기 계대 배양에서 70-80% 컨플루언시(confluency)를 나타낼 때 까지 배양하며, 이어 부착성(adherent) 세포를 수확하고, 이 수확된 세포의 일부를 다음 계대 배양에 이용한다. 상술한 과정을 통하여 연골세포 분화능 및 줄기세포 특성을 갖는 연골줄기세포가 확립된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 연골줄기세포는 연골세포로 증식되거나 또는 분화되는 활성을 나타낸다. 즉, 본 발명의 연골줄기세포는 연골줄기세포가 주입된 위치, 바람직하게는 관절낭 내에서 연골세포로 증식되거나 분화됨으로써 골질환, 바람직하게는 뼈의 손상, 보다 바람직하게는 연골조직의 결함(defects)에 의해 유발되는 다양한 골질환에 대하여 치료 효능을 발휘한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 연골줄기세포는 항염증 활성을 나타낸다(참조: 실시예 4, 표 8). 이러한 연골줄기세포의 항염증 활성은 본 발명자들이 아는 범위에서(to our best knowledge), 본 발명자들이 최초로 규명하고 제시하는 것이다. 하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 연골줄기세포는 종래의 관절염 치료제인 디클로페낙(diclofenac) 보다 항염증 활성이 우수하다. 이러한 연골줄기세포의 우수한 항염증 활성은 매우 흥미로운 사실이며, 연골줄기세포에 의한 골질환 또는 골염증 질환에 대한 세포치료(cell therapy)의 새로운 진전을 가져올 수 있다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 인간 연골줄기세포는 기탁번호 KCTC 11397BP의 “CBAC266”, KCTC 11617BP의 “CBAC237”, KCTC 11618BP의 “CBAC240” 또는 KCTC 11619BP의 “CBAC1014”이다.

본 발명의 약제학적 조성물에 의해 치료되는 골질환은 병리학적 또는 물리적으로 인한 뼈 및 연골 조직의 손상으로부터 유래한 골질환이며, 바람직하게는 관절연골 손상(반월상연골손상, 추간판 탈출증 등), 골관절염, 골다공증, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 대사성 골질환, 골용해, 백혈구 감소증, 뼈의 기형, 고칼슘혈증, 신경압박 증후군 또는 물리적 손상으로 인한 뼈 손상이고, 가장 바람직하게는 골관절염이다.

본 명세서에서 용어 “치료학적 유효량”은 상술한 연골줄기세포의 치료 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 식염수, PBS(phosphate buffered saline) 또는 배지 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여 방식, 가장 바람직하게는 관절낭내(intraarticular) 투여이다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 1일 당 10²-10¹⁰ 세포이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 항염증용 약제학적 조성물에 의해 치료될 수 있는 염증 질환은 연골조직이 있는 부위에서 염증반응에 의해 유발되는 모든 질환을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 항염증용 약제학적 조성물에 의해 치료될 수 있는 염증 질환은 염증성 관절염이고, 보다 바람직하게는 골관절염, 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 소아 류마티스 관절염, 반응성 관절염, 라이터 증후군 또는 장병성 관절염이고, 가장 바람직하게는 골관절염 또는 류마티스 관절염이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항염증용 약제학적 조성물은 관절낭내(intraarticular) 투여용 조성물이며, 상기 조성물을 관절낭 내에 투여하는 경우 투여된 연골줄기세포는 관절낭 내에서 항염증 활성을 나타내어 염증성 관절염의 치료 효능을 나타낸다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 연골줄기세포를 유효성분으로 이용하여 골질환의 새로운 세포치료 영역(regimen)을 제공한다.

(ⅱ) 또한, 본 발명은 연골줄기세포를 유효성분으로 이용하여 염증질환의 새로운 세포치료 영역(regimen)을 제공한다.

(ⅲ) 본 발명의 연골줄기세포를 관절낭내에 투여하는 경우, 투여된 연골줄기세포는 투여된 부위의 연골세포를 증식시키고 항염증 활성을 나타냄으로써 골질환 및 염증질환을 치료하는 데 매우 유효하다.

(ⅳ) 특히, 본 발명에서의 연골줄기세포의 항염증 활성은 본 발명자들이 아는 범위에서(to our best knowledge), 본 발명자들이 최초로 규명하고 제시하는 것이다.

(v) 본 발명의 연골줄기세포는 종래의 관절염 치료제인 디클로페낙(diclofenac) 보다 항염증 활성이 우수하다.

(ⅵ) 본 발명의 연골줄기세포는 조직이나 장기 이식에서 거부반응을 일으키는 조직적합항원을 발현하지 않으며, 골질환 및 항염증 치료를 위한 세포이식(transplantation) 시 자가세포 또는 타가세포를 이용할 수 있는 장점이 있다.

도 1a-1d는 세포배양 디쉬에서 인간 관절연골조직으로부터 성장시킨 연골유래줄기세포를 나타낸 각각의 이미지이다. 도 1a는 CBAC266, 도 1b는 CBAC237, 도 1c는 CBAC240 및 도 1d는 CBAC1014의 이미지이다.
도 2a-2d는 연골유래줄기세포를 8번째 계대배양 하였을 때 세포의 모양이 변하지 않고 유지되고 있음을 나타낸 각각의 이미지이다. 도 2a는 CBAC266, 도 2b는 CBAC237, 도 2c는 CBAC240 및 도 2d는 CBAC1014의 이미지이다.
도 3a-3d는 인간 연골줄기세포의 배양기간에 따른 증식율을 나타낸 그래프이다. 도 3a는 CBAC266, 도 3b는 CBAC237, 도 3c는 CBAC240 및 도 3d는 CBAC1014의 배양기간에 따른 증식율을 나타낸 결과이다.
도 4a-4d는 FACS를 이용하여 15번째 계대배양된 인간 연골줄기세포의 표면항원들을 분석한 그래프이다. 도 4a는 CBAC266, 도 4b는 CBAC237, 도 4c는 CBAC240 및 도 4d는 CBAC1014의 인간 연골유래줄기세포의 표면항원들을 분석한 결과이다.
도 5는 CBAC266 인간 연골유래줄기세포(15번째 계대배양)의 염색체를 나타낸 이미지이다.
도 6은 CBAC266 인간 연골유래줄기세포(15번째 계대배양)의 미세구조를 나타낸 이미지이다.
도 7은 CBAC266 인간 연골유래줄기세포(15번째 계대배양)를 면역세포화학적 염색으로 나타낸 이미지이다.
도 8은 CBAC266 인간 연골유래줄기세포를 연골분화유도배지에 4주간 펠렛(pellet)으로 배양된 이미지이다.
도 9a-9e는 4주간 펠렛 배양된 CBAC266 인간 연골유래줄기세포의 미세구조를 나타낸 이미지이다.
도 10은 4주간 펠렛 배양된 CBAC266 인간 연골유래줄기세포의 표지유전자를 분석한 결과이다.
도 11은 4주간 펠렛배양된 CBAC266 인간 연골유래줄기세포를 조직화학적 염색으로 나타낸 이미지이다.
도 12는 CBAC266 인간 연골유래줄기세포를 무릎 관절에 주입한 후 무릎 관절(슬관절) 두께의 변화를 분석한 결과이다.
도 13은 CBAC266 인간 연골유래줄기세포를 무릎 관절에 주입한 후 무릎 관절(슬관절)의 최대신장각도의 변화를 분석한 결과이다.
도 14는 CBAC266 인간 연골유래줄기세포를 대퇴골 및 경골에 주입한 후 대퇴골과 경골의 연골표면의 조직병리학적 염색으로 나타낸 이미지이다.
도 15는 CBAC266 인간 연골유래줄기세포를 대퇴골 및 경골에 주입한 후 대퇴골과 경골의 연골표면의 BrdU 면역반응세포를 나타낸 이미지이다.
도 16은 CBAC266 인간 연골유래줄기세포를 연골에 주입한 후 연골의 면역세포화학적 염색으로 나타낸 이미지이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 연골유래줄기세포의 분리 및 배양

조직의 수집

골형성 과정에 있는 인간 태아의 연골에서 4개의 연골조직을 수집하였다. 연골조직시료 운반시에는 5 IU/㎖ 헤파린(Hanlim pharm., 대한민국) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, 미국)이 첨가된 DPBS(Dulbecco’s Phosphate-buffered Salines; Gibco, 미국)가 들어있는 멸균된 플라스틱 용기를 이용하여 무균상태를 유지하였다. 조직시료는 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, Gibco, 미국)이 첨가된 DPBS로 3회 이상 세척하여 잔여 혈액을 제거하였으며, DPBS가 담긴 100 Ø 페트리 디쉬(petri dish)에 옮겼다.

연골유래줄기세포의 분리 및 배양

세척 배지가 담긴 페트리 디쉬에 옮겨진 4개의 조직시료에서 해부현미경(올림푸스, 미국)을 이용하여 4개의 연골조직을 분리하였다. 분리된 연골조직들은 50 ㎖ 무균성 튜브(Falcon, 미국)내에 각각 옮겨서 무균성 수술용 칼(scalpel)로 작은 조각(<0.5 cm²)으로 잘게 자른 후, 세포배양 배지를 첨가하여 파이펫팅으로 재현탁하고 배지가 첨가된 세포배양 접시에서 37℃, 7% CO₂ 조건에서 배양하였다. 조직으로부터 성장시킨 세포는 3-4일 이후부터 광학현미경(Nikon, 일본)을 통해 성상을 관찰 할 수 있었으며, 세포배양 배지는 3일 또는 4일 간격으로 교환하였다.

조직으로부터 11일 동안 60 mm 세포배양접시(Nunc. 미국) 내에서 성장한 세포는 70-80% 이상 증식하였다. 각각 증식된 세포의 단일(single) 형태는 모두 다각형의 형태를 나타내었으며, 세포 간 밀접하게 형성된 세포는 수지상 섬유아세포의 전형적인 방추 형태로 균일하게 증식하는 것을 확인할 수 있었다(도 1a-1d).

기본배지는 CSBM(CoreStem Basal Medium; corestem Inc., 대한민국)을 사용하였다. 세척배지는 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가한 CSBM 배지를 사용하였으며, 세포배양 배지는 10%(v/v) 우태아혈청(FBS; Hyclone, 미국)을 첨가하여 사용하였다.

계대 배양시 세포배양접시(Nunc, 미국) 바닥에 70-80% 이상 붙은 부착성 세포를 트립신 처리(0.125% trypsin-EDTA)하여 수확하였다. 수확한 세포의 수와 생존율 측정은 트립판 블루 색소 배제법(trypan blue dye exclusion method)에 의해 결정하였다. 이 때 수확한 세포를 계대(passage, P) 0으로 결정하였다.

상기 과정을 통하여 구축된 인간 연골줄기세포주들 중에서, 한 개의 연골줄기세포주를 “CBAC266”라 명명하고, 기탁기관 한국유전자은행에 2008년 10월 2일자로 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 11397BP을 부여받았다.

또한, 상기 과정을 통하여 구축된 인간 연골줄기세포주들 중에서, 세 개의 연골줄기세포주를 “CBAC237”, “CBAC240” 및 “CBAC1014”라 각각 명명하고, 기탁기관 한국유전자은행에 2010년 1월 8일자로 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 11617BP, KCTC 11618BP 및 KCTC 11619BP를 각각 부여받았다.

연골유래줄기세포의 동결보존

4개의 연골유래줄기세포를 T175 세포배양 플라스크(Nunc. 미국)에 플라스크 당 1.5 x 10⁵ - 2 x 10⁵개의 세포로 접종한 후 37℃, 7% CO₂ 조건에서 7일간 배양하였다. 세포배양시 배지의 교환은 3일 또는 4일 간격으로 시행하였다.

70-80% 이상 증식한 세포를 트립신 처리(0.125% trypsin-EDTA)하여 수확하였다. 이 수확한 세포들을 20% 우태아혈청과 10% DMSO(dimethylsulfoxide, Sigma, 미국)가 첨가된 CSBM으로 구성된 동결보존용 배지 500 ㎕에 6 x 10⁵세포/바이알(vial)의 밀도로 존재할 수 있도록 세포를 현탁한 다음 세포동결 보존튜브 바이알(cryotube vial; Nunc, 미국)에 각각 분주하였다.

상기 바이알에 분주된 세포현탁액은 이소프로필 알코올이 담긴 동결보존용 용기(Nalgene, 미국)에 넣어 -80℃ 초저온냉장고에 24시간동안 각각 저장한 다음, 다음날 세포가 담긴 바이알을 액체질소저장탱크에 옮겨 보관하였다

연골유래줄기세포의 해동

6 x 10⁵세포/바이알(vial) 밀도의 세포가 담긴 각각의 바이알을 액체 질소 저장탱크에서 실온으로 옮겨 액체질소를 제거한 다음 신속히 37℃ 수조로 이동하였다. 바이알 안에 해동된 4개의 세포 현탁액을 멸균 상태 하에서 세포배양 배지가 담긴 세포배양 플라스크에 접종하였다.

접종한 각각의 세포 밀도는 T175 플라스크 당 1.5 x 10⁵ - 2 x 10⁵개의 세포수로 존재하도록 하였다.

세포배양배지 교환은 3일 또는 4일 간격으로 시행하였으며, 세포의 성상 및 증식 여부는 광학현미경(Nikon, 일본)으로 관찰하였다.

계대8(P8)의 세포성상을 각각 관찰하였으며, 도 1a-1d에서 관찰된 각각의 계대 0(P0)에서 성장하는 세포의 형태를 나타낸 바와 같이, 섬유아세포와 같은 방추 형태로 균일하게 증식하는 것을 확인할 수 있었다(도 2a-2d).

실시예 2: 연골유래줄기세포의 특성분석

연골줄기세포의 증식률 분석

분리한 4개의 연골유래줄기세포에 대하여 계대수(passage number) 증가에 따른 줄기세포의 성장률을 측정하였다.

세포배가(population doubling, PD)는 세포의 성장률을 나타내는 지수로서 세포배가(population doubling, PD) = log (최종 수확한 세포수/초기 접종 세포수)/log 2의 식으로 나타낼 수 있다. 초기접종 세포수는 각 계대수(passage number)마다 T175 플라스크에 1.5 x 10⁵개의 세포로 결정하였고, 배양 후 획득되는 세포의 수를 측정하여 수율을 결정하였다.

연골조직으로부터 분리한 4개의 연골유래 줄기세포를 실시예 1과 같은 분리방법을 거쳐 얻은 후 각각 계대 배양하였다.

성장 곡선 그래프를 통해 130일간(P8-P23)세포의 성장률을 확인한 결과, CBAC226 세포 배가시간(population doubling time. PDT)은 22± 3시간이고, CBAC237 세포 배가시간은 30± 2.8시간이며, CBAC240 세포 배가시간은 25.9± 4.2시간이고, CBAC1014 세포 배가시간은 32.2± 4.1시간임을 확인할 수 있었다(도 3a-3d).

연골유래줄기세포의 표면항원 발현분석

분리된 각각의 연골유래줄기세포의 줄기세포 표지 표면항원 발현특성을 확인하고자 형광 활성화 세포 분류법(fluorescence activated cell sorting: FACS)을 이용하였다. 연골조직으로부터 분리한 4개의 줄기세포를 각각 T75 플라스크에 0.7 x 10⁵개의 세포로 접종한 후 37℃, 7% CO₂ 조건에서 7일간 배양하였다. 세포배양 배지 교환은 3일 또는 4일 간격으로 시행하였다. 70-80% 이상 증식한 4개의 줄기세포를 트립신 처리(0.125% trypsin-EDTA)하여 수확하였다. 이 수확한 4개의 세포를 각각 2% 우태아혈청이 첨가된 DPBS(Gibco, 미국)로 3회 세척하고, 1 x 10⁵세포/100 ㎕의 농도로 현탁한 후 시험관에 분주하여 FACS 칼리버(Calibur; Becton Dickinson, NJ, 미국)로 분석하였다. 항체는 중간엽 줄기세포 마커인 PE-CD29, PE-CD49C, PE-CD44, PE-CD73 및 PE-CD105와 조혈모 세포 마커인 PE-CD34 및 PE-CD45를 이용하였고, 조직적합항원 마커인 PE-HLA-DR (MHC class Ⅱ), 그리고 음성대조군 항체인 PE-면역글로불린 아이소타입 IgG1(immunoglobulin isotype IgG1)를 이용하였으며, 모든 항체는 미국의 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)사의 제품을 사용하였다. 이용한 항체는 얼음 위에서 30분간 암조건에서 세포와 반응시키고, 여분의 항체를 DPBS(Gibco, 미국)로 세척한 후 유세포분석을 하였다.

4개의 구축된 연골유래줄기세포에서 95% 이상의 세포가 줄기세포 표지 표면항원인 CD29, CD44, CD49C, CD73 및 CD105에 대해 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내었고, 조혈줄기세포 표지 표면항원 CD34 및 CD45에 대해서는 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내었다. 결과적으로, 분리한 4개의 연골유래줄기세포는 줄기세포의 특성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 조직이나 장기 이식에서 거부반응을 일으키는 조직적합항원 HLA-DR(MHC class II)이 전혀 발현되지 않거나 거의 발현되지 않은 세포이므로, 기존의 타가유래 세포의 이식수술을 하는 경우 문제가 되는 거부반응 등의 면역반응을 유발하지 아니하고, 이러한 결과를 토대로 구축된 4개의 연골유래줄기세포는 타가유래의 세포로 사용 가능함을 확인 할 수 있었다(도 4a-4d 및 표 1-4).

연골유래줄기세포의 핵형 분석

세포의 분리 및 배양과정 중 정상적인 염색체의 핵형 및 염색체의 수를 유지하고 있는지 확인하기 위해 분석을 시행하였다. 분리한 세포를 T25 플라스크에 1.0 - 1.2 x 10⁵개의 세포로 접종한 후 37℃, 7% CO₂ 조건에서 2-3일간 배양하였다. 증식한 세포를 트립신 처리(0.125% trypsin-EDTA)하여 수확하였으며, 수확한 세포의 유사 분열의 중기(metaphase) 25개를 GTG-밴딩 하였다. 결과적으로, 염색체의 수적 및 구조적 이상을 발견할 수 없었으며, 연골줄기세포의 배양과정에서도 핵형의 변화가 일어나지 않고 정상 염색체(46 XX)를 유지하고 있는 것을 확인하였다(도 5).

연골유래줄기세포의 안전성 검사 (Safety test)

세포의 분리 및 배양과정 중 외부의 미생물 및 바이러스에 감염되었는지 확인하였다. 분리한 세포를 T75 플라스크에 0.7 x 10⁵개의 세포로 접종한 후 37℃, 7% CO₂ 조건에서 7일간 배양하였다. 세포배양 시 3일 또는 4일 간격으로 배지를 교환하였다. 70-80% 이상 증식한 세포를 트립신 처리(0.125% trypsin-EDTA)하여 수확하였으며, 세균 및 외래성 바이러스의 감염 여부를 조사한 결과, 수확한 연골줄기세포에서 이들 세균이 검출되지 않았다(표 5).

연골유래줄기세포의 미세구조 분석

연골조직으로부터 분리한 세포 미세구조의 형태학적 특성을 분석하기 위해 전자 현미경을 통해 관찰하였다. 분리한 세포를 T25 플라스크에 1.0 - 1.2 x 10⁵개의 세포로 접종한 후 37℃, 7% CO₂ 조건에서 7일간 배양하였다. 세포배양배지 교환은 3일 또는 4일 간격으로 시행하였다. 증식한 세포를 트립신 처리하여 수확하였으며, 수확한 세포를 DPBS로 3회 세척 후 2.5% 글루타르알데히드-2% 파라포름알데히드(glutaraldehyde-2% paraformaldehyde; 4℃, 0.1 M 인산완충액(phosphate buffer) 및 pH 7.4)에서 2시간 동안 고정하고, PBS(4℃, 0.1M 인산완충액 및 pH 7.4)으로 3회 세척 후, 1% OsO₄(4℃, 0.1M 인산완충액 및 pH 7.4)으로 암조건에서 1시간 동안 고정하였다. 모든 고정이 끝난 세포는 동일 인산완충용액으로 3회 세척 후, 에탄올 농도 상승 순으로 탈수하고, 프로필렌 옥사이드(propylene oxide)로 치환하여 Epon 812 믹스츄어(mixture)로 포매 한 후, 60℃에서 48시간 동안 열중합하였다. 블록은 초박절기(Ultracut UCT, Leica, 독일)를 이용하여 1 ㎛의 박절편을 제작하여 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색 후 광학현미경 상에서 관찰하고, 60 nm의 초박절편을 만든 후, 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)와 레드 시트레이트(lead citrate)로 이중 염색하여 투과전자현미경(TEM, transmission electronic microscope, H-7600; Hitachi, 일본)으로 가속전압 80 ㎸ 상에서 관찰하였다. 세포의 미세구조 관찰 결과, 전체적으로 세포질 돌기(cytoplasmic process) 및 미세융모가 발달되어 있으며(도 6 패널(A) 및 (B)), 세포질 내 다수의 발달된 분비과립이 관찰되었다(도 6 패널(C) 및 (D)). 또한, 세포질 내 유리 리보소체 및 팽창한 핵과 핵 내막 사이에 섬유판이 관찰되었으며(도 6 패널(E)), 핵에 인접한 사립체(미토콘드리아) 및 조면 소포체(과립세포질세망)가 분포하고 있음을 관찰하였다(도 6 패널(F)). 상기의 결과로 보아 이들의 줄기세포가 전형적인 연골줄기세포의 미세구조적인 특징을 나타냈다.

연골유래줄기세포의 면역세포화학적 분석

세포의 줄기세포 표지 단백질 발현양상은 면역형광 검출방법으로 분석하였다. 0.1% 젤라틴(gelation)으로 전처리한 글라스 커버슬립(glass coverslip)이 담긴 4-웰 세포배양 플레이트(Nunc. 미국)에 세포(0.5 x 10⁴세포/웰)를 접종한 후 37℃, 7% CO₂ 조건에서 7일간 배양하여, 70-80% 이상 증식한 세포를 DPBS로 3회 세척한 후 10% NBF(neutral buffer formalin) 고정 용액으로 30분간 처리하였다. 고정된 세포를 0.1% 트리톤 X-100으로 5분간 처리한 후 DPBS로 3회 세척하고, 3% 우혈청알부민(bovine serum albumin: BSA; Sigma, 미국)으로 60분간 블로킹(blocking) 하였다. 블로킹한 후 DPBS로 3회 세척한 다음 각각의 1차 항체 항-마우스 Oct3/4(1:25, Santa Cruz, 미국), 항-염소 Nanog(1:25, Santa Cruz, 미국), 항-래빗 Sox2(1:100, Chemicon, 미국), 항-마우스 vWF(1:100, Novocastra Lab. Ltd., 영국), 항-마우스 HCAM(CD44, Novocastra Lab. Ltd., 영국), 항-마우스 ICAM(CD54, 1:200, Novocastra Lab. Ltd.,영국), 항-마우스 비멘틴(vimentin; 1:200, Novocastra Lab. Ltd., 영국)으로 3시간 반응시키고, DPBS로 3회 세척 후 2차 항체 FITC-컨쥬게이티드(conjugated) 항-래빗 (1:500, Invitrogen, 미국)과 Cy3-컨쥬게이티드 항-염소(1:500, Invitrogen. 미국)으로 3시간 반응시켰다. 그리고 핵 마커(nuclear marker)인 DAPI(1:1000, Sigma, 미국)로 10분간 반응시킨 후 DPBS로 3회 세척한 다음 공초점 주사현미경(confocal microscopy, LSM 510; Zeiss, 독일)를 이용하여 세포의 단백질 발현을 분석하였다.

미분화 줄기세포 표지단백질인 Oct3/4, Nanog 및 Sox2, 내피세포 표지단백질인 vWF(von Willebrand Factor), 세포골격 표지단백질인 비멘틴 및 세포연접단백질인 CD54(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)가 세포질에서 강하게 발현하였으며, 세포연접단백질인 CD44(homing cell adhesion molecule, HCAM)는 세포막에 강하게 발현하였다(도 7).

실시예 3: 연골유래줄기세포의 연골분화 특성분석

연골세포 분화유도

세포의 연골세포 분화특성을 분석하고자 연골세포분화유도배지(NH ChondroDiff medium; Miltenyi Biotec. 미국)를 첨가하여 일정 기간 동안 펠렛 배양하고 형태학적 특성을 분석하였다.

연골 조직으로부터 분리한 세포를 T25 플라스크에 1.0 - 1.2 x 10⁵개의 세포로 접종한 후 37℃, 7% CO₂ 조건에서 7일간 배양하였다. 증식한 세포를 트립신 처리하여 수확하였다. 수확한 세포를 5 x 10⁵세포/㎖의 세포농도로 세포배양배지에 현탁하여 15 ㎖ 폴리프로필렌 코니칼 튜브(polypropylene conical tube)에 1 ㎖씩 분주하였다. 그리고 튜브를 500 xg에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 연골세포분화유도배지(NH ChondroDiff medium; Miltenyi Biotec. 미국)를 1 ㎖씩 분주하였다.

튜브의 뚜껑을 일부 열어 공기의 순환이 원활하도록 하여, 37℃, 7% CO₂ 조건에서 0.5주, 1주, 2주, 3주 및 4주간 배양하였으며, 세포의 형태는 광학현미경(Nikon, 일본)으로 관찰하였다. 펠렛 배양된 세포의 형태학적 특성을 확인한 결과, 0.5주째 배양된 세포는 불규칙한 형태의 펠렛을 형성하였다(도 8 패널(A)). 1주째부터 4주째에 배양된 세포는 구형의 펠렛을 형성하였으며, 배양기간이 길어짐에 따라 펠렛의 크기가 증가하였다(도 8 패널(B), (C), (D) 및 (E)).

분화된 연굴유래줄기세포의 미세구조 분석

펠렛 배양된 세포 미세구조의 형태학적 특성을 분석하기 위해 전자 현미경으로 관찰하였다. 일정 기간 동안 펠렛 배양된 세포를 2.5% 글루타르알데히드-2% 파라포름알데히드(4℃, 0.1M 인산 완충액, pH 7.4)에 2시간 동안 고정한 후 실시예 2과 동일하게 진행하였다. 세포의 미세구조 관찰 결과, 0.5주째 펠렛 배양된 세포는 전체적으로 불규칙한 둥근 형태를 나타냈으며, 핵은 크고 둥글거나 불규칙한 형태로 세포의 대부분을 차지하고 있었다. 세포질 내에는 핵에 인접한 소수의 작은 사립체가 산재해 있고 다수의 발달된 분비 과립과 유리 리보소체가 관찰되었으며, 조면소포체(과립세포질세망)가 잘 발달되어있다. 그 밖에 지방 방울(lipid droplet)을 함유하고 있었다(도 9a 패널 (A)). 그리고 세포사이물질에서는 연골의 기질을 이루고 있는 소수의 얇은 섬유다발(thin fiber bundle)이 관찰되었다(도 9a 패널 (B) 및 (C)).

1주째 펠렛 배양된 세포는 타원형으로, 세포내 핵의 비율이 높았다(도 9b 패널 (A)). 세포질 내 유리 리보좀 및 핵에 인접한 활성화된 사립체와 조면 소포체(과립세포질세망)가 발달되어 있으며, 지방방울(lipid droplet)을 함유하고 있었다(도 9b 패널 (B)). 그리고 세포사이 물질에서는 연골의 기질을 이루고 있는 얇은 섬유 다발(thin fiber bundle)이 소수 형성되고(도 9b 패널 (C)), 여러 겹으로 형성된 골지체의 주위에 분비소포들이 관찰되었다(도 9b 패널 (C) 및 (D)).

2주, 3주 및 4주째 펠렛 배양된 세포는 전체적으로 불규칙하고 신장(elongation)된 형태의 세포로 세포질 내에는 핵에 인접한 활성화된 사립체가 산재해 있고 다수의 발달된 유리 리보소체가 관찰되었으며, 조면소포체(과립세포질세망)가 잘 발달되어있다. 그 밖에 다수의 지방방울을 함유하고 있었다((도 9c 패널 (A) 및 (B)), (도 9d 패널 (A) 및 (B)), (도 9e 패널 (A) 및 (B)). 그리고 세포사이 물질에서는 연골의 기질을 이루고 있는 다수의 얇은 섬유 다발(thin fiber bundle)과 여러 겹으로 형성된 골지체가 다수 관찰되었다[(도 9c 패널 (C) 및 (D), (도 9a 패널 (C), (D) 및 (E)) 및 (도 9a 패널 (C), (D) 및 (E))].

연골유래줄기세포에서 줄기세포 및 세포분화 표지유전자 분석

연골조직으로부터 분리한 단층 배양된 세포 및 일정 기간 동안 펠렛 배양된 세포의 줄기세포 특성 및 연골세포 분화 특성을 유전자 수준에서 분석하고자 미분화 줄기세포의 표지 유전자 및 연골분화에 관련된 표지 유전자의 발현 양상을 분석하였다.

연골조직으로부터 분리한 단층 배양된 세포 및 일정 기간 동안 펠렛 배양된 세포의 전체 RNA는 트리졸 시약(TRIzol; Invitrogen, 미국)을 사용하여 분리하였다. 펠렛 배양된 세포는 균질기(homogenizer)를 이용하여 세포분쇄 후 총 RNA를 분리하였다. 최종적으로 RNase-부재 물에 녹여 흡광도계(Bio-Rad, 미국)를 이용하여 260 nm에서 정량 측정하였다.

cDNA합성은 DNase I을 사용한 방법을 사용하였다. 추출한 전체 RNA 3 ㎍을 주형으로 하여 DNase I(Roche Diagnostics, 독일), Super Script Ⅱ 역전사효소(Invitrogen, 미국), 올리고 d(T)(Invitrogen, 미국) 및 dNTP(Invitrogen, US)을 사용하여 42℃/60분, 72℃/15분의 역전사 반응을 거쳐 만든 후 4℃ 조건에 보관하여 사용하였다.

PCR 증폭은 최종 반응액 부피 50 ㎕로 25 ㎕의 PCR 프리믹스츄어(2x Multiplex PCR Pre-Mix; SolGent co., Ltd. 대한민국), 1 ㎕의 cDNA, 2 ㎕의 표지유전자의 정방향 및 역방향 프라이머(forward & reverse primer, 10 pmol)를 첨가하여 95℃/45초 변성, 53-56℃/1분 어닐링, 72℃/2분 연장반응을 25-30 사이클로 T3 열순환 반응기(thermocycler; Biometra, 독일)에서 증폭을 시행하였다.

프라이머의 염기서열은 미국 국립생물정보센터 (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 데이터베이스로부터 얻은 정보로 인테그레이티드 DNA 테크놀로지(Integrated DNA Technologies; http://www.idtdna.com)에서 제공하는 프라이머 제작 프로그램을 이용하여 제작하였으며, PCR에 사용된 모든 유전자에 대한 프라이머 서열(primer sequence), 산물 크기(product size), 어닐링(annealing) 온도 및 PCR 증폭 사이클(cycle) 수는 표 6과 같은 조건에서 PCR 증폭을 시행하였다. PCR에 얻어진 산물은 2% 아가로즈 젤에서 전기영동한 후, EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 UV에서 확인하였고, GAPDH를 대조군으로 하여 분석하였다.

미분화 줄기세포 표지 유전자인 Oct3/4, Nanog 및 Rex-1의 발현이 단층 배양된 세포에서는 증가하였으므로 미분화 상태를 유지하고 있었다. 연골기질의 주요성분인 콜라겐 중 제1, 3 및 10형 콜라겐(타입 I, Ⅲ 및 X 콜라겐)의 발현은 연골분화초기인 펠렛 배양 0.5주째부터 발현이 증가하였으며, 제2형 콜라겐(Type Ⅱ Collagen)의 발현은 연골분화중기인 펠렛 배양 1주 및 2주째에 증가하다가 이후에 감소하였고, 제9형 콜라겐(Type IX Collagen)의 발현은 연골분화후기인 4주째에 강하게 증가하였다. 연골 기질 성분인 어그리칸(Aggrecan)은 1주째부터 발현이 증가하다가 3주째부터 감소하였으며, 연골세포의 증식 및 분화 조절에 관여하는 유전자 Sox 5, Sox 6 및 Sox 9는 0.5주째에 강하게 발현하다가 2주째 이후부터 감소하였다.

펠렛배양된 세포의 조직화학적 분석

일정 기간 동안 펠렛 배양된 세포의 조직화학적 분석을 실시하였다. 사프라닌 O, 알시안 블루(alcian blue) 및 트리크롬(trichrome) 염색을 통해 연골의 주요기질 성분인 프로테오글리칸(proteoglycan), 글리코사민글리칸(glycosaminglycan:GAG), 콜라겐의 발현양상을 확인하였다.

펠렛 배양된 세포를 DPBS로 3회 세척한 후 10% 중성 포르말린(neutral buffer formalin:NBF) 고정용액으로 2시간 동안 고정하였다. 고정된 세포를 일반적인 조직 표본제작법 과정을 시행한 후 파라핀 포매 하였다. 박절기를 이용하여 6 ㎛ 두께의 조직절편을 제작하여 탈파리핀과 함수과정을 거친 후 각각의 조직화학적 염색 하였다.

헤마톡실린(Hematoxylin) 및 에오신(Eosin) 염색 방법(Harris, 1900)을 이용하여 세포의 핵 및 세포질을 염색하였다. 헤마톡실린 용액에 3-5분간 염색한 후 세척한 다음, 에오신 용액에 2분간 염색하고, 세척, 탈수, 청명 및 봉입단계를 실시하였다.

사프라닌 O 염색 방법을 이용하여 연골의 주요성분이며, 단백질과 복합된 점액성 다당류인 프로테오글리칸(proteoglycan)이 함유된 부분을 염색하였다. 웨이거트 아이언 헤마톡실린(Weigert’s iron hematoxylin) 용액에 7분간 염색한 후 세척한 하고, 0.01% 페스트 그린(fast green) 용액에 3분간 염색하였다. 1% 아세트산(acetic acid) 용액에 10-15초간 반응 후 0.1% 사프라닌 O 용액에 5분간 염색한 후 세척, 탈수, 청명 및 봉입 단계를 시행하였다.

알시안 블루(Alcian blue) 염색방법을 응용하여 연골의 주요성분인 글리코사민글리칸이 함유된 부분을 염색하였다. 웨이거 아이언 헤마톡실린 용액에 7분간 염색한 후 세척하고, 3% 빙초산(glacial acetic acid) 용액에 5분간 반응시킨 후 1% 알시안 블루 용액에 30분간 염색하였다. 그리고 세척, 탈수, 청명 및 봉입 단계를 실시하였다.

트리크롬 염색방법(Masson Trichrome)을 이용하여 연골의 주요성분인 콜라겐 기질부분이 함유된 부분을 염색하였다. 56℃ 조건의 보우인(Bouin) 용액에서 1시간 반응시킨 후 세척한 다음 웨이거트 아이언 헤마톡실린 용액에 7분간 염색한 후 세척한다. 그리고 비에브리치 스칼렛-산 푹신(Biebrich scarlet-acid fuchsin) 용액에 2분간 염색하고 세척한 다음, 포스포몰리브딕-포스포텅스틱산(phosphomolybdic-phosphotungstic acid) 용액에 10-15분간 반응시키고, 아닐린 블루(aniline blue) 용액에 5분간 염색한다. 마지막으로 0.5% 빙초산 용액에 5분간 반응시킨 후 세척, 탈수, 청명 및 봉입단계를 실시하였다.

분석 결과, 펠렛 배양기간이 길어짐에 따라 염색의 정도가 증가하였으며, 특이적으로 연골소강(cartilage lacuna)이 형성되었음을 확인하였다.

실시예 4: 연골줄기세포의 세포치료제 유효성 검증

실험동물 및 사양관리

120마리의 6주령 수컷 스프래그-돌리 랫트(Sprague-Dawley rats; SLC, 일본)를 7일간의 순화기간을 거쳐 실험에 이용하였으며, 모든 실험 동물은 4마리 또는 5마리씩 랫트용 사육 상자(polycarbonate cage)에 수용하여 온도(20-25℃) 및 습도(40-45%)가 조절된 실험 동물실에서 사육하였다. 명암 주기는 12시간:12시간으로 조절하였으며, 사료(삼양사, 대한민국) 및 음수는 자유롭게 공급하였다. 모든 실험동물은 최종 희생일에 18시간 이상 절식하였으며, “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals by Institute of Laboratory Animal Resources, Commission on Life Science, National Research Council, USA on 1996, Washington D.C”에 준하여 취급하였다. 수술 7일 후의 관절두께 및 체중을 기준으로 하여, 표 4과 같이 7그룹으로 구분하였다. 본 실험에서는 군당 8마리의 실험동물(총 56수)을 선정하여 사용하였다.

연골줄기세포 및 대조약물(Diclofenac sodium) 준비 및 투여

본 실험에서는 CSBM 배지에 현탁된 4가지 농도(고농도(9.6 x 10⁶세포/마리), 중간고농도(4.8 x 10⁶세포/마리), 중간저농도(2.4 x 10⁶세포/마리), 저농도(1.2 x 10⁶세포/마리))의 세포를 사용하였으며, CSBM 배지를 매체로 이용하여 1 ㎖/㎏의 용량으로 골관절염 유발 수술(앞쪽 십자인대 및 내측 반월판 부분절제술) 실시 1주 후 관절낭 내로 각각 1회 주입하였다. 정상 및 골관절염 유발 대조군에서는 CBAC226 투여와 동일한 방법으로 CSBM 배지만을 관절낭내로 1회 주입하였으며, 대조 약물로 2 ㎎/㎏의 디클로페낙나트륨(Diclofenac sodium; Sigma, MO, 미국)을 생리식염수에 용해시켜, 1 ㎖/㎏의 용량으로, 매일 1회씩 84일간 경부에 피하주사로 투여하였다(표 7).

무릎 관절(슬관절) 두께의 변화 분석

골관절염 유발은 만성 염증성 질환으로 골관절염 유발 시 연골 손상 등에 의해 주위 관절의 부종이 초래되고, 관절 두께의 현저한 증가가 관찰된다. 일반적으로 관절의 두께 변화측정은 골관절염 유발정도를 평가하는데 가장 기본적인 지표로 이용되고 있으며, 관절두께가 감소할수록 골관절염 유발정도가 낮은 것으로 확인된다.

생존한 각 대조군 및 실험군 관절의 두께를 캘리퍼스(calipers)를 이용하여 측정한 결과, 골관절염 유발 대조군에서는 정상 대조군에 비해 18.66% 증가하여, 현저히 무릎 관절의 두께가 증가한 것을 알 수 있었다. 대조약물 투여군, 세포 고농도, 중간 고농도, 중간 저농도 및 저농도 투여군에서는 각각 골관절염 대조군에 비해 5.79, 5.10, 3.82, 4.72 및 6.00% 감소하였다(도 12).

모든 세포투여군 및 대조약물 투여군에서는 현저히 무릎 관절 두께가 감소되어 연골유래 줄기세포는 골관절염에 의해 유발되는 주위 조직의 부종을 현저히 감소됨을 확인하였다.

무릎 관절(슬관절)의 최대신장각도 변화 분석

골관절염 유발 시 만성염증에 의한 섬유화가 진행됨에 따라 유발된 관절의 운동성이 매우 제한 받게 된다. 관절의 최대 신장 각도는 관절의 운동성을 평가하는데 가장 기본적인 지표로 사용되고 있다. 따라서 신장 각도가 낮을수록 높은 운동성을 나타낸다(Rezende et al., 2006).

약물 및 세포 투여군을 84일 후 희생하여, 고관절부위에서 오른쪽 후지를 적출한 다음 주변 피부, 결합조직 및 근육을 제거하고, 각도 0을 이론상 최대 신장각도로 하여 무릅 관절의 신장 각도를 각각 측정하였으며, 측정시의 오류를 최소화하기 위해 모든 신장각도는 동일한 실험자가 측정하였다(Rezende et al.,2006).

분석 결과, 골관절염 유발 대조군(도 13의 패널(B))에서는 정상대조군(도 13의 패널(A))에 비해 159.39% 증가하여 무릎 관절의 최대 신장 각도가 현저히 증가한 것을 알 수 있었다. 대조약물 투여군(도 13의 패널(C)), 세포 고농도(도 13의 패널(D)), 중간고농도(도 13의 패널(E)), 중간저농도(도 13의 패널(F)) 및 저농도 투여군(도 13(G))에서는 각각 골관절염 대조군에 비해 18.18, 21.72, 29.29, 16.16 및 15.99% 감소하였다. 따라서 대조약물 투여 및 세포 투여에 의해 관절염 증상과 관련된 무릎 관절(슬관절)의 최대신장각도가 효과적으로 감소되었음을 확인하였다(표 8).

무릎 연골의 조직병리학적 분석

연골의 조직병리학적 관찰 및 분석을 위해 맨킨 스코어(Mankin score) 분석법과 연골의 두께를 측정하였다(표 9). 맨킨 스코어 분석법은 관절염을 평가하는 가장 기본적인 조직병리학적 관찰로, 스코어가 높을수록 골관절염의 유발 정도가 높은 것으로 알려져 있다(Armstrong et al., 1994 ; Rezende et al., 2006).

각 대조군 및 실험군의 관절낭을 잘 보존한 상태로 무릎 관절부위를 적출하여 10% 중성포르말린(neutral buffered formalin: NBF) 고정용액에 5일간 고정한 다음 탈회액(decalcifying solution [24.4% formic acid, and 0.5N sodium hydroxide])을 이용하여 탈회하였으며, 탈회액은 매일 1회씩 5일간 교환하였다. 탈회 후, 관절낭의 내측부분(median joint parts)을 가로로 절단하여 파라핀 포매를 실시하고. 3-4 ㎛ 두께의 조직절편을 제작하여 탈파라핀과 함수과정을 거친 후 헤마톡실린 & 에오신(Hematoxylin & Eosin: H&E) 및 사프라닌 O 염색을 실시하여 연골을 관찰하였다(Camplejohn and Allard, 1988; Kahveci et al., 2000 ; Tran et al., 2000).

무릎 관절조직의 손상 정도는 정상 대조군과 비교하여 맨킨 스코어링(Mankin Scoring)을 하였으며, 조직형태측정법(histomorphometry)으로 경골과 대퇴골 관절면의 연골 두께를 자동영상분석 장치 (DMI-300, DMI, 대한민국)를 이용하여 분석하였다.

분석 결과, 대퇴골의 맨킨 스코어는 골관절염 유발대조군의 경우 정상대조군에 비해 1,216.67% 증가하였다. 대조약물 투여군, 세포 고농도, 중간 고농도, 중간 저농도 및 저농도 투여군에서는 각각 골관절염 유발 대조군에 비해 27.85, 69.62, 73.42, 50.63 및 51.90% 감소하였다(표 10). 그리고 연골두께는 골관절염 유발대조군의 경우 정상 대조군에 비해 46.78% 증가하였다. 대조약물 투여군, 세포 고농도, 중간고농도, 중간저농도 및 저농도 투여군에서는 각각 골관절염 대조군에 비해 35.11, 130.49, 155.18, 107.53 및 109.59% 증가하였다(표 12).

경골의 맨킨 스코어는 골관절염 유발 대조군의 경우 정상대조군에 비해 2166.67%의 변화를 나타내어 맨킨 스코어 값이 증가한 것을 알 수 있었다. 대조약물 투여군, 세포 고농도, 중간 고농도, 중간 저농도 및 저농도 투여군에서는 각각 골관절염 유발대조군에 비해 20.59, 39.71, 44.12, 42.65 및 36.76% 감소하였다(표 11). 그리고 연골두께는 골관절염 유발대조군의 경우 정상대조군에 비해 61.99% 증가하였다. 대조약물 투여군, 세포 고농도, 중간 고농도, 중간 저농도 및 저농도 투여군에서는 각각 골관절염 유발대조군에 비해 68.81, 104.12, 137.91, 96.84 및 116.46% 증가하였다(표 12).

상기의 결과를 분석하였을 때, 골관절염군에서는 경골 및 대퇴골 관절면 연골의 맨킨 스코어가 증가하였으며, 현저히 관절 연골의 두께가 감소하였다(Moore et al., 2005). 반면에 대조약물 및 세포 투여군에서는 맨킨 스코어가 감소하였으며, 연골 두께가 정상대조군 수준으로 회복되었다(표 7, 8, 9, 도 14).

맨킨 스코어는 각 지수의 합이다.

1)총 Mankin score 측정값 (최대값= 12)

1)총 Mankin score 측정값 (최대값= 12)

무릎 연골 내의 연골세포 증식력 분석

각 실험군의 관절낭내에서 연골유래의 줄기세포의 투여 및 증식에 의한 관절 연골의 증식 여부를 확인하기 위해 관절낭 내에서 증식중인 연골세포를 BrdU로 표지하여 확인하였다. BrdU에 표지된 세포는 BrdU 주입 후 증식한 세포이므로 연골세포의 증식을 분석할 수 있다.

각 대조군 및 실험군의 최종 희생일 72시간 전에 2 ㎖/㎏의 농도로 생리식염수에 희석된 5-브로모-2’-디옥시우리딘(5-Bromo-2’-Deoxyuridine; 50 ㎎/㎏, BrdU; MP Biomedicals, OH, 미국)을 1회 복강 주사하였으며, BrdU 항체 및 ANNEX V에 첨부된 BrdU 염색법에 따라 면역조직화학적 염색을 시행하였다(Hwang et al., 2000 ; Moore et al., 2005 ; Ganey et al., 2003 ; Ito et al., 1998 ; Tang et al., 2007).

면역조직화학염색은 벡터 엘리트 ABC 키트(Vector Elite ABC kit; Vector Lab. Inc., CA, 미국)를 이용하여 BrdU의 발현양상을 확인하였다. 조직을 DPBS로 세척한 후 3% H₂O₂(hydrogen peroxide)용액에 30분간 상온에서 반응시켰다. DPBS 로 세척 후 정상혈청(1:100, Normal horse serum ; Vector Lab. Inc., CA, 미국)으로 30분간 반응 시켜서 염색과정 중에 나타날 수 있는 비특이적 반응을 방지하였다. 1차 항체 항-마우스 BrdU(1:100, Abcam, 영국)로 4℃ 조건에서 18시간 동안 반응시키고 DPBS로 세척한 후 바이오틴(biotin)이 결합된 2차 항체를 실온에서 30분 반응시켰다. 여분의 2차 항체를 DPBS로 세척한 후 벡터 엘리트 ABC 키트에 포함된 ABC 용액(1:50로 희석)으로 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 DPBS로 세척한 후 퍼옥시다아제 기질 키트(Peroxidase substrate kit; Vector Lab. Inc., CA. 미국)로 발색반응을 유도한 다음, 메이어 헤마톡실린(Mayer's hematoxylin) 용액으로 대조염색을 하고, 세척, 탈수, 청명 및 봉입단계를 시행하였다. 염색의 특이성을 확인하기 위한 음성대조군에는 1차 항체를 생략한 후 모든 염색과정을 동일하게 실시하였으며, 광학현미경(Nikon, 일본)을 통해 관찰하였다. BrdU 면역반응 세포수 측정은 BrdU 항체에 10% 이상 반응을 나타내는 세포를 면역반응 세포로 하여, 경골 및 대퇴골의 관절면에서 총 100개의 연골세포 중 BrdU 양성반응세포의 수를 각각 자동영상 분석 장치를 이용하여 % 단위를 측정하였다.

분석결과, 대퇴골 관절면 연골에서 BrdU 면역반응세포의 수는 골관절염 유발대조군의 경우 정상 대조군에 비해 82.69% 감소하였으며, 대조약물 투여군, 세포 고농도, 중간 고농도, 중간 저농도 및 저농도 투여군에서는 각각 골관절염 유발대조군에 비해 9.52%, 298.41%, 400.00%, 233.33% 및 206.35% 증가하였다(표 13).

경골 관절면 연골에서 BrdU 면역반응세포의 수는 골관절염 유발대조군의 경우 정상 대조군에 비해 80.43% 감소하였으며, 대조약물 투여군, 세포 고농도, 중간 고농도, 중간 저농도 및 저농도 투여군에서는 각각 골관절염 유발대조군에 비해 1.56%, 265.63%, 401.56%, 314.06%, 314.06% 및 209.38% 증가하였다(표 13).

따라서 골관절염 유발대조군은 정상대조군에 비해 현저히 BrdU 면역반응세포의 수적 감소가 확인되었고, 대조약물 투여군은 골관절염 유발대조군과 유사한 면역반응세포가 인정된 반면 모든 연골유래 줄기세포 투여군에서는 골관절염 유발대조군에 비해 현저히 면역반응세포의 증가가 인정되었다. 또한, 연골줄기세포 투여군은 대조약물 투여군과 달리 주입한 연골줄기세포의 증식 및 분화에 의해 손상된 연골결손 부위가 정상 대조군과 같은 수준으로 회복되었다(도 15).

면역조직화학적 염색법을 이용한 세포의 분포분석

면역조직화학적 염색법을 이용하여 실험군에 주입한 세포의 분포를 확인하기 위하여 인간 특이적 미토콘드리아와 연골의 표지단백질인 인간 특이적 제2형 콜라겐(Type Ⅱ Collagen)의 발현 분포를 분석하였다.

실험군의 관절낭을 잘 보존한 상태로 무릎 관절부위를 적출하여 10% 중성포르말린 고정용액에 5일간 고정한 다음 탈회액을 이용하여 탈회하였다. 이때 탈회액은 매일 1회씩 5일간 교환하였다. 탈회 후, 관절낭의 내측부분(median joint parts)을 가로로 절단하여 파라핀 포매를 실시하였고. 3-4 ㎛ 두께의 조직절편을 제작하여 탈파라핀과 함수과정을 거친 후 증류수 세척하였으며, 0.05% Tween 20 이 첨가된 구연산나트륨(sodium citrate) 용액(10 mM, pH 6.0)에 5분간 끓인 후 면역조직화학염색을 실시하였다.

조직절편을 DPBS로 세척한 후 3% 우혈청 알부민(bovine serum albumin: BSA; Sigma, 미국)으로 45분간 반응 시켜서 염색과정 중에 나타날 수 있는 비특이적 반응을 방지하였다. 블록킹 후 DPBS로 3회 세척한 다음 각각의 1차 항체 인간 특이적 항-마우스 미토콘드리아(1:50, Chemicon, 미국), 인간 특이적 항-래빗 제2형 콜라겐 (1:50, Chemicon, 미국)으로 4℃조건에서 14-16시간 동안 반응시키고 DPBS로 3회 세척 후 2차 항체 FITC-컨쥬게이티드 항-래빗(1: 500, Invitrogen, 미국)과 Cy3-컨쥬게이티드 항-염소(1:500, Invitrogen. 미국)로 3시간 반응시켰다. 그리고 핵 마커(nuclear marker)인 DAPI(1:1000, Sigma, 미국)로 10분간 반응시킨 후 DPBS로 3회 세척한 다음 공초점 주사현미경(confocal microscopy; LSM 510, Zeiss, 독일)을 이용하여 세포의 단백질 발현을 분석하였다.

분석결과, 실험군 조직 절편 내의 세포 중 인간 특이적 미토콘드리아 및 인간 특이적 제2형 콜라겐(Type Ⅱ Collagen)의 단백질이 강하게 발현하는 부분을 확인하였으며, 분비된 형태의 제2형 콜라겐(Type Ⅱ Collagen)을 확인하였다(도 16).

유효성 평가 산출식

골관절염의 유발정도를 파악하기 위하여 정상 대조군과 골관절염 유발 대조군과의 퍼센트 변화율(percent change)을 하기의 제1공식을 이용하여 측정하였으며, 투여 물질의 약효를 좀 더 명확히 하기 위하여 투여군과 골관절염 유발 대조군과의 퍼센트 변화율을 하기의 제2공식을 이용하여 각각 산출하였다.

제1공식: 정상 대조군과 골관절염 유발 대조군과의 퍼센트 변화율(%)

= [(골관절염 유발 대조군의 수치-정상 대조군의 수치)/정상 대조군의 수치] x 100

제2공식: 투여군과 골관절염 유발 대조군과 퍼센트 변화율(%)

= [(투여군의 수치-골관절염 유발 대조군의 수치)/골관절염 유발 대조군의 수치] x 100

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참조 문헌

1. Armstrong S, Read R, Ghosh P. The effects of intra articular hyaluronan on cartilage and subchondral bone changes in an ovine model of early osteoarthritis. J Rheumatol. 1994;21:680-8.

2. Camplejohn KL, Allard SA. Limitations of safranin 'O' staining in proteoglycan-depleted cartilage demonstrated with monoclonal antibodies. Histochemistry. 1988;89:185-8.

3. Kahveci Z, Minbay FZ, Cavusoglu L. Safranin O staining using a microwave oven. Biotech Histochem. 2000;75:264-8.

4. Moore EE, Bendele AM, Thompson DL, Littau A, WaggieKS, ReardonB, EllsworthJL. Fibroblast growth factor-18 stimulates chondrogenesis and cartilage repair in a rat model of injury-induced osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2005;13:623-31.

5. Rezende MU, Gurgel HM, Vilaca Junior PR, Kuroba RK, Lopes AS, Phillipi RZ, Hernandez AJ. Diacerhein versus glucosamine in a rat model of osteoarthritis. Clinics. 2006;61:461-6.

6. Tran D, Golick M, Rabinovitz H, Rivlin D, Elgart G, Nordlow B. Hematoxylin and safranin O staining of frozen sections. 2000; Dermatol Surg. 26:197-9.

한국생명공학연구원

KCTC11397

20081002

한국생명공학연구원

KCTC11617

20100108

한국생명공학연구원

KCTC11618

20100108

한국생명공학연구원

KCTC11619

20100108

Claims

(a) (i) CD44 표면항원에 대하여 양성의 면역학적 특성; (ⅱ) CD29, CD49C, CD73 및 CD105로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 표면항원에 대하여 양성의 면역학적 특성; 및 (ⅲ) 표면 항원인 CD34 또는 CD45에 음성의 면역학적 특성을 가지며, 그리고 (ⅳ) Oct3/4, Nanog, Rex-1, Sox 2, Sox 5, Sox 6 및 Sox 9로 구성된 군으로부터 선택되는 미분화 줄기세포 표지 단백질의 최소 1종을 세포질에서 발현하는 인간의 연골조직으로부터 유래된 연골줄기세포의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 골질환(bone disease) 치료용 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 연골줄기세포는 세포배가시간(population doubling time)이 15-30 시간인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 연골줄기세포는 조직적합항원 HLA-DR(MHC class Ⅱ)을 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 연골줄기세포는 자가세포 또는 타가세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 연골줄기세포는 세포질에서 세포골격 표지단백질인 비멘틴(vimentin) 또는 세포연접 단백질인 CD54(intercellular cell adhesion molecule-1: ICAM-1)를 발현하는 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 연골줄기세포는 기탁번호 KCTC 11397BP의 “CBAC266”, KCTC 11617BP의 “CBAC237”, KCTC 11618BP의 “CBAC240” 또는 KCTC 11619BP의 “CBAC1014”의 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 연골줄기세포는 항염증 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 연골줄기세포는 연골세포의 증식 촉진 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 골질환은 병리학적 또는 물리적으로 인한 뼈의 손상으로부터 유래한 것을 특징으로 하는 조성물.
(a) (i) CD29, CD44, CD49C, CD73 및 CD105로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 표면항원에 대하여 양성의 면역학적 특성; 및 (ⅱ) 표면 항원인 CD34 또는 CD45에 음성의 면역학적 특성을 가지며, 그리고 (ⅲ) Oct3/4, Nanog, Rex-1, Sox 2, Sox 5, Sox 6 및 Sox 9로 구성된 군으로부터 선택되는 미분화 줄기세포 표지 단백질의 최소 1종을 세포질에서 발현하는 연골줄기세포의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항염증용 약제학적 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 연골줄기세포는 세포배가시간(population doubling time)이 15-30시간인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 연골줄기세포는 조직적합항원 HLA-DR(MHC class Ⅱ)을 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 연골줄기세포는 자가세포 또는 타가세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 연골줄기세포는 세포질에서 세포골격 표지단백질인 비멘틴(vimentin) 또는 세포연접 단백질인 CD54(intercellular cell adhesion molecule-1: ICAM-1)를 발현하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 연골줄기세포는 세포막에서 세포연접 단백질인 CD44(homing cell adhension molecule, HCAM)을 발현하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 연골줄기세포는 기탁번호 KCTC 11397BP의 “CBAC226”, KCTC 11617BP의 “CBAC237”, KCTC 11618BP의 “CBAC240” 또는 KCTC 11619BP의 “CBAC1014”의 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 연골줄기세포는 인간의 연골조직으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 조성물은 관절낭내(intraarticular) 투여용 조성물이며, 상기 조성물은 관절에서의 염증 반응을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.