CN102399745A

CN102399745A - 一种软骨干细胞分离培养方法

Info

Publication number: CN102399745A
Application number: CN2011103746250A
Authority: CN
Inventors: 姜洋子; 欧阳宏伟
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2011-11-22
Filing date: 2011-11-22
Publication date: 2012-04-04

Abstract

本发明提供了一种软骨干细胞分离培养方法。本发明所述的软骨干细胞为由软骨组织细胞筛选而来，经特定培养基培养条件维持的成纤维样细胞，具骨、软骨及脂肪分化能力，与成体细胞相比还具有良好的扩增能力，自原代收获后可传至15代以上而保持原来特性。本发明利用特定培养条件进行筛选，纯化出软骨干细胞，使软骨干细胞含量在95％以上，此技术将促进软骨组织性特异干细胞的收获和应用于骨、软骨组织工程。

Description

一种软骨干细胞分离培养方法

(一)技术领域

本发明涉及一种软骨干细胞分离培养方法。

(二)背景技术

软骨缺损是一类普遍疾病，严重的关节软骨缺损会导致骨关节炎。在我国，骨关节炎发病率3％，并有逐年上升的趋势。然而目前治疗骨关节炎的手段对症治疗效果短暂，长期疗效不确定，而基于组织工程原理的自体软骨细胞移植的疗法也存在种子细胞来源不足和质量有限的缺陷：成体软骨细胞的的供区极其有限；软骨细胞在体外培养过程中扩增能力有限；传代后的细胞老化，发生“去分化”现象，丧失形成软骨能力等。因此难以用少量的成体软骨细胞经体外培养扩增后来获得大量有正常功能的软骨细胞，从而限制了软骨组织工程的临床应用。为了解决种子细胞来源不足的问题，干细胞凭借其自我更新能力和多向分化潜能的特征，为组织工程提供了理想的种子来源，来源于软骨组织的组织特异性干细胞在其中有其先天优势。最近有研究表明，软骨组织中存在具有多能特性的干细胞。将软骨细胞体外低密度种植，有部分细胞表现出成集落特性。经鉴定发现其中有十分之一的细胞具有向脂肪，骨和软骨多向分化的潜能。从胚胎软骨组织中也分离出了具有间质干细胞特性的细胞。只是，在这样的分离过程中，还没有标准的分选流程，并能保证分选效率。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种软骨干细胞分离培养方法。

本发明采用的技术方案是：

一种软骨干细胞分离培养方法，所述方法包括：

(1)取三代以内的软骨细胞，用细胞培养基I培养至软骨细胞长满培养皿；所述细胞培养基I终浓度组成如下：5～20％(w/v，质量体积百分比浓度，某组分浓度1％表示100mL培养液中含有该组分1g，下同)胎牛血清，50～200U/ml青霉素，50～200U/ml链霉素，0.5～2mM L-谷氨酰胺，溶剂为F12-DMEM(F12与DMEM体积比1∶1的混合液)；

(2)软骨细胞长满后用胰酶-EDTA(即胰酶/EDTA消化液，胰酶浓度0.01～0.05％，EDTA浓度0.01～0.05％，w/v)消化成单细胞悬液，以小于50个细胞/cm²的密度接种至培养板，利用细胞培养基II进行培养10～14天；所述细胞培养基II终浓度组成如下：5～20％胎牛血清，50～200U/ml青霉素，50～200U/ml链霉素，溶剂为L-DMEM；

(3)待获得细胞平铺面积占培养板20～30％的细胞量时，更换用细胞培养基III培养；所述细胞培养基III终浓度组成如下：5～20％胎牛血清，50～200U/ml青霉素，50～200U/ml链霉素，溶剂为L-DMEM；

(4)待细胞呈现50％以上面积融合率时，用胰酶-EDTA(即胰酶/EDTA消化液，胰酶浓度0.01～0.05％，EDTA浓度0.01～0.05％，w/v)消化成单细胞悬液，以50～100个细胞/cm²的密度，接种至培养板，用细胞培养基III进行培养；传代细胞经细胞鉴定，获得所述软骨干细胞；所述细胞培养基III终浓度组成如下：5～20％胎牛血清，50～200U/ml青霉素，50～200U/ml链霉素，溶剂为L-DMEM。后代细胞可正常传代培养，正常传代条件为：利用胰酶-EDTA消化成单细胞悬液，以100～300个细胞/cm²的密度接种培养。

优选的，所述细胞培养基I终浓度组成如下：10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，1mM L-谷氨酰胺，溶剂为F12-DMEM。

所述步骤(2)中细胞接种密度优选为3～10个/平方厘米，所述细胞培养基II终浓度组成如下：20％胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，溶剂为L-DMEM。

所述细胞培养基III终浓度组成如下：10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，溶剂为L-DMEM。

细胞鉴定方法：

(1)利用CD146抗体，进行磁珠分选进行阴性细胞分选，对比上述获得的软骨干细胞，进行比对鉴定。

(2)利用CD146作为软骨组织中特定亚群软骨干细胞标记物软骨干细胞鉴定：1)细胞形态观察：细胞贴壁为分化第一天，每天观察贴壁细胞形态，细胞筛选后成纤维样细胞比例＞95％。2)克隆形成能力对比：CD146-的软骨细胞(＜3％)和依照本发明方法收获的软骨干细胞(＞45％)在克隆形成率上有明显差别。3)细胞表型鉴定：间质细胞表型阳性(CD44，CD90，CD105，CD106)，造血系表形阴性(CD34)，间质样细胞占到95％以上。4)增殖、分化及组织分化能力：细胞具有骨、软骨及脂肪三系分化能力。

本发明所述的软骨干细胞为由软骨组织细胞筛选而来，经特定培养基培养条件维持的成纤维样细胞，具骨、软骨及脂肪分化能力，与成体细胞相比还具有良好的扩增能力，自原代收获后可传至15代以上而保持原来特性。本发明是在前研究的基础上进一步提高，利用特定培养条件进行筛选，纯化出软骨干细胞，使软骨干细胞含量在95％以上。此技术将促进软骨组织性特异干细胞的收获和应用于骨、软骨组织工程。

本发明的有益效果主要体现在：

(1)本发明所获得细胞具有良好的扩增能力，可传至15代而保持特性，并具有形成骨，软骨及脂肪的能力；

(2)本发明获得了定义准确、纯度高的细胞亚群；

(3)本发明细胞适合于骨、软骨等组织的缺损修复和作为组织工程的种子细胞。未来骨关节炎的细胞治疗也是本发明潜在的应用范围。

(四)附图说明

图1为软骨细胞平面培养的原代细胞(A)和软骨干细胞(B)的种子细胞形态；

图2为分选后细胞形态和表面标记具有高度均一性；

图3为本发明分离出软骨干细胞的倍增速率；

图4为软骨干细胞与间充质干细胞表型相似度；

图5为与CD146-软骨细胞亚群相比的阳性克隆形成力对比；

图6为软骨干细胞具有类似于间充质干细胞的三系分化能力；

图7为软骨干细胞与MSC体内成骨能力对比；

图8为软骨干细胞与MSC体外成软骨能力对比；

图9为软骨干细胞与MSC体内成软骨能力对比。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1(本实例试剂除特殊说明均购自Invitrogen公司)：

1)软骨细胞培养：取0.20g软骨组织(废弃组织，由浙江大学医学院附属邵逸夫医院惠赠)，将其切成1mm×1mm×1mm碎片，PBS缓冲液(含青霉素、链霉素各100U/mL)冲洗后，在透明质酸酶和II型胶原酶的序列性消化下，分离单个软骨细胞。过滤，1500r/min离心5min，离心半径为4.5cm，沉淀细胞PBS洗2次。低糖DMEM(20％FBS)制成细胞悬液，以10个细胞/cm²密度接种于10em培养皿，每3d换液1次，0.25％的胰蛋白酶-EDTA进行传代，体外单层培养，低糖DMEM(10％FBS)至第3代。

2)进行体外单层培养并进行CD146免疫荧光染色。

体外单层培养过程如下：

(1)取三代以内的软骨细胞，用细胞培养基I培养至软骨细胞长满培养皿；所述细胞培养基I终浓度组成如下：10％(w/v)胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，1mM L-谷氨酰胺，溶剂为F12-DMEM(1∶1)；

(2)软骨细胞长满后用胰酶-EDTA(即胰酶/EDTA消化液，胰酶浓度0.25％，EDTA浓度0.02％，w/v)消化成单细胞悬液，以3～10个细胞/cm²的密度接种至培养板，利用细胞培养基II进行培养12天；所述细胞培养基II终浓度组成如下：20％胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，溶剂为L-DMEM；

(3)待获得细胞平铺面积占培养板20～30％的细胞量时，更换用细胞培养基III培养；所述细胞培养基III终浓度组成如下：10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，溶剂为L-DMEM；

(4)待细胞呈现50％以上面积融合率，用胰酶-EDTA(即胰酶/EDTA消化液，胰酶浓度0.25％，EDTA浓度0.02％，w/v)消化成单细胞悬液，以50～100个细胞/cm²的密度，接种与培养板，用细胞培养基III进行培养。后代细胞可正常传代培养。传代细胞经细胞鉴定，获得所述软骨干细胞；所述细胞培养基III终浓度组成如下：10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，溶剂为L-DMEM。正常传代条件为：利用胰酶-EDTA消化成单细胞悬液，以100～300个细胞/cm²的密度接种培养。

软骨细胞平面培养的原代细胞和软骨干细胞的种子细胞形态见图1；分选后细胞形态和表面标记具有高度均一性(图2)，分离出软骨干细胞的倍增速率见图3；

3)流式细胞术检测CD146阳性细胞表面标记：将体外单层培养培养的CD146阳性细胞分离消化下来，PBS洗一次，一抗常温孵育30min，PBS洗两次，多聚甲醛固定，上机检测CD146、CD105、CD90、CD44、CD34等表面标记。结果见图4。由图可见，软骨干细胞具有间充质干细胞类似表型。

4)利用磁珠分选筛选出CD146-细胞亚群，和以上分离出的细胞进行克隆形成能力比对。在直径6cm的培养皿中种植100个细胞，9天后清点直径大于2mm的克隆数，评估其克隆形成能力。结果图5，由图可见，与CD146-软骨细胞亚群相比，软骨干细胞具有明显的阳性克隆形成力。

实施例2：对实施例1所得的细胞进行三系分化能力鉴定。

(1)骨系分化鉴定：

诱导过程：将软骨干细胞以100个细胞/cm²接种与24孔培养板，利用骨诱导培养基(溶剂：H-DMEM，添加：10％FBS，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，50μM抗坏血酸，10mM β-甘油磷酸钠，0.1uM地塞米松)进行诱导14天。

成骨分化鉴定结果：ALP碱性磷酸酶表达阳性(参见图6A)

(2)脂肪系分化鉴定：

将软骨干细胞以100个细胞/cm²接种与24孔培养板，利用脂肪诱导培养基(溶剂：H-DMEM，添加：10％FBS，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，0.5mM 3-异丁基-1-甲基(IBMX)，10uM胰岛素，0.5uM地塞米松)进行诱导14天。

成脂肪分化鉴定方法：油红染色，脂滴着色红(参见图6B)

(3)软骨系分化鉴定：细胞团块三维软骨诱导模型：将软骨干细胞胰酶消化后以2×10⁵个细胞/0.5ml软骨诱导液/离心管分装，300g离心5分钟。直立放入培养箱，进行三维软骨诱导，隔2天换液一次，21天后收集样本。软骨诱导液配方：L-DMEM+10ng/ml TGF-β1，0.1uM地塞米松，50mg/ml维生素C。

成软骨分化鉴定方法：组织学包埋固定后，进行番红-O染色。细胞团块的基质呈红色，代表有糖胺聚糖分泌，软骨诱导成功(参见图6C)。

实施例3：

将实施例1所得的细胞和已有的骨髓来源间充质干细胞培养至长满后，种植2.5×10⁶细胞(50ul，5×10⁷/ml)于海藻酸钠凝胶，构建组织工程骨。

1)细胞标记Dil荧光染料，植入支架材料空缺处，利用海藻酸钠凝胶将细胞和材料复合物包裹，加入BMP4作为成骨诱导因素，植入裸鼠皮下。

2)8周后取出，追踪其荧光，观察细胞存活情况，显示细胞生存良好。利用X光检测其钙化，软骨干细胞(CSPC)组优于骨髓来源的间质干细胞(BMSC)。软骨干细胞与MSC体内成骨能力对比结果见图7，提示其拥有较好异位成骨能力。

实施例4：

将实施例1所得的细胞和已有的骨髓来源间充质干细胞培养至长满后，种植2.5×10⁵细胞进行pellet培养，评估其体外成软骨能力。根据VisualHistological Grading System for the Evaluation of in Vitro-GeneratedNeocartilage一文中评分标准获得评分。软骨干细胞与MSC体外成软骨能力对比结果见图8，由图可见，本发明获得的软骨干细胞与MSC相比，具有更强的体外成软骨能力。

实施例5：

将实施例1所得的细胞和已有的骨髓来源间充质干细胞培养至长满后，种植2.5×10⁶细胞(50ul，5×10⁷/m1)于海藻酸钠凝胶，构建组织工程软骨。

1)细胞标记Dil荧光染料，植入支架材料空缺处，利用海藻酸钠凝胶将细胞和材料复合物包裹，植入裸鼠皮下。

2)8周后取出，追踪其荧光，观察细胞存活情况，显示细胞生存良好。

3)利用X光检测其钙化，软骨干细胞(CSPC)组几乎无钙化，骨髓来源的间质干细胞(BMSC)则出现钙化情况。

4)根据国际软骨修复学会的组织修复大体评分标准，CSPC体内成软骨能力与原代软骨细胞持平(见图9)，优于骨髓来源间质干细胞。

Claims

1.一种软骨干细胞分离培养方法，所述方法包括：

(1)取三代以内的软骨细胞，用细胞培养基I培养至软骨细胞长满培养皿；所述细胞培养基I终浓度组成如下：5～20％胎牛血清，50～200U/ml青霉素，50～200U/ml链霉素，0.5～2mM L-谷氨酰胺，溶剂为F12-DMEM；

(2)软骨细胞长满后用胰酶-EDTA消化成单细胞悬液，以小于50个细胞/cm²的密度接种至培养板，利用细胞培养基II进行培养10～14天；所述细胞培养基II终浓度组成如下：5～20％胎牛血清，50～200U/ml青霉素，50～200U/ml链霉素，溶剂为L-DMEM；

(3)待获得细胞平铺面积占培养板20～30％细胞量时，更换用细胞培养基III培养；所述细胞培养基III终浓度组成如下：5～20％胎牛血清，50～200U/ml青霉素，50～200U/ml链霉素，溶剂为L-DMEM；

(4)待细胞呈现50％以上面积融合率时，用胰酶-EDTA消化成单细胞悬液，以50～100个细胞/cm²的密度，接种至培养板，用细胞培养基III进行培养；传代细胞经细胞鉴定，获得所述软骨干细胞；所述细胞培养基III终浓度组成如下：5～20％胎牛血清，50～200U/ml青霉素，50～200U/ml链霉素，溶剂为L-DMEM。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞培养基I终浓度组成如下：10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，1mM L-谷氨酰胺，溶剂为F12-DMEM。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中细胞接种密度为3～10个/平方厘米，所述细胞培养基II终浓度组成如下：20％胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，溶剂为L-DMEM。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞培养基III终浓度组成如下：10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，溶剂为L-DMEM。