CN112352044A - 包含真皮-皮下接合的纤维母细胞的细胞和组织模型及其应用 - Google Patents
包含真皮-皮下接合的纤维母细胞的细胞和组织模型及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于制备细胞模型和组织模型的体外方法，所述方法包括至少一个培养真皮‑皮下接合的纤维母细胞的步骤；还涉及获得的模型以及其在用于筛选活性剂的方法中的实施，所述活性剂促进真皮‑皮下接合的纤维母细胞分化为脂肪细胞、成骨细胞和/或成软骨细胞。
Description
本发明涉及新型细胞模型和组织模型，其包含真皮-皮下接合的纤维母细胞，并且还涉及其制备方法。
此外，本发明还涉及这些模型作为筛选活性剂的工具的用途，这些活性剂促进纤维母细胞分化为脂肪细胞、成骨细胞和/或成软骨细胞。
皮肤由三个连接的隔区构成，即表皮、真皮及皮下组织。
表皮主要由三种细胞类型构成，即角质形成细胞(其在表皮的细胞中占大多数)、黑素细胞以及郎格汉斯细胞。这些细胞构成角质化的上皮，该角质化的上皮分化成重叠的层，这些重叠的层上面是一层形成角质层的死细胞。
皮下组织由结缔小梁包围脂肪细胞积聚形成的脂小叶构成。结缔小梁稳定了组织的内聚力，同时促进了血管的通过。皮下组织的主要功能是确保身体的热调节，同时也确保能量分子和毒素的储存。
表皮和皮下组织包围真皮。皮下组织为表皮提供坚实的支撑。皮下组织也是表皮的营养元件。皮下组织主要由纤维母细胞和细胞外基质构成。
纤维母细胞，通常也称为“支持细胞”，存在于许多结缔组织中，特别地存在于皮肤、腱、软骨、骨组织等中。
目前，文献中仅鉴定了皮肤中的两种纤维母细胞亚群：乳头状纤维母细胞和网状纤维母细胞。
通过体外研究突出了纤维母细胞作为筛选工具的潜能，该研究显示出纤维母细胞分化为其他细胞类型的能力，这些细胞类型形成结缔组织例如脂肪细胞(fat cells)(脂肪细胞(adipocytes))、软骨细胞(成软骨细胞)和骨细胞(成骨细胞)。
因此，文献中已经描述了能够筛选活性剂的模型，这些活性剂促进纤维母细胞分化为脂肪细胞、成软骨细胞和/或成骨细胞。特别值得一提的是：Brun C等人″Intrinsically aged dermal fibroblasts fail to differentiate into adipogeniclineage[固有老化的真皮纤维母细胞不能分化为脂肪形成谱系]″Exp Dermatol.[实验皮肤病学]2016年11月25日(11)：906-909；Chen FG等人″Clonalanalysis of nestin(-)vimentin(+)multipotent fibroblasts isolated from human dermis[从人真皮分离的巢蛋白(-)波形蛋白(+)多能纤维母细胞的克隆分析]″，J Cell Sci.[细胞科学期刊]2007年8月15日120(Pt 16)：2875-83；Jeney F等人″Cytochemical studies on thefibroblast-preadipocyte relationships in cultured fibroblast cell lines[关于培养的纤维母细胞系中纤维母细胞-前脂肪细胞的关系的细胞化学研究]″ActaHistochem.[组织化学学报]2000年11月；102(4)：381-9。
除了用于研究纤维母细胞的分化能力的用途之外，这样的模型还显示在皮肤老化的研究中是有益的。的确，已知皮肤老化与纤维母细胞分化为脂肪细胞能力的丧失有关(Cécilia Brun等人″Altération de la différenciation adipogénique des fibroblastesdermiques avec
″[“Alteration in the adipogenic differentiation ofdermalfibroblasts with age”][真皮纤维母细胞成脂分化随年龄的变化]，annales deDermatologie et Vénérologie[皮肤病学年鉴]，143卷，2016年12月)。
然而，已经证实这些模型不是足够有效的，尤其不是足够敏感的，因为如下面的比较所示，它们会对活性剂产生假阴性。
因此，仍然需要提供更有效和/或更敏感的细胞或组织模型，它们可以避免在其用于筛选活性剂的方法中获得假阴性，这些活性剂促进纤维母细胞分化为脂肪细胞、成骨细胞和/或成软骨细胞。
申请人已经证实，特定的真皮纤维母细胞，即真皮-皮下接合的纤维母细胞的亚群的使用，可以获得比现有技术中披露的模型更敏感的细胞或组织模型(这些细胞或组织模型促进纤维母细胞分化为脂肪细胞、成软骨细胞和/或成骨细胞)，并且特别地可以避免由过多比例的乳头状和/或网状纤维母细胞类型的非应答细胞所产生的假阴性。
因此，本发明的第一个主题是用于制备细胞模型的体外方法，该方法包括至少一个培养真皮-皮下接合的纤维母细胞的步骤。
本发明还涉及用于制备组织模型的体外方法，该方法包括至少一个在胶原海绵上培养真皮-皮下接合的纤维母细胞的步骤。
根据其另一个主题，本发明涉及通过所述方法获得的细胞和组织模型。
本发明还涉及使用所述细胞和组织模型筛选活性剂的方法，这些活性剂促进真皮-皮下接合的纤维母细胞分化为脂肪细胞、成骨细胞和/或成软骨细胞。
具体实施方式
真皮-皮下接合的纤维母细胞
“真皮-皮下接合的纤维母细胞”或“DHJF纤维母细胞”在本文中意指位于从真皮伸入皮下的结缔小梁处的区域中的纤维母细胞。培养的DHJF纤维母细胞典型地具有高度异质的形态。因此，可以在范围为非常小的三尖瓣细胞到非常大的多极细胞的细胞层中观察到高度不同的形式，这些多级细胞具有高度明显的细胞内小梁网络(在光学显微镜下可视)。
除了其如上所述的形态特征以及位置外，根据本发明所述的真皮-皮下接合的纤维母细胞可以通过测量选自由基因UCP2、ACAN、FGF9和COL11A1组成的组中的至少一个基因的表达水平，以及测量基因KLF9的表达产物的水平来鉴定。
特别地，用于鉴定纤维母细胞为真皮-皮下接合的纤维母细胞的方法包括：
a)提供包含至少一个真皮纤维母细胞的生物样品，
b)在步骤a)提供的生物样品中测量选自由基因UCP2、ACAN、FGF9和COL11A1组成的组中的至少一个基因的表达产物的水平，以及测量基因KLF9的表达产物的水平，
c)在以下情况下，鉴定步骤a)中的真皮纤维母细胞为真皮-皮下接合的纤维母细胞：
1)(i)基因UCP2的表达产物的水平相对于对照水平降低，
(ii)基因ACAN的表达产物的水平相对于对照水平增加，
(iii)基因FGF9的表达产物的水平相对于对照水平增加，和/或
(iv)基因COL11A1的表达产物的水平相对于对照水平增加，
以及
2)基因KLF9的表达产物的水平相对于对照水平增加，
1(i)、1(ii)、1(iii)和1(iv)的对照水平优选地分别为在已知是乳头状纤维母细胞的真皮纤维母细胞中基因UCP2、ACAN、FGF9和COL11A1的表达产物的水平，并且2)的对照水平优选地为在已知是网状纤维母细胞的真皮纤维母细胞中基因KLF9的表达产物的水平。
有利地，步骤a)提供的生物样品是真皮纤维母细胞的体外培养物或真皮纤维母细胞的混合物，源于皮肤活检的样品，或源于体外获得的真皮或皮肤等同物的样品。
优选地，在真皮-皮下接合处存在的结缔小梁处，从未脱脂的人皮肤中分离出真皮纤维母细胞的生物样品。将结缔小梁用镊子和剪刀取出。
特别地，样品源于对青年受试者(例如受试者年龄在15岁与40岁之间，优选地年龄在17岁与31岁之间)进行的人皮肤活检。
“基因X的表达产物”在本文中意指由所述基因X编码的mRNA或由所述基因X编码的蛋白质。因此基因X的表达产物的水平可以通过定量相应的mRNA或蛋白质来测量。在一个具体实施例中，所述基因X的表达产物是由所述基因X编码的mRNA。
优选地，表达产物的水平对应于表达产物的浓度或量。
当比率[测试样品中基因X的表达水平/基因X的对照水平]大于或等于2时，测试样品中基因X的表达产物的水平被认为是增加的。
当比率[基因X的对照水平/测试样品中基因X的表达水平]大于或等于2时，测试样品中基因X的表达产物的水平被认为是降低的。
当比率[基因X的对照水平/测试样品中基因X的表达水平]大于或等于2时，符号(-)置于所获值之前。
该比率通常被称为“倍数变化”。
“对照水平”在本文中意指参考值，优选地与源自相同供体的、已知是乳头状或网状真皮纤维母细胞的真皮纤维母细胞中基因的所述表达产物水平相一致。
“已知是乳头状或网状真皮纤维母细胞的真皮纤维母细胞”在本文中意指真皮纤维母细胞的类型(乳头状或网状)已经根据其形态、起源或检测到的生物标记进行了确定。
特别地，按如下取得已知是乳头状或网状真皮纤维母细胞的真皮纤维母细胞：
a)乳头状纤维母细胞(Fp)、网状纤维母细胞(Fr)从未脱脂的人皮肤中分离；
b)Fr的分离在组织的一部分上进行，因此废弃了其真皮-皮下接合，然后将该组织取皮至700μm。只保留该组织的靠下部分；和或
c)Fp的分离在取皮到300μm并且在4℃进行分散酶作用(罗氏公司(Roche)-2.4个单位/ml)16h后脱表皮的组织上进行。
基因X的表达产物的水平可以通过本领域技术人员熟知的任何技术，用上述鉴定方法的步骤(b)来测量。特别地，当表达产物是蛋白质时，表达产物的水平可以通过免疫学测定来测量，这些免疫学测定例如ELISA测定、免疫荧光测定(IFA)、放射免疫测定(RIA)、竞争性结合测定或蛋白质印迹法。当表达产物是mRNA时，表达产物的水平可以通过RT-PCR、qRT-PCR、ddPCR(微滴式数字PCR)，通过测序，例如通过NGS型测序(下一代测序)或通过ddSEQTM单细胞分离仪测序来测量。
“真皮纤维母细胞”在本文中意指源自真皮的任何纤维母细胞。
“乳头状纤维母细胞”在本文中意指乳头状真皮层的纤维母细胞，该乳头状真皮层的特征在于：细胞外基质相对较薄，细胞密度高，并且在组织水平上位于表皮和浅丛之间，也称作乳头下网。培养的乳头状纤维母细胞典型地具有薄的纺锤形形态。
“网状纤维母细胞”在本文中意指网状真皮层的纤维母细胞，该网状真皮层的特征在于基质纤维网络密集且细胞密度低。在组织水平上，其从浅丛延伸至深丛，也称作皮肤网。培养的网状纤维母细胞典型地具有延伸的且更方的外观。
“基因UCP2”在本文中意指编码“线粒体解偶联蛋白2”的基因。基因UCP2也称作基因SLC25A8，并且蛋白质UCP2也称作UCPH或“溶质载体家族25成员8”。其属于线粒体阴离子载体蛋白(MACP)家族以及用于控制线粒体来源的活性氧簇的蛋白质。其典型地描述于Pecqueur等人(1999)Biochemical and Biophysical Research Communications[生物化学和生物物理研究通讯]255：40-46中。人UCP2蛋白质序列典型地以UniProt编号P55851引用。
“基因ACAN”在本文中意指编码“聚集蛋白聚糖核心蛋白”的基因。基因ACAN也称作基因AGC1、CSPG1和MSK16，并且ACAN蛋白质也称作“聚集蛋白聚糖”或“软骨特异性蛋白聚糖核心蛋白”或CSPCP或“硫酸软骨素蛋白聚糖核心蛋白1”或“硫酸软骨素蛋白聚糖1”。其是软骨组织中细胞外基质的一部分。其是蛋白聚糖。其典型地描述于Doege等人(1991)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]15：894-902中。人ACAN蛋白质序列典型地以UniProt编号P16112引用。
“基因FGF9”在本文中意指编码纤维母细胞生长因子9的基因。蛋白质FGF9也称作“神经胶质活化因子”或GAF或“肝素结合性生长因子9”或HBGF-9。其对培养的神经胶质细胞有生长刺激作用。其典型地描述于Miyamoto等人(1993)Molecular and Cellular Biology[分子与细胞生物学]13：4251-4259中。人FGF9蛋白质序列典型地以UniProt编号P31371引用。
“基因COL11A1”在本文中意指编码α1(XI)胶原蛋白链的基因。基因COL11A1也称作基因COLL6。这条链是XI型胶原蛋白(一种次要纤维胶原)的两条α链中的一条。其典型地描述于Yoshioka等人(1990)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]15：6423-6426中。人COL11A1蛋白质序列典型地以UniProt编号P12107引用。
“基因KLF9”在本文中意指编码“Krueppel样因子9”的基因。基因KLF9也称作基因BTEB或基因BTEB1，并且蛋白质KLF9也称作BTEB1转录因子或“GC盒结合蛋白1”或“基础转录元件结合蛋白1”或“BTE结合蛋白1”。其是Sp1 C2H2型锌指转录因子家族的一部分。其典型地描述于
等人(2012)Proc.Natl.Acad.Science USA[美国科学院院报]109：10903-10908中。人KLF9蛋白质序列典型地以UniProt编号Q13886引用。
在本发明的上下文中，上文引用的UniProt参考是自2018年6月19日起可获得的那些。
细胞模型
用于制备细胞模型的方法
本发明的一个主题是用于制备细胞模型的体外方法，该方法包括至少一个培养真皮-皮下接合的纤维母细胞的步骤。
优选地，所述真皮-皮下接合的纤维母细胞根据“真皮-皮下接合的纤维母细胞”部分所定义的鉴定方法来鉴定。
所述纤维母细胞特别地以700至5000个细胞/cm2，优选地以1000至4000个细胞/cm2接种。
此外，使用的培养支持体是本领域技术人员熟知的2D培养支持体，例如用于细胞培养的处理过的塑料培养皿或多孔培养板，如24孔或96孔微板。
有利地，将所述纤维母细胞在达到至少80％汇合后培养24h到72h，优选地在达到至少80％汇合后培养48h，甚至更好地是在达到汇合后仍培养48h。
“汇合”在本文中意指细胞层在合适的支持体上以单层培养的每个贴壁细胞之间没有间隙，并且例如可以用肉眼或显微镜观察到。
所述真皮-皮下接合的纤维母细胞优选地在允许其扩增的培养基中培养，特别是选自MEM、DMEM、DMEM/F12、和/或FGM的培养基，该培养基进一步包含至少5％胎牛血清(FCS)、谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸以及任选地抗生素和/或抗真菌药。
在一个具体实施例中，将所述真皮-皮下接合的纤维母细胞在MEM培养基中培养，该培养基进一步包括10％胎牛血清(FCS)、谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸以及任选地抗生素和/或抗真菌药。
“扩增”在本文中意指细胞的增殖或倍增。
在第一个实施例中，用于制备根据本发明的细胞模型的体外方法还包括使在所述培养步骤结束时获得的纤维母细胞离心的步骤。
在第二个实施例中，用于制备根据本发明的细胞模型的体外方法不包括使在所述培养步骤结束时获得的纤维母细胞离心的步骤。
在一个具体实施例中，用于制备根据本发明的细胞模型的方法不包括进行培养除了真皮-皮下接合的纤维母细胞之外的纤维母细胞的步骤，特别地其不包括培养乳头状和/或网状纤维母细胞的步骤。
在另一个实施例中，在根据本发明的制备方法中培养真皮-皮下接合的纤维母细胞的步骤是从生物样品进行的，该生物样品包含相对于所述生物样品中存在的细胞的总量而言，至少60％、优选地至少80％的真皮-皮下接合的纤维母细胞的量。
甚至更优选地，在根据本发明的制备方法中培养真皮-皮下接合的纤维母细胞的步骤是从生物样品进行的，该生物样品包含相对于所述生物样品中存在的细胞的总量而言，在60％到95％之间、甚至更好地还在80％到95％之间的真皮-皮下接合的纤维母细胞的量。
该生物样品可以是真皮纤维母细胞的体外培养物或真皮纤维母细胞的混合物，源于皮肤活检的样品，或源于体外获得的真皮或皮肤等同物的样品。
优选地，在真皮-皮下接合处存在的结缔小梁处，从未脱脂的人皮肤中分离出真皮纤维母细胞的生物样品。将结缔小梁用镊子和剪刀取出。
细胞模型
本发明还涉及可根据上文在“用于制备细胞模型的方法”部分中提及的方法获得的细胞模型。
优选地，根据本发明的细胞模型包含真皮-皮下接合的纤维母细胞，针对这些纤维母细胞：
1)(i)基因UCP2的表达产物的水平相对于对照水平降低，
(ii)基因ACAN的表达产物的水平相对于对照水平增加，
(iii)基因FGF9的表达产物的水平相对于对照水平增加，和/或
(iv)基因COL11A1的表达产物的水平相对于对照水平增加，
以及
2)基因KLF9的表达产物的水平相对于对照水平增加；
1(i)、1(ii)、1(iii)和1(iv)的对照水平优选地分别为在已知是乳头状纤维母细胞的真皮纤维母细胞中基因UCP2、ACAN、FGF9和COL11A1的表达产物的水平，并且2)的对照水平优选地为在已知是网状纤维母细胞的真皮纤维母细胞中基因KLF9的表达产物的水平。
上文在“真皮-皮下接合的纤维母细胞”部分中提及的术语“对照水平”、“已知是乳头状或网状真皮纤维母细胞的真皮纤维母细胞”、“基因X的表达产物”、“真皮纤维母细胞”、“乳头状纤维母细胞”、“网状纤维母细胞”、“基因UCP2”、“基因ACAN”、“基因FGF9”、“基因COL11A1”以及“基因KLF9”的定义将再次使用。
当根据本发明的方法还包括使在所述培养步骤结束时获得的纤维母细胞离心的步骤时，该细胞模型呈球体形式。
“球体”在本文中意指一群具有不规则且无组织的形状的细胞。
在一个具体实施例中，根据本发明的细胞模型由真皮-皮下接合的纤维母细胞构成，针对这些纤维母细胞：
1)(i)基因UCP2的表达产物的水平相对于对照水平降低，
(ii)基因ACAN的表达产物的水平相对于对照水平增加，
(iii)基因FGF9的表达产物的水平相对于对照水平增加，和/或
(iv)基因COL11A1的表达产物的水平相对于对照水平增加，
以及
2)基因KLF9的表达产物的水平相对于对照水平增加；
1(i)、1(ii)、1(iii)和1(iv)的对照水平优选地分别为在已知是乳头状纤维母细胞的真皮纤维母细胞中基因UCP2、ACAN、FGF9和COL11A1的表达产物的水平，并且2)的对照水平优选地为在已知是网状纤维母细胞的真皮纤维母细胞中基因KLF9的表达产物的水平。
在另一个具体实施例中，真皮-皮下接合的纤维母细胞以相对于所述细胞模型中存在的细胞的总量而言，至少60％、优选地至少80％的量存在于根据本发明的细胞模型中。
甚至更优选地，真皮-皮下接合的纤维母细胞以相对于所述细胞模型中存在的细胞的总量而言，在60％到95％之间、甚至更好地还在80％到95％之间的量存在于根据本发明的细胞模型中。
组织模型
用于制备组织模型的方法
本发明还涉及用于制备组织模型的体外方法，该方法包括至少一个在胶原海绵上培养真皮-皮下接合的纤维母细胞的步骤。
术语“胶原海绵”也是本领域技术人员所熟知的。其是指基于胶原蛋白的生物聚合物。
根据本发明，胶原蛋白可以是任何来源的任何类型的胶原蛋白，优选地是动物来源，特别地是牛来源。在这方面，将参考Van der Rest和Garonne，1990，Biochem.[生物化学]，第72卷，473-484或1991，Faseb Journal[美国实验生物学联合会期刊]，第5卷，2814-2823的综述中提到的不同类型的胶原蛋白。
因此，根据本发明，胶原蛋白优选地选自I、III或V型纤维胶原；甚至更好地，本发明的上下文中使用的胶原蛋白是I型胶原蛋白。
可以提及的胶原海绵的实例是，由巴斯夫美容护理公司(BASF Beauty Care)或Symatese Biomateriaux公司出售的
海绵。
所述纤维母细胞优选地以125 000至500 000个细胞，优选地以200 000至300 000个细胞接种。
优选地，将所述纤维母细胞培养10至20天，特别优选地培养14天。
有利地，根据本发明的组织模型不呈胶原晶格的形式。术语“胶原晶格”是现有技术中所熟知的(Bell等人，1979，Proc Natl Acad Sci USA[美国科学院院报]，第76卷，第3期，第1274-1278页)，并且其是指已知且使用了几十年的真皮等效模型。
所述真皮-皮下接合的纤维母细胞优选地在允许其扩增的培养基中培养，特别是选自MEM、DMEM、DMEM/F12、和/或FGM的培养基，该培养基进一步包含至少5％胎牛血清(FCS)、谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸以及任选地抗生素和/或抗真菌药。
在一个具体实施例中，将所述真皮-皮下接合的纤维母细胞在MEM培养基中培养，该培养基进一步包括10％胎牛血清(FCS)、谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸以及任选地抗生素和/或抗真菌药。
“扩增”在本文中意指细胞的增殖或倍增。
在一个具体实施例中，用于制备根据本发明的组织模型的方法不包括进行培养除了真皮-皮下接合的纤维母细胞之外的纤维母细胞的步骤，特别地其不包括培养乳头状和/或网状纤维母细胞的步骤。
在另一个实施例中，在根据本发明的制备方法中培养真皮-皮下接合的纤维母细胞的步骤是从生物样品进行的，该生物样品包含相对于所述生物样品中存在的细胞的总量而言，至少60％、优选地至少80％的真皮-皮下接合的纤维母细胞的量。
甚至更优选地，在根据本发明的制备方法中培养真皮-皮下接合的纤维母细胞的步骤是从生物样品进行的，该生物样品包含相对于所述生物样品中存在的细胞的总量而言，在60％到95％之间、甚至更好地还在80％到95％之间的真皮-皮下接合的纤维母细胞的量。
该生物样品可以是真皮纤维母细胞的体外培养物或真皮纤维母细胞的混合物，源于皮肤活检的样品，或源于体外获得的真皮或皮肤等同物的样品。
优选地，在真皮-皮下接合处存在的结缔小梁处，从未脱脂的人皮肤中分离出真皮纤维母细胞的生物样品。将结缔小梁用镊子和剪刀取出。
组织模型
本发明还涉及可根据上文在“用于制备组织模型的方法”部分中提及的方法获得的组织模型。
优选地，根据本发明的组织模型包含真皮-皮下接合的纤维母细胞，针对这些纤维母细胞：
1)(i)基因UCP2的表达产物的水平相对于对照水平降低，
(ii)基因ACAN的表达产物的水平相对于对照水平增加，
(iii)基因FGF9的表达产物的水平相对于对照水平增加，和/或
(iv)基因COL11A1的表达产物的水平相对于对照水平增加，
以及
2)基因KLF9的表达产物的水平相对于对照水平增加；
1(i)、1(ii)、1(iii)和1(iv)的对照水平优选地分别为在已知是乳头状纤维母细胞的真皮纤维母细胞中基因UCP2、ACAN、FGF9和COL11A1的表达产物的水平，并且2)的对照水平优选地为在已知是网状纤维母细胞的真皮纤维母细胞中基因KLF9的表达产物的水平。
上文在“真皮-皮下接合的纤维母细胞”部分中提及的术语“对照水平”、“已知是乳头状或网状真皮纤维母细胞的真皮纤维母细胞”、“基因X的表达产物”、“真皮纤维母细胞”、“乳头状纤维母细胞”、“网状纤维母细胞”、“基因UCP2”、“基因ACAN”、“基因FGF9”、“基因COL11A1”以及“基因KLF9”的定义将再次使用。
在一个具体实施例中，根据本发明的组织模型由真皮-皮下接合的纤维母细胞构成，针对这些纤维母细胞：
1)(i)基因UCP2的表达产物的水平相对于对照水平降低，
(ii)基因ACAN的表达产物的水平相对于对照水平增加，
(iii)基因FGF9的表达产物的水平相对于对照水平增加，和/或
(iv)基因COL11A1的表达产物的水平相对于对照水平增加，
以及
2)基因KLF9的表达产物的水平相对于对照水平增加；
1(i)、1(ii)、1(iii)和1(iv)的对照水平优选地分别为在已知是乳头状纤维母细胞的真皮纤维母细胞中基因UCP2、ACAN、FGF9和COL11A1的表达产物的水平，并且2)的对照水平优选地为在已知是网状纤维母细胞的真皮纤维母细胞中基因KLF9的表达产物的水平。
在另一个具体实施例中，真皮-皮下接合的纤维母细胞以相对于所述组织模型中存在的细胞的总量而言，至少60％、优选地至少80％的量存在于根据本发明的组织模型中。甚至更优选地，真皮-皮下接合的纤维母细胞以相对于所述组织模型中存在的细胞的总量而言，在60％到95％之间、甚至更好地还在80％到95％之间的量存在于根据本发明的组织模型中。
使用和筛选方法
本发明还涉及如“细胞模型”和“组织模型”部分中所定义的体外细胞或组织模型作为筛选活性剂的工具的用途，这些活性剂促进真皮-皮下接合的纤维母细胞分化为脂肪细胞、成骨细胞和/或成软骨细胞。
“脂肪细胞”在本文中意指以脂滴在细胞体内积聚为特征的细胞，这些小滴能够融合以构成单个脂质空泡，该脂质空泡将占据整个细胞体积。脂肪细胞的存在通常通过使用脂类染色剂例如油红(油红O)或苏丹(苏丹黑)来确认。
“成骨细胞”在本文中意指其形态与二维培养的纤维母细胞没有区别的细胞。成骨细胞的存在通常通过使用染色来确认，染色显示骨骼矿化的成骨细胞所特有的细胞外基质的合成。为此目的，使用如茜素等染色剂。茜素对钙沉积物具有高亲和力。茜素也可以测定碱性磷酸酶(一种大量存在于这些细胞中的酶)活性。
“成软骨细胞”在本文中意指其形态与二维培养的纤维母细胞没有区别的细胞。成软骨细胞的存在通常通过使用对其分泌的细胞外基质具有高亲和力的染色剂来确认。在常用的染色剂中，可以提及甲苯胺蓝和番红O。这些染色剂对软骨中大量存在的酸性蛋白聚糖具有高亲和力。固定后，番红O染成橘色或甚至红色，而甲苯胺蓝将显示紫色染色。也可以针对该细胞外基质中大量存在的蛋白质进行免疫组织化学标记。因此，可以提及II型胶原蛋白、XI型胶原蛋白或聚集蛋白聚糖。
本发明还涉及用于筛选活性剂的方法，这些活性剂促进真皮-皮下接合的纤维母细胞分化为脂肪细胞、成骨细胞和/或成软骨细胞，该方法包括以下步骤：
i.提供根据“细胞模型”和“组织模型”部分所定义的细胞或组织模型，
ii.使所述模型与至少一个待筛选的试剂进行接触，
iii.对脂肪细胞、成骨细胞和/或软骨细胞的至少一种标志物的表达或其一种或多种生物活性进行定性和/或定量测量，然后
iv.将步骤iii)中进行的测量与对照中所获得的进行比较。
有利地，该对照是在与步骤i)中实施的条件相同的条件下培养的细胞或组织模型，但其尚未接受待筛选的活性剂。
根据第一个实施例，步骤i)中的所述模型是可根据包含至少一个培养真皮-皮下接合的纤维母细胞的步骤的制备方法获得的细胞模型，并且其能够在步骤iii)中对脂肪细胞和/或成骨细胞的至少一种标志物的表达或其一种或多种生物活性进行定性和/或定量测量。
根据第二个实施例，步骤i)中的所述模型是可根据包含至少一个培养真皮-皮下接合的纤维母细胞的步骤随后包含离心步骤的制备方法获得的细胞模型，并且其能够在步骤iii)中对成软骨细胞的至少一种标志物的表达或其一种或多种生物活性进行定性和/或定量测量。
根据第三个实施例，步骤i)中的所述模型是可根据包含至少一个在胶原海绵上培养真皮-皮下接合的纤维母细胞的步骤的制备方法获得的组织模型，并且其能够在步骤iii)中对脂肪细胞和/或成骨细胞的至少一种标志物的表达或其一种或多种生物活性进行定性和/或定量测量。
“对脂肪细胞、成骨细胞和/或成软骨细胞的至少一种标志物的表达进行定性和/或定量测量”在本文中等同地意指肉眼可见或显微镜下可见的形态学特征，并且还意指给定细胞类型(脂肪细胞、成骨细胞或成软骨细胞)所特有的基因和/或蛋白质的存在和/或其表达，如上文在“使用和筛选方法”部分中所提及的以及在以下出版物中所提及的：Pittenger等人Science[科学]1999；Peiffer等人Leukemia[白血病]2007；Choudhery等人JTransl Med[转化医学杂志]2014。
“脂肪细胞、成骨细胞和/或成软骨细胞的生物活性”在本文中意指给细胞类型(脂肪细胞、成骨细胞或成软骨细胞)所特有的酶活性和/或代谢产物产生活性，如如上文在“使用和筛选方法”部分中所提及的以及在以下出版物中所提及的：Pittenger等人Science[科学]1999；Peiffer等人Leukemia[白血病]2007；Choudhery等人J Transl Med[转化医学杂志]2014。
这样的筛选方法的优势尤其是可以选择护肤领域，特别是抗衰老领域中感兴趣的活性剂。
此外，根据本发明的筛选方法可以鉴定用于预防和/或处理皮肤老化迹象的新活性剂，并且特别地可以鉴定用于预防和/或处理由于结缔组织缺失(例如脂肪组织缺失)而造成的美学缺陷的活性剂。
下面的实例和附图是作为说明提供的，并不限制本发明的领域。
附图说明
图1：来自纤维母细胞的区域的视图，其中有真皮-皮下接合的视图。
图2：展示了在根据实例1的细胞模型中，真皮-皮下组织接合的纤维母细胞分化为脂肪细胞。
图3：展示了在根据实例1的细胞模型中，真皮-皮下组织接合的纤维母细胞分化为成骨细胞。
图4：展示了在根据实例1的球形细胞模型中，真皮-皮下组织接合的纤维母细胞分化为成软骨细胞。
图5：展示了在根据实例2的组织模型中，真皮-皮下组织接合的纤维母细胞分化为脂肪细胞。
图6：展示了在细胞模型中，纤维母细胞Fp(在本发明之外的)、Fr(在本发明之外的)和F-DHJ(根据本发明的)分化为脂肪细胞。
图7：展示了在细胞模型中，纤维母细胞Fp(在本发明之外的)、Fr(在本发明之外的)和F-DHJ(根据本发明的)分化为成骨细胞。
图8：展示了在细胞模型中，纤维母细胞Fp(在本发明之外的)、Fr(在本发明之外的)和F-DHJ(根据本发明的)分化为成软骨细胞。
实例1：用于制备从DHJ纤维母细胞获得的细胞模型的方法，并验证该细胞模型作为筛选活性剂的工具的用途，这些活性剂促进DHJ纤维母细胞分化为脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞
1)从DHJ获取纤维母细胞
从未脱脂的人皮肤分离出真皮-皮下接合的纤维母细胞(F-DHJ)。在出于审美原因进行缩胸后收集样品。从在真皮-皮下接合处存在的结缔小梁分离出F-DHJ。将结缔小梁用镊子和剪刀取出。(参见图1)
粉碎后，使真皮的片段在0.2％(Gibco)、37℃下在II型胶原酶的作用下消化。
然后在潮湿的气氛下，在37℃和5％CO2下，使细胞在MEM培养基-补充有谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸、青霉素、链霉素和二性霉素B的10％胎牛血清中扩增。
2)用于鉴定DHJ的纤维母细胞的方法(通过RT-qPCR验证细胞表型)
在纤维母细胞扩增后(在7至10个之间的群体倍增)，根据供应商提供的说明在QIAgen柱上提取mRNA。
针对p值＜0.05，被认为差异表达的探针必须具有＞2的倍数变化。
根据以下方法验证细胞的分子标签。因此，F-DHJ将展示出ACAN、Col11a1、FGF9、UCP2和KLF9的相对表达水平，这与下表中所总结的一致。
表1
Fp：乳头状纤维母细胞，Fr：网状纤维母细胞，FDHJ：真皮-皮下接合的纤维母细胞
用于RT-qPCR验证的引物表(QIAgen-quantitech引物测定)
3)用于制备根据本发明的细胞模型的方法
a.2D细胞模型
在潮湿的气氛下，在37℃和5％CO2下，将真皮-皮下接合的纤维母细胞以1400个细胞/cm2接种在皮氏培养皿(Petri dish)中的MEM培养基-补充有谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸、青霉素、链霉素和二性霉素B的10％胎牛血清中。在达到汇合后，将真皮-皮下接合的纤维母细胞培养48小时。
在这个方法结束时，获得根据本发明的细胞模型。
b.球体形式的细胞模型
在潮湿的气氛下，在37℃和5％CO2下，将真皮-皮下接合的纤维母细胞以1400个细胞/cm2接种在皮氏培养皿(Petri dish)中的MEM培养基-补充有谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸、青霉素、链霉素和二性霉素B的10％胎牛血清中。在达到汇合后，将真皮-皮下接合的纤维母细胞培养48小时。
在达到汇合后48小时，在100 000个DHJ细胞离心后形成球体。
在这个方法结束时，获得根据本发明的球体形式的细胞模型。
4)验证根据本发明的细胞模型作为筛选活性剂的工具的用途，这些活性剂：
a.促进DHJ纤维母细胞分化为脂肪细胞
为了验证段落3)a.中产生的细胞模型用作筛选促进F-DHJ分化为脂肪细胞的活性剂的工具的用途，使用由活性剂的混合物组成的阳性对照，该活性剂的混合物包含吲哚美辛、IBMX和地塞米松，这些活性剂因其促进纤维母细胞分化为脂肪细胞的活性而闻名(Peiffer等人，Leukemia[白血病]2007年4月；21(4)：714-24)。
因此，点3)a.中的培养基被以下组成的混合物替代：60μM吲哚美辛/0.5mM IBMX/10-6M地塞米松，稀释于DMEM/20％胎牛血清中。在分化诱导混合物存在下，将细胞培养3周。每周3次更新培养基。
在3周的诱导结束时，通过在4％的多聚甲醛中固定来停止细胞培养。在显微镜下检测朝向脂肪细胞分化谱的细胞。细胞内可以观察到高度折射的球体。还可以进行油红O染色，已知其可将脂肪细胞内存在的脂滴染成红色。(参见图2)
结论：观察到DHJ纤维母细胞分化为脂肪细胞；因此，这个模型可以用作筛选促进DHJ纤维母细胞分化为脂肪细胞的活性剂的工具。
b.促进DHJ纤维母细胞分化为成骨细胞
为了验证段落3)a.中产生的细胞模型用作筛选促进F-DHJ分化为成骨细胞的活性剂的工具的用途，使用由活性剂的混合物组成的阳性对照，该活性剂的混合物包含2β-甘油磷酸酯、抗坏血酸2-磷酸酯和地塞米松，这些活性剂因其促进纤维母细胞分化为成骨细胞的活性而闻名(Peiffer等人，Leukemia[白血病]2007年4月；21(4)：714-24)。
因此，点3)a.中的培养基被以下组成的混合物替代：2mM 2β-甘油磷酸酯、0.15mM抗坏血酸2-磷酸酯、10-7M地塞米松和10％胎牛血清。在分化诱导混合物存在下，将细胞培养3周。每周3次更新培养基。
在3周的诱导结束时，通过在4％的多聚甲醛中固定来停止细胞培养。通过茜素染色来检测朝向成骨细胞分化谱的细胞。该产品将钙化的细胞外基质染成红色。(参见图3)
结论：观察到DHJ纤维母细胞分化为成骨细胞；因此，这个模型可以用作筛选促进DHJ纤维母细胞分化为成骨细胞的活性剂的工具。
c.促进DHJ纤维母细胞分化为成软骨细胞
为了验证段落3)b.中产生的细胞模型用作筛选促进F-DHJ分化为成软骨细胞的活性剂的工具的用途，使用由活性剂的混合物组成的阳性对照，该活性剂的混合物包含胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、亚油酸、油酸、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、抗坏血酸2-磷酸酯和地塞米松，这些活性剂因其促进纤维母细胞分化为成软骨细胞的活性而闻名(间充质干细胞和造血干细胞形成独特的骨髓小生境，Méndez-Ferrer S，Michurina TV，Ferraro F，MazloomAR，Macarthur BD，Lira SA，Scadden DT，Ma′ayan A，Enikolopov GN，Frenette PS，Nature.[自然]2010年8月12日；466(7308)：829-34.doi：10.1038/nature09262)。
形成球体后24小时，用诱导混合物替换来自点3)b.的培养基，该诱导混合物由0.5μg/ml胰岛素、0.5μg/ml转铁蛋白、0.5ng/ml亚硒酸钠、6.25μg/ml亚油酸、6.25μg/ml油酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白、1mmol/l丙酮酸钠、0.17mmol/l抗坏血酸2-磷酸酯、0.1μmol/l地塞米松、0.35mmol/l脯氨酸和0.01μg/ml TGF-β组成。培养基每周更新3次，持续2周。
在使用OCT后，通过冷冻球体来停止培养。然后在5μm处用切片机切割球体。通过用甲苯胺蓝染色辅以番红O染色来证明F-DHJ分化为成软骨细胞(参见图4)。
结论：观察到DHJ纤维母细胞分化为成软骨细胞；因此，这个模型可以用作筛选促进DHJ纤维母细胞分化为成软骨细胞的活性剂的工具。
实例2：用于在胶原海绵上从DHJ纤维母细胞制备组织模型的方法，并验证该组织模型作为筛选活性剂的工具的用途，这些活性剂促进DHJ纤维母细胞分化为脂肪细胞
1)从DHJ获取纤维母细胞(根据实例1)
2)用于鉴定DHJ的纤维母细胞的方法(通过RT-qPCR验证细胞表型)(根据实例1)
3)用于制备根据本发明的组织模型的方法
在潮湿的气氛中，在37℃和5％CO2下，将真皮-皮下接合的细胞以250 000个细胞/海绵(Symatese Biomaterials公司)接种在MEM培养基-补充有谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸、青霉素、链霉素和二性霉素B的10％胎牛血清中。维持培养14天。
在这个方法结束时，获得根据本发明的组织模型。
4)验证根据本发明的组织模型作为筛选活性剂的工具的用途：
为了验证段落3)中产生的组织模型用作筛选促进F-DHJ分化为脂肪细胞的活性剂的工具的用途，使用由活性剂的混合物组成的阳性对照，该活性剂的混合物包含吲哚美辛、IBMX和地塞米松，这些活性剂因其促进纤维母细胞分化为脂肪细胞的活性而闻名(Peiffer等人，Leukemia[白血病]2007年4月；21(4)：714-24)。
因此，点3)中的培养基被以下组成的混合物替代：60μM吲哚美辛/0.5mM IBMX/10- 6M地塞米松，稀释于DMEM/20％胎牛血清中。分化诱导维持3周。每周3次更新培养基。
在3周的诱导结束时，通过在4％的多聚甲醛中固定来停止细胞培养。在用油红O(已知其可将脂肪细胞内存在的脂滴染成红色)染色后，在显微镜下检测朝向脂肪细胞分化谱的细胞。(参见图5)
结论：观察到DHJ纤维母细胞分化为脂肪细胞；因此，这个模型可以用作筛选促进DHJ纤维母细胞分化为脂肪细胞的活性剂的工具。
实例3：本发明以外的比较：从DHJ纤维母细胞获得的胶原晶格上的组织模型
晶格是按照先前公开的方案制备的(Asselineau等人-Exp Cell res[实验细胞研究]，1985)。使106个F-DHJ纤维母细胞包括在牛I型胶原蛋白溶液(Symatèse Biomateriaux公司)中。
为了研究晶格(在本发明之外的)上的组织模型的敏感性，在将该组织模型实施为筛选活性剂(这些活性剂促进DHJ纤维母细胞分化为脂肪细胞)的工具的背景下，如针对实例1)、4)a.和2)、4)中所述，使用由吲哚美辛、IBMX和地塞米松的混合物组成的阳性对照，已知该混合物因促进纤维母细胞分化为脂肪细胞的活性而闻名(Peiffer等人Leukemia[白血病]2007年4月；21(4)：714-24)。
因此，在晶格组织和收缩4天后，培养基被由以下组成的诱导混合物替代：60μM吲哚美辛/0.5mM IBMX/10-6M地塞米松，稀释于DMEM/20％胎牛血清中。分化诱导维持3周。每周3次更新培养基。
在3周的诱导结束时，在使用OCT后，通过冷冻晶格来停止细胞培养。然后在5μm处用切片机切割晶格。使用油红O染色来证明F-DHJ分化为脂肪细胞。在这个诱导条件下，不会发生F-DHJ分化为脂肪细胞。不可能展示脂肪细胞的染色。
结论：没有观察到DHJ纤维母细胞分化为脂肪细胞；因此，这个模型不够敏感，无法用作筛选促进DHJ纤维母细胞分化为脂肪细胞的活性剂的工具。
实例4：本发明以外的比较：从乳头状或网状纤维母细胞获得的细胞模型
1)用于制备本发明以外的细胞模型的方法
所实施的方法与上文实例1的点3)中所述的方法相同，在该方法中DHJ纤维母细胞被乳头状纤维母细胞或网状纤维母细胞替代。
因此，在这个方法结束时，给出了从乳头状纤维母细胞获得的本发明以外的细胞模型以及从网状纤维母细胞获得的本发明以外的细胞模型。
2)研究本发明以外的细胞模型作为筛选活性剂的工具的用途，这些活性剂：
a.促进乳头状或网状纤维母细胞分化为脂肪细胞
所实施的方法与实例1的点4)a.中所述的方法一致。
在显微镜下检测朝向脂肪细胞分化谱的细胞。在乳头状和网状纤维母细胞建立的培养物中的少量的细胞内，观察到表示脂质空泡的存在的小的折射球体(参见图6)。用油红O进行计数染色验证了这些空泡本质上是脂肪的事实。
结论：观察到乳头状或网状纤维母细胞非常少量地分化为脂肪细胞；因此，从乳头状或网状纤维母细胞获得的细胞模型不够敏感，无法用作筛选促进这些纤维母细胞分化为脂肪细胞的活性剂的工具。
b.促进乳头状或网状纤维母细胞分化为成骨细胞
所实施的方法与实例1的点4)b.中所述的方法一致。
通过茜素染色来检测朝向成骨细胞分化谱的细胞。该产品将钙化的细胞外基质染成红色。在从乳头状纤维母细胞获得的细胞模型的情况下，未观察到红色染色，因此不存在钙化的细胞外基质。在从网状纤维母细胞获得的细胞模型的情况下，观察到非常小的、表明细胞外基质被钙化的红色染色痕迹(参见图7)。因此，乳头状和网状纤维母细胞分化为成骨细胞的倾向非常弱。
结论：观察到乳头状或网状纤维母细胞非常少量地分化为成骨细胞；因此，从乳头状或网状纤维母细胞获得的细胞模型不够敏感，无法用作筛选促进这些纤维母细胞分化为成骨细胞的活性剂的工具。
c.促进乳头状或网状纤维母细胞分化为成软骨细胞
所实施的方法与实例1的点4)c.中所述的方法一致。
使用甲苯胺蓝染色辅以番红O染色来证明乳头状或网状纤维母细胞分化为成软骨细胞。在从乳头状和网状纤维母细胞获得的细胞模型的情况下，观察到淡蓝色和淡红色染色，而在从DHJ的成纤维细胞获得的细胞模型的情况下，在外围观察到深蓝色染色，并且观察到深红色染色。(参见图8)
结论：观察到乳头状或网状纤维母细胞非常少量地分化为成软骨细胞；因此，从乳头状或网状纤维母细胞获得的细胞模型不够敏感，无法用作筛选促进这些纤维母细胞分化为成软骨细胞的活性剂的工具。
下表总结了测试的纤维母细胞亚群(Fp、Fr或F-DHJ)分化为脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞的潜力。
表2
Claims (11)
1.一种用于制备细胞模型的体外方法，所述方法包括至少一个培养真皮-皮下接合的纤维母细胞的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中将所述纤维母细胞在达到至少80％汇合后培养24h到72h；将所述纤维母细胞优选地在达到至少80％汇合后培养48h。
3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括使在所述培养步骤结束时获得的纤维母细胞离心的步骤。
4.一种用于制备组织模型的体外方法，该方法包括至少一个在胶原海绵上培养真皮-皮下接合的纤维母细胞的步骤。
5.如权利要求4所述的方法，其中将所述纤维母细胞培养10至20天，优选地培养14天。
6.如权利要求1至3中任一项所述的用于制备细胞模型的体外方法或如权利要求4或5所述的用于制备组织模型的体外方法，所述方法还包括鉴定真皮纤维母细胞为真皮-皮下结合的纤维母细胞的步骤，所述鉴定步骤在所述培养步骤之前且包括：
a)提供包含至少一个真皮纤维母细胞的生物样品，
b)在步骤a)提供的生物样品中测量选自由基因UCP2、ACAN、FGF9和COL11A1组成的组中的至少一个基因的表达产物的水平，以及测量基因KLF9的表达产物的水平，
c)在以下情况下，鉴定步骤a)中的真皮纤维母细胞为真皮-皮下接合的纤维母细胞：
1)(i)基因UCP2的表达产物的水平相对于对照水平降低，
(ii)基因ACAN的表达产物的水平相对于对照水平增加，
(iii)基因FGF9的表达产物的水平相对于对照水平增加，和/或
(iv)基因COL11A1的表达产物的水平相对于对照水平增加，
以及
2)基因KLF9的表达产物的水平相对于对照水平增加，
其中1(i)、1(ii)、1(iii)和1(iv)的对照水平分别为在已知是乳头状纤维母细胞的真皮纤维母细胞中基因UCP2、ACAN、FGF9和COL11A1的表达产物的水平，并且2)的对照水平为在已知是网状纤维母细胞的真皮纤维母细胞中基因KLF9的表达产物的水平。
7.一种体外细胞模型，所述体外细胞模型可根据如权利要求1至3以及6中任一项所述的方法获得。
8.一种体外组织模型，所述体外组织模型可根据如权利要求4至6中任一项所述的方法获得。
9.如权利要求7所述的细胞模型或如权利要求8所述的组织模型，所述模型包含真皮-皮下接合的纤维母细胞，针对所述纤维母细胞：
1)(i)基因UCP2的表达产物的水平相对于对照水平降低，
(ii)基因ACAN的表达产物的水平相对于对照水平增加，
(iii)基因FGF9的表达产物的水平相对于对照水平增加，和/或
(iv)基因COL11A1的表达产物的水平相对于对照水平增加，
以及
2)基因KLF9的表达产物的水平相对于对照水平增加，
其中1(i)、1(ii)、1(iii)和1(iv)的对照水平分别为在已知是乳头状纤维母细胞的真皮纤维母细胞中基因UCP2、ACAN、FGF9和COL11A1的表达产物的水平，并且2)的对照水平为在已知是网状纤维母细胞的真皮纤维母细胞中基因KLF9的表达产物的水平。
10.如权利要求7至9中所述的体外细胞模型或组织模型作为筛选活性剂的工具的用途，所述活性剂促进真皮-皮下接合的纤维母细胞分化为脂肪细胞、成骨细胞和/或成软骨细胞。
11.一种用于筛选活性剂的方法，所述活性剂促进真皮-皮下接合的纤维母细胞分化为脂肪细胞、成骨细胞和/或成软骨细胞，所述方法包括以下步骤：
i.提供如权利要求7至9所述的细胞模型或组织模型，
ii使所述模型与至少一个待筛选的试剂进行接触，
iii.对脂肪细胞、成骨细胞和/或软骨细胞的至少一种标志物的表达或其一种或多种生物活性进行定性和/或定量测量，然后
iv.将步骤iii)中进行的测量与对照中所获得的进行比较。
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