CN104513806A - 体外软骨细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种体外软骨细胞的培养方法，包括：获取软骨细胞样本；将软骨细胞样本进行原代培养；将原代培养所得的软骨细胞进行传代培养，并在待传代培养至软骨细胞汇合度达到70～80％时，更换新鲜培养基并加入莱菔硫烷(SFN)对软骨细胞进行处理。采用本发明的体外软骨细胞培养方法，先通过原代培养在初期使其形态和特异分子表达水平最大化地维持与机体内相同，使其能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征；之后再通过传代培养进行大量增殖，并且在适当的时机采用SFN进行退化抑制，有效缓解软骨细胞体外单层培养时的退化现象，为临床用软骨细胞的培养提供一种新的优良方法。

Description

体外软骨细胞的培养方法

技术领域

本发明属于体外组织细胞定向培养技术领域，具体涉及一种体外软骨细胞的培养方法。

背景技术

在机体中，软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型，其主要功能是通过分泌II型胶原(type II collagen)及蛋白多糖(aggrecan，Acan)等保持关节软骨的功能。在正常生理条件下，软骨细胞的合成和分解代谢维持着动态平衡；而发生软骨缺损和骨关节炎(OA)时，关节软骨组织受到多种因子的作用，关节软骨损伤和修复之间的稳态被破坏，软骨的分解代谢明显大于合成代谢，表现为二型胶原和蛋白多糖的降解大于合成，其中二型胶原通常被基质金属蛋白酶(MMPs)所降解，而蛋白多糖则由ADAMTS家族所降解。

对于软骨缺损的治疗方法中，现有较为理想的是采用自体软骨细胞移植(ACI)以及基质介导的自体软骨细胞移植术(MACI)，将选自体内的正常软骨细胞在体外进行定向(细胞)培养后，再移植至机体内的软骨损伤处。而其中的难点在于，软骨细胞的体外培养过程中，由于失去了机体内特定的增殖环境以及本身细胞的全能性因素，所以软骨细胞体外培养增殖速度较慢以及伴随着退变现象，如二型胶原COLII表达下降、一型胶原COLI表达上升、MMPs表达上升及COLX表达上升等，使得体外培养的软骨细胞回植后常常形成纤维软骨，使得软骨的机械性能下降，导致进行透明软骨修复的效果达不到预期，成为影响治疗的长期效果的一个主要问题。

发明内容

本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种能在体外维持与机体内软骨细胞特异性分化和表达水平相同的体外软骨细胞培养方法。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种体外软骨细胞培养方法，包括如下步骤：

获取软骨细胞样本；

将所述软骨细胞样本进行原代培养；

将原代培养所得的软骨细胞进行传代培养，并在待传代培养至软骨细胞汇合度达到70～80％时，更换新鲜培养基并加入莱菔硫烷对软骨细胞进行处理。

采用本发明的体外软骨细胞培养方法，先通过原代培养在初期使其形态和特异分子表达水平等最大化地维持与机体内相同，使其能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征；之后再通过传代培养进行大量增殖，并且在适当的时机采用SFN进行退化抑制，有效缓解软骨细胞体外单层培养时的退化现象，为临床用软骨细胞的培养提供一种新的优良方法。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明实施例原代培养细胞P0显微镜下的细胞形态图；

图2为本发明实施例第一次传代培养细胞P1显微镜下的细胞形态图；

图3为本发明实施例第二次传代培养细胞P2显微镜下的细胞形态图；

图4为本发明实施例原代培养细胞P0甲苯胺蓝染色后的形态结果图；

图5为本发明实施例第一次传代培养细胞P1甲苯胺蓝染色后的形态结果图；

图6为本发明实施例第二次传代培养细胞P2甲苯胺蓝染色后的形态结果图；

图7为本发明实施例传代培养的软骨细胞SFN处理后Col2a1蛋白基因的表达水平结果图；

图8为本发明实施例传代培养的软骨细胞SFN处理后Col1a1蛋白基因的表达水平结果图；

图9为本发明实施例传代培养的软骨细胞SFN处理后COL2A1/COL1A1表达结果图；

图10为本发明实施例中分别选用不同浓度SFN的培养基培养的软骨细胞MMP13的表达差异对比图；

图11为本发明实施例中采用8μM的SFN对传代培养的软骨细胞处理后COL2A1/COL1A1表达差异对比图；

图12为本发明实施例不同浓度SFN处理软骨细胞后I型胶原免疫荧光染色结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种体外软骨细胞培养方法，培养方法的细节实施过程，包括如下步骤：

S10，获取软骨细胞样本；

S20，将软骨细胞样本用培养基进行原代培养；

S30，将原代培养所得的软骨细胞进行传代培养；

S40，待传代培养中软骨细胞汇合度达到70～80％时，更换新鲜培养基并加入SFN；

S50，在SFN下传代培养至软骨细胞汇合度为80～90％时，收集细胞。

在本发明中，采用将获取的软骨细胞样本先进行原代培养，在该阶段内获取的软骨细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。因此在这一时期进行原代培养，使其形态和表达水平等最大化地维持与机体内相同，使其能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征。

在步骤S20的原代培养过程之后，步骤S30中进一步进行传代培养，通过在其细胞的形态和特异结合性等方面的维持下，进行大量传代。同时，在传代的过程中对于细胞的特异性分化形态的定向维持通过步骤S40中的时机和SFN处理进行。

本身SFN(1-isothiocyanato-4-methylsulphinylbutane，莱菔硫烷)是一种从十字花科植物中提取的异硫氰酸酯，在西兰花中尤为丰富，具有抗炎症、抗肿瘤等作用。SFN能抑制软骨细胞中的MMPs的表达，降低其对软骨基质的降解作用，亦有体内动物实验证明SFN能保护软骨组织，具有阻止或减缓OA的发生发展的作用。本发明中，重点在于SFN对体外培养软骨细胞特性的维持，培养过程中加入SFN用于抑制基质金属蛋白酶(MMPs)，从而进一步抑制II型胶原的降解；在这一情形下，传代细胞在增殖的过程中由于II型胶原的降解被抑制，会进一步影响软骨细胞本身的两种胶原的表达量比，抑制体外原本应当大量表达的I型胶原COLI，从而使细胞的分化维持于与原始机体内最为接近的程度。同时，在培养的过程中需要对退化的程度进行控制，在本发明选为70～80％汇合成时机，因为在研究之后细胞一代中约能倍增3～6次，相邻的上下代间最容易发生退化，传代越长退化程度越高。因此在本发明中选择在约70～80％汇合成时对其进行，使其未达到退化发生程度即进行诱导，大大降低其脱分化的可能。

最后步骤S50中在诱导中继续培养，直至软骨细胞汇合度为80～90％时，增殖的细胞数量足够下，即可收集细胞。或者在数量不够的情形下，可以继续于添加有SFN的新鲜培养基中传代培养。

同时，在本发明上述步骤的实施过程中，为了避免在培养过程中有其他的杂菌的生长，采用原代培养和传代培养的培养基为DMEM/F12(Hyclone)培养基，并且在该DMEM/F12(Hyclone)培养基中还添加有培养基质量分数10％胎牛血清FBS、1％双抗及1％α-MEM非必需氨基酸。本发明采用的该培养基，添加有胎牛血清FBS其有利于细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上，维持传代过程中细胞的局部生长密度，避免在增殖过程中细胞的分散不均匀导致局部保密度高，而出现传代生长慢和退化的情形；同时其本身还能有结合蛋白质能与热原质结合的能力，因此在培养过程能与基质金属蛋白酶(MMPs)等结合，从而降低软骨细胞的II型胶原的降解水平，维持分化的程度。同时，添加双抗(青霉素和链霉素)抑制其它的杂菌的生长，保证培养过程中细胞的单纯性。

并且，在上述实施方式中，传代培养过程中按照1:3的比例进行传代，因为本身从机体内获取的软骨细胞在原代培养之后，本身具有一定程度的密度依赖性，如果细胞密度不够，细胞就不容易生长，甚至很快会死亡；而如果传代的比例大于1:3之后，本身密度太大，细胞生长太快，会降低每一代中的增殖倍数。

进一步在上述实施方式中，在步骤S20和步骤S30之间还包括将原代培养的细胞用胰蛋白酶处理的步骤，细胞在原代培养之后，会贴壁生长，其形态会发生变化，采用胰蛋白酶的处理可以使细胞变回最佳的圆形状态，从显微镜下观察为细胞质回缩，细胞间隙增加，从培养瓶壁上脱落，从而进行传代。

为了保证培养的准确性，在步骤S50之后还包括S60：对体外培养获得的细胞进行检测的过程，除了普通传统的软骨细胞形态显微镜观察之外，还可以采用如下手段进行：具体可以包括采用根据软骨细胞的特异标志分子基因表达水平的实时荧光定量PCR检测，以及软骨细胞特异性的分子的蛋白(即上述COL2a1/COL1a1等等)表达含量的特异标志蛋白免疫荧光检测；可以分别采用如下步骤进行。

S60a，实时荧光定量PCR检测验证：

S61a，收集步骤S50培养获得的细胞体；

S62a，用Trizol裂解细胞，提取待测RNA；

S63a，以待测RNA为模板进行实时荧光定量RT-PCR，检测Col2a1、Col1a1、Col10a1、MMP13等相关基因的表达水平。

以及，

S60b，蛋白免疫荧光染色法检测：

S61b，收集步骤S50培养获得的细胞体；

S62b，用4％多聚甲醛对细胞进行固定；

S63b，通过免疫荧光实验检测特异标志分子的蛋白表达情况。

采用本发明的体外软骨细胞培养方法，先通过原代培养在初期使其在体内的形状和特异分子表达最大化地维持与机体内相同，使其能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征；之后再通过传代培养进行大量增殖，并且在适当的时机采用SFN进行退化抑制，有效缓解软骨细胞体外单层培养时的退化现象，为临床用软骨细胞的培养提供一种新的优良方法。

为使本领域技术人员能更进一步明确知悉本发明上述方法的细节实施过程以及使体外培养过程中抑制退化的效果能真实体现，以下通过实施例进行举例说明。

实施例1

在该实施例1中基于实施过程需要，实施中使用的仪器设备如下：苏州净化二级安全柜、Thermal Scientific Series II细胞培养箱、Miulab MTH-100恒温混匀仪、Leica DMIL LED倒置显微镜、Thermal Scientific Multiscan GO化学发光仪、Applied Biosystems Veriti 96-well Thermal Cycler PCR仪、AppliedBiosystems ViiA7荧光定量PCR仪、Eppendorf 5804 R离心机。实施过程按如下步骤进行：

S11，经伦理委员会同意及患者知情，取关节置换患者膝关节软骨组织作为培养的软骨细胞；

S12，将获取的软骨组织于添加双抗(青霉素、链霉素)的生理盐水中(50ml离心管)振荡清洗3次后；倒入10cm的培养皿中，以手术刀片将片状软骨组织切成1mmx1mm大小，转移至15cmEP管中；

S13，向步骤S12的EP管中加入2.25ml无血清的DMEM/F12培养基及250ul10mg/mL的II型胶原酶，使终浓度达到1mg/ml，于恒温混匀仪上37℃震荡(700r/min)消化6小时，得消化产物；

S14，用40μM过滤网筛过滤去除步骤S13的消化产物中的碎屑及未消化的软骨残渣；然后用15mL离心管收集滤过细胞，在离心机上离心(1000r/min，5min)弃上清液，所获得的离心沉淀即为细胞体；

将细胞体用1mL软骨细胞培养液重悬细胞，使细胞悬液均匀，观察并进行细胞计数；其中在该步骤中采用的软骨细胞培养液即为液体DMEM/F12(Hyclone)培养基，并且在该DMEM/F12(Hyclone)培养基中还添加有培养基质量分数10％胎牛血清FBS、1％双抗及1％α-MEM非必需氨基酸；同时之后的传代培养中也采用该培养基。

S20，通过步骤S14的细胞计数结果，调整细胞密度，以5×10⁴/孔细胞密度接种于6孔板中，置于37℃、5％CO₂饱和湿度的恒温培养箱中培养；72小时后视细胞贴壁情况更换培养液，以后每隔3天换培养液，并在倒置显微镜下观察细胞生长状况以及形态特征，待软骨细胞汇合度为80～90％时，进行传代培养；

S31，将步骤S20的原代培养的细胞以PBS清洗2遍，吸除PBS后加入0.25％的胰蛋白酶7滴，室温下静置消化2～5分钟，待细胞变圆形(显微镜下观察细胞质回缩，细胞重新变成圆形，细胞间隙增加)，此时迅速而轻柔地吸除胰蛋白酶溶液(不使瓶底细胞随胰蛋白溶液流失)；

S32，将步骤S31的细胞中用新鲜软骨细胞培养液吹打细胞使其散开成细胞悬液，按1：3的比例进行传代培养。每日在倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况并拍照，每3天换液1次；

S40，当步骤S32中传代培养至软骨细胞汇合度达到约70％时，更换新鲜培养基并加入8μM SFN处理细胞24小时；

S50，将步骤S40SFN处理后的软骨细胞继续培养，每日在倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况，隔2天拍照一次记录；至汇合度为80～90％时，收集细胞。

S61a，将步骤S50中获得的培养培养产物接种于6孔板中，弃6孔板中细胞上清后，加入1ml Trizol(Invitrogen)裂解细胞，吹吸均匀后转移至1.5ml EP管中，保存在-20度冰箱待用；

S62a，以步骤S61中提取的RNA为模板，通过实时荧光定量PCR检测软骨细胞特异标志分子及相关基因表达水平，其中，包括Col2a1、Col1a1、Col10a1、MMP13的表达水平。

或者，S61b，将步骤S50中获得的培养培养产物接种于6孔板中，弃6孔板中细胞上清，以PBS清洗3次，加入1ml 4％多聚甲醛对细胞进行固定，4度冰箱过夜；第二天，以PBS清洗3次，加入2ml PBS，保存在4度冰箱待用；

S62b，将步骤S61中多聚甲醛处理后的细胞，通过免疫荧光实验检测特异标志分子的蛋白表达情况。

按照本发明的上述方法步骤所进行的检测的过程，用显微镜分别观察步骤S20原代培养细胞P0的形态、以及步骤S30传代培养中中第一次传代培养P1和第二次传代培养P2的细胞的形态；观察的结果拍照分别如图1～3所示，原代软骨细胞多呈三角形及椭圆形如图1，随着传代次数增加，软骨细胞逐渐呈梭形图2和图3。同时，将上述原代培养细胞和传代培养的细胞通过甲苯胺蓝染色后的形态结果图如图4～6所示，原代软骨细胞胞浆及基质均着色如图4所示，传代后的软骨细胞着色较弱，并从图5和图6中着色程度的差异可以看出，随着传代的代数，着色的程度之间降低。

同时，在步骤S62a中荧光PCR检测的相关基因的表达水平如图7～9所示，其中图7为Col2a1基因的表达水平结果、图8为Col1a1基因的表达水平结果、图9为COL2A1/COL1A1表达结果。从检测的结果中可以明显看出，COL2A1随传代显著下降，COL1A1则显著上升。

同时，在步骤S40中采用SFN处理后通过对SFN浓度的筛选，对汇合度约70％的软骨细胞添加5～8μM的SFN进行培养，然后进行了MMP13、COL2A1/COL1A1表达水平检测及COLII、COLI免疫荧光检测，其检测的数据图表如图10-11所示；从图10-11的结果中发现基质金属蛋白酶MMP13的表达水平显著降低，COL2A1/COL1A1显著高于未处理组。同时，采用横向对比，将SFN添加的浓度进行改变，分别选用8μM、5μM，对比处理后的MMP13的表达水平差异，其结果如图10所示。

同时将上述荧光PCR改换成免疫荧光染色法检测，将不同浓度SFN处理软骨细胞后一型胶原的染色免疫荧光染色结果如图12所示。从图12的靶蛋白的颜色检测结果图中COLII荧光检测均过低，而COLI的蛋白水平与SFN的处理浓度有一定的关系，结果显示8μM SFN处理后COLI的蛋白水平最低。

从上述的真实检测的数据结果可以看出，软骨细胞在体外培养随着传代而逐渐退化，表现为细胞由圆形及三角形逐渐向长梭形转变，软骨细胞特异的多糖及二型胶原表达显著降低，而一型胶原表达显著上升。但是在本发明的体外培养的方法过程中，经SFN在适当的时机处理后明显具有非常良好的脱分化抑制的效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种体外软骨细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取软骨细胞样本；

将所述软骨细胞样本进行原代培养；

将原代培养所得的软骨细胞进行传代培养，并在待传代培养至软骨细胞汇合度达到70～80％时，更换新鲜培养基并加入莱菔硫烷对软骨细胞进行处理。

2.如权利要求1所述的体外软骨细胞培养方法，其特征在于，所述新鲜培养基中添加的莱菔硫烷为5μΜ～8μΜ。

3.如权利要求1或2所述的体外软骨细胞培养方法，其特征在于，所述传代培养过程中按照1:3的比例进行传代。

4.如权利要求1或2所述的体外软骨细胞培养方法，其特征在于，所述原代培养和传代培养过程中采用的培养基为DMEM/F12培养基，且该DMEM/F12培养基中还添加有DMEM/F12培养基质量分数10％的胎牛血清FBS、1％的双抗及1％的α-MEM非必需氨基酸。

5.如权利要求1或2所述的体外软骨细胞培养方法，其特征在于，将所述软骨细胞样本进行原代培养之后、以及将原代培养所得的软骨细胞进行传代培养之前，还包括将所述原代培养细胞用胰蛋白酶处理。

6.如权利要求1或2所述的体外软骨细胞培养方法，其特征在于，将所述软骨细胞样本进行原代培养过程中，培养至软骨细胞汇合度为80～90％。

7.如权利要求3所述的体外软骨细胞培养方法，其特征在于，所述莱菔硫烷对软骨细胞进行处理过程之后，还包括：

将软骨细胞继续培养至汇合度为80～90％时，收集软骨细胞的细胞体。

8.如权利要求7所述的体外软骨细胞培养方法，其特征在于，所述收集软骨细胞的细胞体步骤之后还包括：

检测所述细胞体中Col2a1和Col1a1的表达水平。

9.如权利要求8所述的体外软骨细胞培养方法，其特征在于，所述检测所述细胞体中Col2a1和Col1a1的表达水平包括：

用Trizol裂解所述细胞体，提取细胞体内的RNA；

分别采用实时荧光RT-PCR检测Col2a1和Col1a1基因的表达水平。

10.如权利要求8所述的体外软骨细胞培养方法，其特征在于，所述检测所述细胞体中Col2a1和Col1a1的表达水平包括：

将所述细胞体用多聚甲醛进行处理；

通过蛋白免疫荧光染色法检测多聚甲醛处理后的细胞体中Col2a1和Col1a1的含量。