CN112877283A - 一种鸡原代软骨细胞分离培养及鉴定的方法 - Google Patents

一种鸡原代软骨细胞分离培养及鉴定的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112877283A
CN112877283A CN202110184800.3A CN202110184800A CN112877283A CN 112877283 A CN112877283 A CN 112877283A CN 202110184800 A CN202110184800 A CN 202110184800A CN 112877283 A CN112877283 A CN 112877283A
Authority
CN
China
Prior art keywords
chondrocytes
chicken
pbs
cell
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110184800.3A
Other languages
English (en)
Inventor
金四华
何培莉
邱桂如
耿照玉
夏晶晶
朱一笑
税斐
贾羽晴
江洪峰
郑书丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui Agricultural University AHAU
Original Assignee
Anhui Agricultural University AHAU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui Agricultural University AHAU filed Critical Anhui Agricultural University AHAU
Priority to CN202110184800.3A priority Critical patent/CN112877283A/zh
Publication of CN112877283A publication Critical patent/CN112877283A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90216—Oxidoreductases (1.) acting on a heme group of donors (1.9)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种鸡原代软骨细胞分离培养及鉴定的方法，其中，所述分离培养方法包括以下步骤：将鸡胚分离出软骨，将软骨组织剪碎后进行离心处理，弃上清液；在软骨组织碎片中加入胰蛋白酶进行消化处理，然后加入纯胎牛血清终止消化，离心后弃上清，再加入Ⅱ型胶原酶，水浴消化至组织块呈悬浊状；将上述悬浊液用细胞筛网过滤，将过滤后的滤液离心处理后弃去上清液，加入完全培养液，巴氏吸管轻轻吹打使细胞均匀重悬利用，得到软骨细胞；将分离的软骨细胞接种于细胞培养皿中，在37℃、5％CO2的培养箱中培养。所述鉴定方法采用免疫荧光鉴定软骨细胞标志蛋白ColⅡ。本发明首次建立了一种简单、可操作性强、重复性好的鸡软骨细胞分离培养及鉴定的方法。

Description

一种鸡原代软骨细胞分离培养及鉴定的方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种鸡原代软骨细胞分离培养及鉴定的方法。
背景技术
软骨是由软骨细胞和细胞外基质组成的无血管组织，软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型，其主要功能是通过分泌Ⅱ型胶原及蛋白多糖等保持关节软骨的功能，在正常生理条件下，软骨细胞的合成和分解代谢维持着动态平衡。而软骨细胞主要依靠关节的运动和挤压吸收营养物质，无血液供应，细胞代谢缓慢，所以软骨损伤后自我修复能力比较弱。因此，本发明研发出一种软骨细胞的培养方法，能够促进软骨细胞的增殖，提高软骨细胞的数量，用于解决现有技术中增殖速度较慢并伴随细胞退化的技术缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡原代软骨细胞分离培养及鉴定的方法，其首次建立了一种简单、可操作性强、重复性好的鸡软骨细胞分离培养及鉴定的方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种鸡原代软骨细胞分离培养的方法，包括以下步骤：
(1)将鸡胚用75％酒精消毒后，用镊子敲碎气室端蛋壳，挑出整个鸡胚置于装有37℃的不含钙镁的PBS溶液的无菌培养皿中冲洗干净，然后分离腿部转移至干净的培养皿中，用镊子和手术剪剪去除软骨外的肌肉和骨膜，分离出软骨，将软骨组织剪碎后进行离心处理，弃上清液；
(2)在剪碎的软骨组织碎片中加入胰蛋白酶，在37℃水浴中进行消化处理，期间每隔10min轻摇离心管几次，然后加入纯胎牛血清终止消化，离心后弃上清，再加入Ⅱ型胶原酶，水浴消化至组织块呈悬浊状，期间每隔10min轻颠离心管几次；
(3)将上述悬浊液用细胞筛网过滤，将过滤后的滤液离心处理后弃去上清液，加入完全培养液，巴氏吸管轻轻吹打使细胞均匀重悬利用，得到软骨细胞；
(4)将分离的软骨细胞接种于细胞培养皿中，在37℃、5％CO2的培养箱中培养。
优选地，所述步骤(1)中的鸡胚的胚龄为15天，离心转速为1000r/min，离心时间为5min。
优选地，所述步骤(2)中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25％，Ⅱ型胶原酶的质量浓度为0.2％，消化时间均为30-40min。
优选地，所述步骤(3)中的细胞筛网的目数为200目，离心转速为800-1000r/min，离心时间为4-6min。
优选地，所述步骤(4)中的软骨细胞按照1×104个/孔的密度铺板细胞培养皿。
一种鸡原代软骨细胞的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)鸡原代软骨细胞培养至第3天时，制作细胞爬片，将细胞接种至12孔板中，放入培养箱中；细胞爬片第二天弃去培养液，利用温育的PBS溶液冲洗两次，加入细胞固定液，细胞固定后，弃去固定液，利用PBS清洗3次；
(2)PBS清洗之后，加入封闭液，室温静置，弃去封闭液，PBS清洗3次，加一抗过夜；
(3)将一抗回收，PBS清洗3次，然后加入二抗，室温静置后弃去二抗，PBS清洗；
(4)加DAPI复染，室温静置后弃去DAPI，PBS清洗后加入少量PBS于培养孔中；在载玻片上加抗荧光淬灭剂，从培养孔中取出玻片铺于载玻片上，荧光显微镜下拍照。
优选地，所述步骤(1)中，加入细胞固定液后，细胞在室温固定15-20min。
优选地，所述步骤(2)中，加入封闭液后细胞在室温下封闭2h，一抗在4℃条件下孵育过夜。
优选地，所述步骤(3)中在避光条件下加入二抗，室温静置2h。
优选地，所述步骤(4)中的DAPI复染时间为5-10min
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1)本发明首次建立了一种简单、可操作性强、重复性好的鸡软骨细胞分离培养及鉴定的方法。
2)在本发明提供的实施例中，采用胰酶和Ⅱ型胶原酶两步消化的方法。胶原酶是从溶组织梭状芽孢杆菌中提取的水解酶，具有水解结缔组织中胶原蛋白的作用，是消化结缔组织的理想酶类。Ⅱ型胶原酶适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织的消化。
3)在本发明提供的实施例中，不需要解剖成年家禽，减少细胞污染并且减少了试验成本，能够快速高效的获取软骨细胞。
4)本发明通过实验研究得知，采用适宜的胰酶和Ⅱ型胶原酶的浓度和消化时间用于软骨组织的消化，可有效维持软骨细胞的活力，使得分离得到的软骨细胞在后期的增殖培养时能够在较短时间内获得足够数量的软骨细胞，大大提高了细胞培养的效率。
附图说明
图1是本发明实施例1中培养1d的软骨细胞悬液，200倍放大，白色箭头指着的为软骨细胞；
图2是本发明实施例1中培养2d的软骨细胞悬液，200倍放大，白色箭头指着的为软骨细胞；
图3是本发明实施例1中培养3d的软骨细胞悬液，200倍放大，白色箭头指着的为软骨细胞；
图4是本发明实施例2中利用免疫荧光鉴定的软骨细胞，200倍放大，利用软骨细胞表达的标记蛋白ColⅡ对细胞进行鉴定，图中蓝色为DAPI标记的细胞核蛋白，显示每个细胞的细胞核位置；绿色为绿色荧光基团标记的ColⅡ特异蛋白；
图5是本发明实施例2中软骨细胞的生长曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：鸡原代软骨细胞的分离培养
一种鸡原代软骨细胞分离培养方法，包括以下步骤：
(1)将入孵15d的鸡胚，75％酒精消毒后，用镊子敲碎气室端蛋壳，挑出整个鸡胚置于装有37℃的不含钙镁的PBS溶液的无菌培养皿中冲洗干净；分离腿部转移至干净的培养皿中，用镊子和眼科剪去除软骨外的肌肉和骨膜，分离出软骨置于装有PBS的小烧杯中；将软骨剪成约1mm3大小，转移至无菌的15mL的离心管中，1000r/min，离心5min，去除上清液；
(2)在剪碎的软骨组织碎片中加入7mL准备好的质量浓度0.25％胰蛋白酶，在37℃水浴中消化30min，期间每隔10min轻摇离心管几次；后加入3mL纯胎牛血清终止消化，1500r/min，离心10min，弃上清；加入7mL配好的质量浓度0.2％Ⅱ型胶原酶，在37℃水浴锅中消化30-40min，至组织块呈悬浊状，期间每隔10min轻颠离心管几次；
(3)将上述悬浊液以800r/min离心5min，取上清经过200目的过滤筛。将过滤后的滤液转移至15mL离心管中以2000r/min离心10min，弃上清，加入完全培养液，巴氏吸管轻轻吹打使细胞均匀重悬；
(4)将软骨细胞按约5×105个/孔的密度将上述细胞接种于6孔板，在37℃、5％CO2的培养箱中培养。
图1是本发明实施例1中培养1d的软骨细胞悬液，200倍放大，白色箭头指着的为软骨细胞；图2是本发明实施例1中培养2d的软骨细胞悬液，200倍放大，白色箭头指着的为软骨细胞；图3是本发明实施例1中培养3d的软骨细胞悬液，200倍放大，白色箭头指着的为软骨细胞。
实施例2：鸡原代软骨细胞的鉴定
一种鸡原代软骨细胞的鉴定方法，有以下几种方法：细胞形态学观察、免疫荧光鉴定软骨细胞标志蛋白ColⅡ及细胞生长曲线测定等。
其中，其中细胞形态学观察是在光学显微镜下观察细胞的形态结构并拍照细胞形态学观察，细胞形态学观察具体包括以下步骤：
将分离的鸡原代软骨细胞在5％CO2恒温培养箱中培养2h左右，其中的成纤维细胞、淋巴细胞和血细胞等杂细胞已经贴壁。倒置显微镜观察，刚消化下来的软骨细胞呈球形，悬浮状，较为圆润。如图1-3，软骨细胞培养1d后细胞呈现圆形、梭形和多角形等不同形态，2d后细胞增殖开始变快、胞浆丰富饱满，3d时细胞之间联系紧密，局部细胞连成一片。
免疫荧光鉴定软骨细胞标志蛋白ColⅡ，包括以下步骤：
(1)细胞培养至第3天，制作细胞爬片，将细胞接种至12孔板中，放入培养箱中；细胞爬片第二天弃去培养液，温育的PBS冲洗两次，加入细胞固定液(4％多聚甲醛)，室温固定15min，弃去固定液，PBS清洗3次；
(2)PBS清洗后，加入封闭液，封闭液为1％BSA，室温静置2h，弃去封闭液，PBS清洗3次，加一抗，4℃孵育过夜；
(3)将一抗回收，PBS清洗3次，避光条件下加入二抗，室温静置2h；弃去二抗，PBS清洗；
(4)加DAPI复染5min，室温静置后弃去DAPI，PBS清洗后加入少量PBS于培养孔中；在载玻片上加抗荧光淬灭剂，从培养孔中取出玻片铺于载玻片上，荧光显微镜下观察并拍照。
应用免疫荧光鉴定技术检测第2代软骨细胞标志性蛋白ColⅡ的表达情况，并用DAPI染核。如图4，结果发现，ColⅡ呈阳性表达，经DAPI染色后细胞核呈蓝色。结果表明，本次试验成功分离了软骨细胞，且细胞纯度较高，可进行后续试验。
细胞生长曲线的测定，具体包括以下步骤：
通过测定鸡原代软骨细胞生长曲线观察细胞的生长规律，软骨细胞的生长曲线大致呈“S”型，分为4个生长阶段：潜伏期、对数生长期、平台期和衰亡期。如图5，体外培养软骨细胞前2d细胞生长缓慢，为潜伏期；3-7d时细胞开始迅速增殖，进入对数生长期，第7d时细胞活力达到最高；8-9d时细胞生长缓慢，进入平台期；随着细胞密度的增加，细胞出现接触抑制现象，第9d后细胞增殖速度减慢，细胞数目逐渐减少，进入衰亡期。从生长曲线可以看出符合正常的软骨细胞增殖过程。
细胞生长曲线的测定，采用以下步骤：取鸡软骨细胞，按照5×103个/孔的密度接种于96孔培养板，共60孔，并置于细胞培养箱中培养。设置无细胞的空白孔、测定组每组设6个重复孔。从接种细胞开始，每隔24h，测定组每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃孵育4h后测定450nm各孔的吸光值，添加至第10d结束。细胞吸光值按照以下公式计算：细胞吸光值＝测定组细胞OD-空白组OD。以培养时间(d)为横坐标，6孔细胞的吸光度平均值为纵坐标绘制生长曲线。图5是本实施例中软骨细胞的生长曲线。
本发明首次建立了一种鸡原代软骨细胞分离培养及鉴定的方法，利用该方法可获得生长良好、纯度和活性高的鸡软骨细胞。利用软骨细胞表达的标记蛋白ColⅡ对细胞进行免疫荧光鉴定，结果发现本发明所培养的细胞具有典型的软骨细胞形态结构特征，表明试验过程所用的细胞是鸡软骨细胞。
以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种鸡原代软骨细胞分离培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将鸡胚用75％酒精消毒后，用镊子敲碎气室端蛋壳，挑出整个鸡胚置于装有37℃的不含钙镁的PBS溶液的无菌培养皿中冲洗干净，然后分离腿部转移至干净的培养皿中，用镊子和手术剪剪去除软骨外的肌肉和骨膜，分离出软骨，将软骨组织剪碎后进行离心处理，弃上清液；
(2)在剪碎的软骨组织碎片中加入胰蛋白酶，在37℃水浴中进行消化处理，期间每隔10min轻摇离心管几次，然后加入纯胎牛血清终止消化，离心后弃上清，再加入Ⅱ型胶原酶，水浴消化至组织块呈悬浊状，期间每隔10min轻颠离心管几次；
(3)将上述悬浊液用细胞筛网过滤，将过滤后的滤液离心处理后弃去上清液，加入完全培养液，巴氏吸管轻轻吹打使细胞均匀重悬利用，得到软骨细胞；
(4)将分离的软骨细胞接种于细胞培养皿中，在37℃、5％CO2的培养箱中培养。
2.根据权利要求1所述的一种鸡原代软骨细胞分离培养的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的鸡胚的胚龄为15天，离心转速为1000r/min，离心时间为5min。
3.根据权利要求1所述的一种鸡原代软骨细胞分离培养的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25％，Ⅱ型胶原酶的质量浓度为0.2％，消化时间均为30-40min。
4.根据权利要求1所述的一种鸡原代软骨细胞分离培养的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的细胞筛网的目数为200目，离心转速为800-1000r/min，离心时间为4-6min。
5.根据权利要求1所述的一种鸡原代软骨细胞分离培养的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的软骨细胞按照1×104个/孔的密度铺板细胞培养皿。
6.一种鸡原代软骨细胞的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)鸡原代软骨细胞培养至第3天时，制作细胞爬片，将细胞接种至12孔板中，放入培养箱中；细胞爬片第二天弃去培养液，利用温育的PBS溶液冲洗两次，加入细胞固定液，细胞固定后，弃去固定液，利用PBS清洗3次；
(2)PBS清洗之后，加入封闭液，室温静置，弃去封闭液，PBS清洗3次，加一抗过夜；
(3)将一抗回收，PBS清洗3次，然后加入二抗，室温静置后弃去二抗，PBS清洗；
(4)加DAPI复染，室温静置后弃去DAPI，PBS清洗后加入少量PBS于培养孔中；在载玻片上加抗荧光淬灭剂，从培养孔中取出玻片铺于载玻片上，荧光显微镜下拍照。
7.根据权利要求6所述的一种鸡原代软骨细胞的鉴定方法，其特征在于：所述步骤(1)中，加入细胞固定液后，细胞在室温固定15-20min。
8.根据权利要求6所述的一种鸡原代软骨细胞的鉴定方法，其特征在于：所述步骤(2)中，加入封闭液后细胞在室温下封闭2h，一抗在4℃条件下孵育过夜。
9.根据权利要求6所述的一种鸡原代软骨细胞的鉴定方法，其特征在于：所述步骤(3)中在避光条件下加入二抗，室温静置2h。
10.根据权利要求6所述的一种鸡原代软骨细胞的鉴定方法，其特征在于：所述步骤(4)中的DAPI复染时间为5-10min。
CN202110184800.3A 2021-02-10 2021-02-10 一种鸡原代软骨细胞分离培养及鉴定的方法 Pending CN112877283A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110184800.3A CN112877283A (zh) 2021-02-10 2021-02-10 一种鸡原代软骨细胞分离培养及鉴定的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110184800.3A CN112877283A (zh) 2021-02-10 2021-02-10 一种鸡原代软骨细胞分离培养及鉴定的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112877283A true CN112877283A (zh) 2021-06-01

Family

ID=76057589

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110184800.3A Pending CN112877283A (zh) 2021-02-10 2021-02-10 一种鸡原代软骨细胞分离培养及鉴定的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112877283A (zh)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0271668A1 (de) * 1986-10-22 1988-06-22 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF) Wachstumstimulierendes Material, Herstellungsverfahren und therapeutische Zusammensetzung
US20040176289A1 (en) * 2001-06-19 2004-09-09 Jang-Soo Chun Pharmaceutical composition for prevention and treatment of joint arthritis and a screening method thereof
CN103131675A (zh) * 2013-02-07 2013-06-05 中国人民解放军第二军医大学 体外腺病毒介导bmp-2/7基因共表达诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法
CN104513806A (zh) * 2014-12-16 2015-04-15 深圳市第二人民医院 体外软骨细胞的培养方法
US20170283859A1 (en) * 2014-10-24 2017-10-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York MICROFLUIDIC qRT-PCR ANALYSIS OF SINGLE CELLS
CN107531687A (zh) * 2015-02-27 2018-01-02 加利福尼亚大学董事会 能够实现软骨复壮的小分子
CN107653224A (zh) * 2017-11-13 2018-02-02 重庆斯德姆生物技术有限公司 一种软骨细胞的增殖培养基及增殖培养方法
CN110016461A (zh) * 2019-01-15 2019-07-16 深圳市第二人民医院 一种软骨细胞体外扩增方法
CN213866155U (zh) * 2020-11-23 2021-08-03 安徽农业大学 一种家禽原代软骨细胞的分离装置

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0271668A1 (de) * 1986-10-22 1988-06-22 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF) Wachstumstimulierendes Material, Herstellungsverfahren und therapeutische Zusammensetzung
US20040176289A1 (en) * 2001-06-19 2004-09-09 Jang-Soo Chun Pharmaceutical composition for prevention and treatment of joint arthritis and a screening method thereof
CN103131675A (zh) * 2013-02-07 2013-06-05 中国人民解放军第二军医大学 体外腺病毒介导bmp-2/7基因共表达诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法
US20170283859A1 (en) * 2014-10-24 2017-10-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York MICROFLUIDIC qRT-PCR ANALYSIS OF SINGLE CELLS
CN104513806A (zh) * 2014-12-16 2015-04-15 深圳市第二人民医院 体外软骨细胞的培养方法
CN107531687A (zh) * 2015-02-27 2018-01-02 加利福尼亚大学董事会 能够实现软骨复壮的小分子
CN107653224A (zh) * 2017-11-13 2018-02-02 重庆斯德姆生物技术有限公司 一种软骨细胞的增殖培养基及增殖培养方法
CN110016461A (zh) * 2019-01-15 2019-07-16 深圳市第二人民医院 一种软骨细胞体外扩增方法
CN213866155U (zh) * 2020-11-23 2021-08-03 安徽农业大学 一种家禽原代软骨细胞的分离装置

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIN SIHUA等: "Polymorphisms in the uncoupling protein 3 gene and their associations with feed efficiency in chickens", 《ASIAN-AUSTRALASIAN JOURNAL OF ANIMAL SCIENCES》 *
SERAFIM M. OLIVEIRA等: "Engineering endochondral bone: in vitro studies", 《TISSUE ENGINEERING》 *
张海英著: "《神经科学研究常用技术》", 31 December 2018 *
李赛慧等: "鸡胚原代软骨细胞的分离培养及表型鉴定", 《中国兽医学报》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114058592B (zh) 一种永生化牦牛瘤胃上皮细胞系及其构建方法
CN108384745A (zh) 一种改进的两步酶分离培养睾丸支持细胞的方法
CN105483078A (zh) 一种鸡小肠上皮细胞的分离及原代培养方法
CN101657536B (zh) 软骨细胞制备方法
CN112852717B (zh) 一种高效分离培养猪乳腺上皮细胞的方法
CN109706181A (zh) 一种构建永生化猪肝星状细胞系的方法、永生化猪肝星状细胞系和应用
CN109055316A (zh) 一种神经细胞和肥大细胞共培养体系的构建及应用
CN112877283A (zh) 一种鸡原代软骨细胞分离培养及鉴定的方法
CN108823154A (zh) 一种脂肪干细胞的无血清培养基及其制备方法
CN110117570B (zh) 一种类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的原代培养方法
CN105907707A (zh) 一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法
CN107460166A (zh) 一种鸡ghr缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法
CN114276986A (zh) 一种分离纯化水牛原代成肌细胞的方法及其应用
CN113999809A (zh) 一种鸭卵巢颗粒细胞的体外分离纯化培养方法
CN114426948A (zh) 一种自发永生化的胎猪肾小球系膜细胞系及其应用
CN110295137B (zh) 一种乌斑鳢肾细胞系及其构建方法和应用
CN106591223A (zh) 一种人皮肤成纤维细胞分离与原代培养方法
CN112391337A (zh) 一种鸽嗉囊成纤维细胞的分离及原代培养方法
CN111925980A (zh) 一种鸡卵泡颗粒的体外培养方法
CN116836912B (zh) 一种大口黑鲈吻端细胞系及其构建方法和应用
CN114774352B (zh) 一种畜禽动物肌肉干细胞的纯化方法
CN113444681B (zh) 一种鸡松果体细胞的分离及原代培养方法
CN114672454B (zh) 使用原代心肌细胞构建心肌缺血再灌注胰岛素抵抗模型的构建方法
CN117187173A (zh) 一种鹅原代成肌细胞的培养方法
CN115558654A (zh) 一种混合酶消化液及异齿裂腹鱼原代肝细胞的分离培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210601

RJ01 Rejection of invention patent application after publication