CN109706181A - 一种构建永生化猪肝星状细胞系的方法、永生化猪肝星状细胞系和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种构建永生化猪肝星状细胞系的方法、永生化猪肝星状细胞系和应用，涉及永生化细胞技术领域，本发明所述方法从猪肝脏中分离得到正常的猪肝星状细胞，以SV40LT过表达慢病毒转染，得到永生化的猪肝星状细胞系。本发明采用包含SV40LT序列的慢病毒载体对猪肝星状细胞进行永生化，具有可感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，可长期表达等优点。本发明所述方法构建的永生化猪肝星状细胞系呈伸展状态生长，有伪足，细胞轮廓清晰，细胞完整，具有与原代猪肝星状细胞类似的典型形态学特征；所得永生化猪肝星状细胞系传代10代后，细胞形态和特征与第1代细胞无明显差别，该构建的永生化猪肝星状细胞系可在药物筛选中应用。

Description

一种构建永生化猪肝星状细胞系的方法、永生化猪肝星状细 胞系和应用

技术领域

本发明涉及永生化细胞技术领域，尤其涉及一种构建永生化猪肝星状细胞系的方法、永生化猪肝星状细胞系和应用。

背景技术

各类肝病是当前世界范围内的常见病、多发病，严重影响人类健康，给各国政府带来巨大经济负担。但由于人类研究样本背景条件的控制和大规模取样较困难，目前对其发病机制知之甚少，急需通过合适的模型，深入研究其发病的细胞和分子机制，为预防、治疗和药物研发提供科学依据。

猪肝细胞的代谢功能与人肝细胞最为接近，目前大多数基础和临床研究均采用原代猪肝细胞作为肝细胞源。但是，由于原代肝细胞在体外培养时均存在生长条件要求严格、存活时间及产量有限、难以传代等问题，因此需要采用永生化技术建立永生化的猪肝细胞系。

现有研究中对永生化星状细胞系的构建进行了研究，庄鹏等人利用含有SV40TL的PSV3neo质粒转染大鼠原代肝星状细胞(HSC)，以G418筛选转染后的大鼠原代肝星状细胞，经过20d抗性筛选获得阳性克隆，所得永生化大鼠肝星状细胞系已传代50代，可在体外长期传代，倍增速度快，其形态和生物学特性与原代HSC形态相似(庄鹏,马会慧,江元森,etal.SV40LTag基因诱导永生化大鼠肝星状细胞系的建立及鉴定[J].中国病理生理杂志,2007,23(10):2074-2077.)。

潘小平利用SV40LT重组反转录病毒(SV40LT和hTERT基因共转染；具体参见Pan X,Du W,Yu X,et al.Establishment and Characterization of Immortalized PorcineHepatocytes for the Study of Hepatocyte Xenotransplantation[J].Transplantation Proceedings,2010,42(5):0-1906.)转染原代人肝星状细胞，构建得到永生化人肝星状细胞HSC-Li，具有人肝星状细胞的生物学形态和功能(潘小平.永生化人肝星状细胞系的建立及其对肝细胞功能与肝祖细胞分化的影响[D].浙江大学,2013.)。

由于猪的体积较大无法麻醉，需要先杀死猪才能够进行后续制备，无法实现灌流。同时，猪的养殖环境较差，分离组织时很难获得无菌的猪肝组织。目前并没有一种有效的永生化猪肝星状细胞系的构建方法。

发明内容

本发明为了克服目前无法构建永生化猪肝星状细胞的缺陷，提供了构建永生化猪肝星状细胞系的方法，可获得与原代猪肝星状细胞的细胞形态和特性无明显差别的永生化猪肝星状细胞系，扩大肝星状细胞的来源，为肝脏治疗的药物筛选提供便利条件。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种构建永生化猪肝星状细胞系的方法，包括以下步骤：

(1)将猪肝脏组织破碎后与质量浓度0.05～0.2％的Ⅳ型胶原酶溶液混合，35～38℃加热0.5～2h，得到酶解复合物；

(2)以180～240目筛网过滤所述酶解复合物，取滤液，得到全肝细胞悬液；

(3)将全肝细胞悬液进行第一离心，固液分离，得到第一上清液；所述第一离心的转速为300～600rpm；

(4)将第一上清液进行第二离心，固液分离，所得沉淀为猪肝星状细胞；所述第二离心的转速为1200～1800rpm；

(5)将猪肝星状细胞接种于容器的孔中，加入星状细胞完全培养基培养至贴壁后换液，依次加入新的星状细胞完全培养基和SV40LT过表达慢病毒进行转染；

所述SV40LT过表达慢病毒包括如SEQ ID NO.1所示的SV40LT核苷酸序列；

(6)将转染后的猪肝星状细胞传代3～4次后，筛选阳性克隆，得到永生化猪肝星状细胞系。

优选的，步骤(1)中，所述猪肝脏组织与质量浓度0.05～0.2％的Ⅳ型胶原酶溶液的体积比在1:3以上。

优选的，所述第一离心或第二离心的离心时间独立地为8～15min。

优选的，所述步骤(4)得到猪肝星状细胞后，还包括扩增步骤：

将猪肝星状细胞以星状细胞完全培养基重悬，35～38℃培养50～80min，取培养后未贴壁的细胞转入新的星状细胞完全培养基中培养。

优选的，步骤(5)中，所述猪肝星状细胞的接种量为0.5×10⁵～2×10⁵个/孔。

优选的，步骤(5)中，所述星状细胞完全培养基的添加量为0.8～2ml/孔。

优选的，步骤(5)中，所述SV40LT过表达慢病毒为pHY-SV40LT-Puro慢病毒。

优选的，步骤(6)中，所述筛选阳性克隆时采用2.5～3.5μg/ml嘌呤霉素处理转染后的永生化猪肝星状细胞系，处理3d后存活的即为转染成功的永生化猪肝星状细胞系。

本发明还提供了上述技术方案所述方法构建的永生化猪肝星状细胞系。

本发明还提供了前述技术方案所述永生化猪肝星状细胞系在筛选药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明提供了一种构建永生化猪肝星状细胞系的方法，从猪肝脏中分离得到正常的猪肝星状细胞，以SV40LT过表达慢病毒转染，得到永生化的猪肝星状细胞系。本发明采用包含SV40LT序列(如SEQ ID NO.1所示)的慢病毒载体对猪肝星状细胞进行永生化，具有可以感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，可以长期表达等显著优点。而其他常用的病毒载体如腺病毒、逆转录病毒载体，逆转录病毒载体只能感染分裂期细胞并且容量有限，而腺病毒则一般不能整合到染色体上，只能进行瞬时感染。与其它逆转录病毒相比，慢病毒不产生任何有效的细胞免疫应答，可作为一种体外基因运输的工具。慢病毒载体介导的转基因表达能持续数月，且无可观察到的病理学现象。如本发明实施例所示，本发明所述方法构建的永生化猪肝星状细胞系呈伸展状态生长，有伪足，细胞轮廓清晰，细胞完整，具有与原代猪肝星状细胞类似的典型形态学特征；本发明所得永生化猪肝星状细胞系传代10代后，细胞形态和特征与第1代细胞无明显差别。

本发明构建的永生化猪肝星状细胞系可用于药物筛选中，例如本发明实施例所示的，利用本发明所述永生化猪肝星状细胞构建内质网应激模型，利用其构建的内质网应激模型可确定衣霉素处理不同浓度和培养时间对肝星状细胞的存活率、细胞周期以及对内质网应激标志蛋白表达的影响。再比如本发明实施例所示的，利用本发明所述通过慢病毒介导的shRNA敲低永生化猪肝星状细胞中GRP94的表达，以确定能够有效敲低GRP94基因表达的shRNA序列。

附图说明

图1为pHY-SV40LT-Puro慢病毒的载体图谱；

图2为实施例1中分离得到的正常未转染的猪肝星状细胞的肝星状细胞形态图；

图3为实施例1第2节免疫荧光鉴定中对照组猪肝星状细胞的免疫荧光图；

图4为实施例1第2节免疫荧光鉴定中实验组猪肝星状细胞的免疫荧光图；

图5为实施例1筛选得到的转染成功的1代猪肝星状细胞的肝星状细胞形态图；

图6为实施例1筛选得到的转染成功的10代猪肝星状细胞的肝星状细胞形态图；

图7为实施例2中不同衣霉素浓度和培养时间对细胞存活率的影响柱状图；

图8为实施例2中5μg/mL衣霉素剂量培养8h对内质网应激标志蛋白表达的影响；其中A为不同处理下GPR 94的表达量，B为不同处理下GPR78的表达量，C为不同处理下ATF4的表达量，D为不同处理下plRE1的表达量；

图9为5μg/mL衣霉素剂量培养24h对内质网应激标志蛋白表达的影响；其中A为不同处理下GPR 94的表达量，B为不同处理下GPR 78的表达量，C为不同处理下ATF4的表达量，D为不同处理下plRE1的表达量；

图10为实施例3中构建的基因沉默慢病毒质粒示意图；

图11为实施例3中GRP94-shRNA慢病毒转染永生化猪肝星状细胞后GRP94的表达量；

图12为实施例3中慢病毒干扰的永生化猪肝星状细胞中GRP94蛋白的表达情况。

具体实施方式

本发明提供了一种构建永生化猪肝星状细胞系的方法，包括以下步骤：

(1)将猪肝脏组织破碎后与质量浓度0.05～0.2％的Ⅳ型胶原酶溶液混合，35～38℃加热0.5～2h，得到酶解复合物；

(2)以180～240目筛网过滤所述酶解复合物，取滤液，得到全肝细胞悬液；

(3)将全肝细胞悬液进行第一离心，固液分离，得到第一上清液；所述第一离心的转速为300～600rpm；

(4)将第一上清液进行第二离心，固液分离，所得沉淀为猪肝星状细胞；所述第二离心的转速为1200～1800rpm；

(5)将猪肝星状细胞接种于容器的孔中，加入星状细胞完全培养基培养至贴壁后换液，依次加入新的星状细胞完全培养基和SV40LT过表达慢病毒进行转染；

所述SV40LT过表达慢病毒包括如SEQ ID NO.1所示的SV40LT核苷酸序列；

(6)将转染后的猪肝星状细胞传代3～4次后，筛选阳性克隆，得到永生化猪肝星状细胞系。

本发明将猪肝脏组织破碎后与质量浓度0.05～0.2％的Ⅳ型胶原酶溶液混合，35～38℃加热0.5～2h，得到酶解复合物。

在本发明中，所述猪肝脏组织优选的采用新鲜的离体猪肝脏，所述新鲜是指离体时间不超过0.5h。

本发明对猪肝脏组织进行破碎的目的是便于酶解。本发明优选的在破碎前将猪肝脏组织浸泡在含有P/S(双抗(青霉素-链霉素混合液))的PBS缓冲液中，以获得无菌的猪肝脏组织；在本发明所述PBS缓冲液中，P/S的质量浓度优选为0.5～2％，更优选为1％。本发明对于含有P/S的PBS缓冲液用量没有特殊限定，能够浸没所述猪肝脏组织即可。本发明优选的在破碎前去除猪肝脏组织中的包膜等杂质，所述去除杂质的步骤在浸泡之后。在本发明中，所述破碎包括但不限于捣碎、剪碎等，本领域技术人员对此不做特殊限定。在本发明中，所述破碎后优选的将破碎的猪肝脏组织以PBS缓冲液进行清洗，再与Ⅳ型胶原酶溶液混合。

在本发明中，所述猪肝脏组织与质量浓度0.05～0.2％的Ⅳ型胶原酶溶液的体积比优选的在1:3以上，更优选为1:3。本发明采用质量浓度0.05～0.2％的Ⅳ型胶原酶溶液对猪肝脏组织酶解的目的是水解结缔组织中的胶原蛋白。在本发明中，所述Ⅳ型胶原酶溶液的质量浓度优选为1％。

在本发明中，所述35～38℃加热0.5～2h优选的通过水浴完成。在本发明中，所述加热时间优选为1h；所述加热温度优选为37℃。

得到酶解复合物后，本发明将以180～240目筛网过滤所述酶解复合物，取滤液，得到全肝细胞悬液。在本发明中，所述筛网目数优选为200目。本发明采用180～240目筛网对酶解复合物过滤的目的是彻底去除未消化完全的组织块。

得到全肝细胞悬液后，本发明将全肝细胞悬液进行第一离心，固液分离，得到第一上清液；所述第一离心的转速为300～600rpm。在本发明中，所述第一离心的离心时间优选为8～15min，更优选为10min。在本发明中，第一离心进行固体分离后得到第一上清液和沉淀，其中沉淀为肝实质细胞，第一上清液用于进一步离心分离，肝星状细胞位于第一上清液中。

得到第一上清液后，本发明将第一上清液进行第二离心，固液分离，所得沉淀为猪肝星状细胞；所述第二离心的转速为1200～1800rpm。在本发明中，所述第二离心的离心时间优选为8～15min，更优选为10min。在本发明中，第一离心的目的是为了沉淀去除肝实质细胞，第二离心是为了收集除肝实质细胞外的其他细胞。

本发明优选的，得到猪肝星状细胞后，优选的还包括扩增步骤：将猪肝星状细胞以星状细胞完全培养基重悬，35～38℃培养50～80min，取培养后未贴壁的细胞转入新的星状细胞完全培养基中培养。本发明设置扩增步骤的目的是扩大猪肝星状细胞的数量，以满足后续转染的需要，还可对猪肝星状细胞进行纯化。本发明所述星状细胞完全培养基优选的来源于市售商品，例如本发明实施例中采用赛百慷(上海)生物技术股份有限公司生产的Primed-icell-009星状细胞完全培养基。

在本发明中，所述35～38℃培养50～80min优选的采取恒温培养箱方式实现。在本发明中，所述培养温度优选为37℃；所述培养时间优选为60min。

得到猪肝星状细胞后，本发明将猪肝星状细胞接种于容器的孔中，加入星状细胞完全培养基培养至贴壁后换液，依次加入新的星状细胞完全培养基和SV40LT过表达慢病毒进行转染；所述SV40LT过表达慢病毒包括如SEQ ID NO.1所示的SV40LT核苷酸序列。SV40由结构蛋白(VP1、VP2、VP3)和两种抗原LT和st组成。SV40病毒早期转录区转化基因(A基因)编码LT和st抗原。LT抗原为细胞转化启动所必需的，对转化起决定作用，而且转化细胞表型的维持必须有LT抗原的连续表达。

在本发明中，所述猪肝星状细胞的接种量为0.5×10⁵～2×10⁵个/孔，更优选为1×10⁵个/孔。在此基础上，本发明所述新添加的星状细胞完全培养基的用量优选为0.8～2ml/孔，更优选为1ml/孔；添加的SV40LT过表达慢病毒优选为15～30μL/孔，更优选为20μL/孔。

本发明采用SV40LT过表达慢病毒进行转染的目的是促使星状细胞永生化。在本发明中，所述SV40LT过表达慢病毒中包括SV40LT序列，如SEQ ID NO.1所示：

atggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatgagaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttcatcctgataaaggaggagatgaagaaaaaatgaagaaaatgaatactctgtacaagaaaatggaagatggagtaaaatatgctcatcaacctgactttggaggcttctgggatgcaactgagattccaacctatggaactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaacattctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactctt gcttgctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacatactgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttgatgtatagtgccttgactagagatccattttctgttattgaggaaagtttgccaggtgggttaaaggagcatgattttaatccagaagaagcagaggaaactaaacaagtgtcctggaagcttgtaacagagtatgcaatggaaacaaaatgtgatgatgtgttgttattgcttgggatgtacttggaatttcagtacagttttgaaatgtgtttaaaatgtattaaaaaagaacagcccagccactataagtaccatgaaaagcattatgcaaatgctgctatatttgctgacagcaaaaaccaaaaaaccatatgccaacaggctgttgatactgttttagctaaaaagcgggttgatagcctacaattaactagagaacaaatgttaacaaacagatttaatgatcttttggataggatggatataatgtttggttctacaggctctgctgacatagaagaatggatggctggagttgcttggctacactgtttgttgcccaaaatggattcagtggtgtatgactttttaaaatgcatggtgtacaacattcctaaaaaaagatactggctgtttaaaggaccaattgatagtggtaaaactacattagcagctgctttgcttgaattatgtggggggaaagctttaaatgttaatttgcccttggacaggctgaactttgagctaggagtagctattgaccagtttttagtagtttttgaggatgtaaagggcactggaggggagtccagagatttgccttcaggtcagggaattaataacctggacaatttaagggattatttggatggcagtgttaaggtaaacttagaaaagaaacacctaaataaaagaactcaaatatttccccctggaatagtcaccatgaatgagtacagtgtgcctaaaacactgcaggccagatttgtaaaacaaatagattttaggcccaaagattatttaaagcattgcctggaacgcagtgagtttttgttagaaaagagaataattcaaagtggcattgctttgcttcttatgttaatttggtacagacctgtggctgagtttgctcaaagtattcagagcagaattgtggagtggaaagagagattggacaaagagtttagtttgtcagtgtatcaaaaaatgaagtttaatgtggctatgggaattggagttttagattggctaagaaacagtgatgatgatgatgaagacagccaggaaaatgctgataaaaatgaagatggtggggagaagaacatggaagactcagggcatgaaacaggcattgattcacagtcccaaggctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacagagcaaaagctcatttctgaagaggacttgtaa。

在本发明中，所述SV40LT过表达慢病毒为pHY-SV40LT-Puro慢病毒，该慢病毒的载体图谱如图1所示，其中含有嘌呤霉素，可作为筛选标记。

在本发明中，所述转染优选的至孔中的猪肝星状细胞长满板底时停止，转入新的培养瓶中进行传代；更优选的，在转染期间每隔10～14h更换一次星状细胞完全培养基。在本发明中，所述转染的温度优选为35～40℃，更优选为37℃。

转染完成后，将转染后的猪肝星状细胞传代3～4次后，筛选，得到永生化猪肝星状细胞系。本发明所述筛选根据SV40LT过表达慢病毒中携带的标记不同而选择不同的筛选标记。本发明优选的，当所述SV40LT过表达慢病毒优选为pHY-SV40LT-Puro慢病毒时，该慢病毒中携带有嘌呤霉素，进而本发明优选的采用嘌呤霉素对转染后的猪肝星状细胞系进行筛选，存活的即为阳性克隆。本发明优选的，所述嘌呤霉素用于筛选时的浓度优选为2.5～3.5μg/ml，更优选为3μg/ml。本发明优选的，在筛选时，选择所述2.5～3.5μg/ml的嘌呤霉素处理3d后存活的细胞确定为转染后的永生化猪肝星状细胞系。

本发明还提供了一种上述技术方案所述方法构建的永生化猪肝星状细胞系。如本发明实施例所示，本发明所述方法得到的永生化猪肝星状细胞系具有与原代猪肝星状细胞相同的细胞形态和特性，并且传代10次后并未发生显著改变。有效的扩大了猪肝星状细胞的体外来源，解决了目前直接分离原代猪肝星状细胞造成的不稳定等问题。

本发明还提供了一种上述技术方案所述永生化猪肝星状细胞系在筛选药物中的应用。具体的，本发明所述永生化猪肝星状细胞系可通过构建生物模型，进而筛选药物对该模型的作用效果；本发明所述永生化猪肝星状细胞系还可以直接用于药物的筛选，利用以不同shRNA敲低所述永生化猪肝星状细胞系中的GRP4基因，从而确定shRNA的敲低能力。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

试验所需仪器设备及试剂

(1)仪器

表1实验仪器设备

(2)试剂耗材

表2实验耗材和试剂

实施例1

1、猪肝星状细胞的分离培养

1)将猪颈部动脉放血致死，取部分肝组织，置于含有P/S的PBS中，

2)去除包膜等，然后将肝组织剪碎，PBS至少清洗3次，

3)用至少3倍于组织体积的0.1％Ⅳ型胶原酶37℃水浴消化1h，

4)过200目筛网，得全肝细胞悬液，

5)将悬液转入离心管中，400rpm离心10min，沉淀细胞为肝实质细胞，

6)将上清转移至另一离心管中，1500rpm离心10min，离心完成后，弃上清，得到的沉淀为猪肝星状细胞；

7)步骤6)的沉淀用培养基重悬后，转入T-25培养瓶中，37℃培养箱中培养60min，然后将未贴壁的细胞转入另一新的培养瓶中进进行培养，此瓶中培养的为肝星状细胞。

分离得到的猪肝星状细胞，如图2所示，图左为100X物镜的观察结果，图右为200X物镜的观察结果。在倒置显微镜下观察，新鲜猪肝星状细胞呈单个分布，形状为圆形、椭圆形，细胞轮廓清晰，细胞膜完整，胞浆中含有脂滴。细胞贴壁生长。可以看出，本发明分离得到的为正常的猪肝星状细胞。

2、免疫荧光鉴定

2.1实验步骤

(1)细胞爬片

取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。

(2)固定

细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入4％PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS，放4℃过夜。

(3)破膜封闭

将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，玻璃片封闭液配置：0.5％Trition X-100与PBS 1:1混合，再加10％血清，取50uL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。

(4)一抗孵育

一抗配制：抗体与PBS 1:100(200)稀释破膜封闭后，取50uL一抗于防水膜上(湿盒中)，将玻片(有细胞的一面)盖上置于4℃(最多可放置一周)

(5)二抗孵育

室温避光孵育二抗(二抗:PBS＝1:500)2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI(DAPI:PBS＝1:1000)5min，PBS洗3×5min/次。

(6)包埋

玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。鉴定细胞为客户寄来的细胞，消化下来部分细胞实验共分2组，分别为对照组及实验组对照组：PBS或BSA代替一抗，实验组：一抗为Desmin

2.2免疫荧光鉴定结果

对照组的免疫荧光图谱如图3所示，其中图左为100X-DAPI的免疫荧光图像，图右为100X-fluorescence的免疫荧光图谱。

试验组的免疫荧光图谱如图4所示，其中图左为100X-DAPI的免疫荧光图像，图右为100X-fluorescence的免疫荧光图谱。

如图3、4所示，以肝星状细胞标记蛋白中间丝蛋白(Desmin)进行免疫荧光细胞化学染色，以鉴定获得的细胞为肝星状细胞。Desmin是平滑肌细胞内特有的一种蛋白，也称为结蛋白，肝星状细胞具有肌成纤维细胞的特征，故Desmin稳定地存在于原代及传代的星状细胞中，即静止和活化的肝星状细胞均合成Desmin。免疫荧光显示，细胞的desmin染色呈阳性。

3.猪肝星状细胞的转染

3.1SV40LT过表达慢病毒基本信息

表3 SV40LT过表达慢病毒基本信息

3.2转染

(1)将猪肝星状细胞接种6孔板，每孔细胞数约为1×10⁵个，

(2)第二天，待细胞贴壁后，换液，

(3)加入1mL完全培养基，再加20μL SV40LT过表达慢病毒，

(4)混匀后继续培养，

(5)12h后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基，

(6)当细胞长满板底后，传代至T25培养瓶中。

转染后，细胞扩增3～4代后进行筛选。

4.猪肝星状细胞的筛选

4.1杀灭曲线的确定

(1)将未转染的猪肝星状细胞按每孔0.05million铺入24孔板，孵育过夜，

(2)第二天，除去24孔板中旧的培养基，

(3)将含不同浓度嘌呤霉素(1μg/mL，2μg/mL，3μg/mL，4μg/mL，5μg/mL，6μg/mL，7μg/mL)的新鲜培养基加入已铺有细胞的24孔板，

(4)每2天更换新鲜的筛选培养基，

(5)每天观察细胞的存活比例，

(6)最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1-4d内杀死所有细胞的最低筛选浓度。

结果：嘌呤霉素的使用浓度为3μg/mL，作用时间分别为3d。

4.2嘌呤霉素筛选转染细胞

(1)第一天，将转染的猪肝星状细胞按每孔0.05million铺入24孔板，孵育过夜

(2)第二天，除去24孔板中旧的培养基，

(3)加入含嘌呤霉素(3μg/mL)的完全培养基，孵育，

(4)每2天更换新鲜的筛选培养基，

(5)每天观察细胞的存活比例，

(6)在同一时间点(3d)存活的细胞，即为转染成功的猪肝星状细胞。

(7)对筛选后的细胞进行扩增。

筛选后得到的转染成功的第1代猪肝星状细胞(P1)，结果如图5所示，其中左图为100X物镜观察的图谱，右图为200X物镜观察的图谱。可以看出，转染SV40LT过表达慢病毒后的细胞贴壁，呈伸展状态生长，有伪足，细胞轮廓清晰，细胞膜完整。具有原代猪肝星状细胞类似的典型形态学特征。

5.猪肝星状细胞的扩增

将转染成功的第1代猪肝星状细胞传代至第10代(P10)，结果如图6所示，其中左图为100X物镜观察的图谱，右图为200X物镜观察的图谱。可以看出，细胞经10次传代后，细胞形态及特性与第1代细胞无明显差别。

实施例2：利用本发明的永生化猪肝星状细胞系建立内质网应激模型

按照如下方法进行：

用含体积浓度10％的胎牛血清、体积浓度1％的双抗(青霉素/链霉素，购买于赛百慷(上海)生物技术股份有限公司)和体积浓度1％的生长因子的ICELL星状细胞基础培养基(购买于赛百慷(上海)生物技术股份有限公司，产品编号：PriMed-iCELL-009)，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养实施例1构建的永生化猪肝星状细胞。在六孔板中按照15万个/孔接种所得永生化猪肝星状细胞，以衣霉素(tunicamycin)处理细胞，衣霉素浓度分别为1、2、5、10和15μg/mL，培养时间分别为2h、4h、8h、16h、24h和36h，每个处理做3个复孔。根据细胞的存活率、细胞周期和内质网应激标志蛋白的表达情况来选择合适的衣霉素浓度和处理时间。

采用MTT法检测细胞的存活率。结果如图7所示，衣霉素在培养8h后存活率会存在上升的拐点，而后又继续下降，直至24～36h后细胞存活率逐渐趋于稳定，维持在75％左右。通过观察不同浓度随时间变化的趋势，发现衣霉素在5μg/mL时变化幅度较大。因此通过细胞存活率确定衣霉素浓度5μg/mL，培养8h或24h后有可能出现内质网应激。

采用PI染色法测定细胞周期。结果如表4所示，5μg/mL衣霉素在培养8h内对细胞周期无影响，24h后G1显著升高(P<0.01)，而S、G2/M期显著下降(P<0.01)，该结果表明5μg/mL衣霉素培养24h后会在G1期造成细胞阻滞。

表4 5μg/mL衣霉素处理不同时间对细胞周期的影响

#：DMSO，衣霉素的溶解剂二甲基亚砜。

采用Westernblot测定细胞内质网应激标志蛋白的表达情况。结果如图8～9所示，5μg/mL衣霉素在培养8h内仅造成pIRE-1的蛋白表达显著上调(P＝0.02)，但GRP94、GRP78和ATF4均未发生显著变化。而5μg/mL衣霉素在培养24h后，会使GRP94(P＝0.04)、GRP78(P＝0.05)、ATF4(P<0.01)和pIRE-1(P＝0.02)的蛋白表达均显著上调。

实施例3：利用慢病毒介导的shRNA在永生化猪肝星状细胞中敲低GRP94表达

按照如下方法进行：

构建GRP94基因沉默慢病毒质粒载体，委托北京合生基因科技有限公司进行慢病毒包装。用GRP94-shRNA慢病毒转染实施例1构建的永生化猪肝星状细胞，在37℃、5％CO₂培养箱中培养72h，荧光显微镜下观察红色荧光的亮度。用实时荧光定量PCR技术检测细胞中GRP94的表达情况，用Westernblot技术检测细胞中GRP94蛋白的表达水平。

具体操作如下：

(1)GRP94-shRNA干扰慢病毒载体的构建、克隆和鉴定

根据shRNA设计的一般原则，筛选出3条针对猪GRP94基因的特异性沉默位点shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3；如表5所示。

将3条shRNA分别进行引物合成，并插入慢病毒表达骨架质粒中，完成慢病毒基因沉默质粒构建(如图10所示)。

表5针对猪GRP94基因设计的shRNA的序列

(2)GRP94-shRNA慢病毒载体的包装

委托北京合生基因科技有限公司进行慢病毒包装，得到滴度如下的慢病毒：shRNA-1：3.43E+08TU/mL；shRNA-2：2.53E+08TU/mL；shRNA-3：1.73E+08TU/mL；NC：6.65E+08TU/mL。

(3)GRP94-shRNA慢病毒转染永生化猪肝星状细胞

将永生化猪肝星状细胞用胰酶消化，铺到6孔板中，每孔15万个细胞。用无血清无双抗ICELL星状细胞基础培养基1:100稀释病毒，每孔加入10μL病毒。用含10％胎牛血清的ICELL星状细胞基础培养基在37℃培养箱中培养72h，荧光显微镜下观察感染效率，收集样品用于PCR和WB检测。

(4)Real-time PCR检测检测转染病毒后细胞中GRP94的mRNA表达水平

用Trizol法分别提取细胞总RNA，使用Nanodrop分光光度计对所提RNA定量。取1μgRNA经过Dnase I处理后，用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，稀释5倍后作为荧光定量PCR的模板进行Real-time PCR。内参基因β-actin和GRP94的引物序列见表6。结果采用2^－△△Ct的方法进行分析。

表6 Real-time PCR引物序列

如图11所示，试验组shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3中GRP94的表达量相比空白细胞和NC组均极显著降低(P<0.01)。其中shRNA-1的敲低效率为44％，shRNA-2的敲低效率为47％，shRNA-3的敲低效率为44％。

(5)Westernblot检测GRP94敲低的永生化猪肝星状细胞中GRP94蛋白的表达

将细胞铺进6孔板，汇合度达到90％以上时收集细胞，用RIPA裂解液裂解细胞，离心收集上清，用BCA方法检测蛋白浓度。加入loading buffer在99℃煮5～10min，取30μg跑SDS-PAGE，转膜后，用5％BSA封闭1h后，加入一抗(1：1000)孵育，4℃过夜。第二天，室温孵育辣根过氧化物酶标记的二抗(1：1000)1h，TBST洗膜(3×15min)，用碧云天的ECL Plus试剂遮光处理1～2min后放入Bio-Rad凝胶成像系统中进行拍照，图片用Image Lab软件进行分析。

如图12所示，试验组shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3中GRP94的表达量相比空白对照细胞和NC组均极显著降低(P<0.01)。其中shRNA-1的敲低效率为36％，shRNA-2的敲低效率为44％，shRNA-3的敲低效率为25％。

由以上实施例可知，本发明提供的方法成功构建得到了一种与原代猪肝星状细胞的细胞形态和特性相同的永生化猪肝星状细胞系，并能够用其进行模型构建、基因沉默等药物筛选过程中，并且遗传稳定，为星状细胞提供了更多的体外来源。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种构建永生化猪肝星状细胞系的方法、永生化猪肝星状细胞系和应用

<141> 2019-01-15

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2157

<212> DNA

<213> lentivirus

<400> 1

atggataaag ttttaaacag agaggaatct ttgcagctaa tggaccttct aggtcttgaa 60

aggagtgcct gggggaatat tcctctgatg agaaaggcat atttaaaaaa atgcaaggag 120

tttcatcctg ataaaggagg agatgaagaa aaaatgaaga aaatgaatac tctgtacaag 180

aaaatggaag atggagtaaa atatgctcat caacctgact ttggaggctt ctgggatgca 240

actgagattc caacctatgg aactgatgaa tgggagcagt ggtggaatgc ctttaatgag 300

gaaaacctgt tttgctcaga agaaatgcca tctagtgatg atgaggctac tgctgactct 360

caacattcta ctcctccaaa aaagaagaga aaggtagaag accccaagga ctttccttca 420

gaattgctaa gttttttgag tcatgctgtg tttagtaata gaactcttgc ttgctttgct 480

atttacacca caaaggaaaa agctgcactg ctatacaaga aaattatgga aaaatattct 540

gtaaccttta taagtaggca taacagttat aatcataaca tactgttttt tcttactcca 600

cacaggcata gagtgtctgc tattaataac tatgctcaaa aattgtgtac ctttagcttt 660

ttaatttgta aaggggttaa taaggaatat ttgatgtata gtgccttgac tagagatcca 720

ttttctgtta ttgaggaaag tttgccaggt gggttaaagg agcatgattt taatccagaa 780

gaagcagagg aaactaaaca agtgtcctgg aagcttgtaa cagagtatgc aatggaaaca 840

aaatgtgatg atgtgttgtt attgcttggg atgtacttgg aatttcagta cagttttgaa 900

atgtgtttaa aatgtattaa aaaagaacag cccagccact ataagtacca tgaaaagcat 960

tatgcaaatg ctgctatatt tgctgacagc aaaaaccaaa aaaccatatg ccaacaggct 1020

gttgatactg ttttagctaa aaagcgggtt gatagcctac aattaactag agaacaaatg 1080

ttaacaaaca gatttaatga tcttttggat aggatggata taatgtttgg ttctacaggc 1140

tctgctgaca tagaagaatg gatggctgga gttgcttggc tacactgttt gttgcccaaa 1200

atggattcag tggtgtatga ctttttaaaa tgcatggtgt acaacattcc taaaaaaaga 1260

tactggctgt ttaaaggacc aattgatagt ggtaaaacta cattagcagc tgctttgctt 1320

gaattatgtg gggggaaagc tttaaatgtt aatttgccct tggacaggct gaactttgag 1380

ctaggagtag ctattgacca gtttttagta gtttttgagg atgtaaaggg cactggaggg 1440

gagtccagag atttgccttc aggtcaggga attaataacc tggacaattt aagggattat 1500

ttggatggca gtgttaaggt aaacttagaa aagaaacacc taaataaaag aactcaaata 1560

tttccccctg gaatagtcac catgaatgag tacagtgtgc ctaaaacact gcaggccaga 1620

tttgtaaaac aaatagattt taggcccaaa gattatttaa agcattgcct ggaacgcagt 1680

gagtttttgt tagaaaagag aataattcaa agtggcattg ctttgcttct tatgttaatt 1740

tggtacagac ctgtggctga gtttgctcaa agtattcaga gcagaattgt ggagtggaaa 1800

gagagattgg acaaagagtt tagtttgtca gtgtatcaaa aaatgaagtt taatgtggct 1860

atgggaattg gagttttaga ttggctaaga aacagtgatg atgatgatga agacagccag 1920

gaaaatgctg ataaaaatga agatggtggg gagaagaaca tggaagactc agggcatgaa 1980

acaggcattg attcacagtc ccaaggctca tttcaggccc ctcagtcctc acagtctgtt 2040

catgatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc 2100

acacctcccc ctgaacctga aacagagcaa aagctcattt ctgaagagga cttgtaa 2157

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctggaaatg aggagttaac gcgaacgtta actcctcatt tccagc 46

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcagcaacat aaactcctta acgaattaag gagtttatgt tgctgc 46

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaaagaatt tggtaccaac acgaatgttg gtaccaaatt ctttcc 46

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgtagcatt tgctgcatga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcgtgtgtgt aactaggggt 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acactgcggt cagggtat 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttcttcgtcg tcgtcttg 18

Claims (10)

1.一种构建永生化猪肝星状细胞系的方法，包括以下步骤：

(1)将猪肝脏组织破碎后与质量浓度0.05～0.2％的Ⅳ型胶原酶溶液混合，35～38℃加热0.5～2h，得到酶解复合物；

(2)以180～240目筛网过滤所述酶解复合物，取滤液，得到全肝细胞悬液；

(3)将全肝细胞悬液进行第一离心，固液分离，得到第一上清液；所述第一离心的转速为300～600rpm；

(4)将所述第一上清液进行第二离心，固液分离，所得沉淀为猪肝星状细胞；所述第二离心的转速为1200～1800rpm；

(5)将所述猪肝星状细胞接种于容器的孔中，加入星状细胞完全培养基培养至贴壁后换液，依次加入新的星状细胞完全培养基和SV40LT过表达慢病毒进行转染；

所述SV40LT过表达慢病毒具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(6)将转染后的猪肝星状细胞传代3～4次后，筛选阳性克隆，得到永生化猪肝星状细胞系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述猪肝脏组织与Ⅳ型胶原酶溶液的体积比在1:3以上。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一离心和第二离心的离心时间独立的为8～15min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)得到猪肝星状细胞后，还包括扩增步骤：

将猪肝星状细胞以星状细胞完全培养基重悬，35～38℃培养50～80min，取培养后未贴壁的细胞转入新的星状细胞完全培养基中培养。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述猪肝星状细胞的接种量为0.5×10⁵～2×10⁵个/孔。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述星状细胞完全培养基的添加量为0.8～2ml/孔。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述SV40LT过表达慢病毒为pHY-SV40LT-Puro慢病毒。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述筛选阳性克隆时采用2.5～3.5μg/ml嘌呤霉素处理转染后的永生化猪肝星状细胞系，处理3d后存活的即为转染成功的永生化猪肝星状细胞系。

9.权利要求1～8任意一项所述方法构建的永生化猪肝星状细胞系。

10.权利要求9所述永生化猪肝星状细胞系在筛选药物中的应用。