CN101451124B - 人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备和储存应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人脐带间充质干细胞的分离纯化和培养方法及其创面涂抹剂的制备、储存、快速配制应用方法：(1)人脐带间充质干细胞的分离纯化和培养；(2)甲基纤维素复合培养基的制备；(3)人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备。(4)人脐带间充质干细胞生物学性质的检测。本发明用甲基纤维素作为基质，将人脐带间充质干细胞混入其中，产生一种人脐带间充质干细胞创面涂抹剂，可均匀涂布于皮肤创面而形成一种覆盖物。本发明进行了动物毒性试验、热原试验、过敏试验等临床前研究，建立了人脐带间充质干细胞冻存复苏方法和干细胞库，为较大规模生产制备人脐带间充质干细胞创面涂抹剂及其应用做好了准备。
Description
技术领域
本发明涉及烧伤药物，尤其是涉及一种人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备和储存应用方法。
背景技术
皮肤创伤、烧伤等皮肤损伤用传统的方法治疗还不是很理想。虽然近年来人工复合皮肤已被用来治疗皮肤损伤，但薄层全厚移植物是一种不完美的全厚皮肤替代物，存在下列问题：1.人工复合皮较厚，柔软性较差，不能完全贴紧皮肤凹凸不平的创面。在用其覆盖创面后，创面的分泌物可使复合皮隆起；2.目前使用的人工复合皮种子细胞一般是用自体或异体的表皮细胞，自体表皮细胞有时来源不足；而异体表皮细胞则涉及排异问题；3.由于人工复合皮含有活细胞，而活细胞在皮肤支架中又不易接触细胞冻存液，因而活细胞的冻存复苏有一定困难。如果临时制备则需要几周的时间，而皮肤损伤，必须在尽快的时间内使用复合皮；4.目前使用的复合皮不具有使创面新生皮形成血管的能力，因而复合皮易于坏死。因此，需要寻找治疗皮肤损伤所需的新种子细胞来源和新制备方法。
间充质干细胞已被证明是细胞治疗的有效种子细胞。首先报道的是来自骨髓的间充质干细胞，但是，作为临床应用，采集骨髓时手续较复杂，提供者较痛苦。此外，骨髓来源的间充质干细胞是随提供者年龄的增加，其数量会减少，分化能力也会降低。近年来，发现脐带血来源的间充质干细胞是骨髓来源的间充质干细胞的很好替代物，它不仅幼稚、生长能力强，而且由于胎儿的免疫功能发育不完全，脐带血来源的间充质干细胞免疫源性较低，异体排斥反应也较小。脐带血本是废弃物，其来源较多而且易得。脐带血来源的间充质干细胞可培养较长时间，可以分化为所有三个胚原基。在适当的诱导条件下，除可分化为骨、软骨和脂肪外，还可分化为神经胶质和肝细胞样细胞、骨骼肌细胞和多极神经元等各种细胞类型。文献报道人脐带血间充质干细胞在体外条件下可分化为上皮细胞，形成3-4层上皮。申请人的实验也证明，该类细胞具有向皮肤表皮和真皮分化的能力，并可形成微血管。但是脐带血在应用上的最大问题是有许多脐带血标本其单个核细胞不能形成间充质干细胞，因而其推广应用受到很大的限制。近年来发现大多数脐带的华顿氏胶能形成间充质干细胞，但目前所报道的分离纯化方法或分离步骤多而费时，或间充质干细胞纯化程度不高。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种新的人脐带间充质干细胞的分离纯化 和培养方法，该方法的特点是先用胶原酶和胰蛋白酶两种酶混合同时消化，并用摇床振荡，使消化时间大大缩短，获取细胞数量也较多；然后用网筛研磨脐带华顿氏胶组织小片，可加快并促进细胞分离。处理脐带时，去除脐带表面的羊膜上皮层，并抽去血管，避免了上皮细胞、血管内皮细胞和血管壁其它组织细胞混入。
本发明的第二个目的在于提供一种人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备方法，该方法的特点是将甲基纤维素复合培养基和人脐带间充质干细胞混合制备成一种创面涂抹剂。
本发明的第三个目的在于提供一种人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的储存方法，它是将人脐带间充质干细胞和甲基纤维素复合培养基分别储存，人脐带间充质干细胞采用液氮冻存，甲基纤维素复合培养基4℃保存，应用时混合配制，解决了含细胞的创面涂抹剂冻存复苏的困难，方法简便。
本发明的第四个目的在于提供一种人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的快速配制应用方法，它解决了快速提供创面涂抹剂的问题。
本发明的第一个目的是这样实现的：
一种人脐带间充质干细胞的分离纯化和培养方法：
a、经过家属同意，将正常足月分娩胎儿的脐带在5％洗必泰中浸泡10分钟，同时用洗必泰冲洗脐带中的血管，除去血管中的血液，用手术剪将脐带剪成3-4厘米长的小段，置于含5％洗必泰50ml离心管中浸泡5分钟，再用生理盐水浸泡漂洗3次，每次3分钟；
b、将每段脐带沿纵轴切开，剥去表面羊膜上皮层，暴露脐动脉和脐静脉，剥离并抽去脐动脉和脐静脉，留下的华顿氏胶(wharton’s jelly)组织再进行清洗；
c、将华顿氏胶组织切成小片，每两小段脐带的华顿氏胶组织片置入浓度为1mg/ml的胶原酶溶液和含胰蛋白酶2.5mg/ml-乙二胺四乙酸(EDTA)0.2mg/ml生理盐水的联合消化液15ml中，在37℃、转速为230转/分钟的摇床中振荡消化2小时；
d、取出振荡消化后的华顿氏胶组织片，置于下面连接有不锈钢杯的100目不锈钢网筛上研磨组织块并用生理盐水冲网筛；
e、收集不锈钢杯中的过滤细胞，用生理盐水稀释过滤细胞，然后再1500转/分钟离心10分钟，吸去上清，在50ml离心管中加入伊斯科夫改良刀比科氏培养基(Iscove’s modified Dulbecco’s medium；IMDM)，混匀过滤细胞，再1500转/分钟离心5分钟，并重复洗涤过滤细胞3次，得到单个分散的过滤细胞；
f、将浓度为1×104/ml的过滤细胞培养于含10％胎牛血清和10-6M氢化可的松的伊斯科夫改良刀比科氏培养基中，置入172cm2的培养瓶中，在37℃、5％CO2的培养箱中培养，7日后换液，以后每4日换液-次，得到原代的人脐带间充质干细胞；
间充质干细胞；
g、当培养细胞达80％融合时，用2.5mg/ml胰蛋白酶-0.2mg/ml乙二胺四乙酸(EDTA)进行消化，然后将1×104培养细胞置于预先在瓶底铺有L-多聚赖氨酸的培养瓶中进行传代培养，得到传代的人脐带间充质干细胞。
本发明的第二个目的是这样实现的：
人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备方法，
a、甲基纤维素复合培养基的制备：称取4000厘泊的甲基纤维素11g，将11g甲基纤维素放入500ml玻璃瓶中，再加入三蒸馏水250ml，煮沸溶解，每5分钟振荡一次，待三蒸馏水冷却至37℃时，加两倍强度(2x)的伊斯科夫改良刀比科氏培养基250ml，置于4℃冰箱中，每5分钟取出振荡一次，共5次；再在玻璃瓶中加入表皮生长因子10ng/ml、血管生长因子20ng/ml和庆大霉素50μg/ml，得到甲基纤维素复合培养基，置4℃冰箱12-18小时后，分装于100毫升的灭菌瓶中，4℃保存；需大规模配制时，则用大容器制备；
b、人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备：在每毫升甲基纤维素复合培养基中加入1×106细胞/ml人脐带间充质干细胞，即得人脐带间充质干细胞创面涂抹剂。
本发明的第三个目的是这样实现的：
人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的储存方法为：
a、人脐带间充质干细胞的储存：取10％二甲基亚砜和90％胎牛血清，将10％二甲基亚砜和90％胎牛血清混合在一起后得到冻存液，再将1×107/ml人脐带间充质干细胞加入到1ml冻存液中，放入冻存管，先置4℃冰箱4小时，再放入-80℃超低温冰箱12-18小时后，放入配有液氮罐的已建立的人脐带间充质干细胞库中；在大规模储存时，将人脐带间充质干细胞置入冷冻袋，放进储存盒液氮保存；在人脐带间充质干细胞库中配有优良制造标准(goodmanufacturing practice；GMP)的细胞培养室、大型液氮冻存装置、微生物检测设备和间充质干细胞生物学特性检测设备。
b、甲基纤维素复合培养基的储存：将分装于100毫升灭菌瓶中的甲基纤维素复合培养基置于4℃保存。
本发明的第四个目的是这样实现的：
人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的快速配制应用方法为：
在用户需求时，在人脐带间充质干细胞库中冻存的人脐带间充质干细胞采用快速复苏方法：取出冻存管或冷冻袋后立即浸入40℃水浴箱振荡，当冰块溶解后，立即加入含2％胎牛血清的伊斯科夫改良刀比科氏培养基的离心管，1500转/分钟离心5分钟，反复3-4次，计数细胞，经微生物检测和细胞存活率检测合格后，立即与甲基纤维素复合培养基混合，灌装无菌塑料瓶，用冷冻保藏箱快递给用户。
人脐带间充质干细胞生物学性质和创面涂抹剂应用效果的检测方法为：
1.人脐带间充质干细胞生物学性质的检测方法：
a、流式细胞仪细胞表型检测：传代2次的人脐带间充质干细胞用异硫氰荧光素标记的CD105，CD54，CD29，CK10以及荧光藻红素标记的CD45，CD166，CD34和CD13单克隆抗体用流式细胞仪分析细胞表型；
b、体外多向分化实验：用2.0×10-4M抗坏血酸、1ng/ml人重组转化生长因子-β1诱导人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化，免疫组化检测II型胶原；用2.0×10-4M抗坏血酸、7×10-3M β-磷酸甘油、1.0×10-6M地塞米松诱导人脐带间充质干细胞向成骨细胞分化，用碱性磷酸酶和冯库萨(von Kossa)染色鉴定；
c、体内移植实验：在30只裸鼠背部手术切除1.5cm×1.5cm全层皮肤创面，随机分为3组，每组6只：一组涂抹人脐带间充质干细胞创面涂抹剂；一组仅用甲基纤维素复合培养基；一组仅用生理盐水；
2、创面涂抹剂应用效果的检测方法：在0，7，14，21，28天，每组分别处死1只，取创口组织，福尔马林固定，石腊包埋切片进行苏木素伊红染色、免疫组化和免疫荧光测定，进行创口组织组织学检查：
a、创口愈合时间、瘢痕形成和皮肤柔韧度；
b、受体创口组织中供者细胞的检测：
①绿色荧光蛋白的测定：为了研究人脐带间充质干细胞是否参与创面修复，用增强型绿色荧光蛋白-N2(pEGFP-N2)质粒转染人脐带间充质干细胞，2周后受者小鼠创口新生组织用4％多聚甲醛固定30分钟，用冰冻切片包埋剂包埋，-20℃恒冷箱切片机切片，用荧光显微镜检查人脐带间充质干细胞中绿色荧光蛋白的表达；
②细胞角蛋白、第VIII因子和胶原蛋白表达的检测：为了研究人脐带间充质干细胞是否在受者体内分化为上皮细胞、血管内皮细胞并形成胶原，受体小鼠新生皮切片分别与兔抗人细胞角蛋白(pan-CK)、第VIII因子(vWF)和兔抗人I型胶原多克隆抗体共同孵育，而后用荧光藻红素标记的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)孵育，在0，7，14，21，28天用荧光倒置显微镜检查；
结果发现：
1、传代2次的人脐带间充质干细胞用流式细胞术检测CD166，CD54，CD105，CD29，CD13，CK10表达均为阳性；而CD45和CD34则为阴性；
2、人脐带间充质干细胞可分化为成骨细胞和软骨细胞；
3、甲基纤维素可很好地贴附于创面组织，并参与皮肤表皮和真皮的修复：
(1)、在使用含人脐带间充质干细胞创面涂抹剂后14天，创口愈合，柔韧性较好；而对照组的创口则要21天才能愈合，且有较广泛的瘢痕收缩；
(2)、在使用含人脐带间充质干细胞创面涂抹剂后7天，创口组织苏木素伊红染色可见4-6层新生表皮，21天后达8-10层；真皮中胶原排列规则；而对照组创口要21天才再上皮化；
(3)、在使用含人脐带间充质干细胞创面涂抹剂后14天，发现在受者创口组织中有增强型绿色荧光蛋白质粒转染的供者细胞存在，而对照组则为阴性； 证明供者细胞已生长在受者创口组织中；
(4)、在使用含人脐带间充质干细胞创面涂抹剂后14天，发现在受者创口组织中有第VIII因子表达细胞；同时，I型胶原蛋白表达在真皮中明显增高，而细胞角蛋白表达在表皮中增高，证明供者细胞可分化为皮肤上皮并分泌胶原蛋白并参与血管形成。
本发明的人脐带间充质干细胞创面涂抹剂相关临床前研究如下：
1.急性毒性试验：实验组用10只Balb/C小鼠，在每只小鼠的尾静脉注射人脐带间充质干细胞1×109细胞/kg体重，观察3天，无一例死亡或出现中毒表现；
2.过敏试验：18-22g雌小白鼠6只，分成两组：皮下注射人脐带间充质干细胞，浓度为1×106/ml，注射0.1-0.25ml；2周后从尾静脉注射同样剂量，30分钟内观察小白鼠的反应。结果未见异常反应。
3.热原检查：新西兰大白兔3只，测定正常体温后，在15分钟内由耳静脉注入浓度为1×106/ml的从培养箱刚取出的人脐带间充质干细胞，每隔1小时测体温1次，共测3次。结果符合热原检查的规定。
本发明的基本特点是：1.用人脐带间充质干细胞。2.由于间充质干细胞本身抗原性较弱并有免疫抑制作用，在组织和器官移植时可抑制移植物抗宿主病(graft versus host disease；GVHD)，并可用来预防GVHD，因此植入组织中被排斥的机会较小。3.用一种甲基纤维素作为基质，将人脐带间充质干细胞混入其中，产生含间充质干细胞、细胞培养基、表皮生长因子、血管生长因子和庆大霉素的膏状物，可均匀涂布于皮肤创面而形成一种覆盖物。间充质干细胞具有向损伤组织迁移和聚集的特性，其中的间充质干细胞在创面组织中受到局部环境中多种因素的刺激，可诱导形成新生的表皮和真皮，并促进创面边缘的自身皮向创面内生长。因此，本发明解决了人工复合皮冻存复苏和种子细胞来源困难的问题，动物实验对皮肤损伤创面有明显促进愈合的作用，并具有方法简便易行和效果显著的优点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
一、一种人脐带间充质干细胞的分离纯化和培养方法：
a、经过家属同意，将正常足月分娩胎儿的脐带在5％洗必泰中浸泡10分钟，同时用洗必泰冲洗脐带中的血管，除去血管中的血液，用手术剪将脐带剪成3-4厘米长的小段，置于含5％洗必泰50ml离心管中浸泡5分钟，再用生理盐水浸泡漂洗3次，每次3分钟；
b、将每段脐带沿纵轴切开，剥去表面羊膜上皮层，暴露脐动脉和脐静脉，剥离并抽去脐动脉和脐静脉，留下的华顿氏胶(wharton’s jelly)组织再进行清洗；
c、将华顿氏胶组织切成小片，每两小段脐带的华顿氏胶组织片置入浓度为1mg/ml的胶原酶溶液和含胰蛋白酶2.5mg/ml-乙二胺四乙酸(EDTA)0.2 mg/ml生理盐水的联合消化液15ml中，在37℃、转速为230转/分钟的摇床中振荡消化2小时；
d、取出振荡消化后的华顿氏胶组织片，置于下面连接有不锈钢杯的100目不锈钢网筛上研磨组织块并用生理盐水冲网筛；
e、收集不锈钢杯中的过滤细胞，用生理盐水稀释过滤细胞，然后再1500转/分钟离心10分钟，吸去上清，在50ml离心管中加入伊斯科夫改良刀比科氏培养基(Iscove’s modified Dulbecco’s medium；IMDM)，混匀过滤细胞，再1500转/分钟离心5分钟，并重复洗涤过滤细胞3次，得到单个分散的过滤细胞；
f、将浓度为1×104/ml的过滤细胞培养于含10％胎牛血清和10-6M氢化可的松的伊斯科夫改良刀比科氏培养基中，置入172cm2的培养瓶中，在37℃、5％CO2的培养箱中培养，7日后换液，以后每4日换液-次，得到原代的人脐带间充质干细胞；
g、当培养细胞达80％融合时，用2.5mg/ml胰蛋白酶-0.2mg/ml乙二胺四乙酸(EDTA)进行消化，然后将1×104培养细胞置于预先在瓶底铺有L-多聚赖氨酸的培养瓶中进行传代培养，得到传代的人脐带间充质干细胞。
二、人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备方法，
a、甲基纤维素复合培养基的制备：称取4000厘泊的甲基纤维素11g，将11g甲基纤维素放入500ml玻璃瓶中，再加入三蒸馏水250ml，煮沸溶解，每5分钟振荡一次，待三蒸馏水冷却至37℃时，加两倍强度(2x)的伊斯科夫改良刀比科氏培养基250ml，置于4℃冰箱中，每5分钟取出振荡一次，共5次；再在玻璃瓶中加入表皮生长因子10ng/ml、血管生长因子20ng/ml和庆大霉素50μg/ml，得到甲基纤维素复合培养基，置4℃冰箱12-18小时后分装于100毫升的灭菌瓶中，4℃保存；需大规模配制时，则用大容器制备；
b、人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备：在每毫升甲基纤维素复合培养基中加入1×106细胞/ml人脐带间充质干细胞，即得人脐带间充质干细胞创面涂抹剂。
三、人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的储存方法为：
a、人脐带间充质干细胞的储存：取10％二甲基亚砜和90％胎牛血清，将10％二甲基亚砜和90％胎牛血清混合在一起后得到冻存液，再将1×107/ml人脐带间充质干细胞加入到1ml冻存液中，放入冻存管，先置4℃冰箱4小时，再放入-80℃超低温冰箱，12-18小时后放入配有液氮罐的已建立的人脐带间充质干细胞库中；在大规模储存时，将人脐带间充质干细胞置入冷冻袋，放进储存盒液氮保存；在人脐带间充质干细胞库中配有优良制造标准(goodmanufacturing practice；GMP)的细胞培养室、大型液氮冻存装置、微生物检测设备和间充质干细胞生物学特性检测设备。
b、甲基纤维素复合培养基的储存：将分装于100毫升灭菌瓶中的甲基纤维素复合培养基置于4℃保存。
四、人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的快速配制应用方法为：
在用户需求时，在人脐带间充质干细胞库中冻存的人脐带间充质干细胞采用快速复苏方法：取出冻存管或冷冻袋后立即浸入40℃水浴箱振荡，当冰块溶解后，立即加入含2％胎牛血清的伊斯科夫改良刀比科氏培养基的离心管，1500转/分钟离心5分钟，反复3-4次，计数细胞，经微生物检测和细胞存活率检测合格后，立即与甲基纤维素复合培养基混合，灌装无菌塑料瓶，用冷冻保藏箱快递给用户。
Claims (2)
1.一种人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备方法，其特征在于：
a.甲基纤维素复合培养基的制备：称取4000厘泊的甲基纤维素11g，将11g甲基纤维素放入500ml玻璃瓶中，再加入三蒸馏水250ml，煮沸溶解，每5分钟振荡一次，待三蒸水冷却至37℃时，加两倍强度的伊斯科夫改良刀比科氏培养基250ml，置于4℃冰箱中，每5分钟取出振荡一次，共5次；再在培养瓶中加表皮生长因子10ng/ml，血管生长因子20ng/ml和庆大霉素50ug/ml，得到甲基纤维素复合培养基，置4℃冰箱中12-18小时后分装于100ml的灭菌瓶中，4℃保存；需大规模配置时，则用大容器制备；
b.人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备：在每毫升甲基纤维素复合培养基中加入1x106细胞/ml人脐带间充质干细胞，即得人脐带间充质干细胞创面涂抹剂。
2.一种人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的储存方法，其特征在于：
a.人脐带间充质干细胞的储存：取10％二甲基亚砜和90％胎牛血清，将10％二甲基亚砜和90％胎牛血清混合在一起后得到冻存液，再将1x107/ml人脐带间充质干细胞加入到1ml冻存液中，放入冻存管，先置4℃冰箱4小时，再放入-80℃超低温冰箱，12-18小时后放入配有液氮罐的已建立的人脐带间充质干细胞库中；在大规模储存时，将人脐带间充质干细胞置入冷冻袋，放入储存盒液氮保存；在人脐带间充质干细胞库中配有优良制造标准的细胞培养室、大型液氮冻存装置、微生物检测设备和间充质干细胞生物学特性检测设备；
b.甲基纤维素复合培养基的储存：将分装于100ml灭菌瓶中的甲基纤维素复合培养基置于4℃保存。
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Assignee: Eastern Union Stem Cell & Gene Engineering Co., Ltd. Assignor: Dai Yucheng Contract record no.: 2012990000128 Denomination of invention: Preparation of human umbilical cord mesenchymal stem cells wound surface smearing agent and storage application method Granted publication date: 20110406 License type: Exclusive License Open date: 20090610 Record date: 20120323 |
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