CN110051694B - 一种尿源干细胞制剂、其制备及其在制备抗器官移植后急性免疫排斥药物的应用 - Google Patents

一种尿源干细胞制剂、其制备及其在制备抗器官移植后急性免疫排斥药物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种尿源干细胞制剂及其制备方法，以及该制剂在制备抗器官移植后免疫排斥反应药物的应用。本发明选取健康志愿者清洁中段尿；使用培养基进行分离培养及体外扩增，检测其体外增殖能力；利用流式细胞术检测表面分子标志的表达水平，免疫印迹法检测肾脏相关蛋白的表达水平。取处于对数生长期的经过鉴定符合要求的且汇合度达到80％的第三‑六代尿源干细胞；经进一步消化离心及生理盐水重悬，制成尿源干细胞制剂。本发明具有来源广泛，获取成本低且分离效率高的优点。本发明可显著延长肾移植后大鼠生存期，降低尿素氮及肌酐水平，减少T细胞在肾组织的浸润；同时，可明显延长小鼠心脏移植中移植物搏动时间。

Description

一种尿源干细胞制剂、其制备及其在制备抗器官移植后急性 免疫排斥药物的应用
【技术领域】
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及尿源干细胞制剂及其制备方法，以及该制剂作为抗器官移植后免疫排斥药物的应用，尤其是在制备抗肾移植及心脏移植后免疫排斥药物的应用。
【背景技术】
如何减少免疫排斥导致的移植物功能丧失，是保证器官移植临床效果的关键。虽然随着新型免疫抑制剂的开发使用，患者的免疫系统被抑制，排斥水平大大降低，但是由于免疫抑制药物本身具有肝肾毒性，副作用大，导致患者依从性不良；且由于免疫系统被抑制，容易导致感染，肿瘤等事件发生[1]。因此，新的调节患者免疫系统，抑制免疫排斥的方法亟待出现。
近年来治疗性细胞参与免疫系统调节逐渐成为研究热点，其中间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSCs)的研究最为广泛[2]。然而间充质干细胞多来自志愿者捐献的骨髓等组织，获取过程可诱发出血、感染等，增加供者痛苦；同时MSCs体外的增殖能力有限，一定程度上制约了临床应用。
尿源干细胞(Urine derived stem cell，USCs)是指一类从尿液中分离的具有间充质干细胞特性(自我更新及多向分化潜能，免疫调节等)的细胞[3]。尿源干细胞具有与间充质干细胞相类似的免疫调节功能；可参与输尿管、膀胱重塑，压力性尿失禁的神经肌肉修复；向泌尿系统细胞分化的能力高于骨髓来源的间充质干细胞，具有更强的肾脏亲和力。尿源干细胞是泌尿系统来源，从废弃的尿液中分离，无伦理争议，在体内不形成畸胎瘤，安全可靠，具有一定体外扩增能力，可获得足够数量的细胞；且获取方式便捷无创[4-8]。因此，尿源干细胞在临床疾病治疗中具有巨大潜能。
然而，关于尿源干细胞是否具有参与器官移植术后急性免疫排斥调节的能力尚未可知，且尿源干细胞的获取方法不一，鉴定方案不够全面，难以标准化，在一定程度上限制了其应用。
参考文献：
[1]Marquet,P.,N.Djebli,and N.Picard,Pharmacogenetics andimmunosuppressor drugs:impact and clinical interest in transplantation.AnnPharm Fr,2007.65(6):p.382-9.
[2]Morath,C.,A.Schmitt,M.Zeier,M.Schmitt,F.Sandra-Petrescu,G.Opelz,etal.,Cell therapy for immunosuppression after kidneytransplantation.Langenbecks Arch Surg,2015.400(5):p.541-50.
[3]Chen,L.,L.Li,F.Xing,J.Peng,K.Peng,Y.Wang,et al.,Human Urine-Derived Stem Cells:Potential for Cell-Based Therapy of Cartilage Defects.StemCells Int,2018.2018:p.4686259.
[4]Lang,R.,G.Liu,Y.Shi,S.Bharadwaj,X.Leng,X.Zhou,et al.,Self-renewaland differentiation capacity of urine-derived stem cells after urinepreservation for 24hours.PLoS One,2013.8(1):p.e53980.
[5]Liu,G.,X.Wang,X.Sun,C.Deng,A.Atala,and Y.Zhang,The effect ofurine-derived stem cells expressing VEGF loaded in collagen hydrogels onmyogenesis and innervation following after subcutaneous implantation in nudemice.Biomaterials,2013.34(34):p.8617-8629.
[6]Liu,G.,X.Wang,X.Sun,C.Deng,A.Atala,and Y.Zhang,The effect ofurine-derived stem cells expressing VEGF loaded in collagen hydrogels onmyogenesis and innervation following after subcutaneous implantation in nudemice.Biomaterials,2013.34(34):p.8617-8629.
[7]Pavathuparambil Abdul Manaph,N.,M.Al-Hawwas,L.Bobrovskaya,P.T.Coates,and X.F.Zhou,Urine-derived cells for human cell therapy.Stem CellRes Ther,2018.9(1):p.189.
[8]Zhang,D.,G.Wei,P.Li,X.Zhou,and Y.Zhang,Urine-derived stem cells:Anovel and versatile progenitor source for cell-based therapy and regenerativemedicine.Genes&Diseases,2014.1(1):p.8-17.
【发明内容】
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种可以调节器官移植术后急性免疫排斥的标准化尿源干细胞，其培养条件、制备方法，及其在制备抗器官移植后急性免疫排斥药物的应用。
本发明提供一种标准化的人尿源干细胞制剂(组合物)，用以治疗器官移植后免疫排斥。所述的尿源干细胞制剂由包含离体的人尿源干细胞和生理盐水组成的所述干细胞组合物。
本发明使用特定尿源干细胞培养基培养人尿源干细胞，可保证尿源干细胞稳定增殖；本发明可通过静脉注射发挥抗器官移植术后免疫排斥的作用，给药途径可操作性强，干细胞可以通过血液循环到达移植物局部或分泌相应调节因子，减轻移植物局部的免疫排斥损伤。
优选地，所述的尿源干细胞制剂，配置成的体积为1ml的干细胞悬液，每份所述干细胞悬液中含有的人尿源干细胞的数量为2×106个。
优选地，所述的的尿源干细胞制剂，取处于对数生长期的经过流式细胞术、免疫印迹鉴定及增殖能力检测的符合要求的尿源干细胞，鉴定及采集时其汇合度达到80％。
本发明还涉及一种抗器官移植后免疫排斥治疗药物，所属药物包含离体的人尿源干细胞。
优选地，所属药物还包括药物载体，所述药物载体为本领域技术人员熟知的载体。
本发明的另一目的在于提供所述尿源干细胞的制备方法。
为实现上述目的，本发明提供以下技术方案为:
本发明的尿源干细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：
1、所述尿源干细胞制剂的获取：
1.1尿源干细胞的分离方法如下:
留取健康个体的清洁中段尿，离心，弃上清；使用含有10％的青链霉素混合液的磷酸盐缓冲液重悬，再次离心，弃上清；使用尿源干细胞培养基，重悬；将上述细胞悬液接种于明胶溶液包被处理的培养皿中，置于37℃，5％CO2的培养箱内静置；视细胞贴壁状况，用磷酸盐缓冲液轻柔吹洗，更换新鲜培养基；视细胞生长状况，使用0.25％EDTA胰酶消化传代，扩增至所需的细胞数量；
1.2分离后的检测方法：
分离原代细胞后，进行传代；选取第二或三代尿源干细胞进行鉴定检测；
1.2.1流式细胞术检测表面分子表达水平：
利用流式细胞术进行五个干细胞相关分子标志CD29,CD73,CD44,CD90,CD146、两个造血干细胞相关分子标志CD31,CD45、及免疫原性HLA-DR检测；
1.2.2免疫印迹法检测肾脏相关蛋白WT1,Nephrin表达水平；
1.2.3细胞生长曲线绘制；
1.3检测后制备干细胞制剂的方法:
取对数生长期的经过鉴定符合要求的第三至六代尿源干细胞，保证其汇合度达到80％；DMEM/F12基础培养基清洗后，使用0.25％EDTA胰酶消化；加入等体积含有10％血清的基础培养基终止消化；将细胞悬液离心，弃上清，进行细胞计数；使用注射用生理盐水重悬细胞，并调整细胞浓度至2*106个/ml。
优选的，所述的尿源干细胞制剂的制备方法具体为：
1、所述尿源干细胞制剂的获取：
1.1尿源干细胞的分离方法如下:
1)留取健康志愿者清洁中段尿150-200ml；
2)将尿液分装到50ml离心管，400g离心10min；
3)用吸引器缓慢吸去上清，剩余约3-5mL尿液；
4)加入25ml含有青链霉素混合液的磷酸盐缓冲液(PBS)，轻轻吹打混匀，再次离心；
5)用吸引器缓慢吸去上清至剩余液体少于1mL；
6)加入1mL特定尿源干细胞培养基，重悬剩余沉淀，轻柔吹打若干次；
7)将上述细胞悬液均匀接种于已用0.1％明胶溶液(Gelatin)包被处理的24孔板中,补足尿源干细胞培养基；
8)将培养皿置于37℃，5％CO2的培养箱内静置培养3天；
9)避光观察是否有细胞贴壁，补加少量培养基，继续静置于37℃，5％CO2培养箱；
10)在接种后的5-7天，视细胞贴壁状况，用磷酸盐缓冲液(PBS)轻柔吹洗一遍后更换新鲜培养基，以保证收集到的尿液来源细胞的均一性，选取形成单克隆的孔进行实验，单孔中含有两个及以上的细胞克隆时，则弃去该孔；
11)视细胞生长状况更换或添加培养基；若细胞形成较大克隆，可用0.25％EDTA胰酶消化分盘，传代扩增于12孔板，后转移至6孔板；
12)传代后，若细胞达到80-90％的汇合度，处于对数生长期时按照克隆名称进行冻存；
13)冻存细胞前，留取培养过夜的废旧培养基1mL检测支原体；支原体检测结果为阴性时方可将冻存的细胞转移至液氮罐保存；一定要确保没有细菌,真菌或支原体污染。
1.2尿源干细胞的特定培养基配置如下：
REGM培养基原液(CC-4127,Lonza)、DMEM-high Glucose培养基(hyclone,SH30022.01)、非必需氨基酸添加剂(NEAA,11140050,Gibco)、GlutaMAX添加剂(Gibco,35050061)及胎牛血清(FBS,Gibco,12664025)按照特定比例配置(具体比例见实施例1.2)。
1.3分离后检测方法如下：
分离原代尿源干细胞后，进行第二次传代；一般选取第二或三代尿源干细胞进行鉴定检测；
1.3.1流式细胞术检测表面分子表达水平
1)收取处于对数生长期的尿源干细胞，200g离心5min，去除上清；利用流式细胞仪进行八个分子标志(CD29,CD73,CD44,CD90,CD146,CD31,CD45,HLA-DR)的检测；
2)每个分子标志分两管细胞，一管做同型对照，一管检测样品，调整细胞数量至每管约106个细胞；
3)用PBS洗细胞一遍，离心去除上清，用100ul含0.5％BSA的PBS溶液重悬细胞，并按照不同直标抗体说明添加对应量的抗体，4℃孵育25min；
4)用PBS洗细胞两遍后，操作过程注意避光，上机检测不同分子表达水平。
1.3.2 Western Blot(免疫印迹法)检测肾脏相关蛋白(WT1,Nephrin)表达水平
1)收集蛋白样品
准备处于对数生长期的尿源干细胞107个，使用RIPA裂解液(细胞组织裂解液)裂解细胞，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白样品的蛋白浓度；加入适量浓缩的聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
2)配制SDS-PAGE凝胶、上样、电泳
配制SDS-PAGE凝胶。蛋白样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内，加样，在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。
3)转膜
使用Bio-Rad公司的标准湿式转膜装置及聚偏氟乙烯(PVDF)膜；
可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。转膜槽需要放置在冰浴中进行转膜。
4)封闭
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。配制5％脱脂牛奶溶液，将膜浸没在脱脂牛奶中，摇床缓慢摇动，室温封闭60分钟。
5)一抗孵育
参考对应检测蛋白的抗体说明书，按照适当比例的一抗稀释液稀释抗体(具体比例见实施例1.3.2)；吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。加入1*含吐温的Tris缓冲液(TBST溶液)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。
6)二抗孵育
参考检测蛋白的抗体对应的二抗说明书，按照适当比例二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(具体比例见实施例1.3.2)。吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。加入洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7)压片，检测蛋白
使用化学底物发光(ECL)类试剂盒检测蛋白。
1.3.3细胞生长曲线绘制
1)取生长状态良好的尿源干细胞，用0.25％EDTA胰酶消化为单细胞悬液；
2)200g离心5min，弃上清，加入适量新鲜培养基重悬；
3)按照一定倍数稀释该单细胞悬液；
4)准备血球计数板，洗净晾干；
5)吸取细胞悬液适量，加样到血球计数板，镜下计数；
6)计算细胞总数，调整细胞浓度到106/ml；
7)准备12孔板，每孔加入约10万个细胞(约0.1ml)和0.9ml的新鲜培养基，轻轻晃动摇匀；
8)培养24h后，每隔24h收样，每次3个孔，胰酶消化重悬，进行细胞计数；
9)计数结果整理，以时间为横坐标，细胞数为纵坐标绘制生长曲线。
1.4分离后制备细胞制剂方法如下:
1)取对数生长期的经过鉴定符合要求的尿源干细胞，保证其汇合度达到80％；
2)用DMEM/F12基础培养基轻轻洗一遍细胞，以去除死细胞；
3)用0.25％EDTA胰酶在37℃消化约3-5min；
4)加入等体积含有10％血清的基础培养基终止消化，轻轻吹打细胞，使其从皿底脱落；
5)将细胞悬液转移至离心管，离心；
6)弃上清，进行细胞计数；
7)使用注射用生理盐水重悬细胞，并调整细胞浓度；
8)将细胞悬液转移到无菌EP管中，供通过静脉给药方式治疗。
所述的尿源干细胞制剂的制备方法，制备的干细胞制剂进一步液氮冻存，其步骤为：
待上述尿源干细胞汇合度达到80％时，DMEM/F12基础培养基清洗；使用0.25％EDTA胰酶消化；加入等体积含有10％血清的基础培养基终止消化；将细胞悬液离心；弃上清，进行细胞计数；加入适量冻存液重悬，调整细胞悬液浓度为2*106个/ml，吹打混匀；利用程序降温盒进行梯度降温，次日将细胞转移至液氮罐保存。
优选地，具体的分离后细胞制剂冻存方法为：
1)待细胞汇合度达到80％时，先用DMEM/F12基础培养基轻轻洗一遍细胞，以去除死细胞；
2)用0.25％EDTA胰酶在37℃消化约3-5min；
3)加入等体积含有10％血清的基础培养基终止消化，轻轻吹打细胞，使其从皿底脱落；
4)将细胞悬液转移至离心管，离心；
5)弃上清，进行细胞计数；
6)加入一定量冻存液重悬细胞，调整细胞悬液浓度，轻柔吹打混匀后，转移到冻存管。放到装有常温异丙醇的程序降温盒中，并放置到-80℃超低温冰箱；
7)待次日将细胞转移至液氮罐保存。
本发明创造与现有技术相比，所具有的有益效果；
初步实验显示，本发明采用特定条件培养的尿源干细胞作为制备改善器官移植后免疫排斥的药物，具有来源广泛，获取成本低且分离效率高的优点。通过静脉给药方式将尿源干细胞制剂移植至肾移植后大鼠体内，可显著延长大鼠生存期，降低尿素氮及肌酐水平，减少T细胞在肾组织的浸润。通过静脉给药方式将尿源干细胞制剂移植至心脏移植后小鼠体内，可显著延长小鼠心脏的搏动时间。显示本发明十分具有应用价值。
【附图说明】
图1为本发明实施例中尿源干细胞分离的流程图；
图2为本发明实施例中两株尿源干细胞(USC-1、2)的表面分子标志的流式检测结果；
图3为本发明实施例中两株尿源干细胞(USC-1、2)第三代的肾脏蛋白标志物的免疫印迹检测结果；
图4为本发明实施例中尿源干细胞不同代数(P3、6)的细胞增殖曲线检测结果；
图5为本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组的肾移植大鼠生存期比较结果；
图6为本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组的肾移植大鼠术后BUN、sCr水平比较结果；
图7为本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组的肾移植大鼠术后第七天病理染色及评分比较结果；
图8为本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组的肾移植大鼠术后肾组织的CD3+T细胞浸润水平及颗粒酶B水平的比较结果；
图9为本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组的心脏移植小鼠的心脏搏动时间对比结果。
【具体实施方式】
为了更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1尿源干细胞制剂的制备及检测
1、所述尿源干细胞制剂的获取：
1.1尿源干细胞的分离方法如下:
1)留取健康志愿者清洁中段尿150-200mL；
2)将尿液分装到50mL离心管，400g离心10min；
3)用吸引器缓慢吸去上清，剩余约3-5mL尿液；
4)加入含有青链霉素混合液的磷酸盐缓冲液(PBS)，约20-30mL，轻轻吹打混匀，再次400g离心10min；
5)用吸引器缓慢吸去上清至剩余液体少于1mL；
6)加入1mL特定尿源干细胞培养基，重悬剩余沉淀，轻柔吹打若干次；
7)将上述细胞悬液均匀接种于已用0.1％明胶溶液(Gelatin)包被处理的24孔板中,补足尿源干细胞培养基；
8)将培养皿置于37℃，5％CO2的培养箱内静置培养3天；
9)避光观察是否有细胞贴壁，补加少量培养基，继续静置于37℃，5％CO2培养箱；
10)在接种后的5-7天，视细胞贴壁状况，用磷酸盐缓冲液(PBS)轻柔吹洗一遍后更换新鲜培养基，以保证收集到的尿液来源细胞的均一性，选取形成单克隆的孔进行实验，单孔中含有两个及以上的细胞克隆时，则弃去该孔；
11)视细胞生长状况更换或添加培养基；若细胞形成较大克隆，可用0.25％EDTA胰酶消化分盘，传代扩增于12孔板，后转移至6孔板；
12)传代后，若细胞达到80-90％的汇合度，处于对数生长期时按照克隆名称进行冻存；
13)冻存细胞前，留取培养过夜的废旧培养基1mL检测支原体；支原体检测结果为阴性时方可将冻存的细胞转移至液氮罐保存；一定要确保没有细菌,真菌或支原体污染。
1.2尿源干细胞的特定培养基配置如下：
REGM培养基原液(CC-4127,Lonza)、DMEM-high Glucose培养基(hyclone,SH30022.01)、非必需氨基酸添加剂(NEAA,11140050,Gibco)、GlutaMAX添加剂(Gibco,35050061)及胎牛血清(FBS,Gibco,12664025)按照特定比例配置。其中包括A液:REGM培养基原液；B液：90％DMEM-high Glucose基础培养基+10％胎牛血清+1：100比例添加的非必需氨基酸添加剂+1：100比例添加的GlutaMAX添加剂；将A液和B液以一比一的比例混合均匀，即为尿源干细胞的特定培养基，以上比例均为体积比。
1.3分离后检测方法如下：
分离第一代尿源干细胞后，进行第二次传代；一般选取第二或三代尿源干细胞进行鉴定检测；
1.3.1流式细胞术检测表面分子表达水平
1)收取处于对数生长期的尿源干细胞，200g离心5min，去除上清；利用流式细胞仪进行八个分子标志(CD29,CD73,CD44,CD90,CD146,CD31,CD45,HLA-DR)的检测；
2)每个分子标志分两管细胞，一管做同型对照，一管检测样品，调整细胞数量至每管106个细胞；
3)用PBS洗细胞一遍，离心去除上清，用100ul含0.5％BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液重悬细胞，并按照不同直标抗体说明添加对应量的抗体，4℃孵育25min；
4)用PBS洗细胞两遍后，操作过程注意避光，上机检测不同分子表达水平。
图2为本发明实施例中尿源干细胞的表面分子标志的流式检测结果；其中尿源干细胞高表达CD29,CD73,CD44,CD90,CD146等干性相关分子标志；而低表达CD31,CD45等造血干细胞相关分子标志，低表达HLA-DR则表明尿源干细胞免疫原性较弱，不易引起免疫反应。
表1、2、3为本发明实施例中两株尿源干细胞(USC-1、2)的表面分子表达模式与间充质干细胞(MSCs)的流式检测结果比较；可见，尿源干细胞与间充质干细胞的表面分子表达谱类似，高表达间充质干细胞相关分子标志(CD29,CD73,CD44,CD90,CD146)；而低表达造血干细胞相关分子标志(CD31,CD45)，同时，低表达免疫原性相关分子标志(HLA-DR)。因此，该细胞制剂具有类似间充质干细胞的分子表达模式。
表1本发明所得尿源干细胞其中两株(USC-1、2)的间充质干细胞相关分子标志的表达水平与间充质干细胞(MSCs)的比较
表2本发明所得尿源干细胞其中两株(USC-1、2)的造血干细胞相关分子标志的表达水平与间充质干细胞(MSCs)的比较
表3本发明所得尿源干细胞其中两株(USC-1、2)的免疫原性相关分子标志的表达水平与间充质干细胞(MSCs)的比较
1.3.2 Western Blot(蛋白免疫印迹法)检测肾脏相关蛋白表达水平
1)收集蛋白样品
准备处于对数生长期的尿源干细胞107个，使用RIPA蛋白裂解液裂解细胞，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白样品的蛋白浓度；加入适量浓缩的蛋白上样缓冲液，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
2)配制聚丙烯酰胺凝胶、上样、电泳
配制聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶。蛋白样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内。加样。在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。
3)转膜
使用标准湿式转膜装置(Bio-Rad公司)及聚偏氟乙烯(PVDF)膜，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。转膜槽需要放置在冰浴中进行转膜。
4)封闭
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。配制5％脱脂牛奶溶液，将膜浸没在脱脂牛奶中，摇床缓慢摇动，室温封闭60分钟。
5)一抗孵育
参考对应检测蛋白(WT1,Nephrin)的一抗说明书，按照1：1000(WT1)、1：500(Nephrin)的比例，使用一抗稀释液稀释一抗；吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。加入1*含吐温的Tris缓冲液(TBST)洗涤，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。
6)二抗孵育
参考检测蛋白的一抗对应的二抗说明书，分别使用羊抗兔(WT1)、羊抗鼠(Nephrin)的二抗，按照1：2000的比例，使用二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。加入洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7)压片，检测蛋白
使用底物化学发光(ECL)类试剂来检测蛋白。
图3为本发明实施例中两株尿源干细胞的肾脏蛋白标志物的免疫印迹检测结果；结果显示，两株尿源干细胞(USC-1、2)均高表达肾脏相关蛋白(WT1、Nephrin)，其均为肾脏脱落干细胞。
1.3.3细胞生长曲线绘制
1)取生长状态良好的尿源干细胞，用0.25％EDTA胰酶消化为单细胞悬液；
2)200g离心5min，弃上清，加入适量新鲜培养基重悬；
3)按照一定倍数稀释该单细胞悬液；
4)准备血球计数板，洗净晾干；
5)吸取10ul细胞悬液，加样到血球计数板，镜下计数；
6)计算细胞总数，调整细胞浓度到106/ml；
7)准备12孔板，每孔加入10万个细胞(0.1ml)和0.9ml的新鲜培养基，轻轻晃动摇匀；
8)培养24h后，每隔24h收样，每次3个孔，胰酶消化重悬，进行细胞计数；
9)计数结果整理，以时间为横坐标，细胞数为纵坐标绘制生长曲线。
图4为本发明实施例中尿源干细胞不同代数(P3、6)的细胞增殖曲线检测结果；可见尿源干细胞无论是第三代还是第六代均保持着较为旺盛的增殖能力。
表4为本发明实施例中尿源干细胞不同代数(P3、6)的细胞增殖能力与间充质干细胞的比较，可见尿源干细胞第三代的增殖能力明显比MSCs第三代旺盛，第六代与MSCs第三代持平。因此，该细胞相对于间充质干细胞有更强的体外增殖能力。
表4本发明实施例中尿源干细胞不同代数(P3、6)的细胞增殖能力与间充质干细胞(P3)的比较
1.4分离后制备细胞制剂方法如下:
1)取对数生长期的经过鉴定符合要求的尿源干细胞，保证其汇合度达到80％；
2)用DMEM/F12基础培养基轻轻洗一遍细胞，以去除死细胞；
3)用0.25％EDTA胰酶在37℃消化约3-5min；
4)加入等体积含有10％血清的基础培养基终止消化，轻轻吹打细胞，使其从皿底脱落；
5)将细胞悬液转移至15mL离心管，200g离心5min；
6)弃上清，进行细胞计数；
7)使用注射用生理盐水重悬细胞，并调整细胞浓度在2*106/ml；
8)将细胞悬液转移到无菌EP管中，供通过静脉给药方式，进行治疗。
1.5分离后细胞制剂冻存方法如下：
1)待细胞汇合度达到80％时，先用DMEM/F12基础培养基轻轻洗一遍细胞，以去除死细胞；
2)用0.25％EDTA胰酶在37℃消化约3-5min；
3)加入等体积含有10％血清的基础培养基终止消化，轻轻吹打细胞，使其从皿底脱落；
4)将细胞悬液转移至15mL离心管，200g离心5min；
5)弃上清，进行细胞计数；
6)加入一定量冻存液重悬细胞，调整细胞悬液浓度为2*106个细胞/ml，轻柔吹打混匀后，转移到冻存管。放到装有常温异丙醇的程序降温盒中，并放置到-80℃超低温冰箱；
7)待次日将细胞转移至液氮罐保存。
实施例2尿源干细胞制剂用于肾移植术后免疫排斥治疗的动物实验
2.1急性排斥动物模型的建立
采用将Brown Norway大鼠(200g)为供体，Lewis大鼠(300g)为受体的模式，尽量保证大鼠体重均一。供体采用腹部“十”字切口，游离肾脏周围的脂肪组织。经动脉匀速灌注10mL预冷的肝素钠高渗枸橼酸盐嘌呤混合液,可见供肾变为黄褐色,表面无花斑,肾静脉流出的灌注液清亮。取出供肾，置于冰上修剪、冰水混合液中保存。受体采用腹部正中切口，游离肾血管、腹主动脉,在暴露的腹主动脉上下分别上动脉夹,在腹主动脉分叉处剪断肾动脉，近肾门处剪断肾静脉，肝素钠生理盐水冲洗准备原位移植。分别进行供受体肾动脉，肾静脉吻合，确保吻合成功后，松开动脉夹，可见供肾血管迅速充盈,由黄褐色变为红色(尽量减少术中供受体的肾动静脉吻合时间)。然后进行输尿管-膀胱吻合。关闭腹腔。
2.2尿源干细胞制剂的使用
关闭腹腔后10min内行所述尿源干细胞制剂的尾静脉注射。将处于对数生长期的状态良好的尿源干细胞(多选择P4-6代)用0.25％EDTA胰酶消化为单细胞，离心计数，用适量生理盐水将细胞重悬，将调整好浓度的细胞制剂1mL(约2*106cells/只)缓慢注射，对照组注射等体积生理盐水。术后将大鼠放在温暖环境下复温。大鼠苏醒后放入鼠笼。
2.3术后效果评估
2.3.1无免疫抑制剂存活天数及血液标本的收集、检测
分别观测不同实验组大鼠在移植后无免疫抑制剂情况下的存活时间。分别在手术当天D0，术后D3、5、7天收集所有实验大鼠约200μL血液进行血肌酐，尿素氮检测。正常饮食饲养各组动物，术后D7处死部分大鼠，在肾下腹主动脉收集外周血约8-9mL，同时，收集淋巴结和脾脏，流式分析外周血、淋巴结和脾脏内CD4+、CD8+T细胞的绝对计数、比例及活化水平，检测调节性T细胞的绝对计数和比例变化。
图3为本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组(N＝10)的肾移植大鼠生存期比较；断续线显示注射细胞组大鼠的生存期显著延长。
图4为本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组的肾移植大鼠术后血肌酐(sCr)，尿素氮(BUN)水平比较图；断续线显示注射细胞组大鼠的尿素氮及血肌酐水平较对照组下降。
表5为本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组的肾移植大鼠生存期比较，结果显示尿源干细胞移植可以延长中位生存期。
表5本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组的肾移植大鼠生存期比较
结果 细胞治疗组(N＝10) 对照组(N＝10) P值
中位生存期(天) 11.5 8 0.0304
表6、7为本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组的肾移植大鼠术后血肌酐(sCr)，尿素氮(BUN)水平比较；结果显示尿源干细胞移植组大鼠的尿素氮及血肌酐水平较对照组明显下降(尤其是移植术后第七天以后)。
表6本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组的肾移植大鼠术后血肌酐(sCr)水平比较
sCr(umol/L) 细胞治疗组 对照组 P值
D0 53.85±36.42 28.6±3.42 0.189
D3 65.38±20.19 58.53±15.77 0.408
D5 152.9±74.98 159.7±26.93 0.789
D7 447.5±167.67 508.6±92.79 0.254
D9 421.2±113.21 604±44.24 0.048
表7本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组的肾移植大鼠术后尿素氮(BUN)水平比较
BUN(mmol/L) 细胞治疗组 对照组 P值
D0 6.491±1.80 4.508±0.31 0.071
D3 11.44±8.2 9.964±3.84 0.611
D5 28.02±17.07 29.72±7.31 0.775
D7 81.62±22.88 97.87±14.72 0.037
D9 91.43±32.59 150.8±25.88 0.049
2.3.2肾组织形态学评估及病理取样
处死大鼠，取实验动物移植肾对其颜色、大小等进行形态学评估。以10％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，进行HE染色后镜检，观察肾脏病理变化及炎性细胞浸润情况。病理结果分析可参照Banff 17国际评分分类。
图5为本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组的肾移植大鼠术后第七天病理染色及评分比较图；可见注射细胞组大鼠肾移植术后第7天的肾脏病理评分水平低于对照组，病理损伤减轻。
表8为本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组的肾移植大鼠术后第七天病理评分分析，结果显示尿源干细胞治疗后显著降低了急性排斥反应导致的小管炎及动脉炎损伤，即细胞治疗后显著减低了T细胞介导的急性免疫排斥反应。
表8本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组的肾移植大鼠术后第七天病理评分分析
2.3.3肾组织免疫组化染色
取实验动物的移植肾，以10％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，进行免疫组化染色后镜检，观察肾脏CD3+的T细胞浸润情况及颗粒酶B水平。
图6为本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组的肾移植大鼠术后肾组织浸润的CD3+T细胞水平及颗粒酶B水平的比较图；显示移植细胞后，移植肾局部浸润的CD3+T细胞水平明显降低，且具有损伤作用的颗粒酶B水平也显著下降；
表9为本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组的肾移植大鼠术后肾组织浸润的CD3+T细胞水平及颗粒酶B水平比较，结果显示尿源干细胞移植后，可明显降低大鼠移植肾局部浸润的CD3+T淋巴细胞水平，其分泌的发挥细胞毒效应的颗粒酶B的水平也较对照组降低。
表9本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组的肾移植大鼠术后肾组织的CD3+T细胞浸润水平及颗粒酶B水平比较
实施例3尿源干细胞制剂用于心脏移植术后免疫排斥治疗的动物实验
3.1小鼠异位心脏移植急性排斥模型的建立
采用将balb/c品系小鼠的心脏，异位移植到C57BL/6J品系小鼠颈部。供体小鼠四肢固定剃毛，75％酒精消毒，开腹暴露下腔静脉，注射20u/ml肝素生理盐水1ml，横断下腔静脉及主动脉放血；横断膈肌，从双侧锁骨中线由下至上直至锁骨剪开；使用4℃生理盐水停搏心脏，全心修剪后保存于4℃生理盐水中。受体小鼠自下颌中点至右锁骨中点处剪一长约1cm斜切口，游离皮下组织及颈外静脉，在远心端分支处用丝线结扎。调整好供心位置，供心的无名动脉与受者颈总动脉吻合，供心的肺动脉与受者颈外静脉吻合；吻合完毕后开放静脉，观察是否有渗血，随后开放动脉，缝合皮下组织及皮肤。术后保温，保证小鼠饮水进食的清洁。
3.2尿源干细胞制剂的使用
缝合皮肤后10min内行所述尿源干细胞制剂的静脉注射。将处于对数生长期的状态良好的尿源干细胞(多选择P4-6代)用0.25％EDTA胰酶消化为单细胞，离心计数，用适量生理盐水将细胞重悬，将调整好浓度的细胞制剂1mL(约1*106cells/只)缓慢注射，对照组注射等体积生理盐水。术后将小鼠放在温暖环境下复温。
3.3术后效果评估
3.3.1无免疫抑制剂条件，移植物搏动时间检测
分别观测不同实验组小鼠在移植后无免疫抑制剂情况下，移植心脏的搏动时间。
图9为本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组的心脏移植小鼠的移植心脏搏动时间对比，断续线显示注射细胞组小鼠异位心脏的搏动时间显著延长。
表10为本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组的心脏移植小鼠的心脏搏动时间对比，结果显示尿源干细胞移植组小鼠异位心脏的搏动时间明显延长。
表10为本发明实施例中移植尿源干细胞及对照组的心脏移植小鼠的心脏搏动时间对比结果
动物实验显示，本发明可通过静脉注射发挥治疗器官移植(包括肾移植及心脏移植)术后免疫排斥的作用。静脉给药可操作性强，干细胞可以通过血液循环到达移植物局部，分泌相应调节因子，减轻移植物免疫排斥损伤。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域技术人员应当理解，可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (3)

1.尿源干细胞制剂在制备抗器官移植后免疫排斥治疗药物的应用，其特征在于：其制备方法，包括如下步骤：
1.1尿源干细胞的分离方法如下：
留取健康个体的清洁中段尿，离心，弃上清；使用含有青链霉素混合液的磷酸盐缓冲液重悬，再次离心，弃上清；使用尿源干细胞培养基，重悬；将上述细胞悬液接种于明胶溶液包被处理的培养皿中，置于37℃，5％CO2的培养箱内静置；待长出可见细胞克隆后，用磷酸盐缓冲液轻柔吹洗，更换新鲜培养基；待细胞增殖至汇合度约80％后，使用0.25％EDTA胰酶消化传代，扩增至所需的细胞数量；
所述的尿源干细胞培养基由REGM培养基、DMEM-high Glucose培养基、非必需氨基酸添加剂、GlutaMAX添加剂及胎牛血清配置；其中包括A液:REGM培养基原液；B液：90％DMEM-high Glucose基础培养基+10％胎牛血清+1：100比例添加的非必需氨基酸添加剂+1:100比例添加的GlutaMAX添加剂；将A液和B液以一比一的比例混合均匀；
1.2分离后的检测方法：
分离原代细胞后，进行传代；选取第二或三代尿源干细胞进行鉴定检测；
1.2.1流式细胞术检测表面分子表达水平：
利用流式细胞术进行五个干细胞相关分子标志CD29,CD73,CD44,CD90,CD146、两个造血干细胞相关分子标志CD31,CD45及免疫原性HLA-DR检测；
1.2.2免疫印迹法检测肾脏相关蛋白WT1,Nephrin表达水平；
1.2.3细胞生长曲线绘制；
1.3检测后制备干细胞制剂的方法:
取对数生长期的经过鉴定符合要求的第三至六代尿源干细胞，保证其汇合度达到80％；DMEM/F12基础培养基清洗后，使用0.25％EDTA胰酶消化；加入等体积含有10％血清的基础培养基终止消化；将细胞悬液离心，弃上清，进行细胞计数；使用注射用生理盐水重悬细胞，并调整细胞浓度至2*106个/ml。
2.权利要求1所述的尿源干细胞制剂在制备抗器官移植后免疫排斥治疗药物的应用，其特征在于，所述的尿源干细胞制剂在制备抗肾移植后或者抗心脏移植后免疫排斥治疗药物的应用。
3.权利要求1或2所述的尿源干细胞制剂在制备抗器官移植后免疫排斥治疗药物的应用，其特征在于，
尿源干细胞制剂的制备方法中，制备的干细胞制剂进一步液氮冻存，其步骤为：
待上述尿源干细胞汇合度达到80％时，DMEM/F12基础培养基清洗；使用0.25％EDTA胰酶消化；加入等体积含有10％血清的基础培养基终止消化；将细胞悬液离心；弃上清，进行细胞计数；加入冻存液重悬，调整细胞悬液浓度为2*106个/ml，吹打混匀；利用程序降温盒进行梯度降温，次日将细胞转移至液氮罐保存。
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