JPWO2015137419A1 - 間葉系幹細胞の賦活化剤、賦活化された間葉系幹細胞およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する、異常な間葉系幹細胞の賦活化剤。
(2)胎児付属物が臍帯組織、胎盤組織または卵膜である、(1)に記載の賦活化剤。
(3)前記抽出物が、前記哺乳動物由来の増殖能を有する細胞を含まない、(1)または(2)に記載の賦活化剤。
(4)前記異常な間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、(1)から(3)のいずれか一項に記載の賦活化剤。
(5)前記異常な間葉系幹細胞が、疾患を有する対象から分離されたものである、(1)から(4)のいずれか一項に記載の賦活化剤。
(6)前記疾患が、糖尿病、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患または骨粗鬆症である、(5)に記載の賦活化剤。
(7)前記疾患が糖尿病または関節リウマチである、(5)に記載の賦活化剤。
(8)対象から分離された異常な間葉系幹細胞を、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤で処理する工程を含む、賦活化された間葉系幹細胞の製造方法。
(9)前記異常な間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、(8)に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
(10)前記対象が疾患を有する対象である、(8)または(9)に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
(11)前記疾患が、糖尿病、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患または骨粗鬆症である、(10)に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
(12)前記疾患が糖尿病または関節リウマチである、(10)に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
(13)(8)から(12)のいずれか一項に記載の方法により製造された、疾患治療および/または予防用の間葉系幹細胞。
(14)前記疾患が糖尿病もしくはその合併症、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患または骨粗鬆症である、(13)に記載の間葉系幹細胞。
(15)前記疾患が糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害または関節リウマチである、(13)に記載の間葉系幹細胞。
(16)(13)から(15)のいずれか一項に記載の間葉系幹細胞および/またはその培養物を含む、疾患治療および/または予防用の医薬。
胎児付属物は、妊娠時に子宮内で形成される胎児の発育を支える役割を担う器官であり、胎盤、臍帯、卵膜(羊膜、絨毛膜、脱落膜の3層からなる)および羊水から構成される。胎盤は、胎児と母体との間の物質交換を行う場として機能する絨毛組織であって、様々な増殖因子やサイトカインを含み、ホルモン産生も行っている。臍帯は、胎児と胎盤をつなぐ器官であり、2本の臍帯動脈と1本の臍帯静脈、ワルトン膠質、臍帯間質と呼ばれる結合組織、およびその周囲を覆う羊膜鞘から構成される。
間葉系幹細胞は、間葉系組織の間質細胞の中に微量に存在する多分化能および自己複製能を有する幹細胞であり、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋細胞といった間葉系に属する細胞に分化するだけでなく、神経細胞や肝細胞などにも胚葉を超えて分化することができる。また、間葉系幹細胞はさらに、自身が産生する液性因子によるパラクライン効果および細胞接着相互作用も有することが知られている。
本発明の賦活化剤は、異常な間葉系幹細胞を賦活化させることができる。
本発明の第三の態様は、前記第二の態様の製造方法により製造された、疾患治療および/または予防用の間葉系幹細胞、ならびに該間葉系幹細胞および/またはその培養物を含む、疾患治療および/または予防用の医薬に関する。
臍帯組織は、母体に合併症のない帝王切開手術施行ヒト症例(n=20)の胎盤娩出直後に、臍帯根部から切断することにより採取した。採取した臍帯組織を滅菌容器に回収し、氷上で保持した。
1) 生理食塩水で臍帯組織に付着した血液および血管内の血液を可能な限り洗い流した。
2) ガラス製の培養皿に、無血清および抗生剤非添加のα−MEM細胞培養用培地を10〜30mL分取した。
3) 洗浄した臍帯組織を湿重量で約5g毎に分割し、培養皿1枚あたり約5gの臍帯組織を入れた。
4) 培養皿の培地の中で、ピンセットおよび先鋭のハサミを用いて羊膜鞘を長軸方向に切開した。
5) さらに長軸方向に走行する臍帯動脈、臍帯静脈をピンセットでワルトン膠質から剥離した。
6) さらにワルトン膠質および羊膜鞘を、ピンセットを用いて5mm程の幅で長軸方向に細切した。
7) 5)および6)で得られた臍帯血管、ワルトン膠質および羊膜鞘のすべてを含む培地を、50mLのサンプル管に回収した。
8) 7)を4℃の冷蔵庫内で振とう機の上に水平に置き、70〜100rpmの強度で72時間、往復振とうさせた。
9) 72時間後にサンプル管を4℃、2000rpm(300×g)で5分間遠心分離した。
10) 9)の上清を回収して、臍帯組織抽出物(以下、「WJ」ともいう)を得た。抽出物は、滅菌容器内で4℃または−80℃で保存し、以降の実施例および参考例において用いた。なお、特に記載がないかぎり、上記2)で使用したα−MEM培地の量は20mLであり、抽出物は4℃で保存した。
実施例1において調製された臍帯組織抽出物について、以下の分析を行った。
抽出物について、蛍光顕微鏡(位相差観察付)BZ9000(キーエンス)またはTE200(ニコン)を用いた位相差顕微鏡観察を行った。網目状の細胞外マトリクス成分のほか、臍帯血に由来すると考えられる赤血球が見出されたが、その他の増殖能を有する細胞の存在は認められなかった(図1A)。
抽出物に含まれる増殖因子(IGF−1、EGF、PDGF−AB、FGFb)(16ロットの抽出物を使用)、ヒアルロン酸(8ロットの抽出物を使用)、L−グルタミン酸(19ロットの抽出物を使用)の量をELISAで測定した。測定の際、IGF−1はHuman IGF−I Quantikine ELISA Kit(R&D Systems)、EGFはHuman EGF Quantikine ELISA Kit(R&D Systems)、PDGF−ABはHuman PDGF−AB Quantikine ELISA Kit(R&D Systems)、FGFbはHuman FGF basic Quantikine ELISA Kit(R&D Systems)、ヒアルロン酸はHyaluronan Quantikine ELISA Kit(R&D Systems)、L−グルタミン酸はF−キット L−グルタミン酸測定キット(J.K.International)を用いた。なお、ヒアルロン酸およびL−グルタミン酸については、4℃のほか−80℃で保存した抽出物についても測定を行った。L−グルタミン酸については、10mL、20mLまたは30mLの抽出媒体(α−MEM培地)を使用して調製した抽出物について測定を行った。
結果を図2に示す。抽出媒体の量を増やすと抽出物中のL−グルタミン酸濃度は若干減少した(図2C)。また、抽出物の保存温度は、測定した成分の含有量に大きな影響を与えなかった(図2B、C)。
10mL、20mLまたは30mLの抽出媒体(α−MEM培地)を使用して調製し、4℃および−80℃で保存した抽出物(それぞれ15ロット)の粘度を音叉型振動式粘度計SV−1A(A&D)で測定した。結果を図3に示す。L−グルタミン酸含有量の結果と同様に、使用した抽出媒体の量に依存して粘度は低下し、また保存温度は粘度に影響しなかった。
臍帯組織抽出物から、Total Exosome Isolation Kit(Invitrogen)を用いてエクソソーム分画を抽出した。エクソソーム分画をペレットとして回収後、電子顕微鏡観察を行った。
臍帯組織抽出物(6ロット、4℃で14〜90日間保存したもの)にFBSを最終濃度10%になるように添加した後、培養皿に播種し、37℃、5%CO2下で96時間の培養を行った。培養後の位相差顕微鏡観察像を図5に示す。抽出物中に含まれるコラーゲン線維や赤血球等は観察されたものの、培養皿に接着して増殖してくる細胞は認められなかった。このことから、抽出物には臍帯組織由来の増殖能を有する細胞が含まれないことが示された。
3−1.間葉系幹細胞の採取
8週齢の雄性Sprague Dawley(SD)ラット(日本SLC)に、40mg/kg体重に相当する量のSTZを含有するSTZクエン酸緩衝液溶液500μLを、尾静脈内投与した。ラットの血糖値は、STZを投与した1週間後から600mg/dL以上となり、高血糖状態となった。STZ投与8週間後にラットを屠殺し、長管骨を採取した。長管骨から全骨髄細胞を回収し、150cm2の培養皿に播種し、培養を行った。培養は、15%FBS、1%ペニシリン、1%ストレプトマイシン、100mg/dLグルコースを含有するα−MEM培地を用いて、20%O2下、37℃で行った。72時間後に培地を交換し、非接着細胞を除去することにより、骨髄由来の間葉系幹細胞(DM−MSC、Passage0(P0))を接着細胞として得た。なお以降、数字を伴って用いられる「Passage」または「P」は細胞の継代回数を意味する。例えばP0の細胞とは継代回数がゼロ回である、すなわち継代を行っていない初代培養細胞を表し、P1の細胞とは継代回数が1回の細胞を表す。
実施例1の抽出物を1.0mg/mLになるように添加したα−MEM培地(15%FBS、1%ペニシリン、1%ストレプトマイシンを含有)中で、P1のDM−MSCを、20%O2下、37℃で48時間〜96時間培養することにより、賦活化処理を行った。培養皿に接着した細胞が85%〜90%コンフルエントになった時点で継代し、抽出物添加培地を用いて同様に培養した。このように継代培養したP3の細胞をDM−MSC−WJ(+)とした。
上述の3−1.および3−2.で得られた間葉系幹細胞について、以下の評価を行った。
(1)MTTアッセイ
各々の間葉系幹細胞を96ウエル マルチウエル培養皿に播種し、24時間後に実施例1の抽出物(15ロット)を0.5〜1.0mg/mLになるように添加した、あるいは非添加のα−MEM培地を用いて48時間培養した。添加開始時を0時として、24時間後または48時間後にWST8(Water soluble Tetrazolium salts、DOJINDO)を各々のウエルに添加した。ホルマザン色素へ還元する酵素活性を測定し、細胞の増殖率を解析した(図6)。賦活化処理後のDM−MSC−WJ(+)は、DM−MSC−WJ(−)と比べて高い増殖能を示した。
実施例2と同様に位相差顕微鏡観察を行った。DM−MSC−WJ(−)は、突起の少ない平坦な線維芽細胞様の細胞であった。一方、DM−MSC−WJ(+)は、Control−MSC以上に突起数が多く、また細胞の厚みが増していることがわかった(図7)。
実施例2と同様に電子顕微鏡観察を行った。DM−MSC−WJ(−)は、ミトコンドリアの数がControl−MSCと比べて減少していた(図8)。また、DM−MSC−WJ(−)では、ミトコンドリア内のクリステの膨化のほか、小胞体ストレス状態を示す小胞体の顕著な拡張が認められた(図9)。これらの形態異常はDM−MSC−WJ(+)において、改善が認められた。
細胞の増殖能を、Ki67染色および細胞増殖、分化、生存促進作用などを媒介するリン酸化酵素であるシグナル伝達因子ERK(Extracellular signal−Regulated Kinase)1/2の活性化によりさらに評価した。
各々の間葉系幹細胞をチャンバースライドに播種したのち、実施例1の抽出物(1ロット)を1.0mg/mLになるように添加した、あるいは非添加のα−MEM培地を用いて48時間培養した。培養後、4%パラホルムアルデヒドで固定し、Cy3で標識した抗Ki67抗体(abcam)を用いたKi67染色を行った。細胞核はDAPI(DOJINDO)で染色した。共焦点レーザースキャン顕微鏡システムLSM 510 META(ZEISS)を用いて観察し、DAPI陽性細胞およびKi67陽性細胞の数をカウントした。結果を図10に示す。一定期間において増殖した全細胞数においては、賦活化処理後のDM−MSC−WJ(+)はDM−MSC−WJ(−)に比較して有意に増加した。一方、増殖活性を呈するKi67陽性細胞の割合は、DM−MSC−WJ(−)はControl−MSCと比べて有意に低く、賦活化処理後のDM−MSC−WJ(+)ではControl−MSCと同程度に回復した。すなわち、実施例1の抽出物により細胞が賦活化されたことが示された。
各々の間葉系幹細胞を播種したのち、実施例1の抽出物(7ロット)を1.0mg/mLになるように添加した、あるいは非添加のα−MEM培地を用いて48時間培養した。細胞を回収し、常法に従ってタンパク質を抽出してウエスタンブロット法にて解析した。ERK1/2は抗ERK1/2抗体(SantaCruz)、リン酸化ERK1/2は抗p−ERK1/2抗体(Cell Signaling Technology)、β−アクチンは抗β−アクチン抗体(Sigma)を用いて検出した。結果を図11に示す。賦活化処理後のDM−MSC−WJ(+)では、DM−MSC−WJ(−)と比べて、リン酸化されたERK1/2の発現が上昇していたことから、賦活化処理によりERK1/2が活性化されたことが示された。
各々の間葉系幹細胞を播種したのち、実施例1の抽出物(5ロット)を1.0mg/mLになるように添加した、あるいは非添加のα−MEM培地を用いて48時間培養した。細胞を回収し、常法に従ってタンパク質を抽出し、小胞体ストレス関連タンパク質の発現をウエスタンブロット法にて解析した。BiP(Binding immunoglobulin Protein)は抗BiP抗体(Cell Signaling Technology)、CHOP(C/EBP−Homologous Protein)は抗CHOP抗体(Cell Signaling Technology)、Ero1−L(Ero1−Like protein)αは抗Ero1−Lα抗体(Cell Signaling Technology)、JNK(c−Jun N−terminal Kinase)1/3は抗JNK1/3抗体(SantaCruz)を用いて検出した。結果を図12に示す。賦活化処理後のDM−MSC−WJ(+)では、DM−MSC−WJ(−)と比べて、BiP、CHOPおよびJNK1/3の発現が減少し、Ero1−Lαの発現が増加した。この結果は、細胞の電子顕微鏡観察において認められた結果と同様、賦活化処理により小胞体ストレスが抑制されることを示している。
各々の間葉系幹細胞からmRNAを抽出した(試薬;TRI reagent、Molecular Research Center,Inc.)。表2に示す因子の発現をリアルタイムPCR法(試薬;Power SYBR(登録商標)Green PCR Master Mix、Applied Biosystems、機器;Applied Biosystems7500リアルタイムPCRシステム)で解析した。なお、各因子の発現量を正規化するための対照としてグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)を用いた。
各々の間葉系幹細胞を脂肪分化誘導培地(試薬;Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit、R&D Systems)中で培養し、14日間分化誘導を行った。その後、細胞をOil red O(SIGMA)で染色した。明視野顕微鏡観察像を図14に示す。DM−MSC−WJ(+)ではDM−MSC−WJ(−)と比べて細胞数が増加しているものの、全細胞に占めるOil red O陽性細胞の割合は同程度であった。したがって、賦活化処理は、間葉系幹細胞が本来保持する脂肪分化能に影響を与えないことが示された。
DM−MSC−WJ(+)の表面抗原の発現を、抗CD90抗体(Immunotec)、抗CD44抗体(Immunotec)、抗CD45抗体(Immunotec)、抗CD43抗体(Immunotec)、抗CD31抗体(Immunotec)、抗CD11b抗体(Immunotec)、抗HLA−DR抗体(abcam)を用いてフローサイトメトリーで解析した(機器;BD FACSCalibur flow cytometer)。図15に示すように、DM−MSC−WJ(+)は、間葉系幹細胞のマーカーであるCD90を発現し、ネガティブマーカーであるCD44、CD45、CD43、CD31、CD11b、HLA−DRを発現していなかった。このことから、賦活化処理は間葉系幹細胞の細胞表面抗原に影響を与えないことが示唆された。
I型糖尿病のモデルであるSTZ投与ラット、およびII型糖尿病のモデルであるOLETFラットを用いて、賦活化に必要な臍帯組織抽出物の濃度を検討し、合わせて血清成分の存在が臍帯組織抽出物の賦活化能に与える影響を評価した。
STZ投与ラットおよびOLETFラット(6月齢)から実施例3の3−1.と同様に調製した間葉系幹細胞に対し、抽出物添加濃度を0.1mg/mL〜2.0mg/mLの範囲に設定して、3−2.と同様に賦活化処理を行った。MTTアッセイおよび細胞形態観察の結果から、いずれの糖尿病ラットの間葉系幹細胞においても0.5mg/mL以上の抽出物添加濃度で十分な賦活化を確認した(図16および図17)。
FBSを除いたα−MEM培地を使用して4−1.と同様にSTZ投与ラットおよびOLETFラットの間葉系幹細胞を培養し、MTTアッセイおよび細胞形態観察を行った。結果を図18および図19に示す。FBS非添加かつ抽出物添加下で培養した細胞は、FBS添加かつ抽出物添加下で培養した細胞と比べて極度に増殖能が低下しており、細胞形態にもほとんど変化は認められなかった。
II型糖尿病患者(69歳女性、HbA1c値6.8%)より採取した骨髄液から実施例3と同様の手法で間葉系幹細胞を調製し、これを用いて臍帯組織抽出物の添加濃度検討、および血清成分非存在下での賦活化能の評価を実施例4と同様に行った。
胎盤は、帝王切開手術施行ヒト症例(n=2)より摘出後、滅菌バックに入れ、4℃で搬送および保存を行った。搬送後24時間以内に組織を凍結保存(−80℃)した後、あるいは、凍結させずにそのまま、以下のように各組織を切り離し、抽出物を調製した。
1) 胎盤を滅菌バックから取り出し、生理食塩水で余分な成分を可及的に洗浄した。
2) 胎盤を平トレイにうつし、卵膜と、膜を剥離した母体側胎盤組織とに分離した。
3) 卵膜および母体側胎盤組織それぞれの湿重量を測定し、湿重量50gに対して100mLの割合で無血清培地(α−MEM)をコニカルチューブ(225mL)に入れ、重量に応じて必要な本数を準備した。
4) 卵膜および母体側胎盤組織それぞれを、ハサミを用いてすべて5mm角に細切し、3)で準備したコニカルチューブに入れた。
5) 4)のコニカルチューブを密栓して口部をパラフィルムで被覆した後、横に寝かせて振とう器に固定し、4℃で8の字振とう、80rpmで72時間振とうした。
6) 72時間後、5)のコニカルチューブを4℃で1000xg、5分間遠心し、上清を新しいコニカルチューブに回収した。
7) 6)で回収した上清を再度、4℃で1000xg、5分間遠心して上清を回収することで、赤血球成分、胎盤組織等の夾雑物を除去した。
8) 7)で回収した上清を適宜分注後、使用時まで−80℃で凍結保存した。
臍帯組織抽出物に含まれる構成成分であるL−グルタミン酸、ヒアルロン酸、エクソソームについて、間葉系幹細胞の賦活化能を評価した。
胎盤組織抽出物および卵膜抽出物のエクソソーム分画による間葉系幹細胞の賦活化について、実施例7と同様に評価した。結果を図29に示す。胎盤組織抽出物または卵膜抽出物のエクソソーム分画で賦活化された間葉系幹細胞は、増殖能、細胞形態、JNK1/3およびα−SMA発現量のいずれも臍帯組織抽出物のエクソソーム分画の場合と同様の傾向を示した。実施例7および実施例8の結果から、胎児付属物からの抽出物中のエクソソーム分画は、間葉系幹細胞の賦活化に寄与する成分の少なくとも一つであることが示された。
実施例1の抽出物によって賦活化された間葉系幹細胞(MSC)について、糖尿病性腎症モデルマウスを用いて治療効果を評価した。
使用したMSCを、以下に示す。
Control−MSCおよびDM−MSC−WJ(−):実施例3の3−2.で得たP3の細胞を用いた。
DM−MSC−WJ(+):P1のDM−MSCのみを抽出物添加培地で培養し、その後は抽出物を含まない培地を用いたこと以外は、実施例3の3−2.と同様に継代培養したP3の細胞を用いた(図30A)。
実施例3の3−2.で得たP3のControl−MSC、DM−MSC−WJ(−)およびDM−MSC−WJ(+)(賦活化プロトコールを図34Aに示す)を用いて、上記9−1.と同様に治療効果の評価を行った(図34B)。結果を図35〜図37に示す。
実施例1の抽出物によって賦活化されたMSCについて、糖尿病性腎症モデルラットを用いて治療効果を評価した。以下に特に記述がないかぎり、実施例3の3−1.および3−2.、ならびに実施例9に記載された手法を用いた。
雄性STZ誘導I型糖尿病ラットの骨髄細胞を、抽出物を含まない培地で2回、抽出物を含まない培地または抽出物0.5mg/mL添加培地で1回継代培養し、得られたP3のMSC(それぞれDM−MSC−WJ(−)およびDM−MSC−WJ(+))を以下の試験に用いた(図38A)。
6月齢の雄性OLETF II型糖尿病モデルラットの骨髄細胞を、抽出物を含まない培地で2回、抽出物を含まない培地または抽出物0.5mg/mL添加培地で1回継代培養し、P3のMSC(それぞれOLETF−DM−MSC−WJ(−)およびOLETF−DM−MSC−WJ(+))を得た。また、コントロールとして正常野生株ラットの骨髄細胞を、抽出物を含まない培地で3回継代培養して、P3のMSC(Control−MSC)を得た(図40A)。これらのMSCを以下の試験に用いた。
11−1.間葉系幹細胞の採取および賦活化処理
7〜9週齢の雌性Lewisラット(日本SLC)を用いて関節リウマチ(RA)ラットを作製した。関節炎の感作には、完全フロイントアジュバント(結核死菌20mg/mL、Chondrex)およびウシII型コラーゲン溶液(II型コラーゲン2mg/mL、Chondrex)をそれぞれ等量混合してエマルジョンを作製し、1匹あたり結核死菌2mgおよびII型コラーゲン0.2mgを含むエマルジョンを尾根部に投与した。さらに、同濃度のエマルジョンを7〜10日おきに4〜5回継続投与し、関節炎を発症させた。
RAラット間葉系幹細胞の異常化を確認するため、11−1.でRAラットまたは正常ラットから採取した骨髄細胞を別途、10cm2培養皿に1x106個播種し、P0として培養した。10日後にそれぞれの培養皿をメタノール固定してWright−Giemsa染色を行い、直径2mm以上のコロニー数を計測した。コロニー形成数はControl−MSC(7週齢)が26個、Control−MSC(12週齢)が20個、RA−MSC(14週齢)が3個であり、RA−MSCでコロニー形成能の低下を認めた。
11−1.と同様に作製したエマルジョン初回投与から30日後の関節炎発症RAラット12匹を4群(n=3)に分け、RA−Vehicle群、Control−MSC群、RA−MSC群、RA−MSC−WJ群として処置した(図43B)。P3として培養したControl−MSC、RA−MSC、RA−MSC−WJは1x104個/g(体重)を1mLのα−MEM培地で懸濁し尾静脈から投与した。Vehicle群には、α−MEM培地のみ1mL尾静脈投与した。処置後6日にはエマルジョンを初回感作の半量投与した。処置後0日をベースラインとし、処置後3日、5日、11日の足部腫脹を計測した。さらに、足関節部(上部、後部、足根部)、中足部、足趾部(Metatarsophalangeal:MTP関節、Proximal Inter−phalangeal;PIP関節)の目視観察を行い、腫脹および変形が認められた場合にそれぞれ0.1を加算することで、その合計点として関節スコアを算出した。さらに、Rat C−Reactive Protein ELISA Kit(eBioscience)により血清CRP値を測定した。
実施例3の3−2.で得たP3のControl−MSCおよびこのMSCの培養上清(MSC−CM)について、糖尿病性腎症に対する治療効果を評価した。MSC−CMは、P3の培養液を遠心分離して得た上清を用いた。
試験は、図47に示す試験計画にしたがって行った。実施例9の9−1.と同様に作製したSTZ投与マウスを3群に分け、STZ−Control−MSC群にはControl−MSCを1x104個/g(体重)含むリン酸緩衝液250μLを4週おきに2回投与し、STZ−MSC−CM群には2mg/kg(体重)のMSC−CMを1日1回、週5日間投与した。また、STZ−Vehicle群にはビークルとしてリン酸緩衝液250μLを4週おきに2回、または1日1回、週5日間、投与した。実施例9の9−1.と同様に8週間の治療試験を行い、各種測定を行った。さらに、採取した腎臓の組織切片を作製し、PAS染色およびAzan染色を行った。
試験は、図50に示す試験計画にしたがって行った。8週齢の雄性C57BL/6マウスに60%ラードを含有する高脂肪食(High−Fat Diet 32、日本クレア)を給餌し、糖尿病を誘導した。給餌開始から28週間後、作製した高脂肪食誘導II型糖尿病モデルマウスを3群に分け、HFD−Control−MSC群にはControl−MSCを1x104個/g(体重)含むリン酸緩衝液250μLを2週おきに4回投与し、HFD−MSC−CM群には2mg/kg(体重)のMSC−CMを1日1回、週5日間投与した。また、HFD−Vehicle群にはビークルとしてリン酸緩衝液250μLを2週おきに4回、または1日1回、週5日間、投与した。8週間の治療試験を行い、実施例9の9−1.と同様に各種測定を行った。
Claims (16)
- 哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する、異常な間葉系幹細胞の賦活化剤。
- 胎児付属物が臍帯組織、胎盤組織または卵膜である、請求項1に記載の賦活化剤。
- 前記抽出物が、前記哺乳動物由来の増殖能を有する細胞を含まない、請求項1または2に記載の賦活化剤。
- 前記異常な間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項1から請求項3のいずれか一項に記載の賦活化剤。
- 前記異常な間葉系幹細胞が、疾患を有する対象から分離されたものである、請求項1から請求項4のいずれか一項に記載の賦活化剤。
- 前記疾患が、糖尿病、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患または骨粗鬆症である、請求項5に記載の賦活化剤。
- 前記疾患が糖尿病または関節リウマチである、請求項5に記載の賦活化剤。
- 対象から分離された異常な間葉系幹細胞を、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤で処理する工程を含む、賦活化された間葉系幹細胞の製造方法。
- 前記異常な間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項8に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
- 前記対象が疾患を有する対象である、請求項8または請求項9に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
- 前記疾患が、糖尿病、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患または骨粗鬆症である、請求項10に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
- 前記疾患が糖尿病または関節リウマチである、請求項10に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
- 請求項8から請求項12のいずれか一項に記載の方法により製造された、疾患治療および/または予防用の間葉系幹細胞。
- 前記疾患が糖尿病もしくはその合併症、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患または骨粗鬆症である、請求項13に記載の間葉系幹細胞。
- 前記疾患が糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害または関節リウマチである、請求項13に記載の間葉系幹細胞。
- 請求項13から請求項15のいずれか一項に記載の間葉系幹細胞および/またはその培養物を含む、疾患治療および/または予防用の医薬。
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