JP2013147479A

JP2013147479A - 幹細胞賦活化剤

Info

Publication number: JP2013147479A
Application number: JP2012011214A
Authority: JP
Inventors: Yumiko Ishimatsu; 弓子石松; Tsutomu Soma; 勤相馬; Shigeyoshi Fujiwara; 重良藤原; Keiko Mori; 圭子森; Haruhi Iwaki; はるひ岩城
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 2012-01-23
Filing date: 2012-01-23
Publication date: 2013-08-01

Abstract

【課題】線維芽細胞の前駆細胞で、各種組織の修復・再生への応用が期待される、幹細胞特に間葉系幹細胞を有効に賦活化し得る新規な剤を提供する。
【解決手段】ローズマリーオイル、ラベンダーオイル及びオリバナムオイルからなる群より選択される１又は２以上を有効成分として含んでなる、間葉系幹細胞等の幹細胞賦活化剤、および該剤を含有する医薬品、化粧品、食品。
【選択図】なし

Description

本発明は、幹細胞を有効に賦活し得る剤に関する。

幹細胞は、複数の細胞に分化した細胞を産生する多分化能と、細胞分裂によりその細胞と同じ細胞を産生する自己複製能という２つの性質を併せ持つ細胞である。受精卵の初期の発生段階である胚に由来する幹細胞は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）と称される。ヒトＥＳ細胞は再生医療に使用することが期待されているものの、受精卵を利用するという倫理上の問題から、新たなヒトＥＳ細胞の作成は認められていない。

近年、ＥＳ細胞類似の性質を持つ細胞として、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）にも注目が集まっている。しかしながら、ｉＰＳ細胞の作成には細胞の癌化、作成効率等の観点で多くの問題がある。一方、特定の組織に分化する能力を有する体性幹細胞は、患者自身の身体の組織、例えば骨髄から得られるため、胚性幹細胞のような倫理上の問題はない。

皮膚では表皮基底層に表皮幹細胞（非特許文献１）が存在することが良く知られており、また毛包のバルジ領域と呼ばれる領域には、毛包上皮幹細胞（非特許文献２）や皮膚色素幹細胞（非特許文献３）が存在することが報告されている。一方、真皮にはコラーゲンを主体とする繊維成分の中に、細長い紡錘形をした線維芽細胞が存在しているが、真皮の線維芽細胞に幹細胞が存在するかは明らかにされていない。また、真皮には脂肪、グリア、軟骨、筋肉など複数の細胞系列に分化する皮膚由来前駆細胞（skin-derived precursors：ＳＫＰ）が存在すること（非特許文献４）は知られているものの、真皮線維芽細胞とＳＫＰの関連は明らかではない。

線維芽細胞の前駆細胞として骨髄から分離された間葉系幹細胞（非特許文献５）は、間葉系に属するさまざまな細胞（骨細胞、筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞など）に分化することから、骨や血管、筋の再構築など再生医療への応用が期待されている。最近では、間葉系組織を持つ組織の多くに存在する可能性が明らかになってきており、脂肪や臍帯血、胎盤等からも間葉系幹細胞が単離されている（非特許文献６〜８）。

近年の知見によれば、間葉系幹細胞は、血管周皮細胞（ぺリサイト）として全身の血管に存在し、血管安定化や組織恒常性維持に働くことが知られている（非特許文献９及び１０）。
また、組織損傷部位又はその近傍において血管が破壊されると、血管周皮細胞（ぺリサイト）である間葉系幹細胞は血管から離れて増殖し、失われた細胞を供給するとともに（非特許文献１１〜１４）、生物活性を持つ因子を放出して組織を保護し（非特許文献１５〜１９）、損傷した組織の修復・再生に作用する。これらの分泌因子は、血管形成や抗アポトーシスの作用のほか、免疫を強力に抑制する作用も有し（非特許文献２１及び２２）、Ｔ細胞やＢ細胞を介した損傷組織の破壊を抑える（非特許文献９及び２２）ことも報告されている。
更に、間葉系幹細胞は、抗線維化の作用（非特許文献２３及び２４）や、多発性硬化症や糖尿病に対する効果（非特許文献９）も示すことが知られている。

一方で、慢性炎症が、各種疾患（例えばメタボリックシンドローム、動脈硬化性疾患、癌、神経変性疾患、自己免疫疾患等）に共通する基盤病態であることが明らかになりつつある（非特許文献２５）。例えば、慢性炎症によって内皮細胞機能障害やインスリン抵抗性が誘導され、糖尿病や動脈硬化性疾患等の種々の疾患の原因となることが報告されている（非特許文献２６）。更には、肥満の脂肪組織そのものが、炎症性へと変化をきたすことも明らかになってきた（非特許文献２７〜２９）。慢性炎症は血管周囲に生じるため、慢性炎症においても、血管周皮細胞（ぺリサイト）である間葉系幹細胞と血管との相互作用の破綻が生じていると考えられる。

以上の知見から、間葉系幹細胞の産生促進や安定化を図ることができれば、血管安定化、組織恒常性維持、損傷組織の修復・再生、抗線維化、多発性硬化症や糖尿病等の各種疾患の予防・治療、メタボリックシンドローム等の慢性炎症に基づく各種状態の予防・改善等、各種の用途に極めて有効であると考えられる。

間葉系幹細胞は骨髄、臍帯血、胎盤に加えて脂肪にも存在することが明らかになっている。また、本発明者等は、真皮にも皮下脂肪と同様に間葉系幹細胞に存在することを明らかにした（特願２００９−２１３２９１）。上述の間葉系幹細胞の作用を考慮すれば、真皮や皮下脂肪における間葉系幹細胞の賦活化を図ることにより、皮膚の状態改善や再生等にも有効であると考えられる。

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本発明は、上記背景に鑑みてなされたもので、その課題は、幹細胞を有効に賦活化し得る剤を提供することにある。

本発明者らは、多種多様な素材について検討を重ね、幹細胞を有効に賦活化し得る剤をスクリーニングした結果、ローズマリーオイル、ラベンダーオイル及びオリバナムオイルが、各々顕著な幹細胞賦活化作用を示すことを見出し、本発明を為すに至った。

すなわち、本発明の要旨は、以下を包含する。
［１］ローズマリーオイル、ラベンダーオイル及びオリバナムオイルからなる群より選択される１又は２以上を有効成分として含有する幹細胞賦活化剤。
［２］幹細胞が間葉系幹細胞である［１］の幹細胞賦活化剤。
［３］［１］又は［２］の幹細胞賦活化剤を含有する医薬品。
［４］［１］又は［２］の幹細胞賦活化剤を含有する化粧品。
［５］［１］又は［２］の幹細胞賦活化剤を含有する食品。

本発明によれば、幹細胞を有効に賦活し得る剤が提供される。

図１（ａ）は、植物由来オイルの培地への添加が脂肪由来幹細胞の呼吸活性に与える影響を示すグラフであり、図１（ｂ）は、同添加が線維芽細胞の呼吸活性に与える影響を示すグラフである。

［ローズマリーオイル］
ローズマリーは、シソ科の常緑低木であるRosmarinus属の植物、例えばRosmarinus officinalis等を指す。ローズマリーオイルは、ローズマリーの全草又は部分から抽出されるオイルである。

ローズマリーの抽出物は、これまで線維芽細胞、癌細胞、前癌細胞、毛乳頭細胞等の細胞の増殖促進、活性化、賦活化等の用途が提案された例があるが（特開平１０−２７９４４０、特開２００４−１５５６８４、特開２００４−３５９６７４、特開２００５−１３９０７０、特開２００６−１０４１１７、特開２００６−２１９４０７、特表２００７−５１３１７７、特表２００８−５４３８５２、特許３５０７６３５等）、ローズマリーオイルが特に幹細胞の賦活化作用を有することはこれまで全く知られておらず、かかる作用は発明者等によって今回初めて見出された。

［ラベンダーオイル］
ラベンダーは、シソ科の常緑低木であるLavandula属の植物、例えばLavandula officinalis等を指す。ラベンダーオイルは、ラベンダーの全草又は部分から抽出されるオイルである。

ラベンダーの抽出物は、これまで細胞賦活化等の用途が言及された例があるが（特開２０１０−１３２６２９）、本文献は賦活化対象の細胞を特定しておらず、また、かかる作用を実証する実験結果等が全く示されていない。ラベンダーオイルが特に幹細胞の賦活化作用を有することはこれまで全く知られておらず、かかる作用は本発明者等によって今回初めて見出された。

［オリバナムオイル］
オリバナムは、カンラン科の常緑高木であるBoswellia carteriを指す。オリバナムオイルは、オリバナムの全草又は部分から抽出されるオイルである。

オリバナムの抽出物は、これまで細胞賦活化等の用途が提案された例があるが（特許４２９９３７４）、本文献で実験により実証されている賦活化対象は線維芽細胞のみである。オリバナムオイルが特に幹細胞の賦活化作用を有することはこれまで全く知られておらず、かかる作用は発明者等によって今回初めて見出された。

［オイルの抽出法］
ローズマリーオイル、ラベンダーオイル及びオリバナムオイル（以降「植物由来オイル」又は単に「オイル」と総称する場合がある）は、制限されるものではないが、例えば以下の手法で調製することができる。

植物由来オイルの材料は、ローズマリー、ラベンダー及びオリバナムから選択される植物である。植物の全体でも部分でもよい。植物の部分の場合、花、花穂、果穂、果皮、果実、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根皮、根、種子等から選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。これらの材料はそのまま抽出に供してもよいが、圧搾、乾燥、粉砕等の処理を加えてから抽出してもよい。

上記の材料から溶媒を用いて植物由来オイルを抽出する。溶媒としては、例えば水、有機溶媒等が挙げられる。有機溶媒としては、例えば低級（例えば炭素数１〜６）アルコール、ポリオール系溶媒等が挙げられる。低級アルコールとしては、例えばメタノール、エタノール、プロパノール等が挙げられる。ポリオール系溶媒としては、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール等が挙げられる。これらの溶媒は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を任意の組み合わせ及び比率で混合して用いてもよい。

上記の材料からオイル（油脂成分）を抽出する手法は制限されないが、代表的な手法としては、溶媒抽出と、水蒸気蒸留とが挙げられる。溶媒抽出では溶媒（中でも低級アルコール、好ましくはエタノール）に溶解し得る種々の油脂成分が抽出されるが、水蒸気蒸留では主に揮発性の油脂成分が抽出される。本発明では何れの手法も使用されるが、水蒸気蒸留により抽出される植物由来オイルの方が好ましい。

水蒸気蒸留は、水を溶媒として用いた蒸留であるが、蒸留の妨げとならない範囲で、上記の他の溶媒を適宜混合して用いてもよい。材料をそのまま蒸留してもよいが、上述の直接抽出や濾過等の処理を行った後、蒸留に供してもよい。なお、常法による濾過、濃縮、蒸留等の処理を更に加えてもよい。

［幹細胞賦活化剤］
本発明の幹細胞賦活化剤（以降「本発明の剤」という場合がある。）は、ローズマリーオイル、ラベンダーオイル及びオリバナムオイルからなる群より選択される１又は２以上のオイル（植物由来オイル）を有効成分として含有する。２以上の有効成分を含有する場合、その組み合わせ及び比率は任意である。

本発明の幹細胞賦活化剤により賦活化される幹細胞は限定されないが、間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell：ＭＳＣ）が好ましい。間葉系幹細胞としては、脂肪由来幹細胞（Adipose-derived stem cell：ＡＳＣ又はＡＤＳＣ）、真皮由来幹細胞等が挙げられる。上述のように、間葉系幹細胞の賦活化は、血管の安定化、組織恒常性の維持、損傷組織の修復・再生（特に真皮の再生）、抗線維化、多発性硬化症や糖尿病等の各種疾患の予防・治療、メタボリックシンドローム等の慢性炎症に基づく各種状態の予防・改善等の用途に極めて有効であることが知られている。よって、本発明の剤は、これらの用途に極めて有効に用いることが可能である。

本発明でいう幹細胞の「賦活化」とは、幹細胞を増殖促進及び／又は活性化する作用をいう。幹細胞の賦活化作用を検証する手法は制限されないが、例えば、後述の実施例で採用したAlamar blue^{（登録商標）}（Invitrogen）等により幹細胞の呼吸活性を測定する手法、ＭＴＴ(3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, yellow tetrazole)試験等が挙げられる。

本発明の剤は、有効成分である上述の植物由来オイルのみからなるものでもよいが、上述の植物由来オイルを、１種又は２種以上の他の成分、例えば賦形剤、担体及び／又は希釈剤等と組み合わせた組成物とすることもできる。組成物の組成や形態は任意であり、有効成分や用途等の条件に応じて適切に選択すればよい。当該組成物は、その剤形に応じ、賦形剤、担体及び／又は希釈剤等及び他の成分と適宜組み合わせた処方で、常法を用いて製造することができる。

本発明の剤は、医薬品又は医薬部外品としてヒト又は動物に投与し、或いは化粧品としてヒト又は動物に適用することができる。また、各種の飲食品や飼料（ペットフード等を含む）等に配合して、ヒト及び動物に摂取させることもできる。

本発明の剤を医薬品、医薬部外品又は化粧品とする場合、本発明の剤をそのまま、或いは必要に応じて用途に応じたその他の成分と混合すればよい。その他の成分としては、医薬製剤や医薬部外品に通常用いられる成分、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線防御剤、色材、水性成分、各種皮膚栄養剤、金属イオン封鎖剤、油分、アルコール類、糖類、粉末成分、水等が挙げられる。これらの成分は、いずれかを単独で使用してもよく、２種以上を任意の組み合わせ及び組成で使用してもよい。

本発明の剤を医薬品又は医薬部外品とする場合、投与経路は任意であり、経口投与でも非経口投与（静脈投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等）でもよい。剤型も任意で、用途や投与経路に応じて適宜選択すればよい。経口投与の場合の剤型としては、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形製剤や、内服液剤、シロップ剤等の液体製剤が挙げられる。非経口投与の場合の剤型としては、例えば注射剤、外用剤等が挙げられる。これらの剤型は、公知の方法により適宜調製することができる。

本発明の剤を化粧品とする場合、その形態は任意であるが、例えば化粧水、乳液、ファンデーション、口紅、リップクリーム、クレンジングクリーム、マッサージクリーム、パック、ハンドクリーム、ハンドパウダー、ボディシャンプー、ボディローション、ボディクリーム、浴用化粧品等の形態が挙げられる。

本発明の剤を化粧品、医薬製剤、医薬部外品等に用いる場合、本発明の剤の配合量は、化粧品、医薬製剤、医薬部外品等の種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができる。例えば、化粧品、医薬製剤、医薬部外品等の全体に対し、有効成分たる植物由来オイルが０．００００１〜５０重量％となるようにすることが好ましく、より好ましくは０．０００１〜５重量％である。但し、後述の実施例に示すように、植物由来オイルの種類によっては、濃度依存的に賦活化作用を発揮するものや、濃度に閾値が存在するものもあるため、植物由来オイルの種類に応じて有効成分量を調整することが好ましい。

なお、本発明の剤を経皮投与用の医薬品若しくは医薬部外品、又は化粧品として用いる場合には、通常は皮膚外用剤として使用される。皮膚外用剤の剤型は、皮膚に適用できる形態であれば任意であるが、液剤（溶液系、可溶化系、懸濁系・乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系等）、軟膏剤、貼付剤、化粧水、ゲル、エアゾール等が挙げられる。

一方、本発明の剤を飲食品や飼料等に配合する場合、本発明の剤の配合量は、それらの種類、目的、形態、利用方法等に応じて適宜決めることができる。例えば、有効成分たる植物由来オイルの成人一日当たりの摂取量が０．００１ｍｇ〜１０ｇ程度となるように配合できる。特に、保健用飲食品等として利用する場合には、本発明の有効成分による所定の効果が十分発揮されるように、有効成分たる植物由来オイルの成人一日当たりの摂取量が０．５ｍｇ〜１ｇ程度となるように含有させることが好ましい。

飲食品や飼料の形態としては、任意の形態とすることが可能であり、例えば固形状（顆粒状、粒状等）、液体状、ペースト状、ゲル状等に成形することができる。これらの形態には、飲食品等に含有することが認められている公知の各種物質、例えば、結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤やｐＨ調製剤等を適宜含有させることができる。

次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。

［材料］
ローズマリーオイルとしては、ローズマリー（Rosmarinus officinalis）の水蒸気蒸留による抽出物（精油）であるBiolandes社製Rosemary Officinalis Oilを用いた。
ラベンダーオイルとしては、ラベンダー（Lavandula officinalis）の水蒸気蒸留による抽出物（精油）であるBiolandes社製Lavender Officinalis Oilを用いた。
オリバナムオイルとしては、オリバナム（Boswellia carteri）の水蒸気蒸留による抽出物（精油）であるBiolandes社製Olibanum Boswellia Oilを用いた。

これらのローズマリーオイル、ラベンダーオイル又はオリバナムオイルを各々、エタノールに溶解した上で、得られたエタノール溶液をMesenPRO(+)培地に対して添加した培地（オイル添加培地）を調製した。培地中のオイル濃度は、ローズマリーオイル及びラベンダーオイルについては、培地中０．００２重量％、０．００５重量％又は０．０１重量％となるように調製し、オリバナムオイルについては、培地中０．００５重量％となるように調製した。培地に対するエタノール濃度は何れも０．１重量％であった。
また、対照として、オイルを添加せず、エタノールのみを培地中０．１重量％の濃度で添加した培地（オイル未添加培地）を調製した。

［細胞培養］
２４ウェルのプレートに、ヒト脂肪由来幹細胞（間葉系幹細胞培養用MesenPRO(+)培地（Invitrogen）にて継代５代目）を、１ウェルあたり約２×１０^４細胞となるようにMesenPRO(+)培地にて播種した。２４時間後、各ウェルの培地を、上記の各オイル添加培地又はオイル未添加培地と交換し、更に２４時間培養した。
また、ヒト脂肪由来幹細胞の代わりにヒト線維芽細胞を用いて、同様に培養を行った。

［呼吸活性測定］
上記培養後の細胞が賦活化されたか否かの指標として、細胞の呼吸活性を、Alamar blue^{（登録商標）}（Invitrogen）を用いて測定した。Alamar blue^{（登録商標）}は、細胞の呼吸活性の指標となる色素であり、酸化型では青色（非蛍光）であるが、電子伝達系によって還元されると赤色（蛍光）に変化する。よって、細胞培養培地に加えると、細胞の呼吸活性の高い増殖時に還元型、細胞の呼吸活性の低い増殖阻害時に酸化型になる。よって、赤色（蛍光）を測定することにより、細胞の呼吸活性を調べることができる。
呼吸活性の測定は、Alamar blueのマニュアルに従って行った。具体的には、オイル添加培地又はオイル未添加培地の存在下で細胞を２４時間培養した後に、各ウェルの培地を、Alamar blue色素含有 MesenPRO(+)培地と交換し、３時間インキュベートした後、蛍光強度（励起波長５４５ｎｍ、検出波長５９０ｎｍ）を測定した。各試験は３重で実施し（ｎ＝３）、各オイル存在下で得られた呼吸活性の測定値について、対照（オイル未添加）に対してスチューデントｔ検定を行い、その有意性を検証した。

［結果］
結果を図１のグラフに示す。図１は、植物由来オイルの培地への添加が脂肪由来幹細胞の呼吸活性に与える影響を示すグラフである。
図１から明らかなとおり、ローズマリーオイルは、培地中０．００５重量％及び０．０１重量％の濃度において、対照（オイル未添加培地）に比べて、脂肪由来幹細胞の呼吸活性に対する有意な賦活化作用が見出された。また、これらの結果から、ローズマリーオイルの賦活化作用には濃度依存性があることが示唆される。
ラベンダーオイルは、培地中０．００２重量％及び０．００５重量％の濃度において、対照に比べて、脂肪由来幹細胞の呼吸活性に対する有意な賦活化作用が見出された。但し、培地中０．０１重量％の濃度では、有意な賦活化作用はみられなかったことから、ラベンダーオイルが賦活化作用を発揮する濃度には、閾値が存在することが示唆される。
オリバナムオイルは、培地中０．００５重量％の濃度において、対照に比べて、脂肪由来幹細胞の呼吸活性に対する有意な賦活化作用が見出された。

本発明は、幹細胞の賦活化が求められる医薬品、化粧品、食品等の各種分野において、顕著な利用可能性を有する。

Claims

ローズマリーオイル、ラベンダーオイル及びオリバナムオイルからなる群より選択される１又は２以上を有効成分として含有する幹細胞賦活化剤。
幹細胞が間葉系幹細胞である請求項１記載の幹細胞賦活化剤。
請求項１又は２記載の幹細胞賦活化剤を含有する医薬品。
請求項１又は２記載の幹細胞賦活化剤を含有する化粧品。
請求項１又は２記載の幹細胞賦活化剤を含有する食品。