JP5905258B2 - 血小板由来成長因子−bb産生亢進剤、並びにそれを含む間葉系幹細胞産生促進剤、幹細胞安定化剤、及び真皮再生化剤 - Google Patents
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Description
また、組織損傷部位又はその近傍において血管が破壊されると、血管周皮細胞(ぺリサイト)である間葉系幹細胞は血管から離れて増殖し、失われた細胞を供給するとともに(非特許文献11〜14)、生物活性を持つ因子を放出して組織を保護し(非特許文献15〜19)、損傷した組織の修復・再生に作用する。これらの分泌因子は、血管形成や抗アポトーシスの作用のほか、免疫を強力に抑制する作用も有し(非特許文献21及び22)、T細胞やB細胞を介した損傷組織の破壊を抑える(非特許文献9及び22)ことも報告されている。
更に、間葉系幹細胞は、抗線維化の作用(非特許文献23及び24)や、多発性硬化症や糖尿病に対する効果(非特許文献9)も示すことが知られている。
[1]コケモモ由来物、マンゴスチン由来物、オウゴン由来物、イノシトール及びイノシトールリン酸から選択される1又は2以上の成分を有効成分として含んでなる血小板由来成長因子−BB(PDGF−BB)産生亢進剤。
[2]イノシトールを含むとともに、酵母エキスをさらに含んでなる、[1]に記載のPDGF−BB産生亢進剤。
[3]イノシトールがコメヌカ由来のイノシトールリン酸である、[1]又は[2]に記載のPDGF−BB産生亢進剤。
[4][1]〜[3]のいずれか1つに記載のPDGF−BB産生亢進剤を含んでなる、間葉系幹細胞産生促進剤。
[5][1]〜[3]のいずれか1つに記載のPDGF−BB産生亢進剤を含んでなる、幹細胞安定化剤。
[6][1]〜[3]のいずれか1つに記載のPDGF−BB産生亢進剤を含んでなる、真皮再生化剤。
コケモモ(学名:Vaccinium vitis-idaea L.)はツツジ科スノキ属の植物である。本発明ではコケモモ由来物として、コケモモの花、花穂、果穂、果皮、果実、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根皮、根、種子又は全草を粉砕後搾取したもの、又は粉砕後に溶媒等で抽出したもの、又は粉砕後に酵素処理や機械的処理等の処理により分解したものを用いることができる。
抽出は常温で行ってもよいが、加熱下で(例えば温水や熱水等の加熱した溶媒を用いて)行ってもよい。
上記溶媒で抽出して得た抽出液をそのまま、あるいは濃縮したエキスを用いるか、あるいはこれらエキスを吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー(例えばアンバーライトXAD−2)のカラムにて吸着させた後、メタノールまたはエタノールで溶出し、濃縮したものも使用することができる。また、公知の分配法(例えば水/酢酸エチル等を用いた分配法)により抽出した抽出物等も用いられる。
マンゴスチン(学名:Garcinia mangostana)はオトギリソウ科フクギ属の植物である。本発明ではマンゴスチン由来物として、マンゴスチンの果穂、果皮、果実、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根皮、根、種子又は全草を粉砕後搾取したもの、又は粉砕後に溶媒等で抽出したものを用いることができる。
抽出は常温で行ってもよいが、加熱下で(例えば温水や熱水等の加熱した溶媒を用いて)行ってもよい。
また、溶媒に酵素を加えて抽出処理を行ってもよい。酵素を加えることによって、果実の細胞組織を崩壊させることができ、これにより抽出効率をより高めることができる。酵素としては、細胞組織崩壊酵素を用いることが好ましい。このような酵素としては、例えば、ペクチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、α−アミラーゼ、フィターゼが挙げられる。これらの酵素は1種類を単独で用いてもよく、2種以上を混合して用いてもよい。
上記抽出溶媒を用いて得られる抽出液をそのまま使用することができるが、抽出溶媒を留去し、必要により乾燥した後に含有させてもよい。
オウゴン(学名:Scutellaria baicalensis Georgi, Labiatae)はシソ科タツナミソウ属の植物である。本発明ではオウゴン由来物として、オウゴンの果穂、果皮、果実、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根皮、根、種子又は全草を粉砕後搾取したもの、又は粉砕後に溶媒等で抽出したものを用いることができる。
抽出は常温で行ってもよいが、加熱下で(例えば温水や熱水等の加熱した溶媒を用いて)行ってもよい。
また、溶媒に酵素を加えて抽出処理を行ってもよい。酵素を加えることによって、果実の細胞組織を崩壊させることができ、これにより抽出効率をより高めることができる。酵素としては、細胞組織崩壊酵素を用いることが好ましい。このような酵素としては、例えば、ペクチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、α−アミラーゼ、フィターゼが挙げられる。これらの酵素は1種類を単独で用いてもよく、2種以上を混合して用いてもよい。
上記抽出溶媒を用いて得られる抽出液をそのまま使用することができるが、抽出溶媒を留去し、必要により乾燥した後に含有させてもよい。
イノシトールはビタミンBの一種と言われ、生体内でもグルコースから生合成されることが知られている。イノシトールは穀物、糠、マメ、果物等の植物にも含有されている。イノシトールはしばしば、そのヒドロキシ基がリン酸化された形態(イノシトールリン酸)で存在する。本発明では斯かるイノシトールリン酸も使用することができる。本発明に用いられるイノシトールには、イノシトールの各種の立体異性体が含まれる。イノシトールの立体異性体としては、cis-イノシトール(1,2,3,4,5,6/0-イノシトール)、epi-イノシトール(1,2,3,4,5/6-イノシトール)、allo-イノシトール(1,2,3,4/5,6-イノシトール)、myo-イノシトール(1,2,3,5/4,6-イノシトール、muco-イノシトール(1,2,4,5/3,6-イノシトール)、neo-イノシトール(1,2,3/4,5,6-イノシトール)、chiro-イノシトール(1,2,4/3,5,6-イノシトール)、及びscyllo-イノシトール(1,3,5/2,4,6-イノシトール)がある。イノシトールリン酸としては、イノシトールの6個のヒドロキシ基のうち任意の1又は2以上がリン酸化された化合物が挙げられる。中でも、イノシトールの6個のヒドロキシ基が全てリン酸化された化合物であるフィチン酸が好ましい。本発明で用いられるイノシトール又はイノシトールリン酸は、コメヌカ由来であることが好ましい。また、イノシトールリン酸の任意の塩も、本発明に使用できる。
本発明のPDGF−BB産生亢進剤は、コケモモ由来物、マンゴスチン由来物、オウゴン由来物、イノシトール及びイノシトールリン酸から選択される1又は2以上を有効成分として含有する。また、本発明の間葉系幹細胞産生促進剤、幹細胞安定化剤及び真皮再生化剤は、上記の有効成分を含む本発明のPDGF−BB産生亢進剤を含有する。本発明のPDGF−BB産生亢進剤、間葉系幹細胞産生促進剤、幹細胞安定化剤及び真皮再生化剤(以降これらを総称して「本発明の剤」という場合がある。)は、上記の有効成分の何れか1種を単独で含有してもよく、2種類以上を任意の組み合わせ及び比率で含有してもよい。
また、上述のように、間葉系幹細胞の産生亢進及び安定化が、血管の安定化、組織恒常性の維持、損傷組織の修復・再生(特に真皮の再生)、抗線維化、多発性硬化症や糖尿病等の各種疾患の予防・治療、メタボリックシンドローム等の慢性炎症に基づく各種状態の予防・改善等の用途に極めて有効であることが知られている。よって、本発明のPDGF−BB産生亢進剤を用いた本発明の間葉系幹細胞産生促進剤及び幹細胞安定化剤は、これらの用途に極めて有効に用いることが可能である。
PDGF−BBの産生亢進作用の評価対象サンプルとして以下を用いた。
市販のイノシトール粉末(和光純薬工業社製:ミオ-イノシトール)をPBSに溶解後、後述の培地に対して10ppmとなるように使用した。
市販のフィチン酸(ナカライテスク社製:50%水溶液)を、後述の培地に対して10ppmとなるように使用した。
オウゴンの周皮を除いた根を、70体積%エタノール(水とエタノールとの体積割合3:7の混合液)で抽出して得られた抽出物を用いた。抽出物は乾燥して保存し、使用直前に70体積%エタノールを加えて溶解させた上で、後述の培地に対して(抽出物の乾燥重量換算で)15ppmとなるように使用した。
コケモモの葉を細胞分解酵素(マセロチームA)で処理した細胞懸濁液に、1,3−BGを40体積%になるよう加えた懸濁液を用いた。懸濁液は液体として保存し、後述の培地に対して(抽出物の乾燥重量換算で)30ppmとなるように使用した。
マンゴスチンの樹皮を、70体積%1,3−BG(水と1,3−BGとの体積割合3:7の混合液)で抽出して得られた抽出物を用いた。抽出物は乾燥して保存し、使用直前に70体積%1,3−BGを加えて溶解させた上で、後述の培地に対して(抽出物の乾燥重量換算で)10ppmとなるように使用した。
ヒト血管内皮細胞HUVECをEGM-2培地(三光純薬)で継代培養し、継代4代目の細胞を、VEGF−Aを含まないHumedia-EG2培地(クラボウ)に懸濁して、コラーゲンコート24穴マルチプレート(旭硝子)に20,000個の割合で播種し、5%CO2存在下、37℃で細胞が集密に達するまで3〜5日間の培養を行った。上記の各サンプルを上記濃度となるように添加、又は各評価対象サンプルが溶解している溶媒を添加したHumedia-EG2培地(クラボウ)に交換した後、さらに2日間培養を行った。培養後の細胞からRNA抽出試薬MagNA Pure LC mRNA HSキット(Roche)と自動核酸抽出装置MagNA Pure LC 1.0 インスツルメント(Roche)を用いて、提供されたプロトコールに従ってmRNAの抽出・精製を行った。各サンプルについて、同容量のmRNAを鋳型に、後述の配列番号1及び2のプライマーペア、反応試薬QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit(Qiagen)と反応装置LightCycler(Roche)を用いて、PDGF−B遺伝子のワンステップ定量リアルタイム(RT)−PCRを行った。組成条件はQiagenのプロトコールに従った。また、RT−PCRの条件は、RT反応50℃で20分、初期変性95℃で15分、変性94℃で15秒、アニール60℃で20秒、伸長72℃で30秒とした。なお、G3PDHは内部標準として用い(配列番号3及び4のプライマーペア)、これを用いて対照群のmRNA量を補正した。
フォワードプライマー:5'-CCTGGCATGCAAGTGTGA-3'(配列番号1)
リバースプライマー:5'-CCAATGGTCACCCGATTT-3'(配列番号2)
G3PDH:
フォワードプライマー:5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'(配列番号3)
リバースプライマー:5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'(配列番号4)
上記評価手順に従い、上記各サンプルについて得られたPDGF−BBのmRNAの発現量の、対照(各評価対象サンプルが溶解している溶媒)について得られた発現量に対する比を、以下の表に示す。以下の結果から、これらの成分はPDGF−BB発現を亢進させる活性を有することが分かる。
Claims (3)
- コケモモ由来物、マンゴスチン由来物、オウゴン由来物、イノシトール及びイノシトールリン酸からなる群より選択される1又は2以上を有効成分として含んでなる血小板由来成長因子−BB(PDGF−BB)産生亢進剤。
- イノシトール又はイノシトールリン酸を含むとともに、酵母エキスをさらに含んでなる、請求項1に記載のPDGF−BB産生亢進剤。
- イノシトール又はイノシトールリン酸がコメヌカ由来である、請求項1又は2に記載のPDGF−BB産生亢進剤。
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