TWI472618B - 促進幹細胞分化爲胰島素生成細胞之方法 - Google Patents
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Description
本案關於促進幹細胞分化的方法,特別是關於促進幹細胞分化為胰島素生成細胞的方法。
糖尿病是造成許多併發症和死亡的主要原因,特別是心血管疾病、視網膜病變所導致的失明、截肢和腎衰竭。一般認為第1型糖尿病是肇因於胰臟貝他(beta)細胞無可回復的減損,第2型糖尿病則主要是因為體內胰島素作用降低所致。然而,現在有越來越多證據顯示這兩型糖尿病均與貝他細胞質量減少和胰島素分泌障礙有關。第1型糖尿病患的貝他細胞減少主要是因為自體免疫破壞貝他細胞,第2型糖尿病患則可能因為葡萄糖毒性、脂肪毒性、氧化壓力、內質網壓力、發炎細胞激素和人類胰島澱粉樣多胜肽(human iamyloid polypeptide)等多重因素而導致貝他細胞凋亡。
由於這兩型病患均有貝他細胞減損的問題,因此有構想透過胰臟移植和胰島移植來提供新的胰島細胞,使其內源性胰島素分泌及血糖恢復正常,可有效地治癒。然而,因捐贈胰臟來源不足、胰臟移植的手術風險與胰島移植需多次移植,及術後均需長期接受免疫抑制劑,使得此二項療法難以普
遍應用於糖尿病的治療。
近年來,科學家嘗試從細胞的觀點來解決此種問題。已知人類及小鼠胚胎幹細胞(embryonic stem cells;ES cells)具有自發性分化為胰島素分泌細胞的能力。透過改變培養基的組成,使得胰臟發育過程中所涉及的顯性轉錄因子表現,可使胚胎幹細胞優先地分化為胰島素生成細胞。
藉由胚胎幹細胞分化為胰島素生成細胞的技術,現代醫學可嘗試透過細胞療法將分化形成的胰島素生成細胞移植於第1型或第2型糖尿病患者,以達到治療的效果。
本發明人等有鑑於上述之技術背景,致力於研究有效使幹細胞分化為胰島素生成細胞之方法,進而完成本案發明。
具體地說,本案揭露一種促進幹細胞分化為胰島素生成細胞之方法,包括:於培養該幹細胞的培養基中,添加山竹素作為分化促進劑。
第1圖顯示根據本案一實施例而分化的小鼠胚胎幹細胞所表現的胰臟細胞的胜肽標記。
第2圖顯示根據本案一實施例而分化的小鼠胚胎幹細胞所分泌胰島素量具有葡萄糖依存性(glucose-dependent)。
第3圖顯示根據本案一實施例經過α
-山竹素的處理而分化的小鼠胚胎幹細胞的胰島素分泌量。
具體而言,本案揭露,於幹細胞的培養基中,添加山竹素作為分化促進劑,用以促進幹細胞分化為胰島素生成細胞之方法。由於用於刺激幹細胞分化的小分子化合物,必須考量其生物安全性以及是否具有刺激幹細胞分化為特定細胞的有效性,本發明人等選用目前已周知作為保健食品的山竹素(mangostin)進行試驗,並發現山竹素的添加可促進由幹細胞分化的胰島素生成細胞的胰島素分泌量,並且不具細胞毒性。
首先,本發明人等研究如何有效地使胚胎幹細胞分化為胰島素生成細胞的培養方法,並已刊登於期刊Szu-Hsiu Liu and Lain-Tze Lee,“Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Insulin-Producing Cells,”Experimental Diabetes Research,vol.2012,Article ID 201295,5 pages,2012.doi:10.1155/2012/201295,在此作為本案參考。
根據本案發明,本發明人等藉由下列兩分化步驟,有效地使小鼠胚胎幹細胞分化為胰島素生成細胞:(i)在單層細胞培養時添加Activin A以形成明確的內胚層(definitive endoderm);以及(ii)在上述形成的單層內胚層中添加菸鹼胺(nicotinamide)、胰島素(insulin)、及層黏蛋白(laminin),使該單層內胚層分化為胰島素生成細胞。根據本發明人等提出的方法,可使胚胎幹細胞分化的時間縮短至約7天左右,並且,所得到的分化後的胚胎幹細胞可表現胰臟細胞所表現的胜肽標記(peptide markers),且所分泌的胰島素具有葡萄糖依存性(glucose-dependent),可確認該胚胎幹細胞已有效地分化為胰
島素生成細胞。
於本案一實施例中,對於以上述步驟處理的胚胎幹細胞,於分化處理1天後,於培養基中添加山竹素,再依上述步驟進行分化約7天,所得的分化後胚胎幹細胞呈現胰島素分泌量受到促進的效果。然而,山竹素作為幹細胞分化為胰島素生成細胞的分化促進劑的效果,並不限於本發明人等所揭露的特定分化方法,對於目前已公開的刺激幹細胞分化的方法及培養基,亦皆適用。亦即,對於目前期刊文獻所揭露的刺激幹細胞分化為胰島素生成細胞的方法及培養基中,添加山竹素的處理,同樣可達到促進分化及提高分化後細胞的胰島素分泌量的效果。
又本案所揭露之方法可用於來自哺乳動物的胚胎幹細胞或成體幹細胞,例如臍帶血幹細胞、骨髓幹細胞、成人周邊血液幹細胞等。由於胚胎幹細胞獲得自發育4-5天的胚胎,此時胚胎內的細胞會形成中空微小的囊胚(blastocyst),將來各自可分化發育成一個完整個體所需的所有細胞組織,因此為較佳的分化對象。又本案可使用的哺乳動物可例如鼠、兔、豬、牛、狗、貓、猴、猿、或人類等,沒有特別限制。
本案所使用之山竹素(mangostin)可來自山竹果皮的萃取物。山竹(Garcinia Mangostana
L.)為特產於東南亞的植物,當地的傳統醫學將山竹果皮應用於治療皮膚感染及傷口處理已行之有年。已知可透過溶劑萃取法、矽膠管柱層析法(silicon chromatography)、及/或高速液相層析法(HPLC),從山竹果皮中純化、分離出如下式(I)之α-山竹素、β-山竹素、或γ-
山竹素。
式(I)中,當R1
為甲基、R2
為氫時,表示α-山竹素;當R1
、R2
分別為甲基時,表示β-山竹素;當R1
、R2
分別為氫時,表示γ-山竹素。
本案一實施例中,添加α
-山竹素作為分化促進劑,但亦可使用β-山竹素、γ-山竹素或這此等之組合,沒有特別的限制。本案所添加的山竹素的含量,相對於培養該幹細胞的培養基的總體積而言,可為50~100μg/ml。
根據本案發明,透過山竹素的處理,可有效地促進幹細胞分化為胰島素生成細胞並且提高胰島素的分泌量,有效地應用於糖尿病患者的治療。
以下說明本發明較佳實施形態,為了明確化說明,適當地省略及簡略化以下的記載以及圖式。再者,本發明不限於上述各實施形態。在本發明的範圍內,此業者可容易變更、追加、變換上述實施形態的各要素。
材料
白血病抑制因子(LIF)購自Chemicon。小鼠明膠購自BD(Becton,Dickinson and Company)。培養基與胎牛血清(FBS)購自Hyclone Laboratories Inc.。ActivinA購自R&D system。其他化學品購自Sigma-Aldrich。
細胞的培養及分化
在塗覆有明膠的燒瓶中,配製DMEM(Dulbecco’s modifies Eagle’s medium),以4mM L-麩醯胺酸調整為含有1.5g/L碳酸氫鈉及4.5g/L葡萄糖、添加15%胎牛血清(FBS)的0.1mM的2-巰基乙醇、及1400units/mL白血病抑制因子(LIF),於37℃、5%CO2
使小鼠胚胎纖維母細胞(embryonic fibroblast)生長於其上,形成飼養層細胞(feeder layer),再進一步將未分化的ESD3小鼠胚胎幹細胞株(BCRC 60205)培養於其上。之後,將ES-D3細胞轉移到塗覆有明膠的燒瓶30分鐘,移除飼養層細胞。ES-D3細胞以每井(well)1×106
個細胞接種於含有添加2mM L-麩醯胺酸、100μM非必要胺基酸、10ng/mL的activin A、10mM菸鹼胺(nicotinamide)、及1μg/mL層黏蛋白(laminin)與10%FBS的DMEM/F-12培養基之膠原蛋白I型塗覆的培養盤過夜。之後將ES-D3細胞培養於添加2mM L-麩醯胺酸、100μM非必要胺基酸、10ng/mL的activin A、10mM菸鹼胺(nicotinamide)、25μg/mL胰島素、及1μg/mL層黏蛋白(Laminin)與2%FBS的DMEM/F-12培養基6天。
RNA的分離與RT-PCR的分析
使用PureLinkTM
Micro-to-Midi Total RNA(Invitrogen)根據操作手冊分離上述未分化及分化的幹細胞的總RNA。具體地為,在oligo-dT存在下,以Superscript(Invitrogen)使RNA樣本進行反轉錄(每次反應1μg),此反轉錄反應以Taq聚合酶擴增。所得的cDNA使用特定引子擴增。對於下列標記胜肽以特定引子擴增:
明確的內胚層標記Sox7(順向引子為SEQ ID NO:1;反向引子為SEQ ID NO:2);內分泌原始細胞標記Ngn3(順向引子為SEQ ID NO:3;反向引子為SEQ ID NO:4);胰島素轉錄因子Pax4(順向引子為SEQ ID NO:5;反向引子為SEQ ID NO:6);胰島素轉錄因子Pax6(順向引子為SEQ ID NO:7;反向引子為SEQ ID NO:8);胰島素β
-細胞標記Insulin 1(順向引子為SEQ ID NO:9;反向引子為SEQ ID NO:10);胰島素β
-細胞標記Insulin 2(順向引子為SEQ ID NO:11;反向引子為SEQ ID NO:12);蘭氏α
-細胞分泌之昇糖素(Glucagon)(順向引子為SEQ ID NO:13;反向引子為SEQ ID NO:14);澱粉酵素(Amylase)(順向引子為SEQ ID NO:15;反向引子為SEQ ID NO:16);蘭氏δ-細胞分泌之體益素(Somatostatin)(順向引子為SEQ ID NO:17;反向引子為SEQ ID NO:18);β
5-微管蛋白(tubulin)(順向引子為SEQ ID NO:19;反向引子為SEQ ID NO:20)。
起始的反轉錄步驟為:變性步驟(94℃、5分鐘),之後進行30次循環的變性(94℃、30秒)、黏合(60℃、30秒)、延展(72℃、30秒),之後延長(72℃、7分鐘),進行擴增。但昇糖素(Glucagon)與Insulin 2的黏合條件分別為55℃、30秒及65℃、30秒。之後,
將PCR產物於2%洋菜膠上進行電泳分離,得到第1圖所示之電泳結果,其中R0表示未分化細胞,R7表示分化後細胞。
胰島素分泌量的檢測
將經過上述分化的細胞以每井(well)1×106
個細胞接種於一24井的培養盤,培養過夜,在無添加胰島素的DMEM/F-12培養基中生長24小時。之後以含有2.5mM葡萄糖的Krebs-Ringer碳酸氫鹽HEPES緩衝液(KRBH)清洗該細胞兩次,在37℃預先培養1小時。之後分別於含有2.5、5.5、12.5mM葡萄糖的KRBH緩衝液(含50Mm甲苯磺丁酸(tolbutamide))培養1.5小時。以ELISA(Mercodia)測定胰島素含量。
統計分析
上述步驟皆至少經過三次。所得數據以平均值±標準差(SD)表示,使用單因子變異數分析(ANOVA,SAS 9.1.3,USA),之後以Tukey’s test確認是否存在顯著差異。P值低於0.05者認為有統計學上的顯著差異。結果如第2圖所示。
α
-山竹素的添加對胰島素分泌的影響
同樣進行上述「細胞的培養及分化」之步驟,但是在培養未分化的ESD3小鼠胚胎幹細胞株一天後,於分化培養基中分別添加0、50、100μg/ml的α
-山竹素,之後同樣培養7天。接著,以相同於上述「胰島素分泌量的檢測
」的步驟,進行預先培養,並進行ELISA分析及統計分析,得到如第3圖及下表1之結果。
結果分析
如第1圖所示,經上述分化的小鼠胚胎幹細胞表現胰臟轉錄因子(Pax4及Pax6)、內分泌原始細胞標記(Ngn3)、明確的內胚層標記(Sox7)、胰臟外分泌標記(Amylase)、胰島素β
-細胞標記(Insulin 1、Insulin 2)、及蘭氏α
-細胞、δ-細胞(Glucagon、Somatostatin)。其中,β
5-微管蛋白(tubulin)用於作為管家基因(housekeeping gene)的標準。第1圖顯示經上述分化之小鼠胚胎幹細胞成功地分化為胰島素生產細胞。
再根據第2圖,上述經分化的小鼠胚胎幹細胞培養於含有葡萄糖的培養基的情形,顯示該經分化的小鼠胚胎幹細胞釋放胰島素的情形具有葡萄糖劑量的依存性(dose dependent)。如第2圖所示,在含有12.5mM葡萄糖的培養基中,胰島素的分泌量是在含有5.5mM葡萄糖的培養基中的兩倍左右,在含有2.5mM葡萄糖的培養基中的三倍左右。
根據第3圖及表1所示之添加α
-山竹素的情形,添加的α
-山竹素對細胞的毒性不強,但是卻能明顯地提高胰島素分泌量(具有統計學上的顯著差異p<0.05),可顯見α
-山竹
素促進小鼠胚胎幹細胞分化為胰島素生成細胞的功效。
<110> 財團法人工業技術研究院
<120> 促進幹細胞分化為胰島素生成細胞之方法
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Claims (5)
- 一種促進幹細胞分化為胰島素生成細胞之方法,包括:於培養該幹細胞的培養基中,添加相對於該培養基總體積的50~100μg/ml的α-山竹素作為分化促進劑,其中該幹細胞為胚胎幹細胞。
- 如申請專利範圍第1項所述之促進幹細胞分化為胰島素生成細胞之方法,其中,該幹細胞的培養基中包含選自由下列成分所組成之群組中的至少一種:Activin A、菸鹼胺(nicotinamide)、胰島素(insulin)、及層黏蛋白(laminin)。
- 如申請專利範圍第1項所述之促進幹細胞分化為胰島素生成細胞之方法,其中該幹細胞來自包含人的哺乳動物。
- 如申請專利範圍第1項所述之促進幹細胞分化為胰島素生成細胞之方法,其中該α-山竹素萃取自山竹果皮。
- 如申請專利範圍第1項所述之促進幹細胞分化為胰島素生成細胞之方法,其中該α-山竹素為下式所示之化合物:
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TW201121556A (en) * | 2009-12-28 | 2011-07-01 | Ind Tech Res Inst | Pharmaceutical compositions for treatment of arthritis and/or modulating secretion of cytokines and uses thereof |
US20130004533A1 (en) * | 2011-07-01 | 2013-01-03 | Shiseido Company, Ltd. | Platelet-derived growth factor-bb production promotor, and mesenchymal stem cell production accelerator, stem cell stabilizer and dermal regenerator comprising the same |
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- 2014-01-15 TW TW103101378A patent/TWI472618B/zh active
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