JP2005514944A - 胚性幹細胞の機能性細胞への分化誘導方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、以下の工程を含む胚性幹細胞の機能性細胞への四段階の分化誘導方法を提供する:1)ES細胞の増殖;2)白血病抑制因子および塩基性FGFの存在下での胚様体誘導;3)EBの選択・増殖;および4)分化。本発明によると、ES細胞はインスリン分泌性膵島様細胞群または神経様細胞へと分化しうる。このようにして得られる機能性細胞は多くの患者のための細胞移植治療におけるドナー細胞の有力な供給源となりうる。
Description
本発明は、哺乳類の胚性幹細胞の機能性細胞への分化誘導方法に関する。本発明はまた、本発明によって得られる機能性細胞および機能性細胞を患者に移植することによる患者の治療方法に関する。
多能性幹細胞は2種類の胚由来の系譜から導き出される。胚性幹(ES)細胞は着床前の胚盤胞の内部細胞塊に由来し、胚性生殖(EG)細胞は始原生殖細胞(PGC)に由来する。ES細胞とEG細胞はどちらも多能性があり、生殖系列にも分化できるため実験的にキメラをつくることができる。マウスのES細胞とEG細胞はいくつかの形態学的性質を共有しており、いずれの細胞も細胞内のアルカリホスファターゼ(AP)が高値で、かつ細胞表面に特定の糖脂質や糖蛋白を発現している。これらの性質は多能性幹細胞に固有の性質ではないが、共通してみられる性質である。他の重要な性質としては、多細胞クローンとして増殖すること、正常で安定な核型をもつこと、長期間の継代が可能であること、三胚葉に由来するすべての細胞に分化しうることなどがある。これらの性質の多くを共有している多能性幹細胞系は、鶏、ミンク、ハムスター、豚、アカゲザル、マーモセットでも報告されている。幹細胞はまた、しばしばその個体の生涯を通じて無制限に分裂(自己増殖)する能力を有している細胞である。適切な条件のもと、あるいは適切なシグナルが与えられることで幹細胞は多くの異なる細胞を生み出し(分化)、臓器を形成し得る。
近年、S.H. Leeらが行った研究において(Nature Biotechnology 18、675 - 679 (2000)、この文献の開示内容を引用により本出願に含める)、ES細胞から中枢神経系の前駆細胞集団を作り出し、これらの細胞を増殖させ、ES細胞からマイトージェンと特定のシグナル分子の存在下でドーパミン産生やセロトニン産生神経への分化誘導を行ったことが記載されている。神経細胞の分化・成熟は培地からマイトージェンを取り除くことで完成した。この実験系はインビトロ、および生体内におけるこれらの神経細胞の機能をコントロールする分子機構の解析の強力な道具となり、神経変性疾患や精神科的疾患の研究や治療にも応用できる可能性がある。
またH. Kawasakiらの研究において (Neuron 28、31-40(2000)、この文献の開示内容を引用により本出願に含める)、彼らはマウスのES細胞を神経へと分化誘導する間質細胞由来誘導活性因子(stromal cell-derived inducing activity(SDIA))を同定した。SDIAはPA6間質細胞の表面に蓄積し、無血清条件下でES細胞とともに培養されるとレチノイン酸や胚様体がなくても効率よく神経の分化を誘導する。BMP4はアフリカツメガエル(Xenopus)において神経分化を抑制するモルフォーゲンとして働くが、これはSDIAによる神経誘導を抑制し、表皮への分化を促進する。ドーパミンを産生するチロシンハイドロキシラーゼ陽性神経細胞は、このSDIAによって操作されたES細胞から多く得られる。SDIAによって誘導されたドーパミン産生神経細胞は移植されるとマウスの線条体に集まり、チロシンハイドロキシラーゼの発現は維持される。SDIAによる神経誘導は基礎神経科学の研究や臨床応用への有力な方法となる。
B.Soriaらの研究ではマウスの胚性幹細胞はI型糖尿病患者における細胞治療に利用可能な新規な細胞供給源として紹介された(Diabetes 49: 157-162 (2000)、この文献の開示内容を引用により本出願に含める)。細胞トラップシステム(cell-trapping system)を用いて彼らは未分化なES細胞からインスリン分泌細胞のクローンを取り出した。遺伝子導入によって、ヒト・インスリン遺伝子の調節領域の制御でネオマイシン選択システムが発現できるようにした。キメラ遺伝子には感染させた細胞を選択するためハイグロマイシン耐性遺伝子(pGK−hygro)も組み込まれていた。完成したクローン(IB/3x−99)は16.5ng/μgタンパク質のインスリンを発現し、インビトロでは種々の分泌促進物質によってホルモンの分泌はコントロールされた。このクローンから得られた細胞集団は、ストレプトゾトシンによる糖尿病モデル動物の脾臓に移植された。移植された動物は、1週間以内に高血糖が是正され4週間で体重が回復した。腹腔内糖負荷による耐糖能検査では、移植された群は正常群に比べて回復の遅延を示したが、食事負荷後の血糖値は同じように正常化した。これらの試みはI型、II型糖尿病治療における組織移植の新たな可能性を広げるとともに、遺伝子治療という選択肢も提示している。
S. Assadyらの研究では(Diabetes 50: 1691-1697 (2001)、この文献の開示内容を引用により本出願に含める)、多能性未分化ヒト胚性幹細胞(hES)を系特異的分化のモデルとして用いた。hES細胞を付着条件と浮遊条件で培養しインスリンを分泌する膵β細胞の性質を持つ細胞の新生を含めた、インビトロにおける自然な分化を観察した。インスリン免疫組織染色では細胞の多くが陽性であった。インスリンの培養液中への分泌は、分化が進むに従って増加し、他の膵β細胞のマーカーの発現と関連があった。これらの発見はhES細胞のモデルが糖尿病における移植治療の有力な供給源として、ヒト膵β細胞やその前駆細胞を豊富に与え得ることを証明している。
Su-Chun Zhangらの研究では(Nature Biotech. 19、1129-1133 (2001)、この文献の開示内容を引用により本出願に含める)ヒトES細胞から神経前駆細胞のインビトロ分化、濃縮、および移植について開示している。胚様体への凝集の際、分化中のES細胞は、線維芽細胞成長因子2(FGF−2)の存在下で多数の神経管様構造を形成した。かかる構造にある神経前駆細胞を選択的酵素消化によって単離し、さらに接着性の相違に基づいて精製した。FGF−2を除いた後、神経細胞、星状細胞および乏突起膠細胞へと分化した。新生児期マウス脳へ移植した後、ヒトES細胞由来の神経前駆細胞は様々な脳領域へと取り込まれ、神経細胞および星状細胞に分化した。移植されたマウスにおいて奇形腫の形成は観察されなかった。これらの結果は、ヒトES細胞は神経系修復能を有する移植可能な神経前駆細胞の供給源であることを示す。
Nadya Lumelskyらは、マウス胚細胞から膵島に類似する組織像を示すインスリン分泌細胞群を分化させる一連の研究を発表した(Science 292、1389-1394 (2001)、その開示内容を引用により本出願に含める)。彼らはマウスのES細胞からインスリンや他の膵内分泌ホルモンを発現する細胞群を作成した。その細胞群は集まって3次元構造を構築し、神経細胞と密接な関係を持つ正常な膵島と類似する形態となる。生体での反応と同じ機序でこれらの細胞群はグルコースに反応し、インスリンを分泌する。糖尿病マウスに注入されると、このインスリン分泌細胞は血管誘導を受け、組織構造を維持し膵島様の器官となる。
しかしながら、Lumelskyにより得られたインスリン分泌細胞は膵臓細胞のマーカーであるアミラーゼおよびカルボキシペプチダーゼを発現するものではなかった。また、得られたインスリン分泌細胞を糖尿病モデル動物に移植しても、高血糖症状の改善は認められなかった。
I型糖尿病患者は日本、アメリカ合衆国においてそれぞれ700万あるいは1600万人いる。現在のところ糖尿病の治療法として、日常的なインスリンの投与や同種膵臓移植などが行われている。膵臓移植は近年、成功率が顕著に上昇しているが、臓器移植には非常に侵襲性の手術と一生涯にわたる免疫抑制療法が必要であり、これによる患者の拘束は甚だしい。また、ドナー数が圧倒的に不足しており一般的な治療法として採用することは難しい。それゆえ、膵臓移植に代わる、簡便かつ普遍的な糖尿病治療法の開発が強く望まれている。
本発明の1つの目的は、多能性胚性幹細胞から機能性細胞、特に膵島様細胞群および神経様細胞への新規な分化誘導方法を提供することである。
本発明の別の目的は、膵島機能に障害を有する患者の治療方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、神経細胞変性または脊髄障害を患う患者の治療方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、哺乳類のES細胞由来であって膵島様または神経様の機能を示す機能性細胞を提供することである。
したがって、本発明は以下の段階を含む哺乳類の胚性幹細胞から機能性細胞への分化誘導方法を提供する:
1)哺乳類の胚性幹細胞をフィーダー細胞とともに、白血病抑制因子を含有する培地を用いて培養する;
2)得られた細胞をフィーダー細胞の非存在下、白血病抑制因子および塩基性線維芽細胞成長因子(以下bFGFと称する)を含有する培地を用いて浮遊条件で培養し、胚様体を得る;
3)得られた胚様体を選択・増殖培地で培養する;そして、
4)得られた細胞集団を分化培地を用いて培養して機能性細胞を得る。
1)哺乳類の胚性幹細胞をフィーダー細胞とともに、白血病抑制因子を含有する培地を用いて培養する;
2)得られた細胞をフィーダー細胞の非存在下、白血病抑制因子および塩基性線維芽細胞成長因子(以下bFGFと称する)を含有する培地を用いて浮遊条件で培養し、胚様体を得る;
3)得られた胚様体を選択・増殖培地で培養する;そして、
4)得られた細胞集団を分化培地を用いて培養して機能性細胞を得る。
本発明によると、膵島様細胞群や神経様細胞などの機能性細胞を哺乳類のES細胞から分化させることができる。
本発明により誘導される膵島様細胞塊は、インスリン産生能を有し、グルコースによる刺激に応答してインスリンを分泌し、かかる細胞群を構成する細胞は膵細胞に関連のある内分泌および外分泌マーカー(例えば、インスリン、グルカゴン、Glut-2、島アミロイドポリペプチド、アミラーゼおよびカルボキシペプチダーゼ)を発現する。
本発明により誘導される神経様細胞は、神経繊維状の形態を示し、かかる細胞群を構成する細胞は神経細胞に関連付けられるマーカー(例えば、ネスチン、β−チューブリンIII、セロトニン、チロシンハイドロキシラーゼNurt 1)を発現する。
本発明の方法によりマウスES細胞から誘導したインスリン分泌性島様細胞群をストレプトゾトシン誘導性糖尿病マウスに移植したところ、正常に近いレベルまで血糖値を下げることができた。このことから、本発明より得られるインスリン分泌性膵島様細胞群が糖尿病の治療に有用であることが示される。
本発明はさらに、本発明による同種ES細胞から誘導された島様細胞群を患者に移植することを含む膵島機能に障害のある哺乳類患者の治療方法を提供する。
本発明はまた、本発明による同種ES細胞から誘導された神経様細胞を患者に移植することを含む神経変性疾患または脊髄傷害を患う患者の治療方法を提供する。
さらに本発明は、本発明の方法によって哺乳類のES細胞から誘導される膵島様細胞群や神経様細胞などの機能性細胞を提供する。機能性細胞は細胞移植による治療に有用であるだけでなく、膵島細胞や神経機能に影響を与えるかあるいは機能を修復する様々な新規薬剤のインビトロでのスクリーニングや新規薬剤の安全性試験に用いることができる。
本出願の明細書、特許請求の範囲および図面において、「胚性幹細胞」または「ES細胞」の語は、授精未分化胚芽細胞のインビトロ内部細胞塊由来の多能性細胞を意味する。
「胚様体」または「EB」は、ES細胞のインビトロでの凝集により形成される三胚葉から構成される細胞集団を意味する。
本明細書において用いるフィーダー細胞層は周知方法によって作成されるものであり、マウス胎生線維芽細胞から得られる。フィーダー細胞は市販のものを使用できる。
本発明において用いる哺乳類のES細胞は特に限定されず、例えば、げっ歯類のものでもよく(マウスES細胞およびラットES細胞)、霊長類のものでもよい(カニクイザルES細胞およびヒトES細胞)。今日、様々なES細胞を入手することができ、例えば、マウスやヒトのEC細胞から得られる。あるいは本発明において用いるES細胞は公知文献で報告されている方法により哺乳類受精卵から得てもよい。例えば、ヒト胚性幹細胞の安定な培養物を得る技術は、Thomsonら(米国特許第5843780号および6200806号; Science vol. 282 1145-1147 (1998)、かかる文献の開示内容は引用により本出願に含まれる)によって記載されている。
本発明の方法の第1段階は、従来から知られているES細胞の増殖段階である。これは例えば、N. Lumelsky et al.、Science 292、1389-1394 (2001)(この文献の開示内容を引用により本出願に含める)に記載されている。
典型的にはマウス胎性フィーダー細胞をゼラチンでコーティングした培養容器の底に層状に培養した上へ、白血病抑制因子(以下「LIF」と称する)を含有するES細胞増殖培地を用いてES細胞を培養する。かかる条件で培養することによって、ES細胞は未分化のまま無限に増殖させることができる。
本発明の方法において、フィーダー細胞は、市販のものを適宜用いればよく、また常套の方法でマウス胎性線維芽細胞から誘導したものを用いてもよい。
第1段階に用いられるES細胞増殖培地は、LIFを100−10000U/ml含んでいるものが用いられる。この段階で用いる培地としては、LIFを含有し、ES細胞の増殖に有用であるいかなる培地を用いてもよい。特に好適な培地は例えば、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地 (Life Technology (以下、Life Tech,と略称する)、Grand、NY)に20%ウシ胎児血清リプレースメント(replacement) (Life Tech.)、2%非必須アミノ酸 (Life Tech.)、0.1mmol/lの2−メルカプトエタノール (Life Tech.)、1000U/mlの白血病抑制因子(LIF; Life Tech.)および2mmol/lのL−グルタミン (Life Tech.)を添加したものが例示される。
第1段階では、所望の量のES細胞が得られるまで培養する。典型的には3〜7日培養すればよい。得られたES細胞を次の段階に供する。
本発明の誘導方法の全段階を通して、細胞または細胞集団の培養は通常の細胞培養条件、例えば37℃、95%空気中5%CO2加湿雰囲気下で行えばよい。
第2段階では、LIFおよびbFGFを添加した培地にてES細胞を浮遊培養により増殖させる。従来はLIFの存在によってES細胞の未分化性が保たれており、LIFを除去しなくてはES細胞からの分化誘導は不可能であると考えられていた。したがって、本発明者らの知る限りでは、EBの誘導条件としては従来から提唱されているものがいくつかあるが、これらはすべて増殖させたES細胞をLIFを含有しない培地で浮遊培養してそれを凝集させるものである(例えば、Su-Chen Zhang et al.、Nature biotechnology、19、1129-1133 (2001)、この文献の開示内容を引用により本出願に含める)。
これに対して本発明者らはLIFおよびbFGFを添加した培地を用いることによって、ES細胞から、非常に効率良くEBを形成させることに成功した。
本発明の第2段階において用いる培地には、LIFとbFGFを含有させる。培地中のLIFは好ましくは約100―10000U/mlとする。培地中のbFGFは好ましくは約2〜100ng/mlとする。第2段階において用いられる培地にはさらに、1または複数の成長因子、例えばアクチビン、神経増殖因子など、サイトカイン類、例えばインターロイキン1、インターロイキン2など、ビタミン類、例えばレチノールやニコチンアミド類、追加的アミノ酸、例えばチロシン、リジン、および細胞外マトリックス成分、例えばフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ヘパリンなどを常套の細胞培養用培地へ適宜添加したものを用いればよい。第2段階において用いられる特に好ましい培地としては、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地(Life Tech.)に20%ウシ胎児血清リプレースメント(Life Tech.)、2%非必須アミノ酸(Life Tech.)、0.1mmol/lの2−メルカプトエタノール(Life Tech.)、1000U/mlの白血病抑制因子 (LIF; Life Tech.)、2mmol/lのL−グルタミン(Life Tech.)および4ng/mlのbFGF (R&D systems、Minneapolis)を添加したものが例示される。
第2段階では、ES細胞をフィーダー細胞層を用いずに浮遊培養して、細胞を凝集させて胚様体を得る。EBの形成は顕微鏡下で判断すればよい。本発明によると、EB形成は浮遊培養から2日程度で観察される。浮遊培養を5〜10日続けて十分な量のEBを得る。本発明によると、LIFもbFGF培地も含有しない培地による従来の浮遊培養による場合と比較して、格段に多いEBが誘導される。
第2段階で得られたEBを次いで、選択・増殖段階(第3段階)に供する。第3段階において、得られたEBをタンパク質(例えばコラーゲンタイプIV)でコーティングした培養容器へ移し、適当な選択・増殖培地を用いて培養する。EBはタンパク質でコーティングした培養容器で第2段階に用いた培地により約2日間培養し、その後培地を選択・増殖培地と交換するのが好ましい。
第3段階に用いる選択・増殖培地は好ましくは無血清細胞培養用培地にニコチンアミド、インスリンおよびフィブロネクチンを添加したものである。この段階で用いる培地はさらに1または複数の成長因子、例えばアクチビン、神経増殖因子など、サイトカイン、例えばインターロイキン−1やインターロイキン−2、ビタミン類、例えば、レチノール、追加的アミノ酸、例えばチロシンやリジン、そして細胞外マトリックス成分、例えば、ラミニン、コラーゲンおよびヘパリンなどを常套の細胞培養用培地へ適宜添加したものを用いればよい。好ましい培地の例は無血清DMEM/F−12培地にニコチンアミド、フィブロネクチン、およびN−2サプリメント(GIBCO、17502-014:水中、インスリン500μg/ml、ヒトトランスフェリン10000μg/ml、プロゲステロン0.63μg/ml、プトレシン1611μg/mlおよび亜セレン酸0.52μg/mlからなる)を添加したものが挙げられる。
第3段階において、EBを選択・増殖培地で3〜14日間、好ましくは4〜7日間培養する。
第3段階で得られた細胞集団を容器から剥離し、その底面がタンパク質またはアミノ酸でコーティングされた培養容器に移す。移した細胞集団をさらに分化培地で培養する。
第4段階において、細胞集団を膵島様細胞群または神経様細胞へと分化させることができる。
膵島様細胞群へ分化誘導する場合には、細胞集団を無血清細胞培養用培地にニコチンアミド、インスリンおよびラミニンを追加した培地で培養するとよい。さらに1または複数の成長因子、例えばアクチビンおよび神経増殖因子、サイトカイン、例えばインターロイキン−1やインターロイキン−2、ビタミン類、例えばレチノール、追加的アミノ酸、例えばチロシンやリジン、および細胞外マトリックス成分、例えばフィブロネクチン、コラーゲンおよびヘパリンなどを常套の細胞培養用培地へ適宜添加したものを用いてもよい。特に好ましくは、無血清DMEM/F12培地にニコチンアミド、ラミニンおよびN−2サプリメントを追加した培地を用いる。
本発明の方法において、神経様細胞へと分化させるには、細胞集団をリジン及びラミニンを添加した無血清細胞培養用培地で培養するとよい。培地には上記のほかに、1または複数の成長因子、例えばアクチビンおよび神経増殖因子、サイトカイン、例えばインターロイキン−1およびインターロイキン−2、ビタミン類、例えばレチノールおよびニコチンアミド、追加的アミノ酸、例えばチロシンやリジン、および細胞外マトリックス成分、例えばフィブロネクチン、コラーゲンおよびヘパリンなどを常套の細胞培養用培地へ適宜添加したものを用いればよい。特に好ましい例は、リジン、ラミニンおよびN−2サプリメントを追加した無血清DMEM/F12培地である。
第4段階において、細胞集団は3〜90日間、あるいはそれ以上培養する。4〜12日間の培養で十分に、所望の機能性細胞へと分化するが、さらなる培養により分化した集団を増殖させるとよい。
本発明の方法によって得られる膵島様細胞群は、インスリン産生能を示し、グルコースによる刺激に応答してインスリンを分泌するのみならず、集団を構成する細胞は、膵内分泌細胞(インスリン、グルカゴン、Glut−2および島アミロイドポリペプチド)および膵外分泌細胞(アミラーゼおよびカルボキシペプチダーゼ)に特異的な遺伝子を発現する。
本発明により得られる神経様細胞は、神経繊維状の形状を示し、ネスチン、β−チューブリンIII、セロトニン、チロシンハイドロキシラーゼなどの神経細胞に関連するマーカーを発現する。それゆえ、該神経様細胞は成熟神経細胞になる能力を有する。
マウスES細胞とヒトES細胞はインビトロで増殖し、一年以上も未分化状態にて多能性を維持することができることから、本発明の方法は細胞移植治療に使用される十分な量のドナー細胞の供給源として利用可能である。
本発明はさらに、本発明による同種ES細胞から誘導された島様細胞集団を患者に移植することを含む、膵島機能に障害のある哺乳類患者の治療方法を提供する。本発明において、「膵島機能に障害のある哺乳類患者」には、これらに限定されないが、I型糖尿病患者、膵臓摘出患者およびインスリン要求性糖尿病患者、例えばII型糖尿病患者または嚢胞性線維症患者が含まれる。哺乳類患者はヒト患者であってもよい。
この態様において、上記のように得られた膵島様細胞群の移植は臨床的に実践または提案されている島移植プロトコール(例えば、Kazutomo Inoue and Masaaki Miyamoto、J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 7: 163-177 (2000)、および Wenjing Wang et al.、Transplantation 73: 122-129 (2002); かかる文献の開示内容は引用により本出願に含める)に従って行えばよい。例えば、膵島様細胞群は肝臓に門脈内移植してもよい。あるいは膵島様細胞群は、未血管形成(prevascularized)皮下部位に移植してもよい。該細胞群は移植前に生体適合性材料によってマクロカプセル封入してもよい。移植すべき細胞群の量は得られた細胞群のタイターおよび治療すべき患者の全身症状、年齢、性別、体重などに基づき当業者に決定されよう。
さらに、本発明は同種ES細胞由来の神経様細胞を患者に移植することを含む神経機能に障害のある哺乳類患者の治療方法も提供する。本発明において、「神経機能に障害のある哺乳類患者」には、これらに限定されないが、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、クロイツフェルトヤコブ病あるいは脊髄傷害を患う患者が含まれる。哺乳類患者はヒト患者であってもよい。
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。かかる実施例は例示の目的であり本発明を限定するものではない。
マウスES細胞からの膵島様細胞群の分化
第1段階
未分化ES細胞の増殖
本実施例において、マウスES細胞系129sv(11継代(大日本製薬(株)日本国大阪市)を用いた。なお、同様の実験をC57/BL6マウスES細胞クローン系(11継代;日本国京都大学再生医化学研究所、ナカツジノリオ教授から譲り受けた)でも実施したが、同様の結果が得られた(データは示さず)。
第1段階
未分化ES細胞の増殖
本実施例において、マウスES細胞系129sv(11継代(大日本製薬(株)日本国大阪市)を用いた。なお、同様の実験をC57/BL6マウスES細胞クローン系(11継代;日本国京都大学再生医化学研究所、ナカツジノリオ教授から譲り受けた)でも実施したが、同様の結果が得られた(データは示さず)。
哺乳類のES細胞は白血病抑制因子の存在下でフィーダー層とともに培養すると未分化状態で増殖できる。20μg/mlのマイトマイシンで増殖を不活性化させたマウス胎生フィーダー細胞(大日本製薬(株)日本国大阪市))を用いた。ES細胞培養用培地としては、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地 (D-MEM Cat# 12100: Life Technology、Grand、NY) に20%ウシ胎児血清リプレースメント(Life Tech.)、2%非必須アミノ酸(Life Tech.)、0.1mmol/lの2−メルカプトエタノール(Life Tech.)、1000U/mlの白血病抑制因子(LIF:Life Tech.)および2mmol/lのL−グルタミン(LIF:Life Tech.)を添加したものを用いた。
マイトマイシン処理したマウス胎性線維芽細胞のフィーダー層をゼラチンコーティングした培養ディッシュ(6cm)上に調製し、5mlの培地を添加し、106のES細胞を層上に接種した。細胞は37℃で95%空気中5%CO2を含む加湿雰囲気下で培養した。3日ごとに細胞を0.04%EDTA中の0.05%トリプシン溶液(Life Tech.)によってディッシュから剥離し、新たに調製したフィーダー層上の新たに調製した培地に継代した。ES細胞の培養は3〜7日間行った。
第2段階
胚様体(EB)の形成
トリプシン−EDTA溶液によって剥離されたES細胞を非粘着性培養ディッシュに細胞密度が6x105細胞/cm2となるように接種した。細胞を第1段階と同じ培地にbFGF(4ng/ml; R&D Systems、Minneapolis、U.S.A. and Kaken Pharmaceuticals、Co. Ltd.、Tokyo Japan)を添加あるいは添加しない条件で浮遊培養した。細胞は37℃で95%空気中5%CO2を含む加湿雰囲気下で培養した。2日毎に新たに調製した培地と交換した。
胚様体(EB)の形成
トリプシン−EDTA溶液によって剥離されたES細胞を非粘着性培養ディッシュに細胞密度が6x105細胞/cm2となるように接種した。細胞を第1段階と同じ培地にbFGF(4ng/ml; R&D Systems、Minneapolis、U.S.A. and Kaken Pharmaceuticals、Co. Ltd.、Tokyo Japan)を添加あるいは添加しない条件で浮遊培養した。細胞は37℃で95%空気中5%CO2を含む加湿雰囲気下で培養した。2日毎に新たに調製した培地と交換した。
培養物は、顕微鏡下で毎日確認した。2日目にbFGF存在下で培養した細胞は凝集し始めてEBを形成した。浮遊培養を5日間続けた。5日目に、従来のLIFとbFGFを含まない培地を用いてのEBの誘導と比して、顕著に増大したEBの形成が認められた(データ示さず)。bFGFを添加していない培地を用いた場合には、凝集はほとんど観察されなかった。
第3段階
EBの選択・増殖
第2段階でbFGF含有培地で得られたEBを、第2段階で用いた培地を入れたコラーゲンタイプIV(Sigma、St. Louis、MO)でコーティングされている6cmディッシュに移した。48時間の培養後、培地を選択・増殖培地である無血清DMEM/F−12(1:1)培地(cat# 11320、Life Tech.)に500μg/mlのウシインスリン、1μg/mlのプロゲステロン、1600μg/mlのプトレシンおよび5μg/mlのフィブロネクチンそして10mMのニコチンアミドを添加した培地と交換した。細胞集団をさらに7日間培養した。培養中、培地は3日毎に新たに調製されたものと交換した。
EBの選択・増殖
第2段階でbFGF含有培地で得られたEBを、第2段階で用いた培地を入れたコラーゲンタイプIV(Sigma、St. Louis、MO)でコーティングされている6cmディッシュに移した。48時間の培養後、培地を選択・増殖培地である無血清DMEM/F−12(1:1)培地(cat# 11320、Life Tech.)に500μg/mlのウシインスリン、1μg/mlのプロゲステロン、1600μg/mlのプトレシンおよび5μg/mlのフィブロネクチンそして10mMのニコチンアミドを添加した培地と交換した。細胞集団をさらに7日間培養した。培養中、培地は3日毎に新たに調製されたものと交換した。
第4段階
細胞の分化
選択・増殖培地で7日間培養した後、さらに細胞集団を無血清DMEM/F−12(1:1)培地(cat# 11320、Life Tech.)に500μg/mlのウシインスリン、1μg/mlのプロゲステロン、1600μg/mlのプトレシン、1μg/mlのラミニンおよび10mMのニコチンアミドを添加した培地で培養することによって分化させた。細胞を95%空気中5%CO2の加湿雰囲気下で37℃で12日間インキュベートして直径約100−400μmの島様細胞群を得た。
細胞の分化
選択・増殖培地で7日間培養した後、さらに細胞集団を無血清DMEM/F−12(1:1)培地(cat# 11320、Life Tech.)に500μg/mlのウシインスリン、1μg/mlのプロゲステロン、1600μg/mlのプトレシン、1μg/mlのラミニンおよび10mMのニコチンアミドを添加した培地で培養することによって分化させた。細胞を95%空気中5%CO2の加湿雰囲気下で37℃で12日間インキュベートして直径約100−400μmの島様細胞群を得た。
RNA抽出およびRT−PCR分析
各段階の後に、細胞の膵臓に関連する遺伝子発現をRT−PCR分析によって調べた。
各段階の後に、細胞の膵臓に関連する遺伝子発現をRT−PCR分析によって調べた。
各段階で得られた細胞より、細胞RNAをISOGEN(Nippon Gene; Osaka、Japan)を用い、説明書にしたがって単離した。細胞を0.8mlのISOGEN中、Potterホモジナイザーをを用いて4℃でホモジナイズした。ホモジネートを1mlのクロロホルムと混合し、水相中のRNAを等量のイソプロパノールによって沈殿させた。cDNAの合成は、オリゴdTプライマー(Takara Shuzo Co. Ltd.、Kyoto、Japan)およびモロニーマウス白血病ウイルス(M−MLV)スーパースクリプトII(Superscript II)逆転写酵素 (Gibco/BRL)を用いて、説明書に従って行った。
このようにして得られたcDNAに基づいて、転写因子のmRNAの発現レベルをPCR法によって測定した。PCRはTaqポリメラーゼ(Boehringer-Mannheim、Indianapolis、IN)を用いて標準的プロトコールに従って行った。サイクルパラメーターは以下の通りである:変性94℃、1分、アニーリング52〜61℃、30〜120秒(アニーリング条件はプライマーごとに設定)、伸展反応72℃、1分、サイクル数はmRNA量に応じて25〜40回とした。サイクル数およびcDNAの量はPCR条件が反応曲線の直線部となるように設定し、PCRの「飽和効果」を避けた。得られたPCR産物はシークエンシングにより確認した。
プライマー配列(フォワードおよびリバース)および増幅産物の長さは以下の通りであった:
β-アクチン:
ATGGATGACGATATCGCTG
ATGAGGTAGTCTGTCAGGT
569 bp
β-アクチン:
ATGGATGACGATATCGCTG
ATGAGGTAGTCTGTCAGGT
569 bp
ネスチン:
GGAGTGTCGCTTAGAGGTGC
TCCAGAAAGCCAAGAGAAGC
327 bp
GGAGTGTCGCTTAGAGGTGC
TCCAGAAAGCCAAGAGAAGC
327 bp
インスリン-I:
TAGTGACCAGCTATAATCAGAG
ACGCCAAGGTCTGAAGGTCC
288 bp
TAGTGACCAGCTATAATCAGAG
ACGCCAAGGTCTGAAGGTCC
288 bp
インスリン-II:
CCCTGCTGGCCCTGCTCTT
AGGTCTGAAGGTCACCTGCT
212 bp
CCCTGCTGGCCCTGCTCTT
AGGTCTGAAGGTCACCTGCT
212 bp
グルカゴン:
TCATGACGTTTGGCAAGTT
CAGAGGAGAACCCCAGATCA
202 bp
TCATGACGTTTGGCAAGTT
CAGAGGAGAACCCCAGATCA
202 bp
島アミロイドポリペプチド (IAPP):
GATTCCCTATTTGGATCCCC
CTCTCTGTGGCACTGAACCA
221 bp
GATTCCCTATTTGGATCCCC
CTCTCTGTGGCACTGAACCA
221 bp
グルコーストランスポーター2 (Glut2):
CCACCCAGTTTACAAGCTC
TGTAGGCAGTACGGGTCCTC
325 bp
CCACCCAGTTTACAAGCTC
TGTAGGCAGTACGGGTCCTC
325 bp
PDX-1:
TGTAGGCAGTACGGGTCCTC
CCACCCCAGTTTACAAGCTC
325 bp
TGTAGGCAGTACGGGTCCTC
CCACCCCAGTTTACAAGCTC
325 bp
アミラーゼ-2A
CATTGTTGCACCTTGTCACC
TTCTGCTGCTTTCCCTCATT
300 bp
CATTGTTGCACCTTGTCACC
TTCTGCTGCTTTCCCTCATT
300 bp
カルボキシペプチダーゼA:
GCAAATGTGTGTTTGATGCC
ATGACCAAACTCTTGGACCG
521 bp
GCAAATGTGTGTTTGATGCC
ATGACCAAACTCTTGGACCG
521 bp
GATA-4:
CGCCGCCTGTCCGCTTCC
TTGGGCTTCCGTTTTCTGGTTTGA
193 bp
CGCCGCCTGTCCGCTTCC
TTGGGCTTCCGTTTTCTGGTTTGA
193 bp
HNF3:
ACCTGAGTCCGAGTCTGACC
GGCACCTTGAGAAAGCAGTC
345 bp
ACCTGAGTCCGAGTCTGACC
GGCACCTTGAGAAAGCAGTC
345 bp
OCT-4:
GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC
CTCGAACCACATCCTTCTCT
293bp
GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC
CTCGAACCACATCCTTCTCT
293bp
膵細胞に関連する転写因子PDX−1遺伝子(膵臓の発生に必要とされる転写因子)は第1段階および第4段階で発現していた。Oct−4(ES細胞の分化に関連する転写因子)は第1段階の細胞で発現しているが、ES細胞の分化過程で発現が低下する。最終(definitive)(胚性)および内臓(visceral)(胚外性)内胚葉のマーカーであるGATA−4や最終内胚葉のマーカーで膵β細胞の運命をたどる細胞に関連のあるHNF−3βは全ての段階でのES細胞で発現された。未分化なホルモン陰性の膵細胞集団に関連する転写因子であるネスチンは第2段階で強く発現しその後、ES細胞の分化に伴い減少した。この結果より、ネスチン陽性の膵内分泌前駆細胞が、bFGFの存在下で得られたEBに多く存在することが分かる。興味深いことに、bFGF処理により誘導されたEBは内分泌細胞関連転写因子(インスリンI、インスリンII、グルカゴン、グルコーストランスポーター−2(Glut−2)、および島アミロイドポリペプチド)特異的遺伝子を発現していたが、第2段階においてbFGFを含有しない培地を用いて得られた細胞集団では膵島細胞に関連する遺伝子は発現していなかった。第3、4段階では、細胞は外分泌特異的遺伝子(アミラーゼおよびカルボキシペプチダーゼ)を発現していた。これらの結果は、本発明の膵島様細胞群は内分泌細胞(グルカゴン産生性α細胞、インスリン産生性β細胞、膵ポリペプチド産生性γ細胞およびソマトスチン産生性ο細胞)および外分泌細胞から構成される膵組織構造に成熟し得ることが示された。
インスリン分泌試験
第4段階で得た細胞集団(20〜25集団)をPBS(−)で3回洗浄し、120mMのNaCl、5mMのKCl、2.5mMのCaCl2、1.1mMのMgCl2、25mMのNaHCO3および0.1%ウシ血清アルブミン含有Krebs-Ringer重炭酸緩衝液を満たした6cmの細胞培養ディッシュに接種し、37℃でインキュベートした。3.3mmol/l(L)または25mmol/l(H)のグルコースを添加し、インキュベートした。グルコースによる刺激の5日および30日後に、緩衝液中のインスリン含量をインスリン酵素結合免疫吸着検定(ELISA)キット(ALPCO、Windham、NH)を用いて測定した。結果を図2に示す。図2において、低グルコースまたは高グルコースによる刺激の5分および30分後に応答した1細胞集団あたりに分泌されたインスリン量を示す。細胞集団は用量依存的にグルコースによる刺激に応答してインスリン分泌を示した。
第4段階で得た細胞集団(20〜25集団)をPBS(−)で3回洗浄し、120mMのNaCl、5mMのKCl、2.5mMのCaCl2、1.1mMのMgCl2、25mMのNaHCO3および0.1%ウシ血清アルブミン含有Krebs-Ringer重炭酸緩衝液を満たした6cmの細胞培養ディッシュに接種し、37℃でインキュベートした。3.3mmol/l(L)または25mmol/l(H)のグルコースを添加し、インキュベートした。グルコースによる刺激の5日および30日後に、緩衝液中のインスリン含量をインスリン酵素結合免疫吸着検定(ELISA)キット(ALPCO、Windham、NH)を用いて測定した。結果を図2に示す。図2において、低グルコースまたは高グルコースによる刺激の5分および30分後に応答した1細胞集団あたりに分泌されたインスリン量を示す。細胞集団は用量依存的にグルコースによる刺激に応答してインスリン分泌を示した。
総細胞インスリン含量の測定のため、第4段階で得た細胞集団を酸エタノール(無水エタノール中10%氷酢酸)で一晩4℃で抽出し、 次いで細胞を超音波処理にかけ、上清中のインスリン含量をELISAキットによって測定した。総細胞タンパク量をDCタンパク質アッセイシステム(Bio-Rad laboratories、Hercules、CA)を用いて測定した。細胞集団の総細胞インスリン含量は、71.3ng/mgタンパク質であった。
織学的・免疫組織化学学的分析
第4段階において得た細胞集団のパラフィン切片を以下のように作成した。細胞集団(第4段階において12日間インキュベートしたもの)を氷冷PBSで3回洗浄し、メタノール/アセトン(1:1)にて一晩固定した。細胞集団をアルコール(70−100%)で脱水し、パラフィンブロックに包埋し、ブロックをスライスして4μmおよび8μmの厚さの切片を得た。
第4段階において得た細胞集団のパラフィン切片を以下のように作成した。細胞集団(第4段階において12日間インキュベートしたもの)を氷冷PBSで3回洗浄し、メタノール/アセトン(1:1)にて一晩固定した。細胞集団をアルコール(70−100%)で脱水し、パラフィンブロックに包埋し、ブロックをスライスして4μmおよび8μmの厚さの切片を得た。
このようにして得た4μmの厚さの切片をヘマトキシリン/エオシン染色によって組織学的に評価した。
免疫組織化学的評価のために、8μmの厚さの切片を標準的プロトコールで抗体によって染色した。本発明において用いる一次抗体は以下の通りである:
ネスチンウサギポリクローナル1:500(Dako、Carpinteria、CA)、
チューブリンタイプIII(TuJ1)マウスモノクローナル1:500(Babco、Richmond、CA)、
チューブリンタイプIII(TuJ1)ウサギポリクローナル1:2000(Babco、Richmond、CA)、
インスリンマウスモノクローナル1:1000(Sigma、St. Louis、MO)、
インスリンモルモットポリクローナル1:100(DAKO、Carpinteria、CA)、
グルカゴンウサギポリクローナル(DAKO、Carpinteria、CA)。
ネスチンウサギポリクローナル1:500(Dako、Carpinteria、CA)、
チューブリンタイプIII(TuJ1)マウスモノクローナル1:500(Babco、Richmond、CA)、
チューブリンタイプIII(TuJ1)ウサギポリクローナル1:2000(Babco、Richmond、CA)、
インスリンマウスモノクローナル1:1000(Sigma、St. Louis、MO)、
インスリンモルモットポリクローナル1:100(DAKO、Carpinteria、CA)、
グルカゴンウサギポリクローナル(DAKO、Carpinteria、CA)。
一次抗体を検出するため、蛍光色素でラベルされた二次抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories、West Grove、PA) を推奨される方法に基づいて使用した。
得られたインスリン分泌細胞集団はインスリンおよびグルカゴンに対して強い陽性を示し、ネスチンおよびTuJ1に陽性であった。
STZ由来糖尿病マウスへのインスリン分泌細胞集団の移植
インスリン分泌性膵島様細胞群を移植し、細胞集団が生体内で機能する膵島へと分化し得るか否かを調べた。
インスリン分泌性膵島様細胞群を移植し、細胞集団が生体内で機能する膵島へと分化し得るか否かを調べた。
全ての動物実験は京都大学の動物実験ガイドラインに沿って行われた。糖尿病モデル動物はH. Iwata et al.、Pancreas vol. 23(4) 375-381(2001)(この文献の開示内容を引用により本出願に含める)に開示の方法によって作成した。凍結保存しているストレプトゾトシン(STZ)粉末 (Sigma、St. Louis、MO)を使用前に0.1Mクエン酸緩衝液、pH4.5に溶解した。STZ溶液を腹腔内に8週から10週齢の雄性ヌードマウス(Shimizu、Kyoto、Japan)に注入した(227mg/kg体重)。安定な高血糖、即ち血糖値約350−600mg/dlの上昇がSTZ単回注入の後7から10日の間に発生した。
マウスの血糖値はGlucometer Elite XL 血中グルコースメーター(Fujii Corp.、Tokyo、Japan)を用いて測定した。STZ注入後7日目から10日目に非絶食下の血中グルコースが350mg/dl以上を示すようになったマウスを糖尿病マウスとして、STZ注入の4日目より以下の実験に用いた。
STZ注入の14日後、糖尿病マウスに実施例1で得られた3000個のインスリン分泌性膵島様細胞群を移植するかあるいは偽手術を行った。ネンブタール麻酔状態下で、PBS(−)に懸濁した細胞集団を糖尿病マウスの腎臓被膜下領域(一方の腎臓)に23−ゲージ翼付針で注入した。偽手術群には、等量のPBS(−)を上記と同様にして注入した。細胞集団を与えられた被験群、非処理対照群および偽手術群はそれぞれ6匹、3匹および3匹のマウスからなった。移植後、非絶食下の血中グルコースおよび体重を毎日モニターした。結果を図3及び図4に示す。
移植の1日後、被験群の血中グルコースは有意に低下しており、実験期間にわたって血糖値は偽手術群より有意に低かった。移植群の体重はわずかに増加し、安定していた。
細胞集団を移植した動物を移植後14および21日目にそれぞれ2および4匹サクリファイスした。すべての被験マウスはサクリファイスまで健康であり、偽手術群よりも有意に低い血中グルコース値を維持していた。一方、非処理対照および偽手術群の血糖値は徐々に上昇して消耗状態を来たした。対照群と偽手術群のすべてのマウスは糖尿病の合併症により手術の14から30日の間に早期に死亡した。
サクリファイスした動物より移植片を取り出し、PBS中の4%パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンブロックに包埋した。得られた組織切片(厚さ4−8μm)を実施例1と同様にして免疫組織化学的に調べた。
移植領域においてンスリンとグルカゴンに対して免疫組織化学的に陽性な単一の塊の内分泌細胞が観察された。移植部位に奇形腫は認められなかった。
神経様細胞の誘導
実施例1の第1〜3段階と同様にして実施例1に用いたものと同じマウスES細胞を処理した。得られた細胞集団をポリ−L−リジンでコーティングした、無血清DMEM/F−12(1:1)培地(cat# 11320、Life Tech.)に500μg/mlのウシインスリン、1μg/mlのプロゲステロン、1600μg/mlのプトレシン、10mMのリジンおよび1μg/mlのラミニンを追加した培地を満たしたディッシュで培養した。細胞を12日間培養し、得られた細胞を実施例1と同様に遺伝学的および免疫組織化学的に分析した。本実施例において、チロシンハイドロキシラーゼ(TH)ポリクローナル1:200(Pel-Freeze、Rogers、AR)、チロシンハイドロキシラーゼ(TH)モノクローナル1:1000(Sigma、St. Louis、MO)、セロトニンポリクローナル1:4000(Sigma、St.Louis, MO)、MAP2ポリクローナル(Chemicon International, Temecula, CA) およびGFAPモノクローナル(Clon Tech、Palo Alto、CA)を実施例1に用いた抗体に加えて用いた。
実施例1の第1〜3段階と同様にして実施例1に用いたものと同じマウスES細胞を処理した。得られた細胞集団をポリ−L−リジンでコーティングした、無血清DMEM/F−12(1:1)培地(cat# 11320、Life Tech.)に500μg/mlのウシインスリン、1μg/mlのプロゲステロン、1600μg/mlのプトレシン、10mMのリジンおよび1μg/mlのラミニンを追加した培地を満たしたディッシュで培養した。細胞を12日間培養し、得られた細胞を実施例1と同様に遺伝学的および免疫組織化学的に分析した。本実施例において、チロシンハイドロキシラーゼ(TH)ポリクローナル1:200(Pel-Freeze、Rogers、AR)、チロシンハイドロキシラーゼ(TH)モノクローナル1:1000(Sigma、St. Louis、MO)、セロトニンポリクローナル1:4000(Sigma、St.Louis, MO)、MAP2ポリクローナル(Chemicon International, Temecula, CA) およびGFAPモノクローナル(Clon Tech、Palo Alto、CA)を実施例1に用いた抗体に加えて用いた。
得られた細胞は神経繊維様の外観を示し、免疫組織化学的には、ネスチン、TuJ1(β−チューブリンIII)、セロトニン、GFAP、MAP2およびチロシン−ハイドロキシラーゼに対して陽性であった。
実施例1に記載のRT−PCRによって、この神経様細胞がNurt−1転写因子を発現していることが確認された。Nurt−1の検出用のプライマー配列は以下の通りである:
TGAAGAGAGC GGAGAAGGAG ATC
TCTGGAGTTA AGAAATCGGA GCTG
255 bp.
TGAAGAGAGC GGAGAAGGAG ATC
TCTGGAGTTA AGAAATCGGA GCTG
255 bp.
したがって得られた神経様細胞は生体内に移植された場合に成熟神経細胞をとなることができるものであった。
ヒトES細胞
実施例1と同様にして、インスリン分泌性膵島様細胞群をヒトES細胞から得た。ES細胞は従来技術文献(例えば米国特許第第5843780号および第6200806号; Science 282、1145-1147 (1998)、これら文献の開示内容を本出願に含める)に記載のものでもよい。こうして得た細胞集団はインスリンを産生し、グルコースに用量依存的に応答してインスリンを分泌する。この細胞集団をヒトI型糖尿病患者に移植した。約3−5105の細胞集団を約50−100mlのクレブス・リンゲル(Krebs-Ringer)溶液に懸濁し、懸濁液を門脈を介して肝臓に注入するかあるい人工膵臓として皮下部位に移植した。移植患者の膵臓機能は回復し、患者はインスリン非依存性を獲得した。
実施例1と同様にして、インスリン分泌性膵島様細胞群をヒトES細胞から得た。ES細胞は従来技術文献(例えば米国特許第第5843780号および第6200806号; Science 282、1145-1147 (1998)、これら文献の開示内容を本出願に含める)に記載のものでもよい。こうして得た細胞集団はインスリンを産生し、グルコースに用量依存的に応答してインスリンを分泌する。この細胞集団をヒトI型糖尿病患者に移植した。約3−5105の細胞集団を約50−100mlのクレブス・リンゲル(Krebs-Ringer)溶液に懸濁し、懸濁液を門脈を介して肝臓に注入するかあるい人工膵臓として皮下部位に移植した。移植患者の膵臓機能は回復し、患者はインスリン非依存性を獲得した。
マウス胚性幹細胞からのドーパミン産生(DA)神経細胞の誘導
実施例1と実質的に同様にして、マウスES細胞系129sv(Dainippon-pharm. Co. LTD.、Osaka、Japan)の分化を誘導した。
実施例1と実質的に同様にして、マウスES細胞系129sv(Dainippon-pharm. Co. LTD.、Osaka、Japan)の分化を誘導した。
第1段階
細胞をマイトマイシン処理したマウス胎性線維芽細胞のフィーダー層上でDMEM(Invitrogen、Grand Island、NY、USA)培地に20%ウシ胎児血清(FBS、JRH Bioscience、Lenexa、KS、USA)、1000U/mlの白血病抑制因子 (LIF)、50mMの2−メルカプトエタノール、2mMのL−グルタミン酸および10X非必須アミノ酸(Invitrogen、Grand Island、NY、USA)を含有させた培地で増殖させた。ES細胞コロニーを剥離し、所望の量の細胞が得られるまで継代培養した。
細胞をマイトマイシン処理したマウス胎性線維芽細胞のフィーダー層上でDMEM(Invitrogen、Grand Island、NY、USA)培地に20%ウシ胎児血清(FBS、JRH Bioscience、Lenexa、KS、USA)、1000U/mlの白血病抑制因子 (LIF)、50mMの2−メルカプトエタノール、2mMのL−グルタミン酸および10X非必須アミノ酸(Invitrogen、Grand Island、NY、USA)を含有させた培地で増殖させた。ES細胞コロニーを剥離し、所望の量の細胞が得られるまで継代培養した。
第2段階
EB形成の誘導のため、トリプシン−EDTAによって剥離した単一細胞を、非接着細菌培養用ディッシュで6x105細胞/cm2未満の密度となるように接種し、EBを上記の培地でbFGF(4ng/ml; R&D Systems、Minneapolis、USA)の存在下で3日間浮遊培養した。
EB形成の誘導のため、トリプシン−EDTAによって剥離した単一細胞を、非接着細菌培養用ディッシュで6x105細胞/cm2未満の密度となるように接種し、EBを上記の培地でbFGF(4ng/ml; R&D Systems、Minneapolis、USA)の存在下で3日間浮遊培養した。
第3段階
EBが形成した後、それをポリ(L−リジン)−コーティングしたディッシュ(Falcon Labware、Bedford、MA)に上記段階に用いたEB培養用培地に接種した。24時間の培養後、EB培養用培地を、無血清DMEM/F−12(Invitrogen、Grand Island、NY、USA)培地に500μg/mlのウシインスリン、1μg/mlのプロゲステロン、1600μg/mlのプトレシン、0、5または10mMのニコチンアミドおよび5μg/mlのフィブロネクチン(Nakalai tesque、Kyoto)を含有させた培地と交換し、4日間培養した。
EBが形成した後、それをポリ(L−リジン)−コーティングしたディッシュ(Falcon Labware、Bedford、MA)に上記段階に用いたEB培養用培地に接種した。24時間の培養後、EB培養用培地を、無血清DMEM/F−12(Invitrogen、Grand Island、NY、USA)培地に500μg/mlのウシインスリン、1μg/mlのプロゲステロン、1600μg/mlのプトレシン、0、5または10mMのニコチンアミドおよび5μg/mlのフィブロネクチン(Nakalai tesque、Kyoto)を含有させた培地と交換し、4日間培養した。
第4段階
4日間の培養後、培地を無血清DMEM/F−12培地に500μg/mlのウシインスリン、1μg/mlのプロゲステロン、1600μg/mlのプトレシン、0、5または10mMのニコチンアミド、5μg/mlのフィブロネクチン(Nakalai tesque、Kyoto、Japan)および1μg/mlのラミニン(Nakalai tesque、Kyoto、Japan)を含有させた培地に交換することによって細胞の分化を誘導した。細胞を培養して得た細胞を以下のようにして調べた。
4日間の培養後、培地を無血清DMEM/F−12培地に500μg/mlのウシインスリン、1μg/mlのプロゲステロン、1600μg/mlのプトレシン、0、5または10mMのニコチンアミド、5μg/mlのフィブロネクチン(Nakalai tesque、Kyoto、Japan)および1μg/mlのラミニン(Nakalai tesque、Kyoto、Japan)を含有させた培地に交換することによって細胞の分化を誘導した。細胞を培養して得た細胞を以下のようにして調べた。
TuJ−陽性コロニー
上記のようにして得られたコロニーを免疫組織化学的分析にかけ、神経細胞マーカーTuJの発現について調べた。結果を図5に示す。
上記のようにして得られたコロニーを免疫組織化学的分析にかけ、神経細胞マーカーTuJの発現について調べた。結果を図5に示す。
第2段階におけるbFGFの効果を調べるために、上記と同様に処理し、ただし、第2段階においてbFGFの存在下(4ng/ml)または不在下で、第3および第4段階で10mMのニコチンアミド存在下で培養したES細胞から得られたコロニーのTuJ−発現について調べた。結果を図6に示す。図6において、bFGFの存在下または不在下で培養したものを「処理」または「非処理」としてそれぞれ示す。
これらの結果はNAとbFGFの両方がTuJを発現するコロニー数を増加させることを示す。
細胞における神経関連遺伝子の発現
実施例1に記載のRT−PCRによって、未分化ES細胞(第1段階)および第4段階で得た細胞を遺伝的に調べた。被験細胞は第2段階でbFGFで処理し、第3および第4段階で10mMのNAの存在下で培養したものである。この実験で用いたプライマーは以下の通りであった:
実施例1に記載のRT−PCRによって、未分化ES細胞(第1段階)および第4段階で得た細胞を遺伝的に調べた。被験細胞は第2段階でbFGFで処理し、第3および第4段階で10mMのNAの存在下で培養したものである。この実験で用いたプライマーは以下の通りであった:
Nurt-1: チロシンハイドロキシラーゼ
TGAAGAGAGC GGAGAAGGAG ATC
TCTGGAGTTA AGAAATCGGA GCTG
TGAAGAGAGC GGAGAAGGAG ATC
TCTGGAGTTA AGAAATCGGA GCTG
Wnt-1: 中脳ドーパミン産生性神経細胞転写因子シグナル伝達分子
5'-ACCTGTTGACGGATTCCAAG-3'
5'-TCATGAGGAAGCGTAGGTCC-3';
5'-ACCTGTTGACGGATTCCAAG-3'
5'-TCATGAGGAAGCGTAGGTCC-3';
エングレイルド-1 (En 1): 中脳ドーパミン産生性神経細胞転写因子
5'-TCAAGACTGACTCACAGCAACCCC-3'
5'-CTTTGTCCTGAACCGTGGTGGTAG-3'
5'-TCAAGACTGACTCACAGCAACCCC-3'
5'-CTTTGTCCTGAACCGTGGTGGTAG-3'
Ptc: SHH シグナル受容体、(patched)
5'-CCTCCTTTACGGTGGACAAA-3'
5'-ATCAACTCCTCCTGCCAATG-3'
5'-CCTCCTTTACGGTGGACAAA-3'
5'-ATCAACTCCTCCTGCCAATG-3'
糖蛋白ソニック・ヘッジホッグ(Shh)
5'-GGAAGATCACAAGAAACTCCGAAC-3'
5'-GGATGCGAGCTTTGGATTCATAG-3'
5'-GGAAGATCACAAGAAACTCCGAAC-3'
5'-GGATGCGAGCTTTGGATTCATAG-3'
Otx 1: 脳形態形成に必須の転写因子
5'-GCTGTTCGCAAAGACTCGCTAC-3'
5'-CCATGACCTATACTCAGGCTTCAGG-3';
5'-GCTGTTCGCAAAGACTCGCTAC-3'
5'-CCATGACCTATACTCAGGCTTCAGG-3';
Otx 2: 脳形態形成に必須の転写因子
5'-CCATGACCTATACTCAGGCTTCAGG-3'
5'-GAAGCTCCATATCCCTGGGTGGAAAG-3'
5'-CCATGACCTATACTCAGGCTTCAGG-3'
5'-GAAGCTCCATATCCCTGGGTGGAAAG-3'
Pax 2:中脳ドーパミン産生性神経細胞転写因子
5'-CCAAAGTGGTGGACAAGATTGCC-3'
5'-GGGATAGGAAGGACGCTCAAAGAC-3'
5'-CCAAAGTGGTGGACAAGATTGCC-3'
5'-GGGATAGGAAGGACGCTCAAAGAC-3'
Pax 5:中脳ドーパミン産生性神経細胞転写因子
5'-CAGATGTAGTCCGCCAAAGGATAG-3'
5'-ATGCCACTGATGGAGTATGAGGAGCC-3'
5'-CAGATGTAGTCCGCCAAAGGATAG-3'
5'-ATGCCACTGATGGAGTATGAGGAGCC-3'
Smo: SHH シグナル受容体、(smoothened)
5'-CTGAGAGTGCCAGAAAAGGG-3'
5'-TCATCATGCTGGAGAACTCG-3'
5'-CTGAGAGTGCCAGAAAAGGG-3'
5'-TCATCATGCTGGAGAACTCG-3'
線維芽細胞成長因子受容体(FGFR 3R)
5'-ATCCTCGGGAGATGACGAAGAC-3'
5'-GGATGCTGCCAAACTTTGTTCTC-3'
5'-ATCCTCGGGAGATGACGAAGAC-3'
5'-GGATGCTGCCAAACTTTGTTCTC-3'
表2に示すように、本発明により誘導されたコロニーは高レベルの転写因子およびシグナル伝達分子をコードする神経特異的遺伝子を発現した。
神経回路網様の外観の発達
得られたコロニーを顕微鏡下で観察して神経回路網様の形成密度を判定した。結果を図7に示す。図7はEBの神経回路網様の形成密度に対するNA(ニコチンアミド)およびbFGFの効果を要約したヒストグラムである。EBを第2段階において4ng/mlのbFGFの不在下または存在下で培養し(「非処理」または「処理」としてそれぞれ示す)、第3および第4段階においてNAの存在下で培養した。各条件について培養中のすべてのEBを計数することによりアッセイし、実験を2回繰り返したところ類似の結果が得られた。
得られたコロニーを顕微鏡下で観察して神経回路網様の形成密度を判定した。結果を図7に示す。図7はEBの神経回路網様の形成密度に対するNA(ニコチンアミド)およびbFGFの効果を要約したヒストグラムである。EBを第2段階において4ng/mlのbFGFの不在下または存在下で培養し(「非処理」または「処理」としてそれぞれ示す)、第3および第4段階においてNAの存在下で培養した。各条件について培養中のすべてのEBを計数することによりアッセイし、実験を2回繰り返したところ類似の結果が得られた。
BMP−4またはFBS処理
第2段階においてbFGFで処理した細胞を後の段階(第3および第4段階)において10mMのNAに加えて0.5nM骨形態形成タンパク質(BMP−4)または5%ウシ胎児血清(FBS)の存在下で培養した。この手順において、BMP4は培地交換ごとに新鮮なものを添加した。BMP−4とFBSはともに細胞の神経細胞への分化を抑制した。
第2段階においてbFGFで処理した細胞を後の段階(第3および第4段階)において10mMのNAに加えて0.5nM骨形態形成タンパク質(BMP−4)または5%ウシ胎児血清(FBS)の存在下で培養した。この手順において、BMP4は培地交換ごとに新鮮なものを添加した。BMP−4とFBSはともに細胞の神経細胞への分化を抑制した。
結果を図8に示す。BMP−4とFBSはともにコロニーにおけるTuJの発現を抑制した。
分化細胞の移植の6−OHDA病変および回転性挙動に対する効果
6−OHDAによって誘導される一方向ドーパミン産生神経変性動物はパーキンソン病(PD)の有用なモデルであると考えられている。というのは黒質ドーパミン産生神経細胞の欠乏がPD症状の特徴だからである。線条体における顕著なドーパミン欠乏(95%を超える)がドーパミン受容体の過感受性を誘導することが知られている。それゆえ6−OHDA−病変ラットにおいて、混合D1/D2受容体アゴニストであるアポモルフィンは反対側方向における回転非対称を誘導し、DA誘発因子であるアンフェタミンは同側回転を誘導する。したがって、本発明者らは生体内での分化細胞および未分化ES細胞の移植の6−OHDA病変モデルに対する効果を調べた。
6−OHDAによって誘導される一方向ドーパミン産生神経変性動物はパーキンソン病(PD)の有用なモデルであると考えられている。というのは黒質ドーパミン産生神経細胞の欠乏がPD症状の特徴だからである。線条体における顕著なドーパミン欠乏(95%を超える)がドーパミン受容体の過感受性を誘導することが知られている。それゆえ6−OHDA−病変ラットにおいて、混合D1/D2受容体アゴニストであるアポモルフィンは反対側方向における回転非対称を誘導し、DA誘発因子であるアンフェタミンは同側回転を誘導する。したがって、本発明者らは生体内での分化細胞および未分化ES細胞の移植の6−OHDA病変モデルに対する効果を調べた。
全ての動物実験は京都大学の動物実験ガイドラインおよび「National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」に沿って行われた。用いた実験動物は、体重約280gの8週齡の雄性Wisterラット(SLC Inc.、Hamamatsu、Japan)であった。ラットを自由に水を与えて一晩絶食させた。6−ヒドロキシドーパミン(6−OHDA)溶液を12gの6−OHDA(Sigma、St Louis、MO、USA)を最終容量4lの0.02%アスコルビン酸を含有する滅菌生理的食塩水に溶解することによって調製した。定位微量注入を行うために、ラットを麻酔し(ペントバルビタールナトリウム、50mg/kg、腹腔内)、Kopf定位フレームに固定した。次いでラットの左黒質に6−OHDA溶液を注入し、十字縫合は−4.8mm尾側、1.8mm左側、−7.8mm腹側とし、モーター駆動10μl−ハミルトンシリンジによって26ゲージ針を用いて行った。座標はラット脳アトラス(Paxinos G. and Watson C. (1986)「The rat brain in stereotaxic coordinates」 (Second Edition). Academic Press、North Ryde、Australia)に従って決めた。2週間後、アポモルフィンに(Sigma)応答する回転性挙動の評価によって移植に用いる病変ラットを選択した。回転試験はrotometer bowl (Ungerstedt、U. (1971) 「Postsynaotic supersensitivity after 6-hydroxydopamine induced degeneration of the nigro-striatal dopamine system」Acta Physiol. Scand.、82 Suppl. 367、69-93)にて行い、反対側方向に完全に360°回転した総数を計数した。アポモルフィン(0.6mg/kg、腹腔内)の投与により誘導される強い反対側回転性挙動を示した動物を選んで次ぎの移植手術に用いた。
移植手術
6−OHDA−病変ラットに媒体(滅菌リン酸緩衝食塩水(PBS)n=10、a:媒体)または少数の未分化ES細胞(約4000細胞の第1段階のES細胞、n=10、b:ES−L)および分化細胞(約20,000細胞の第4段階の4日目の細胞、n=10、i:4F)を含む細胞懸濁液を注入した。
6−OHDA−病変ラットに媒体(滅菌リン酸緩衝食塩水(PBS)n=10、a:媒体)または少数の未分化ES細胞(約4000細胞の第1段階のES細胞、n=10、b:ES−L)および分化細胞(約20,000細胞の第4段階の4日目の細胞、n=10、i:4F)を含む細胞懸濁液を注入した。
選択したラットを麻酔し(ペントバルビタールナトリウム、50mg/kg、腹腔内)Kopf 定位フレームに固定した。各動物に1.0μlの移植細胞懸濁液または媒体を左線条体の2カ所に微量注入し、十字縫合はラット脳アトラス(前掲)にしたがって+1.0mm尾側、3.0mm左側、−5.5および5.0mm腹側とし、22ゲージ針付き10μl−ハミルトンシリンジを用いた。5分間で移植細胞は定着し、その後針を除いた。ついで、アポモルフィン誘導性回転非対称を2週間ごとに評価した。
アポモルフィン(0.6mg/kg、腹腔内)投与の60分後に反対側方向に完全に360°回転した数を数えた。
統計分析
結果を図9−11に示す。データは平均±SEMとして示し、独立スチューデント検定または一元配置分散分析で比較した。危険率0.05未満を有意差とした。さらに後知恵比較のための統計分析をBonferroni/Dunn検定を用いて行って(Statview、Abacus Concepts、Berkely、USA)アポモルフィン誘導性回転非対称の数を評価した。
結果を図9−11に示す。データは平均±SEMとして示し、独立スチューデント検定または一元配置分散分析で比較した。危険率0.05未満を有意差とした。さらに後知恵比較のための統計分析をBonferroni/Dunn検定を用いて行って(Statview、Abacus Concepts、Berkely、USA)アポモルフィン誘導性回転非対称の数を評価した。
アポモルフィン誘導性回転非対称は2週間後の第4段階の分化DA−神経細胞の移植によって有意に改善した。しかし、その他の移植細胞は有効な反対側回転を示さなかった。有意差(ANOVAの後のBonferroni/Dunn 後じえ比較: 媒体注入(a)における各時点に対して*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001;各群の移植前に対して!p<0.05、!!!p<0.001)。
この実験において、未分化mES細胞および媒体はアポモルフィン誘導性回転非対称を改善させなかった。それに対して、本発明に従って処理された第4段階のES細胞の移植によりアポモルフィン誘導性回転非対称を2週間後に有意に減少させた。さらにこの修復は12週間目に挙動評価が完了するまで持続した。
実施例5の結果によると、マウスES細胞は本発明の方法によってドーパミン産生神経細胞へと分化したと結論される。
上記実施例と同様にして、神経様細胞をヒトES細胞から得ることができる。ヒトES細胞は実施例4に記載のものとすればよい。培養条件を最適化するためにいくらかの改変を行うことが必要であろうが、これは当業者にとってルーチン的な作業である。本発明によると、ドーパミン産生神経細胞は遺伝子操作、フローサイトメトリーによる分取、磁気ビーズによる分離などを行わずに効率的に分化ES総細胞集団から濃縮できる。本発明の簡単な四段階方法によりES細胞から誘導される神経様細胞は、パーキンソン病患者に良好な治療効果をもたらし、治療を受けた患者は長期間生存できる。
Claims (14)
- 以下の工程;
1)哺乳類の胚性幹細胞をフィーダー細胞とともに、白血病抑制因子を含有する培地を用いて培養する;
2)得られた細胞をフィーダー細胞の非存在下、白血病抑制因子および塩基性FGFを含有する培地を用いて浮遊条件で培養し、胚様体を得る;
3)得られた胚様体を選択・増殖培地で培養する;および、
4)得られた細胞集団を分化培地を用いて培養して機能性細胞を得る、
を含む哺乳類の胚性幹細胞の機能性細胞への分化誘導方法。 - 第2段階において用いられる培地が、白血病抑制因子を約100−10000U/ml含有する、請求項1記載の方法。
- 第2段階において用いられる培地が、bFGFを約2−100ng/ml含有する、請求項1記載の方法。
- 第3段階において用いられる培地が、無血清細胞培養用培地中に、ニコチンアミド、インスリンおよびフィブロネクチンを含有するものである、請求項1記載の方法。
- 機能性細胞がインスリン分泌性膵島様細胞塊である、請求項1記載の方法。
- 第4段階において用いられる培地が、無血清細胞培養用培地中に、ニコチンアミド、インスリンおよびラミニンを含有するものである、請求項5記載の方法。
- 機能性細胞が神経様細胞である、請求項1記載の方法。
- 第4段階において用いられる培地が、無血清細胞培養用培地中に、L−リジン、インスリンおよびラミニンを含有するものである、請求項7記載の方法。
- 請求項1記載の方法によって哺乳類のES細胞から誘導される、機能性細胞。
- 請求項5記載の方法によって哺乳類のES細胞から誘導される、インスリン分泌性細胞集団。
- 請求項7記載の方法によって哺乳類のES細胞から誘導される、神経様細胞。
- 請求項5記載の方法によって同種ES細胞から誘導された膵島様細胞塊を患者に移植することを含む、膵島機能に障害のある哺乳類患者の治療方法。
- 患者がI型糖尿病患者である、請求項12記載の方法。
- 請求項7記載の方法によって同種ES細胞から誘導された神経様細胞を患者に移植することを含む、神経機能に障害のある哺乳類患者の治療方法。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007267672A (ja) * | 2006-03-31 | 2007-10-18 | Nippon Menaade Keshohin Kk | 哺乳動物の幹細胞における分化誘導方法 |
WO2017073761A1 (ja) * | 2015-10-28 | 2017-05-04 | 学校法人近畿大学 | 多能性幹細胞の胚様体形成方法および多能性幹細胞の胚様体形成用組成物 |
JP2020014477A (ja) * | 2013-12-16 | 2020-01-30 | フレゼニウス メディカル ケア ドイッチェランド ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 膵島様細胞構造体及びそれを調製する方法 |
Families Citing this family (72)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2003224681A1 (en) * | 2002-03-13 | 2003-09-29 | Bresagen Inc. | Compositions and methods for primate neural cell production |
US20070020608A1 (en) * | 2003-05-08 | 2007-01-25 | Peter Eriksson | Method for the generation of neural progenitor cells |
CA2524611A1 (en) | 2003-05-08 | 2004-11-18 | Cellartis Ab | A method for efficient transfer of human blastocyst-derived stem cells (hbs cells) from a feeder-supported to a feeder-free culture system |
US8518390B2 (en) | 2003-06-27 | 2013-08-27 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Treatment of stroke and other acute neural degenerative disorders via intranasal administration of umbilical cord-derived cells |
US7875272B2 (en) | 2003-06-27 | 2011-01-25 | Ethicon, Incorporated | Treatment of stroke and other acute neuraldegenerative disorders using postpartum derived cells |
US9572840B2 (en) | 2003-06-27 | 2017-02-21 | DePuy Synthes Products, Inc. | Regeneration and repair of neural tissue using postpartum-derived cells |
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US8491883B2 (en) | 2003-06-27 | 2013-07-23 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using umbilical derived cells |
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US8790637B2 (en) | 2003-06-27 | 2014-07-29 | DePuy Synthes Products, LLC | Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells |
US20050060166A1 (en) * | 2003-09-15 | 2005-03-17 | Durham Jon A. | Method of providing funeral products and services |
US7510876B2 (en) | 2003-12-23 | 2009-03-31 | Cythera, Inc. | Definitive endoderm |
US8647873B2 (en) | 2004-04-27 | 2014-02-11 | Viacyte, Inc. | PDX1 expressing endoderm |
CN103103158B (zh) * | 2004-04-27 | 2016-08-03 | 韦尔赛特公司 | 细胞培养基 |
WO2005123902A1 (ja) * | 2004-06-18 | 2005-12-29 | Riken | 無血清浮遊培養による胚性幹細胞の神経分化誘導法 |
US20080305544A1 (en) * | 2004-07-06 | 2008-12-11 | Hiroo Iwata | Method of Producing Nerve Cell |
CN100389194C (zh) * | 2004-07-16 | 2008-05-21 | 成都军区昆明总医院 | 胰岛素分泌细胞提取物及其在干细胞诱导分化中的应用 |
US7833513B2 (en) | 2004-12-03 | 2010-11-16 | Rhode Island Hospital | Treatment of Alzheimer's Disease |
CA2587601C (en) * | 2004-12-03 | 2017-11-07 | Rhode Island Hospital | Diagnosis and treatment of alzheimer's disease |
US8017395B2 (en) | 2004-12-17 | 2011-09-13 | Lifescan, Inc. | Seeding cells on porous supports |
US20060153815A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-07-13 | Agnieszka Seyda | Tissue engineering devices for the repair and regeneration of tissue |
WO2006101548A2 (en) * | 2004-12-21 | 2006-09-28 | Ethicon, Inc. | Postpartum cells derived from umbilical cord tissue, and methods of making, culturing, and using the same |
US20060166361A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-07-27 | Agnieszka Seyda | Postpartum cells derived from placental tissue, and methods of making, culturing, and using the same |
WO2006071778A2 (en) | 2004-12-23 | 2006-07-06 | Ethicon Incorporated | Treatment of parkinson's disease and related disorders using postpartum derived cells |
JP4701382B2 (ja) * | 2005-02-09 | 2011-06-15 | 国立大学法人東京農工大学 | 心筋移植片の作製方法及び心筋分化促進剤 |
US20060183712A1 (en) * | 2005-02-17 | 2006-08-17 | The Texas A&M University System | Affinity purified heparin/heparan sulfate for controlling the biological activity of the FGF receptor |
AU2006202209B2 (en) | 2005-05-27 | 2011-04-14 | Lifescan, Inc. | Amniotic fluid derived cells |
CA2613889A1 (en) | 2005-06-08 | 2006-12-14 | Centocor, Inc. | A cellular therapy for ocular degeneration |
WO2007070870A1 (en) | 2005-12-16 | 2007-06-21 | Ethicon, Inc. | Compositions and methods for inhibiting adverse immune response in histocompatibility-mismatched transplantation |
JP5179376B2 (ja) | 2005-12-19 | 2013-04-10 | エシコン・インコーポレイテッド | ローラーボトルでの分娩後取り出し細胞の体外増殖 |
SG170789A1 (en) * | 2005-12-28 | 2011-05-30 | Ethicon Inc | Treatment of peripheral vascular disease using postpartum-derived cells |
US9125906B2 (en) | 2005-12-28 | 2015-09-08 | DePuy Synthes Products, Inc. | Treatment of peripheral vascular disease using umbilical cord tissue-derived cells |
US8741643B2 (en) | 2006-04-28 | 2014-06-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage |
US9080145B2 (en) | 2007-07-01 | 2015-07-14 | Lifescan Corporation | Single pluripotent stem cell culture |
KR101617243B1 (ko) | 2007-07-31 | 2016-05-02 | 라이프스캔, 인코포레이티드 | 인간 배아 줄기 세포의 분화 |
WO2009046335A1 (en) | 2007-10-05 | 2009-04-09 | Ethicon, Incorporated | Repair and regeneration of renal tissue using human umbilical cord tissue-derived cells |
KR101592182B1 (ko) | 2007-11-27 | 2016-02-05 | 라이프스캔, 인코포레이티드 | 인간 배아 줄기 세포의 분화 |
US8236538B2 (en) | 2007-12-20 | 2012-08-07 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Methods for sterilizing materials containing biologically active agents |
KR101731474B1 (ko) | 2008-02-21 | 2017-05-11 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 세포 부착, 배양 및 탈리를 위한 방법, 표면 개질 플레이트 및 조성물 |
US8623648B2 (en) | 2008-04-24 | 2014-01-07 | Janssen Biotech, Inc. | Treatment of pluripotent cells |
PL2942392T3 (pl) | 2008-06-30 | 2019-02-28 | Janssen Biotech, Inc | Różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych |
CN102333862B (zh) | 2008-10-31 | 2018-04-27 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化 |
US9234178B2 (en) | 2008-10-31 | 2016-01-12 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human pluripotent stem cells |
AU2009316580B2 (en) | 2008-11-20 | 2016-04-14 | Janssen Biotech, Inc. | Pluripotent stem cell culture on micro-carriers |
JP5719305B2 (ja) | 2008-11-20 | 2015-05-13 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | 平面支持体上での細胞付着及び培養のための方法及び組成物 |
US10179900B2 (en) | 2008-12-19 | 2019-01-15 | DePuy Synthes Products, Inc. | Conditioned media and methods of making a conditioned media |
EP2379087B1 (en) * | 2008-12-19 | 2014-08-20 | DePuy Synthes Products, LLC | Umbilical cord tissue derived cells for treating neuropathic pain and spasticity |
CN102387807A (zh) | 2008-12-19 | 2012-03-21 | 先进科技及再生医学有限责任公司 | 肺部疾病和病症的治疗 |
WO2010071863A1 (en) * | 2008-12-19 | 2010-06-24 | Ethicon, Incorporated | Regeneration and repair of neural tissue following injury |
US8722034B2 (en) | 2009-03-26 | 2014-05-13 | Depuy Synthes Products Llc | hUTC as therapy for Alzheimer's disease |
MX340952B (es) | 2009-07-20 | 2016-07-29 | Janssen Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas. |
RU2540016C2 (ru) | 2009-07-20 | 2015-01-27 | Янссен Байотек, Инк. | Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека |
WO2011011300A2 (en) | 2009-07-20 | 2011-01-27 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
SG181685A1 (en) | 2009-12-23 | 2012-07-30 | Centocor Ortho Biotech Inc | Differentiation of human embryonic stem cells |
US9150833B2 (en) | 2009-12-23 | 2015-10-06 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
RU2607380C2 (ru) | 2010-03-01 | 2017-01-10 | Янссен Байотек, Инк. | Способы очистки клеток, производных от плюрипотентных стволовых клеток |
WO2011143299A2 (en) | 2010-05-12 | 2011-11-17 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
SG177238A1 (en) | 2010-07-22 | 2012-03-29 | Affiliated Hospital Of Ningxia Medical University | A method of producing neurons from stem cells, the neurons and uses thereof |
EP3211070A1 (en) | 2010-08-31 | 2017-08-30 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
MX348537B (es) | 2010-08-31 | 2017-06-07 | Janssen Biotech Inc | Diferencia de celulas madre pluripotentes. |
US9506036B2 (en) | 2010-08-31 | 2016-11-29 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
RU2705001C2 (ru) | 2011-12-22 | 2019-11-01 | Янссен Байотек, Инк. | Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в одногормональные инсулинположительные клетки |
JP6301263B2 (ja) | 2011-12-23 | 2018-03-28 | デピュイ・シンセス・プロダクツ・インコーポレイテッド | ヒト臍帯組織由来細胞の検出 |
CN104160018A (zh) | 2012-03-07 | 2014-11-19 | 詹森生物科技公司 | 用于扩增和维持多能干细胞的成分确定的培养基 |
ES2690118T3 (es) | 2012-06-08 | 2018-11-19 | Janssen Biotech, Inc. | Diferenciación de células madre embrionarias humanas en células endocrinas pancreáticas |
KR101942769B1 (ko) | 2012-12-31 | 2019-01-28 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | Hb9 조절제를 사용하는 인간 배아 줄기세포의 췌장 내분비 세포로의 분화 |
CA2896750A1 (en) | 2012-12-31 | 2014-07-03 | Janssen Biotech, Inc. | Suspension and clustering of human pluripotent cells for differentiation into pancreatic endocrine cells |
US10370644B2 (en) | 2012-12-31 | 2019-08-06 | Janssen Biotech, Inc. | Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom |
BR112015015770A2 (pt) | 2012-12-31 | 2017-07-11 | Janssen Biotech Inc | cultivo de células-tronco embrionárias humanas na interface ar-líquido para diferenciação em células pancreáticas endócrinas |
WO2015175307A1 (en) | 2014-05-16 | 2015-11-19 | Janssen Biotech, Inc. | Use of small molecules to enhance mafa expression in pancreatic endocrine cells |
MA45479A (fr) | 2016-04-14 | 2019-02-20 | Janssen Biotech Inc | Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5690926A (en) * | 1992-10-08 | 1997-11-25 | Vanderbilt University | Pluripotential embryonic cells and methods of making same |
US5843780A (en) * | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
US6331406B1 (en) * | 1997-03-31 | 2001-12-18 | The John Hopkins University School Of Medicine | Human enbryonic germ cell and methods of use |
US6090622A (en) * | 1997-03-31 | 2000-07-18 | The Johns Hopkins School Of Medicine | Human embryonic pluripotent germ cells |
US6602711B1 (en) * | 2000-02-21 | 2003-08-05 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of making embryoid bodies from primate embryonic stem cells |
AU2001259323A1 (en) * | 2000-05-01 | 2001-11-12 | Sang-Hun Lee | Derivation of midbrain dopaminergic neurons from embryonic stem cells |
-
2002
- 2002-01-25 US US10/054,789 patent/US20030162290A1/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-01-27 JP JP2003562273A patent/JP2005514944A/ja active Pending
- 2003-01-27 WO PCT/JP2003/000699 patent/WO2003062405A2/en active Application Filing
- 2003-07-25 US US10/626,772 patent/US20040072344A1/en not_active Abandoned
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007267672A (ja) * | 2006-03-31 | 2007-10-18 | Nippon Menaade Keshohin Kk | 哺乳動物の幹細胞における分化誘導方法 |
JP2020014477A (ja) * | 2013-12-16 | 2020-01-30 | フレゼニウス メディカル ケア ドイッチェランド ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 膵島様細胞構造体及びそれを調製する方法 |
WO2017073761A1 (ja) * | 2015-10-28 | 2017-05-04 | 学校法人近畿大学 | 多能性幹細胞の胚様体形成方法および多能性幹細胞の胚様体形成用組成物 |
JPWO2017073761A1 (ja) * | 2015-10-28 | 2018-08-23 | 学校法人近畿大学 | 多能性幹細胞の胚様体形成方法および多能性幹細胞の胚様体形成用組成物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2003062405A3 (en) | 2003-10-16 |
US20040072344A1 (en) | 2004-04-15 |
WO2003062405A2 (en) | 2003-07-31 |
US20030162290A1 (en) | 2003-08-28 |
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