CN100389194C - 胰岛素分泌细胞提取物及其在干细胞诱导分化中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及哺乳动物胰岛素分泌细胞提取物及其在体外干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞中的应用，为干细胞诱导技术提供了新的诱导试剂，是胰腺组织→去除血细胞结缔组织及被膜等→细胞匀浆→细胞破碎→沉淀→取上清液→分离去除分子量大于20万道尔顿(Da)以上的物质→分装而得，本发明所述的应用可以是胰岛素分泌细胞提取物与现有技术有机结合的应用，也可以是制备为试剂盒的应用。在干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的应用中显示出良好的诱导分化率，为90%以上。诱导分化的胰岛素分泌细胞可以用来移植治疗糖原病及胰组织损伤性疾病，在临床有很好的应用前景。

Description

胰岛素分泌细胞提取物及其在干细胞诱导分化中的应用

技术领域

本发明涉及生物细胞提取物及应用技术，具体涉及人或动物胰岛素分泌细胞提取物及其在干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞中的应用技术。

背景技术

国内目前有糖尿病人约2500万人，还有近3000万人有发生糖尿病的可能，该病虽可通过注射胰岛素和降糖药物有效控制高血糖症状，但不能根治，目前这类疾病在临床上没有理想治疗措施，近几年，经肝内门静脉植入胰岛细胞治疗糖尿病取得了一些疗效，一些病人在接受胰岛细胞移植后，能脱离胰岛素治疗，血糖控制时间可长达1年以上，遗憾的是，胰岛细胞移植仍面临两大难题：供者来源不足和严重的免疫排斥反应等。干细胞作为一类具有自我更新及多向分化潜能的的细胞，已经逐渐成为人们寻找胰岛细胞的新资源。

1997年以来，干细胞研究取得重要进展，研究发现人体间充质干细胞(MSC)可以被诱导分化为神经、肌肉、皮肤、软骨、脂肪、肌腱、胰岛素分泌、肝脏、血液及组织类型的成熟细胞，扩增诱导后移植到体内和相应组织细胞良好整合，发挥特定的生物学功能，可以用来移植治疗多种疾病。干细胞诱导分化后的胰岛素分泌样细胞移植将成为糖尿病治疗的最佳选择，可以用来移植治疗急慢性胰组织损伤如急性胰岛损伤等疾病。

关于骨髓来源干细胞的可塑性即分化潜能已获得以下证据：(1)将骨髓干细胞移植到脑组织中，发现可转化为神经细胞，修复脑组织损伤；(2)骨髓干细胞在体外被诱导分化为分泌胰岛素的胰岛样细胞；(3)纯化的骨髓造血干细胞移植到胚胎组织中，可随胚胎发育进入各种组织中，分化为相应组织类型的成熟细胞；(4)胰岛素分泌干细胞来源于造血干细胞；上述研究结果提示骨髓来源的干细胞具有转化为胰岛素分泌细胞的潜能。

已有定向诱导成体干细胞分化为胰岛素分泌细胞的报道，方法和使用的制剂主要有：(1)体内诱导，将干细胞直接移植到胰岛素分泌组织中，观察发现可以在胰岛素分泌组织的特定环境中被诱导分化为胰岛素分泌细胞；(2)直接通过静脉注射方法输入干细胞，部分干细胞可进入胰岛组织，分化为胰岛素分泌细胞；(3)体外条件下将干细胞与胰岛素分泌细胞相关因子共培养，发现干细胞被诱导分化为胰岛素分泌样细胞，如2003年6月自然科学进展杂志第13卷第6期报道“成人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为胰岛样细胞团的研究”所采用的诱导剂为含10ng/mL β细胞调节素(Betacellulin)等。

目前的研究尚未形成稳定可靠的技术方法，有关报道所采用的技术主法主要采用体内诱导，现有技术研究方法及诱导试剂各不相同，应用效果不稳定，且未形成标准。

相关名词注释：

(1)干细胞：是各种成熟细胞的起源细胞，根据来源及分化潜能的不同，分为胚胎干细胞(embryonic stemcells，ES)和成体干细胞(dult stem cells，ASCs)两类。有潜在的扩增及诱导分化性能。本发明的应用涉及干细胞中的间充质干细胞和造血干细胞两类。

(2)造血干细胞：来源于骨髓、外周血和脐带血，具有自我更新和分化潜能，特异标志是表达CD34抗原或CD133抗原。

(3)间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs简写为MSC)：是目前研究较多的ASCs，广泛存在于成人多种组织中，而且具有多向分化潜能，可以在体内外被诱导分化为多种类型、不同功能的成熟细胞。在体外能达到50次以上倍增而保持其多向分化的潜能性。

(4)DMEM与F12培养基：细胞培养通用基础培养基。

(5)卵细胞提取物：从人或动物卵细胞中提取，分子量大小正常不等的复杂混合物，含有多种促进、调控及诱导细胞生长分化因子。可作为营养液使用。该项技术的技术方案记载在专利申请号为200410033182.9的专利申请中。

(6)胰岛素分泌细胞：特指具有分泌胰岛素功能的胰β细胞，是胰腺组织结构与功能重要组成细胞。

(7)干细胞诱导分化：用天然化合物或细胞因子等与干细胞在特定温度、湿度和二氧化碳条件下共同培养一定时间后，干细胞分化为成熟细胞。不同诱导因子和条件诱导后所得成熟细胞类型不同。

发明内容

本发明提供一种取材于人或动物体内胰岛素分泌细胞组织，经人工提取的、使分子量小于20万道尔顿(Da)的胰岛素分泌细胞提取物；本发明还提供该胰岛素分泌细胞提取物在体外MSC及造血干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞中作为诱导剂的应用技术，本发明的胰岛素分泌细胞提取物在MSC及造血干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的应用中，显示出良好的诱导分化率，且效果好，重复性及稳定性好。

本发明的应用，在技术方案中，以MSC为代表进行阐述。

发明技术方案如下：

人或动物胰岛素分泌细胞提取物，主要包括以下方法提取：

取人或动物胰腺组织，去除红细胞、被膜及结缔组织等非需要成份→细胞匀浆→细胞破碎→沉淀或过滤，取上清液→分离去除大于20万道尔顿(Da)以上分子量的物质→蛋白浓度测定，活性测定，除菌，冻存或制备成试剂分装。

具体方法为：

(1)取人或动物胰腺组织，去除内存红细胞及被膜、结缔组织，剪碎备用；

(2)在4℃以下，匀浆3-5次；

(3)将匀浆液行细胞破碎至细胞完全破碎；

(4)在1-4℃条件下，去处沉渣和蛋白絮状物，吸取上清液；

(5)获得的上清液，截留分离去除分子量大于20万道尔顿(Da)以上的大分子物质，使获得的过滤液中的蛋白和多肽类物质的分子量小于20万道尔顿(Da)；

(6)获得的过滤液蛋白含量测定，活性测定，除菌，冻存或无菌分装，此为本发明的胰岛素分泌细胞提取物。

步骤(1)的胰腺组织剪碎后进行匀浆，也可以加入1-4倍生理盐水稀释后再匀浆；步骤(3)细胞破碎可以用化学或物理的方法，优选冻融，是置于冰箱冻存至完全冻结，然后在不高于42℃的条件下彻底融化，最好是隔水加温，如上条件反复冻融3-5次，按常规涂片显微镜观察，证明细胞完全破碎；步骤(5)的截留分离方法可以是高速离心、电泳、过滤膜过滤等方法，优选过滤膜在正压或负压条件下过滤截留，其目的是将大分子物质分离出来，保留分子量小于20万道尔顿(Da)的成份。过滤膜的选用要求能截留下分子量大于20万道尔顿(Da)的大分子物质。本发明的胰岛素分泌细胞提取物滤液用常规方法制成试剂，可粉剂或水剂。制成水剂时，蛋白质浓度大于4毫克/毫升为好，若水剂中蛋白浓度过低，在应用时为了满足蛋白浓度，相应的水容积增大，导致一定体积的培养液内的其它成份用量减少，不能满足培养液配比要求。不论是粉剂或水剂，应用时，根据活性单位要求取量即可。试剂应按生物制剂保存办法低温保存。

所述的动物胰腺组织是来源于动物体，动物又以哺乳动物为好。

本发明的胰岛素分泌细胞提取物的生产过程，最好在上述低温条件下进行，以减少活性损失，防止污染。细胞破碎应完全，可采用化学或机械方法，超声波等技术，冻融过程需反复进行至细胞完全破碎。蛋白质含量可因盐水加入的多少而变化，提取液中蛋白质浓度最好为1毫克/毫升以上，保证其它有效成份得以充分提取，制备成试剂时，可再浓缩或稀释到要求浓度，活性界定是在应用中以100毫升培养液含胰岛素分泌细胞提取物以蛋白质浓度表示，含蛋白质1毫克以上即表现有活性，为有效活性范围。冻存以结冻为温度要求，能较好地保存提取物的活性，积量后制备试剂，可以是-20℃以下，能长期保存。除菌方法以过滤法为好。

本发明所述的胰岛素分泌细胞提取物在MSC诱导分化中的应用，是将本发明的胰岛素分泌细胞提取物、基础培养基等与MSC共同培养，诱导其分化为胰岛素分泌样细胞，其应用可以是本发明的胰岛素分泌细胞提取物作为诱导剂结合现有技术的应用，也可以是本发明的胰岛素分泌细胞提取物与其它试剂如基础培养基、营养液、促细胞生长因子、抗氧化剂及抗生素等共同制备成干细胞诱导分化试剂盒的应用。所述试剂盒的应用可以是主要由基础培养基和卵细胞提取物和胰岛素分泌细胞提取物制备的试剂盒中的应用，可以是主要由基础培养基和胰岛素分泌细胞提取物制备的试剂盒中的应用所述基础培养基以选自DMEM与F12的混合培养基为好。

应用有效量即活性条件：以培养液总体积中含胰岛素分泌细胞提取物以蛋白质浓度表示.显示为蛋白质1％(毫克/毫升)以上即表现有活性，为有效活性范围，在1％-100％为更有效活性范围。在此活性范围内，诱导分化率达到60％以上。

经多次反复的实验，分别以人MSC或造血干细胞为例，扩增培养15天，传代四次，将扩增后的干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞，再培养15天，传代四次，诱导分化为胰岛素分泌细胞的诱导分化率达到本发明的应用效果，且重复性和稳定性好。诱导细胞鉴定结果：经显微镜观察具有胰岛细胞形态，用标记单克隆抗体进行流式细胞分析和免疫细胞化学鉴定证明表达胰岛素分泌细胞的特异抗原标志，正常分泌胰岛素，体内移植后可以发挥胰岛素分泌细胞的特定生物学功能和治疗胰岛细胞损伤性疾病。

本发明的胰岛素分泌细胞提取物在MSC和造血干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的应用中，显示出良好的诱导分化率，在60％以上，适宜的应用，诱导分化率可达到95％以上。本发明的应用覆盖这两类细胞诱导分化中的应用。

所述人或动物胰岛素分泌细胞提取物所含成份及其含量目前尚未完全清楚，已有报导证实，胰岛素分泌细胞胞浆中含有潜在调节细胞生长与分化的因子，还含有丰富的蛋白质及相关因子，与其它培养基及相关因素共同为MSC及造血干细胞诱导分化提供了理想的综合营养环境，表现为维持干细胞生长的同时，诱导其向胰岛素分泌细胞分化。

现结合实施例对本发明作进一步阐述：

实施例1.胰岛素分泌细胞提取物的制备

(1)取动物胰腺组织，立即通过动脉和静脉灌生理盐水，最大限度地去除血管内存留的红细胞，剃出被膜、结缔组织、血管等非需要成份，剪碎，加入等量生理盐水备用；

(2)组织匀浆或捣碎机在4℃条件下，1-3万转/分钟匀浆3-5次，每次1分钟；应注意匀浆机不宜过热，否则部分组织液失去插性；

(3)将匀浆液置于-20℃冰箱冻存至完全冻结，一般24小时以上，然后在不高于42℃的条件下隔水彻底融化，如上条件反复冻融3-5次，按常规涂片显微镜观察，证明细胞完全破碎；

(4)在1-4℃的条件下自然沉降2-10小时，吸取上清液，用3-4层无菌纱布过滤，去处沉渣和蛋白絮状物，在4℃条件下，400-600g离心30分钟，取上清液；

(5)用过滤膜在正压或负压条件下过滤获得的上清液，截留分子量大于20万道尔顿(Da)以上的大分子物质，使过滤液中的蛋白和多肽类物质的分子量小于20万道尔顿(Da)；

(6)测定蛋白浓度为20毫克/毫升，应用活性测定符合，过滤法除菌，用无菌生理盐水稀释成蛋白浓度为10毫克/毫升，无菌分装，为水剂试剂。

实施例2，MSC诱导分化为胰岛素分泌细胞的应用

试剂盒的应用，卵细胞提取物水剂，含蛋白10毫克/毫升，上述胰岛素分泌细胞提取物水剂，含蛋白10毫克/毫升，制备每100毫升试剂盒，各组份独立包装用量：

(1)DMEM与F12混合培养基        80毫升

(2)动物卵细胞提取物水剂       10毫升

(3)胰岛素分泌细胞提取物水剂   10毫升

试剂盒中可以有常规用有效量的促细胞生长因子、抗氧化剂及抗生素等。

诱导培养方法：

1、间充质干细胞分离、纯化：按常规方法从骨髓、脂肪等组织中分离获得单个核细胞，先进行细胞原代贴壁培养后用间充质干细胞的表面特异标志抗原进行正、负免疫筛选，获得纯间充质干细胞。若细胞数量足够，也可直接用分离获得的单个核细胞进行分离纯化。依据实验目的和细胞数量，先进行细胞扩增培养到所需数量或直接用本试剂进行诱导。

2、间充质干细胞贴壁培养：将间充质干细胞用基础培养基稀释为1×10⁵细胞/ml，按1×10⁴细胞/cm²密度接种到培养瓶(皿)中，按间充质干细胞体外扩增方法进行体外培养至细胞长满瓶壁，2/3以上细胞融合后进行诱导培养。间充质干细胞判定标准：形态：梭形，呈火焰状有规则排列生长。表面分子标志：CD34^-、CD45^-、CD103⁺、CD106⁺、SH2⁺、SH4⁺。

3、诱导培养：移出贴壁培养细胞后的培养液，用生理盐水洗1-2次，将上述量的细胞进行诱导，需试剂盒培养液总体积为10ML，设定培养液中两种细胞提取物活性蛋白质含量分别为50％，则取DMEM/F12培养基9.0毫升，卵细胞提取物0.5毫升，胰岛素分泌细胞提取物0.5毫升，此10ML培养液中含两种细胞提取物蛋白质各5mg，活性蛋白质浓度分别为50％，根据需要可加入常规用有效量的促细胞生长因子、抗氧化剂及抗生素等。将试剂盒培养液与细胞的混合物置于37℃、5％CO2、95％湿度条件下培养，连续观察细胞生长状况。

4、诱导细胞鉴定：

(1)形态：呈团块状，球形细胞；

(2)NESTIN呈阳性，正常分泌胰岛素；

(3)移植实验：通过对大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞，再将分化的细胞移植入糖尿病大鼠体内，经观察，有效解除了大鼠对胰岛素的依赖，部份消除了糖尿病症状。

(4)诱导率：90％以上。

实施例3，造血干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的应用

试剂盒的应用，胰岛素分泌细胞提取物水剂，含蛋白5毫克/毫升，制备每100毫升试剂盒，各组份独立包装用量：

(1)DMEM与F12混合培养基(重量比1∶1)    80毫升

(2)胰岛素分泌细胞提取物水剂           10毫升

试剂盒中可以有常规用有效量的促细胞生长因子、抗氧化剂及抗生素等。

诱导培养方法：

1、造血干细胞分离、纯化：常规技术；

2、造血干细胞培养：采用悬浮培养，为现有技术手段；

3、诱导培养：培养方法同上，设定培养液中胰岛素分泌细胞提取物活性蛋白质含量为30％，则取DMEM/F12培养基9.4毫升，胰岛素分泌细胞提取物0.6毫升，此10ML培养液中含胰岛素分泌细胞提取物蛋白质3mg，活性蛋白质浓度为30％，加入常规用有效量的促细胞生长因子、抗氧化剂及抗生素等。将试剂盒培养液与细胞的混合物置于37℃、5％CO2、95％湿度条件下培养，连续观察细胞生长状况。

4、诱导细胞鉴定：内容同实施例2。

实施例4

结合现有技术的应用可以是现有体外间充质干细胞诱导分化为胰岛素分泌样细胞的方法中，本发明胰岛素分泌细胞提取物作为诱导试剂的应用。关于结合现有技术的应用。从理论上认为是可行的。

经多个实施例，培养液中分别含胰岛素分泌细胞提取物不同蛋白浓度如5％、10％、20％、35％、50％、75％、100％及150％(毫克/毫升)作诱导培养，均获得较满意的效果，显示出良好的重复性和稳定性。本发明的技术方案不受实施例的限制。

Claims (6)

1.胰岛素分泌细胞提取物，其通过以下方法制取：

(1)将哺乳动物胰腺组织，去除内存红细胞及被膜及结缔组织，剪碎备用；

(2)在4℃以下，加入1-4倍生理盐水稀释后匀浆3-5次；

(3)细胞破碎方法是冻融，将匀浆液置于冰箱冻存至完全冻结，然后在不高于42℃条件下彻底融化，如上条件反复冻融3-5次，按常规涂片显微镜观察，细胞完全破碎；

(4)在1-4℃条件下，去除沉渣和蛋白絮状物，吸取上清液；

(5)获得的上清液，分离去除分子量大于20万道尔顿(Da)的大分子物质；

(6)获得的过滤液蛋白含量测定，蛋白浓度为1毫克以上/每毫升滤液，活性测定，除菌，冻存或制备试剂无菌分装。

2.根据权利要求1所述的胰岛素分泌细胞提取物，其特征在于，步骤(5)的分离方法是用过滤膜在正压或负压条件下过滤。

3.权利要求1的胰岛素分泌细胞提取物在体外诱导间充质干细胞或造血干细胞分化为胰岛素分泌细胞中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用是在制备试剂盒中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒主要是由基础培养基和胰岛素分泌细胞提取物制备的试剂盒。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，试剂盒的基础培养基为DMEM与F12的混合培养基。