KR101592182B1 - 인간 배아 줄기 세포의 분화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법 및 이러한 방법에 관련되거나 그로부터 수득되는 생성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 췌장 호르몬 발현 세포 및 췌장 호르몬 분비 세포의 형성을 위한 개선된 방법을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 또한 영양 세포층을 사용하지 않으면서 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법 및 이러한 방법에 관련되거나 그로부터 수득되는 생성물을 제공한다. 본 발명은 또한 만능 줄기 세포로부터 유래하는 인슐린-생산 세포에서 글루코스-자극된 인슐린 분비를 촉진하는 방법을 제공한다.

Description

인간 배아 줄기 세포의 분화{Differentiation of human embryonic stem cells}
본 발명은 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법 및 이러한 방법에 관련되거나 그로부터 수득되는 생성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 췌장 호르몬 발현 세포 및 췌장 호르몬 분비 세포의 형성을 위한 개선된 방법을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 또한 영양 세포층(feeder cell layer)을 사용하지 않으면서 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법 및 이러한 방법에 관련되거나 그로부터 수득되는 생성물을 제공한다. 본 발명은 또한 만능 줄기 세포로부터 유래하는 인슐린-생산 세포에서 글루코스-자극된 인슐린 분비를 촉진하는 방법을 제공한다.
제I형 진성 당뇨병 및 이식가능한 랑게르한스섬의 부족에 대한 세포-대체 치료법에서의 진전에서는 생착(engraftment)에 적절한 인슐린-생산 세포, 또는 β 세포의 공급원을 개발하는 데 관심이 집중되었다. 한 가지 접근법은 예를 들어 배아 줄기 세포와 같은 만능 줄기 세포로부터의 기능성 β 세포의 생성이다.
척추동물 배아 발생에서, 만능 세포는 낭배형성(gastrulation)으로 알려진 과정에서 삼배엽층(three germ layers)(외배엽, 중배엽, 및 내배엽)을 포함하는 세포군을 생성한다. 예를 들어, 갑상선, 흉선, 췌장, 소화관, 및 간과 같은 조직은 중간 단계를 통해 내배엽으로부터 발생할 것이다. 이 과정에서 중간 단계는 완성 내배엽(definitive endoderm)의 형성이다. 완성 내배엽 세포는 HNF-3베타, GATA4, Mixl1, CXCR4 및 Sox-17과 같은 많은 마커를 발현한다.
만능 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원(stage-specific embryonic antigen, SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다 (문헌[Thomson 등., Science 282:1145, 1998]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81 발현(존재하는 경우)의 손실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼라인 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사 (미국 캘리포니아주 벌링게임 소재의 벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories))가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드(Vector Red)를 이용하여 발색시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화된 만능 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출할 때, Oct-4 및 TERT를 발현한다.
만능 줄기 세포는 전형적으로 다양한 방식으로 만능 줄기 세포를 지지하는 영양 세포층 상에서 배양된다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 본질적으로 영양 세포가 없지만, 그럼에도 불구하고 실질적인 분화를 거치지 않고 만능 줄기 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템에서 배양된다. 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지를 이용하여 지지된다. 대안적으로, 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 화학적 규명 배지를 이용하여 지지된다.
예를 들어, 문헌[Reubinoff et al , Nature Biotechnology 18: 399 - 404 (2000)] 및 문헌[Thompson et al, Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145 - 1147]은 생쥐 배아 섬유아세포 영양 세포층을 사용하여 인간 배반포로부터 만능 줄기 세포주를 배양하는 것을 개시한다.
리차즈(Richards) 등, (문헌[Stem Cells 21: 546-556, 2003])은 인간 만능 줄기 세포 배양을 지지하는 능력에 대해 11가지 상이한 인간 성인, 태아 및 신생아 영양 세포층의 패널을 평가하였다. 리차즈 등은 "성인 피부 섬유아세포 영양세포 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포주는 인간 배아 줄기 세포 형태를 유지하며 만능으로 남아 있다"고 진술한다.
미국 특허 출원 공개 제20020072117호는 영양세포가 없는 배양에서 영장류 만능 줄기 세포의 성장을 지지하는 배지를 생성하는 세포주를 개시한다. 이용된 세포주는 배아 조직으로부터 얻어지거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 중간엽 및 섬유아세포-유사 세포주이다. 미국 특허 출원 공개 제20020072117호는 또한 일차 영양 세포층으로서의 당해 세포주의 사용을 개시한다.
다른 예에서는, 왕(Wang) 등 (문헌[Stem Cells 23: 1221-1227, 2005])은 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 영양 세포층 상에서 인간 만능 줄기 세포의 장기 성장을 위한 방법을 개시한다.
다른 예에서는, 스토코빅(Stojkovic) 등 (문헌[Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005])은 인간 배아 줄기 세포의 자발적 분화로부터 유래된 영양 세포 시스템을 개시한다.
추가 예에서, 미야모토(Miyamoto) 등 (문헌[Stem Cells 22: 433-440, 2004])은 인간 태반으로부터 얻은 영양 세포의 공급원을 개시한다.
아미트(Amit) 등 (문헌[Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003])은 인간 포피로부터 유래된 영양 세포층을 개시한다.
다른 예에서, 인준자(Inzunza) 등 (문헌[Stem Cells 23: 544-549, 2005])은 인간 출생후 포피 섬유아세포 유래의 영양 세포층을 개시한다.
미국 특허 제6642048호는 영양세포가 없는 배양에서 영장류 만능 줄기(primate pluripotent stem, pPS) 세포의 성장을 지지하는 배지 및 그러한 배지의 생성에 유용한 세포주를 개시한다. 미국 특허 제6642048호는: "본 발명은 배아 조직으로부터 얻어지거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 중간엽 및 섬유아세포-유사 세포주를 포함한다. 그러한 세포주를 유도하고, 배지를 가공하고, 조절된 배지를 이용하여 줄기 세포를 성장시키는 방법이 이 개시 내용에 기재되고 예시된다. "라고 진술한다.
다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005014799호는 포유류 세포의 유지, 증식 및 분화를 위한 조절된 배지를 개시한다. 국제특허 공개 WO2005014799호는 "본 발명에 따라 생성된 배양 배지는 쥐과 세포, 특히 MMH(Met 쥐과 간세포(Met Murine Hepatocyte))로 불리는, 분화되고 불멸화된 트랜스제닉(transgenic) 간세포의 세포 분비 활성에 의해 조절된다"고 진술한다.
다른 예에서, 수(Xu) 등 (문헌[Stem Cells 22: 972-980, 2004])은 인간 텔로머라아제 역전사효소를 과다 발현하도록 유전적으로 변형된 인간 배아 줄기 세포 유도체로부터 얻은 조절된 배지를 개시한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20070010011호는 만능 줄기 세포의 유지를 위한 화학적으로 규명된 배양 배지를 개시한다.
대안적인 배양 시스템은 배아 줄기 세포의 증식을 촉진할 수 있는 성장 인자로 보충된 무-혈청 배지를 이용한다. 예를 들어, 천(Cheon) 등 (문헌[BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005])은 배아 줄기 세포 자가-재생을 일으킬 수 있는 상이한 성장 인자로 보충된 비조절된 혈청 대체(serum replacement, SR) 배지에서 배아 줄기 세포가 유지되는 영양세포가 없는 무-혈청 배양 시스템을 개시한다.
다른 예에서, 레벤스타인(Levenstein) 등 (문헌[Stem Cells 24: 568-574, 2006])은 bFGF로 보충된 배지를 이용하여, 섬유아세포 또는 조절된 배지의 부재 하에서 인간 배아 줄기 세포의 장기 배양을 위한 방법을 개시한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050148070호는 혈청 없이 그리고 섬유아세포 영양 세포 없이 규명된 배지에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 개시하며, 이 방법은 알부민, 아미노산, 비타민, 미네랄, 적어도 하나의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 적어도 하나의 인슐린 또는 인슐린 대체물을 함유한 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 배양 배지는 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없으며 적어도 약 100 ng/mL의, 섬유아세포 성장 인자 시그널링 수용체를 활성화시킬 수 있는 섬유아세포 성장 인자를 함유하며, 여기서 성장 인자는 단지 섬유아세포 영양 세포층 이외의 공급원으로부터 공급되며, 배지는 영양 세포 또는 조절된 배지 없이 미분화된 상태로 줄기 세포의 증식을 지지한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050233446호는 미분화 영장류 원시 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포를 배양하는 데 유용한 규명된 배지를 개시한다. 용액에서, 배지는 배양되는 줄기 세포와 비교할 때 사실상 등장성이다. 주어진 배양물에서, 특정 배지는 기본 배지 및 원시 줄기 세포의 사실상 미분화된 성장을 지지하는 데 필요한 양의 bFGF, 인슐린 및 아스코르브산 각각을 포함한다.
다른 예에서, 미국 특허 제6800480호는 "일 실시 형태에서, 사실상 미분화된 상태의 영장류-유래 원시 줄기 세포를 성장시키기 위한 세포 배양 배지가 제공되며 이 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 저 삼투압, 저 내독소 기본 배지를 포함한다. 기본 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 영양 혈청과, 영양 세포 및 영양 세포로부터 유래된 세포외 매트릭스 성분으로 이루어진 군으로부터 선택된 기질과 조합된다. 배지는 추가로 비필수 아미노산, 산화방지제, 및 뉴클레오시드와 피루베이트염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 성장 인자를 포함한다. "고 진술한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050244962호는 "일 태양에서 본 발명은 영장류 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없는(바람직하게는 또한 본질적으로 임의의 동물 혈청이 없는) 배지에서 그리고 단지 섬유아세포 영양 세포층 이외의 공급원으로부터 공급된 섬유아세포 성장 인자의 존재 하에서 줄기 세포를 배양한다. 바람직한 형태에서, 이전에는 줄기 세포 배양을 지속하기 위해 필요했던 섬유아세포 영양세포층이 충분한 섬유아세포 성장 인자의 첨가에 의해 불필요해지게 된다."고 진술한다.
추가의 예에서, 국제특허 공개 WO2005065354호는 본질적으로 영양세포가 없는 그리고 무혈청인 규명된 등장성 배양 배지를 개시하며, 이 배지는 a. 기본 배지; b. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 bFGF; c. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 인슐린; 및 d. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 아스코르브산을 포함한다.
다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005086845호는 미분화 줄기 세포의 유지 방법을 개시하며, 상기 방법은 원하는 결과를 성취하기에 충분한 시간 동안 미분화 상태의 세포를 유지하기에 충분한 양의 형질전환 성장 인자-베타(transforming growth factor-beta, TGFβ) 패밀리 단백질의 구성원, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 패밀리 단백질의 구성원, 또는 니코틴아미드(NIC)에 줄기 세포를 노출시키는 것을 포함한다.
만능 줄기 세포는 세포외 매트릭스로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 배양되고 분화될 수 있다. 세포외 매트릭스는 조직 배양 기재를 코팅하기 전에 희석될 수 있다. 세포외 매트릭스을 희석하고 조직 배양 기재를 코팅하기 위한 적합한 방법의 예는 문헌[Kleinman, H.K., 등, Biochemistry 25:312 (1986), 및 Hadley, M.A., 등, J.Cell.Biol. 101:1511 (1985)]에서 찾을 수 있다.
췌장의 형성은 완성 내배엽의 췌장 내배엽으로의 분화로부터 생긴다. 췌장 내배엽의 세포는 췌장-십이지장 호메오박스(homeobox) 유전자, Pdx1을 발현한다. Pdx1의 부재 하에서는, 췌장은 복측 원기(ventral bud) 및 배측 원기(dorsal bud)의 형성 이상으로는 발달하지 못한다. 따라서, Pdx1 발현이 췌장 기관형성에서 중요한 단계를 특징짓는다. 성숙한 췌장은 다른 세포 유형 중에서도 외분비 조직 및 내분비 조직을 함유한다. 외분비 및 내분비 조직은 췌장 내배엽의 분화로부터 생긴다.
췌도 세포의 특징을 지닌 세포가 생쥐의 배아 세포로부터 유도된 것으로 보고되었다. 예를 들어, 루멜스키(Lumelsky) 등 (문헌[Science 292:1389, 2001])은 생쥐 배아 줄기 세포가 췌도와 유사한 인슐린-분비 구조로 분화한 것을 보고한다. 소리아(Soria) 등(문헌[Diabetes 49:157, 2000])은 생쥐 배아 줄기 세포로부터 유도된 인슐린-분비 세포가 스트렙토조토신-유도 당뇨 생쥐에서 혈당을 정상화시킴을 보고한다.
한 예에서, 호리(Hori) 등 (문헌[PNAS 99: 16105, 2002])은 생쥐 배아 줄기 세포를 포스포이노시티드 3-키나아제의 억제제(SLY294002)로 처리하여 β 세포와 닮은 세포를 생성하였음을 개시한다.
다른 예에서는, 블리츠주크(Blyszczuk) 등 (문헌[PNAS 100:998, 2003])은 구성적으로 Pax4를 발현하는 생쥐 배아 줄기 세포로부터 인슐린-생산 세포를 생성하는 것을 보고한다.
미칼레프(Micallef) 등은 Pdx1 양성 췌장 내배엽이 형성되게 하는 배아 줄기 세포의 책무를 레틴산이 조절할 수 있음을 보고한다. 레틴산은 배아에서 낭배형성의 마지막에 해당하는 기간 동안 배아 줄기 세포 분화의 4일째에 배양물에 첨가될 때 Pdx1 발현을 유도하는 데 가장 효과적이다 (문헌[Diabetes 54:301, 2005]).
미야자키(Miyazaki) 등은 Pdx1을 과다 발현하는 생쥐 배아 줄기 세포주를 보고한다. 그들의 결과는 외인성 Pdx1 발현이 생성된 분화된 세포에서 인슐린, 소마토스타틴, 글루코키나아제, 뉴로제닌3, P48, Pax6, 및 HNF6 유전자의 발현을 명확히 향상시켰음을 보여준다 (문헌[Diabetes 53: 1030, 2004]).
스코우디(Skoudy) 등은 액티빈 A (TGF-β 수퍼패밀리의 구성원)가 생쥐 배아 줄기 세포에서 외분비 췌장 유전자(p48 및 아밀라아제) 및 내분비 유전자(Pdx1, 인슐린 및 글루카곤)의 발현을 상향조절함을 보고하고 있다. 최대 효과는 1 nM 액티빈 A를 이용할 때 관찰되었다. 그들은 또한 인슐린 및 Pdx1 mRNA의 발현 수준이 레틴산에 의해 영향을 받지 않지만, 3 nM FGF7 처리가 Pdx1의 전사체의 수준을 증가시킴을 관찰하였다 (문헌[Biochem. J. 379: 749, 2004]).
쉬라키(Shiraki) 등은 배아 줄기 세포의 Pdx1 양성 세포로의 분화를 특이적으로 향상시키는 성장 인자들의 효과를 연구하였다. 이들은 TGF-β2가 재현가능하게 더 높은 비율의 Pdx1 양성 세포를 생성함을 관찰하였다 (문헌[Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16]).
고든(Gordon) 등은 혈청의 부재 하에서 그리고 Wnt 시그널링의 억제제와 함께 액티빈의 존재 하에서 생쥐 배아 줄기 세포로부터 브라키우리(brachyury)+/HNF-3베타+ 내배엽 세포의 유도를 증명하였다 (미국 특허 출원 공개 제2006/0003446A1호).
고든(Gordon) 등(문헌[PNAS, Vol 103, page 16806, 2006])은 "Wnt 및 TGF-베타/ 노달(nodal)/ 액티빈 시그널링은 전방 원시선(anterior primative streak)의 생성에 동시에 필요하였다"라고 진술한다.
그러나, 배아 줄기 세포 발생의 생쥐 모델은 예를 들어, 인간과 같은 고등 포유류에서의 발생 프로그램을 정확하게 모방하지 않을 수 있다.
톰슨(Thomson) 등은 인간 배반포로부터 배아 줄기 세포를 단리하였다 (문헌[Science 282:114, 1998]). 동시에, 기어하트(Gearhart)와 동료들은 태아 생식선 조직으로부터 인간 배아 배(human embryonic germ, hEG) 세포주를 유도하였다 (문헌[Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998]). 백혈병 억제 인자(Leukemia Inhibitory Factor, LIF)와 함께 배양함으로써 간단하게 분화를 방지할 수 있는 생쥐 배아 줄기 세포와는 달리, 인간 배아 줄기 세포는 매우 특별한 조건 하에서 유지되어야 한다(미국 특허 제6,200,806호; 국제특허 공개 WO 99/20741호; 국제특허 공개 WO 01/51616호).
드'아무르(D'Amour) 등은 고농도의 액티빈과 저 혈청의 존재 하에서 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽의 농축 배양물의 생성을 개시한다 (문헌[Nature Biotechnology 2005]). 생쥐의 신장 피막 하에 이들 세포를 이식하면 일부 내배엽 기관의 특징을 가진 보다 성숙한 세포로 분화되었다. 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽 세포는 FGF-10의 첨가 후에 Pdx1 양성 세포로 추가로 분화될 수 있다 (미국 특허 출원 공개 제2005/0266554A1호).
드'아무르 등 (문헌[Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401 (2006)])은 "우리는 인간 배아 줄기(hES) 세포를 췌장 호르몬 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩티드 및 그렐린(ghrelin)을 합성할 수 있는 내분비 세포로 전환시키는 분화 과정을 개발하였다. 이 과정은 도중에 완성 내배엽, 창자관 내배엽, 췌장 내배엽, 및 내분비 전구체를 닮은 단계들을 통해 세포를 내분비 호르몬 발현 세포가 되도록 함으로써 생체내(in vivo) 췌장 기관형성을 모방한다"라고 진술한다.
다른 예에서, 피스크(Fisk) 등은 인간 배아 줄기 세포로부터 췌도 세포를 생성하는 시스템을 보고한다 (미국 특허 출원 공개 제2006/0040387A1호). 이 경우에는, 분화 경로가 세 단계로 나뉘어졌다. 먼저, 인간 배아 줄기 세포는 부티르산나트륨과 액티빈 A의 조합을 사용하여 내배엽으로 분화되었다. 이어서, EGF 또는 베타셀룰린과 조합된 노긴(Noggin)과 같은 TGF-β 길항제를 이용하여 세포를 배양하여 Pdx1 양성 세포를 생성하였다. 마지막 분화는 니코틴아미드에 의해 유도되었다.
일 예에서, 벤베니스트리(Benvenistry) 등은 "우리는 Pdx1의 과다 발현이 췌장에 풍부한 유전자의 발현을 향상시켰으며 인슐린 발현의 유도는 생체내에서만 존재하는 추가의 시그널을 필요로 할 수 있다고 결론내린다"라고 진술한다 (문헌[Benvenistry et al, Stem Cells 2006; 24:1923-1930]).
다른 예에서, 오도리코(Odorico) 등은 포유류 만능 줄기 세포의 췌장 계통 세포로의 직접적인 시험관 내 분화를 위한 방법을 보고한다. 이 방법은 유효량의 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein)의 존재 하에서 줄기 세포를 배양하여 중내배엽 방향으로 분화를 유도하는 것을 포함한다. 이들 중내배엽 세포는 추가로 배양되어 완성 내배엽 결정(committed) 세포가 풍부해진 배양체(embryoid body, EB)를 형성하고, 이는 마지막에 규정된 조건 하에서 췌장 계통 세포로 분화된다(미국 특허 출원 공개 제20070259423호).
다른 예에서, 문헌[Tulachan et al, Developmental Biology, 305, 2007, Pgs 508-521]은 "따라서 배아기에서의 TGF-B 시그널링의 억제는 췌장 상피 세포가 내분비 계통 쪽으로 진행하는 것을 허용할 수 있다"고 진술한다.
따라서, 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 또는 췌장 호르몬 분비 세포로 분화하는 잠재력을 보유하면서, 현재의 임상적 요구에 대처하도록 확장될 수 있고 글루코스 농도의 변화에 응답하여 인슐린을 분비하는 능력을 갖는 만능 줄기 세포주를 확립하기 위한 조건을 개발하는 것에 대한 상당한 필요성이 여전히 존재한다. 본 발명자들은 인간 배아 줄기 세포를 글루코스 수준의 변화에 응답하여 인슐린을 분비할 수 있는 췌장 내분비 세포로 분화시키는 효율을 향상시키는 대안적 접근법을 취하였다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포로부터 글루코스-자극된 인슐린 분비를 할 수 있는 세포를 생성하는 방법을 제공한다:
a. 만능 줄기 세포를 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계, 및
d. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계.
일 실시 형태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포로부터 유래하는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에서 글루코스-자극된 인슐린 분비를 촉진하는 방법을 제공한다:
a. 만능 줄기 세포를 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계, 및
d. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계.
일 실시 형태에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포는 하기 방법 중 임의의 하나에 의해 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포로부터 분화된다:
a. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포를 섬유아세포 성장 인자 및 헤지호그(hedgehog) 시그널링 경로 억제제로 처리하고, 이어서 섬유아세포 성장 인자 및 헤지호그 시그널링 경로 억제제를 함유하는 배지를 제거하고, 후속적으로 레틴산, 섬유아세포 성장 인자 및 헤지호그 시그널링 경로 억제제를 함유하는 배지에서 상기 세포를 배양하거나, 또는
b. 레틴산 및 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포를 처리하거나, 또는
c. 레틴산, 소닉 헤지호그 억제제, 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자, 및 BMP를 억제할 수 있는 적어도 하나의 인자로 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리하거나, 또는
d. 레틴산, 소닉 헤지호그 억제제, 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자, 및 네트린으로 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리하거나, 또는
e. 레틴산, 소닉 헤지호그 억제제, 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자, BMP를 억제할 수 있는 적어도 하나의 인자, 및 네트린으로 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리하거나, 또는
f. 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자 및 소닉 헤지호그 억제제로 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리한 후, 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자 및 소닉 헤지호그 억제제를 제거하고 후속적으로 소닉 헤지호그 억제제, 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자, 및 레틴산으로 상기 세포를 처리하거나, 또는
g. 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자 및 소닉 헤지호그 억제제로 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리한 후, 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자 및 소닉 헤지호그 억제제를 제거하고 후속적으로 소닉 헤지호그 억제제, 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자, 레틴산, 및 BMP를 억제할 수 있는 적어도 하나의 인자로 상기 세포를 처리하거나, 또는
h. 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자 및 소닉 헤지호그 억제제로 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리한 후, 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자 및 소닉 헤지호그 억제제를 제거하고 후속적으로 소닉 헤지호그 억제제, 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자, 레틴산 및 네트린으로 상기 세포를 처리하거나, 또는
i. 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자 및 소닉 헤지호그 억제제로 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리한 후, 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자 및 소닉 헤지호그 억제제를 제거하고 후속적으로 소닉 헤지호그 억제제, 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자, 레틴산, BMP를 억제할 수 있는 적어도 하나의 인자, 및 네트린으로 세포를 처리함.
일 실시 형태에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포는 하기 방법 중 임의의 하나에 의해 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포를 처리함으로써 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포로부터 분화된다:
a. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 γ 시크리타아제 억제제 및 GLP-1 작용제를 함유하는 배지에서 배양한 후, γ 시크리타아제 억제제 및 GLP-1 작용제를 함유하는 배지를 제거하고 후속적으로 GLP-1 작용제, IGF-1 및 HGF를 함유하는 배지에서 세포를 배양하거나, 또는
b. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 GLP-1 작용제를 함유하는 배지에서 배양한 후, GLP-1 작용제를 함유하는 배지를 제거하고 후속적으로 GLP-1 작용제, IGF-1 및 HGF를 함유하는 배지에서 세포를 배양하거나, 또는
c. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 γ 시크리타아제 억제제 및 GLP-1 작용제를 함유하는 배지에서 배양하거나, 또는
d. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 GLP-1 작용제를 함유하는 배지에서 배양하거나, 또는
e. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포를 노치(Notch) 시그널링 경로를 억제하는 인자로 처리하거나, 또는
f. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 TGF-βR-1 경로를 억제하는 인자로 처리하거나, 또는
g. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자, 및 TGF-βR-1 경로를 억제하는 인자로 처리하거나, 또는
h. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 약 10 mM 내지 약 20 mM 글루코스 및 GLP-1 작용제를 함유하는 배지에서 배양함.
<도 1>
도 1은 본 발명에 사용된 분화 프로토콜의 개요를 나타낸다. 패널 a)는 미국 특허 출원 제11/736,908호에 보고된 방법을 나타내고, 패널 b) 및 c)는 본 발명의 방법이다.
<도 2>
도 2는 실시예 2에 개시된 방법에 따라 분화된, 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포의 실시간(real-time) PCR 분석을 나타낸다. 췌장 내배엽(PDX-1, ISL-1) 및 내분비 마커들(NeuroD, 인슐린, 및 글루카곤)의 발현은 3기 내지 5기(S3-S5)에서 도시된다. 4기 내지 5기에서 인슐린 및 글루카곤의 발현이 유의하게 증가하였다.
<도 3>
도 3은 실시예 3에 개시된 방법에 따라 분화된, 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포의 실시간 PCR 분석을 나타낸다. 3기 내지 5기에서의 췌장 내분비 a) 인슐린, b) NKX2, c) 글루카곤, d) NeuroD, 및 췌장 내배엽 마커 d) PDX-1. 다양한 키나아제 억제제들의 효과를 3기, 4기, 또는 3기 및 4기에서 평가하였다. (+/+는 3기 및 4기 둘 모두에서의 특정 화합물의 존재를 나타내고, +/-는 3기에서의 특정 화합물의 존재 및 4기에서의 그의 부재를 나타내고, -/+는 4기에서의 특정 화합물의 존재 및 3기에서의 그의 부재를 나타낸다).
<도 4>
도 4는 실시예 4에 개시된 방법에 따라 분화된, 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포의 실시간 PCR을 나타낸다. 췌장 마커들 a) 글루카곤 및 인슐린, b) HAND1 및 NeuroD, c) HNF4a 및 PDX-1, d) NKX2.2 및 Sox17이 3기 내지 5기에서 도시된다. ALK5 억제제 II의 효과를 4기, 5기, 또는 4기 및 5기에서 평가하였다. (+/+는 4기 및 5기 둘 모두에서의 억제제의 존재를 나타내고, +/-는 4기에서의 억제제의 존재 및 5기에서의 그의 부재를 나타내고, -/+는 5기에서의 억제제의 존재 및 4기에서의 그의 부재를 나타낸다.).
<도 5>
도 5는 실시예 5에 개시된 방법에 따라 분화된, 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포의 실시간 PCR 분석을 나타낸다. a) 글루카곤, b) 인슐린, c) PDX-1, d) NeuroD의 발현에 대한 1-10 ㎛ ALK5 억제제 I 및 II의 영향이 4기 및 5기에서 도시된다. 대조군 처리는 분화 과정 중에 어떠한 ALK5 억제제도 포함하지 않았다.
<도 6>
도 6은 실시예 6에 개시된 방법에 따라 분화된, 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포의 실시간 PCR 분석을 나타낸다. a) 알부민, b) CDX2, c) 인슐린, d) 글루카곤, e) PDX-1, f) NeuroD, 및 g) NKX2.2의 발현에 대한 1 ㎛ ALK5 억제제 및 0-500 ng/ml의 재조합 인간 노긴의 병용 효과가 3기 내지 5기에서 도시된다. ALK5 억제제는 4기 및 5기에 첨가하였고 노긴은 3기에 첨가하였다.
<도 7>
도 7은 실시예 7에 개시된 방법에 따라 분화된, 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포의 실시간 PCR 분석을 나타낸다. a) 인슐린, b) 글루카곤, c) ngn3, d) NeuroD, e) CDX-2, f) PDX-1의 발현에 대한 1 ㎛ ALK5 억제제 및 100 ng/ml의 재조합 인간 노긴의 병용 효과가 4기 및 5기에서 도시된다. ALK5 억제제는 4기 및 5기에 첨가하였고 노긴은 3기, 4기, 또는 3기 및 4기에 첨가하였다.
<도 8>
도 8은 실시예 7에 개시된 방법에 따라 분화된 세포의 형태를 나타낸다. a) 6일째 5기 세포의 4X 위상차 이미지, b) 6일째 5기 세포의 10X 위상차 이미지, c) 12일째 5기 세포의 4X 위상차 이미지, d) 12일째 5기 세포의 10X 위상차 이미지.
<도 9>
도 9는 실시예 7에 개시된 방법에 따라 분화된, 세포의 면역형광 이미지를 나타낸다. 세포는 12일째 5기의 세포이다. b) DAPI 핵 염색과 함께 a) 단일 클러스터(cluster)의 인슐린 염색.
<도 10>
도 10은 실시예 7에 개시된 방법에 따라 분화된, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 실시간 PCR 분석 세포를 나타낸다.
<도 11>
도 11은 실시예 8에 개시된 방법에 따라 분화된, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 실시간 PCR 분석 세포를 나타낸다. 데이터는 a) ngn3, b) PDX-1, c) NeuroD, d) Pax4, e) 인슐린, 및 f) 글루카곤의 발현에 대한 4기에 첨가된 네트린-4 및/또는 ALK 5 억제제와 함께인, 3기 및 4기에 첨가된 노긴의 병용 효과를 나타낸다.
<도 12>
도 12는 실시예 8에 개시된 방법에 따라 분화된, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 실시간 PCR 분석 세포를 나타낸다. 패널 a) 인슐린, b) 글루카곤, c) ngn3, d) NKX2.2, e) NeuroD, 및 f) PDX-1.
<도 13>
도 13은 확장된 5기 배양물의 시험관 내에서의 글루코스 자극된 인슐린 분비(Glucose Stimulated Insulin Secretion, GSIS)를 나타낸다. 실시예 9에 개시된 방법에 따라 준비된 5기 세포를 5기에서 배양 a) 6일째, b) 12일째, 및 c) 8-20일째에 글루코스 챌린징하였다.
<도 14>
도 14는 내분비 마커의 발현에 대한 네트린-1 또는 네트린-2의 효과를 나타낸다. 실시예 10에 개시된 방법에 따라 분화된, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 실시간 PCR 분석 세포.
<도 15>
도 15는 완성 내배엽을 유도하기 위해 대안적 방법을 이용하여 내분비 마커를 유도한 것을 나타낸다. 실시예 11에 개시된 방법에 따라 분화된, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 실시간 PCR 분석 세포. 패널 a) 인슐린, b) 글루카곤, c) NKX2.2, d) Pax4, f) PDX-1, 및 g) NeuroD.
<도 16>
도 16은 도 1c에 약술된 분화 프로토콜의 다양한 시기에서의 다양한 마커들의 발현을 나타낸다. 패널 a)는 1기의 3일째에 H1 세포에서 FACS에 의해 결정할 때 CXCR4의 발현을 나타낸다. 패널 b)는 실시간 PCR에 의해 결정할 때 1기의 3일째 세포에서 완성 내배엽 계통 및 배아외(extraembryonic) 계통의 특징적인 마커의 발현을 나타낸다. 패널 c) - n)은 실시간 PCR에 의해 결정할 때 2기 내지 6기의 마지막에 수확된 세포에서의 다양한 유전자들의 발현을 나타낸다.
<도 17>
도 17은 도 1c에 약술된 분화 프로토콜의 다양한 시기에서의 세포의 개수를 나타낸다.
<도 18>
도 18은 다양한 자극에 응답하여 도 1c에 약술된 분화 프로토콜의 6기의 마지막에서의 세포로부터의 C-펩티드 방출을 나타낸다.
<도 19>
도 19는 성인 인간 췌도와 비교하여 도 1c에 약술된 분화 프로토콜의 6기의 마지막에서의 세포 내 C-펩티드 및 프로-인슐린(pro-Insulin) 함량을 나타낸다.
<도 20>
도 20은 도 1c에 약술된 분화 프로토콜의 6기의 마지막에서의 세포 내 인슐린(패널 a), 시냅토파이신(패널 b)의 발현 및 시냅토파이신(X-축) 및 인슐린(Y-축)의 동시-발현(패널 c)을 나타낸다.
<도 21>
도 21은 3기-4기에서 노긴 대신에 100 ng/ml의 코딘(Chordin)으로 처리된, 도 1c에 약술된 분화 프로토콜의 6기의 마지막에서의 세포 내 시냅토파이신(패널 a 및 c) 및 인슐린(패널 b 및 d)의 발현을 나타낸다.
<도 22>
도 22는 도 1c에 약술된 분화 프로토콜에 따라 처리된 인간 배아 줄기 세포주 H9 세포 내 다양한 마커들의 발현을 나타낸다. 데이터는 3기 내지 6기의 마지막에 수확된 세포 내에서 실시간 PCR에 의해 결정할 때 a) HNF4a, b) HNF6, c) CDX2, d) PDX-1, e) NKX6.1, f) Pax4, g) NKX2.2, h) NeuroD, i) NGN3, j) PECAM, k) 글루카곤, 및 l) 인슐린의 발현을 나타낸다.
<도 23>
도 23은 도 1c에 약술된 분화 프로토콜에 따라 처리된 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포 내 다양한 마커들의 발현을 나타내며, 여기서 세포는 B27 또는 N2 중 어느 하나로 처리된다. 데이터는 3기 내지 6기의 마지막에 수확된 세포 내에서 실시간 PCR에 의해 결정할 때 a) CDX2, b) 글루카곤, c) 인슐린, 및 d) PDX-1의 발현을 나타낸다.
개시 내용의 명확함을 위하여, 그리고 제한하지 않고서, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 본 발명의 소정의 특징, 실시 형태, 또는 응용을 설명하거나 예시하는 하기 세부 항목으로 나뉘어진다.
정의
줄기 세포는 단일 세포 수준에서 자가-재생하고 분화하여 자가-재생 조상세포(progenitors), 비-재생 조상세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포(progeny cells)를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서(in vitro) 분화하는 그의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직이 생기게 하며 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니라 하더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.
줄기 세포는 그들의 발생 잠재력에 의해 분류된다: (1) 모든 배아 및 배아외 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (2) 모든 배아 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 만능성; (3) 세포 계통의 하위세트이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 하위세트가 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성(예를 들어, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC(자가-재생), 혈구 세포 제한된 소기능성(oligopotent) 조상세포 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소(예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (4) 다능성 줄기 세포보다 더 제한된 하위세트의 세포 계통이 될 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계통(예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단일기능성.
분화는 특화되지 않은("미결된") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화-유도된 세포는 세포의 계통 내에서 보다 특화된 ("결정된(committed)") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 정상 환경 하에서 특정 세포 유형 또는 세포 유형의 하위세트로 계속 분화할 것이며 정상 환경 하에서 다른 세포 유형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포 유형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. 탈분화(De-differentiation)는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특화된(또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포의 계통은 세포의 유전, 즉 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포가 생성되게 할 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통-특이적 마커는 관심있는 계통의 세포의 표현형과 특이적으로 관련되며 미결정 세포가 관심있는 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.
"β-세포 계통"은 전사 인자 PDX-1 및 하기 전사 인자들 적어도 하나에 대해 양성 유전자 발현을 갖는 세포를 말한다: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 베타, MAFA, Pax4, 및 Pax6. β-세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: SOX-17, GATA-4, HNF-3 베타, GSC, Cer1, 노달(Nodal), FGF8, 브라키우리, Mix-유사 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소데르민(eomesodermin, EOMES), DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99, 또는 OTX2. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포, 원시선 세포, 중내배엽 세포 및 완성 내배엽 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: PDX-1, HNF-1베타, PTF-1 알파, HNF-6, 또는 HB9. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포, 원시 장관(primitive gut tube) 세포, 및 후방 전장(posterior foregut) 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는, 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: NGN-3, NeuroD, Islet-1, PDX-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3, 또는 PTF-1 알파. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 및 췌장 호르몬 분비 세포, 및 β-세포 계통의 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽"은 낭배형성동안 상배엽으로부터 생기는 세포의 특징을 보유하며 위장관 및 그 유도체를 형성하는 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커들을 발현한다: HNF-3 베타, GATA-4, SOX-17, 세르베루스, OTX2, 구스코이드, C-Kit, CD99, 및 Mixl1.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "배아외 내배엽"은 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포 집단을 말한다: SOX-7, AFP, 및 SPARC.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "마커"는 관심있는 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차등 발현은 양성 마커의 수준 증가 및 음성 마커의 수준 감소를 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 수준은 다른 세포에 비하여 관심있는 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 관심있는 세포는 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 식별되고 구별될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "중내배엽 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: CD48, 에오메소데르민(EOMES), SOX-17, DKK4, HNF-3 베타, GSC, FGF17, GATA-6.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 세포", 또는 ,"췌장 호르몬 발현 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내배엽 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 세포를 말한다: NGN-3, NeuroD, Islet-1, PDX-1, PAX-4, NKX2.2.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 호르몬 생산 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 생산할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 호르몬 분비 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 분비할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "후방 전장 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 분비할 수 있는 세포를 말한다: PDX-1, HNF-1, PTF-1A, HNF-6, HB-9, PROX-1.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "전(pre)-원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 노달, 또는 FGF8.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "원시 장관 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 분비할 수 있는 세포를 말한다: HNF-1, HNF-4A.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 브라키우리, Mix-유사 호메오박스 단백질, 또는 FGF4.
만능 줄기 세포의 단리, 확장 및 배양
만능 줄기 세포의 특성화
만능 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원(stage-specific embryonic antigen, SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다 (문헌[Thomson et al., Science 282:1145, 1998]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81 발현(존재하는 경우)의 손실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼라인 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사 (미국 캘리포니아주 벌링게임 소재의 벡터 래보러토리즈)가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드를 이용하여 발색시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화된 만능 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출할 때, Oct-4 및 TERT를 발현한다.
번식된 만능 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽층의 세포, 즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 조직으로 분화하는 잠재력이다. 만능 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 세포를 중증 복합형 면역결핍증(severe combined immunodeficient, SCID) 생쥐내로 주사하고, 형성되는 기형종을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하고, 이어서 삼배엽층으로부터의 세포 유형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 만능성은 배양체(embryoid bodies)의 형성 및 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배양체를 평가함으로써 결정할 수 있다.
번식된 만능 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다.
만능 줄기 세포의 공급원
사용될 수 있는 만능 줄기 세포의 유형은 전-배아(pre-embryonic) 조직(예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 임신 동안 그러나 전형적으로 약 10-12주 임신 전일 필요는 없는 임의의 시점에 취한 태아 조직을 비롯한, 임신 후 형성된 조직으로부터 유래된 만능 세포의 확립된 주를 포함한다. 비제한적인 예로는 인간 배아 줄기 세포 또는 인간 배아 배 세포의 확립된 주, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H1, H7, 및 H9 (WiCell)가 있다. 그러한 세포의 초기 확립 또는 안정화 동안 본 명세서의 조성물의 사용도 고려되며, 이 경우에는 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취한 일차 만능 세포일 것이다. 영양 세포의 부재 하에서 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 돌연변이 인간 배아 줄기 세포주, 예를 들어, BG01v (미국 조지아주 아텐스 소재의 브레사젠(BresaGen))가 또한 적합하다.
일 실시 형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 톰슨등 (미국 특허 제5,843,780호; 문헌[Science 282:1145, 1998]; 문헌[Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998]; 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995])에 개시된 바와 같이 제조된다.
만능 줄기 세포의 배양
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 전형적으로 다양한 방식으로 만능 줄기 세포를 지지하는 영양 세포층 상에서 배양된다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 본질적으로 영양 세포가 없지만, 그럼에도 불구하고 실질적인 분화를 거치지 않고 만능 줄기 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템에서 배양된다. 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지를 이용하여 지지된다. 대안적으로, 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 화학적 규명 배지를 이용하여 지지된다.
만능 줄기 세포는 적합한 배양 기재 상에 도말될 수 있다. 일 실시 형태에서, 적합한 배양 기재는 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어, 기저막에서 유래되거나 또는 부착 분자 수용체-리간드 커플링의 일부를 형성할 수 있는 것들이다. 일 실시 형태에서, 적합한 배양 기재는 매트리젤(등록상표)(벡톤 디켄슨(Becton Dickenson))이다. 매트리젤(등록상표)은 실온에서 젤화하여 재구성된 기저막을 형성하는 엔젤브레스-홈-스왐(Engelbreth-Holm-Swarm) 종양 세포 유래의 용해성 제제이다.
다른 세포외 매트릭스 성분 및 성분 혼합물이 대안으로서 적합하다. 증식되는 세포 유형에 따라, 이것은 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 헤파란 설페이트 등을 단독으로 또는 다양한 조합으로 포함할 수 있다.
만능 줄기 세포는 적합한 분포로 그리고 세포 생존, 번식, 및 바람직한 특징의 보유를 촉진하는 배지의 존재 하에서 기재상에 도말될 수 있다. 모든 이들 특징들은 접종 분포에 대해 신중한 주의를 기울이는 것으로부터 이익을 얻으며 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
적합한 배양 배지는 하기 성분들, 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)(DMEM), 깁코(Gibco) # 11965-092; 넉아웃(Knockout) 둘베코 변형 이글 배지 (KO DMEM), 깁코 # 10829-018; 햄(Ham's) F12/50% DMEM 기본 배지; 200 mM L-글루타민, 깁코 # 15039-027; 비-필수 아미노산 용액, 깁코 11140-050; β-메르캅토에탄올, 시그마(Sigma) # M7522; 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 깁코 # 13256-029로부터 제조될 수 있다.
만능 줄기 세포로부터 글루코스-자극된 인슐린 분비를 할 수 있는 세포의 형성
일 실시 형태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포로부터 글루코스-자극된 인슐린 분비를 할 수 있는 세포를 생성하는 방법을 제공한다:
a. 만능 줄기 세포를 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계, 및
d. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계.
일 실시 형태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포로부터 유래하는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에서 글루코스-자극된 인슐린 분비를 촉진하는 방법을 제공한다:
a. 만능 줄기 세포를 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계, 및
d. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계.
본 발명에 사용하기에 적합한 만능 줄기 세포는 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H9 (NIH 코드: WA09), 인간 배아 줄기 세포주 H1 (NIH 코드: WA01), 인간 배아 줄기 세포주 H7 (NIH 코드: WA07), 및 인간 배아 줄기 세포주 SA002 (스웨덴 소재의 셀라르티스(Cellartis))를 포함한다.. 만능 세포의 특징적인 하기 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 또한 본 발명에 사용하기에 적합하다: ABCG2, 크립토(cripto), CD9, FoxD3, 커넥신(Connexin)43, 커넥신45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, Tra1-81.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX-17, GATA4, Hnf-3베타, GSC, Cer1, 노달, FGF8, 브라키우리, Mix-유사 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소데르민(EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99, 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 대안적 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 대안적 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들은 Pdx1, HNF-1베타, PTF1a, HNF-6, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NGN-3, NeuroD, Islet-1, Pdx-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3, 및 PTF-1 알파로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내분비 세포는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 대안적으로, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 세포는 β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포이다. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 Pdx1 및 하기 전사 인자 중 적어도 하나를 발현한다: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 베타, MAFA, Pax4, 및 Pax6. 본 발명의 일 태양에서, β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포이다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
만능 줄기 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 제안된 임의의 방법에 의해 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[Shinozaki et al, Development 131, 1651 - 1662(2004)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[McLean et al, Stem Cells 25 , 29 - 38 (2007)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 혈청 부재 하에서 액티빈 A를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 액티빈 A와 혈청을 이용하여 세포를 배양하고, 이어서 상이한 농도의 액티빈 A와 혈청을 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 혈청 부재 하에서 액티빈 A를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 다른 농도의 혈청을 포함하는 액티빈 A를 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology, 2005]에 개시된다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 혈청 부재 하에서 액티빈 A와 Wnt 리간드를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 Wnt 리간드를 제거하고 혈청을 포함하는 액티빈 A를 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인크(LifeScan, Inc.)에 허여된, 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인크에 허여된, 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제61/076,889호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제61/076,900호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제61/076,908호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제61/076,915호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 검출
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성은 특정 프로토콜을 따르기 전과 후에 마커의 존재에 대해 시험함으로써 결정할 수 있다. 만능 줄기 세포는 전형적으로 그러한 마커를 발현하지 않는다. 따라서, 만능 세포의 분화는 세포가 그들을 발현하기 시작할 때 검출된다.
분화의 효율은 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제(예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄반응(RT-PCR), 노던 블롯, 원위치(in situ) 혼성화(예컨대, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역분석, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 상태의 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석(FACS) (예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
만능 줄기 세포의 특징은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 만능 줄기 세포의 추가 특징은 계속 확인되고 있다. 만능 줄기 세포 마커는 예를 들어, 하기 중 하나 이상의 발현을 포함한다: ABCG2, 크립토, FoxD3, 커넥신43, 커넥신45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, Tra1-81.
본 발명의 방법으로 만능 줄기 세포를 처리한 후, 분화된 세포는, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현된 CXCR4와 같은 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제(예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시켜 정제할 수 있다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 제안된 임의의 방법에 의해 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 섬유아세포 성장 인자 및 헤지호그 시그널링 경로 억제제 KAAD-사이클로파민으로 처리하고, 이어서 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 세포를 레틴산, 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.
본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 라이프스캔 인크에 허여된, 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 레틴산 및 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 소정 기간 동안 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 라이프스캔 인크에 허여된, 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 레틴산 및 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 소정 기간 동안 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 방법을 제공하며, 이 방법은
a. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하는 단계, 및
b. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 레틴산, FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10, 소닉 헤지호그 억제제, BMP를 억제할 수 있는 인자, 및 네트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 처리하는 단계를 포함한다.
일 실시 형태에서, 완성 내배엽의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 1일 내지 약 6일간 레틴산, FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10, 소닉 헤지호그 억제제, BMP를 억제할 수 있는 인자, 및 네트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 처리된다. 일 실시 형태에서, 완성 내배엽의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 6일간 레틴산, FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10, 소닉 헤지호그 억제제, BMP를 억제할 수 있는 인자, 및 네트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 처리된다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 임의의 세포는 이 방법을 사용하여 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키기에 적합하다.
대안적 실시 형태에서, 본 발명은 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 방법을 제공하며, 이 방법은
a. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하는 단계,
b. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 레틴산, 및 섬유아세포 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 처리하는 단계, 및
c. 레틴산, 및 섬유아세포 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 제거하고 후속적으로 세포를 소닉 헤지호그 억제제, 레틴산, 섬유아세포 성장 인자, BMP를 억제할 수 있는 인자, 및 네트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 처리하는 단계를 포함한다.
일 실시 형태에서, 완성 내배엽의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 1일 내지 약 3일간 레틴산, 및 섬유아세포 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 처리된다. 일 실시 형태에서, 완성 내배엽의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 3일간 레틴산, 및 섬유아세포 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 처리된다. 일 실시 형태에서, 완성 내배엽의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 1일 내지 약 4일간 소닉 헤지호그 억제제, 레틴산, 섬유아세포 성장 인자, BMP를 억제할 수 있는 인자, 및 네트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 처리된다. 일 실시 형태에서, 완성 내배엽의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 4일간 소닉 헤지호그 억제제, 레틴산, 섬유아세포 성장 인자, BMP를 억제할 수 있는 인자, 및 네트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 처리된다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 임의의 세포는 이 방법을 사용하여 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키기에 적합하다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 간 및 장 조직과 관련된 마커의 감소된 수준의 발현을 나타내었다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 알부민 및 CDX-2의 감소된 수준의 발현을 나타내었다.
적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자는 FGF-2, FGF-4, FGF-7 및 FGF-10으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시 형태에서, BMP는 BMP4이다. 일 실시 형태에서, BMP4를 억제할 수 있는 적어도 하나의 인자는 노긴이다.
네트린은 네트린 1, 네트린 2, 및 네트린 4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
레틴산은 약 1 nM 내지 약 1 mM의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 레틴산은 1 ㎛의 농도로 사용된다.
FGF-2는 약 50 pg/ml 내지 약 50 ㎍/ml의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, FGF-2는 50 ng/mL의 농도로 사용된다.
FGF-4는 약 50 pg/ml 내지 약 50 ㎍/mL의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, FGF-4는 50 ng/ml의 농도로 사용된다.
FGF-7은 약 50 pg/ml 내지 약 50 ㎍/ml의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, FGF-7은 50 ng/mL의 농도로 사용된다.
FGF-10은 약 50 pg/ml 내지 약 50 ㎍/ml의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, FGF-10은 50 ng/mL의 농도로 사용된다.
노긴은 약 500 ng/ml 내지 약 500 ㎍/ml의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 노긴은 100 ng/ml의 농도로 사용된다.
네트린 1은 약 500 ng/ml 내지 약 500 ㎍/ml의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 네트린 1은 100 ng/ml의 농도로 사용된다.
네트린 2는 약 500 ng/ml 내지 약 500 ㎍/ml의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 네트린 2는 100 ng/ml의 농도로 사용된다.
네트린 4는 약 500 ng/ml 내지 약 500 ㎍/ml의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 네트린 4는 100 ng/ml의 농도로 사용된다.
일 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 하기 인자 중 적어도 하나로 처리된다: 레틴산, FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10, 사이클로파민, 노긴, 네트린 1, 네트린 2, 또는 네트린 4.
일 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 레틴산, FGF-2, 사이클로파민, 및 노긴으로 처리된다. 다른 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 레틴산, FGF-4, 사이클로파민, 및 노긴으로 처리된다. 다른 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 레틴산, FGF-7, 사이클로파민, 및 노긴으로 처리된다. 다른 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 레틴산, FGF-10, 사이클로파민, 및 노긴으로 처리된다.
일 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 레틴산, FGF-2, 사이클로파민, 및 네트린으로 처리된다. 다른 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 레틴산, FGF-4, 사이클로파민, 및 네트린으로 처리된다. 다른 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 레틴산, FGF-7, 사이클로파민, 및 네트린으로 처리된다. 다른 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 레틴산, FGF-10, 사이클로파민, 및 네트린으로 처리된다.
네트린은 네트린 1, 네트린 2, 및 네트린 4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 레틴산, FGF-2, 사이클로파민, 노긴 및 네트린으로 처리된다. 다른 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 레틴산, FGF-4, 사이클로파민, 노긴 및 네트린으로 처리된다. 다른 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 레틴산, FGF-7, 사이클로파민, 노긴 및 네트린으로 처리된다. 다른 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 레틴산, FGF-10, 사이클로파민, 노긴 및 네트린으로 처리된다.
네트린은 네트린 1, 네트린 2, 및 네트린 4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성을 향상시킬 수 있는 적어도 하나의 다른 추가 인자로 처리될 수 있다. 대안적으로, 적어도 하나의 다른 추가 인자는 본 발명의 방법에 의해 형성된 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 증식을 향상시킬 수 있다. 추가로, 적어도 하나의 다른 추가 인자는 본 발명의 방법에 의해 형성된 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포가 다른 세포 유형을 형성하는 능력을 향상시키거나, 또는 임의의 다른 추가의 분화 단계의 효율을 개선할 수 있다.
적어도 하나의 추가 인자는, 예를 들어, 니코틴아미드, TGF-β1, 2, 및 3을 포함하는 TGF-β 패밀리의 구성원, 혈청 알부민, 섬유아세포 성장 인자 패밀리의 구성원, 혈소판-유래 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부 혈장, 인슐린 성장 인자(IGF-I, II), 성장 분화 인자(GDF-5, -6, -8, -10, 11), 글루카곤 유사 펩티드-I 및 II(GLP-I 및 II), GLP-1 및 GLP-2 미메토바디(mimetobdy), 엑센딘(Exendin)-4, 레틴산, 부갑상선 호르몬, 인슐린, 프로게스테론, 아프로티닌, 하이드로코르티손, 에탄올아민, 베타 메르캅토에탄올, 표피 성장 인자(EGF), 가스트린 I 및 II, 예를 들어, 트라이에틸렌 펜타민과 같은 구리 킬레이트제, 포르스콜린, Na-부티레이트, 액티빈, 베타셀룰린, ITS, 노긴, 신경돌기 성장 인자, 노달, 발포릭산, 트리코스타틴 A, 부티르산나트륨, 간세포 성장 인자(HGF), 스핑고신-1, VEGF, MG132 (EMD, 미국 캘리포니아주 ), N2 및 B27 보충제(깁코, 미국 캘리포니아주), 예를 들어, 사이클로파민(EMD, 미국 캘리포니아주)과 같은 스테로이드 알칼로이드, 각질세포 성장 인자(KGF), 딕코프(Dickkopf) 단백질 패밀리, 소 뇌하수체 추출물, 소도 신생-연관 단백질(islet neogenesis-associated protein, INGAP), 인디안 헤지호그, 소닉 헤지호그, 프로테아솜 억제제, 노치 경로 억제제, 소닉 헤지호그 억제제, 또는 이들의 조합일 수 있다.
적어도 하나의 다른 추가 인자는 췌장 세포주, 예를 들어, PANC-1 (ATCC 번호: CRL-1469), CAPAN-1 (ATCC 번호: HTB-79), BxPC-3 (ATCC 번호: CRL-1687), HPAF-II (ATCC 번호: CRL-1997), 간 세포주, 예를 들어, HepG2 (ATCC 번호: HTB-8065), 및 장 세포주, 예를 들어, FHs 74 (ATCC 번호: CCL-241)로부터 얻은 조절된 배지에 의해 공급될 수 있다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 검출
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 추가의 마커는 계속 확인되고 있다. 이들 마커는 본 발명에 따라 처리된 세포가 분화하여 췌장 내배엽 계통의 특징적인 특성을 획득한 것을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 췌장 내배엽 계통 특이적 마커는 예를 들어, Hlxb9, PTF-1a, PDX-1, HNF-6, HNF-1베타와 같은 하나 이상의 전사 인자의 발현을 포함한다.
분화의 효율은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제(예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄반응(RT-PCR), 노던 블롯, 원위치 혼성화(예컨대, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역분석, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 상태의 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석(FACS) (예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 개시된 임의의 방법에 의해 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 DAPT 및 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하고, 이어서 DAPT와 엑센딘 4를 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 엑센딘 1, IGF-1 및 HGF를 함유하는 배지에서 상기 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하고, 이어서 엑센딘 4를 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 엑센딘 1, IGF-1 및 HGF를 함유하는 배지에서 상기 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 DAPT 및 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔 인크에 허여된 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔 인크에 허여된 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔 인크에 허여된 미국 특허 출원 제60/953,178호에 개시된 방법에 따라 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 TGF-βR-1 경로를 억제하는 인자로 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. TGF-βR-1 경로를 억제하는 인자는 TGF-β 세포외 수용체-1의 길항제일 수 있다. 대안적으로, 상기 인자는 TGF-βR-1 수용체의 생물학적 활성을 억제할 수 있다. 대안적으로, 상기 인자는 세포 내에서 TGF-βR-1 신호 전달 경로에서 요소를 억제할 수 있거나 요소의 길항제일 수 있다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 1일 내지 약 12일간 TGF-βR-1 경로를 억제하는 인자로 처리된다. 대안적으로, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 5일 내지 약 12일간 TGF-βR-1 경로를 억제하는 인자로 처리된다. 대안적으로, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 12일간 TGF-βR-1 경로를 억제하는 인자로 처리된다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 임의의 세포는 이 방법을 사용하여 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키기에 적합하다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 방법을 제공하며, 이 방법은
a. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하는 단계, 및
b. 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자, 및 TGF-βR-1 시그널링 경로를 억제하는 인자로 세포를 처리하는 단계를 포함한다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 1일 내지 약 12일간 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자 및 TGF-βR-1 경로를 억제하는 인자로 처리된다. 대안적으로, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 5일 내지 약 12일간 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자 및 TGF-βR-1 경로를 억제하는 인자로 처리된다. 대안적으로, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 12일간 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자 및 TGF-βR-1 경로를 억제하는 인자로 처리된다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 임의의 세포는 이 방법을 사용하여 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키기에 적합하다.
일 실시 형태에서, 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자는 γ-시크리타아제 억제제이다. 일 실시 형태에서, γ-시크리타아제 억제제는 1S-벤질-4R-[1-(1S-카르바모일-2-펜에틸카르바모일)-1S-3-메틸부틸카르바모일]-2R-하이드로지-5-페닐펜틸] 카르밤산 tert-부틸 에스테르이며, 이는 L-685,458로도 알려져 있다.
L-685,458은 약 0.1 ㎛ 내지 약 100 ㎛의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 90 ㎛의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 80 ㎛의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 70 ㎛의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 60 ㎛의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 50 ㎛의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 40 ㎛의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 30 ㎛의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 20 ㎛의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, L-685,458은 약 10 ㎛의 농도로 사용된다.
일 실시 형태에서, TGF-βR-1 시그널링 경로를 억제하는 인자는 TGF-βR-1 키나아제의 억제제이다. 일 실시 형태에서, TGF-βR-1 키나아제 억제제는 (2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘)이다. 다른 실시 형태에서, TGF-βR-1 키나아제 억제제는 [3-(피리딘-2-일)-4-(4-퀴노닐)]-1H-피라졸이다.
TGF-βR-1 키나아제 억제제는 약 0.1 ㎛ 내지 약 100 ㎛의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, TGF-βR-1 키나아제 억제제는 약 90 ㎛의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, TGF-βR-1 키나아제 억제제는 약 80 ㎛의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, TGF-βR-1 키나아제 억제제는 약 70 ㎛의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, TGF-βR-1 키나아제 억제제는 약 60 ㎛의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, TGF-βR-1 키나아제 억제제는 약 50 ㎛의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, TGF-βR-1 키나아제 억제제는 약 40 ㎛의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, TGF-βR-1 키나아제 억제제는 약 30 ㎛의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, TGF-βR-1 키나아제 억제제는 약 20 ㎛의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, TGF-βR-1 키나아제 억제제는 약 10 ㎛의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, TGF-βR-1 키나아제 억제제는 약 1 ㎛의 농도로 사용된다. 일 실시 형태에서, TGF-βR-1 키나아제 억제제는 약 0.1 ㎛의 농도로 사용된다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성을 향상시킬 수 있는 적어도 하나의 다른 추가 인자로 처리될 수 있다. 대안적으로, 적어도 하나의 다른 추가 인자는 본 발명의 방법에 의해 형성된 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 증식을 향상시킬 수 있다. 추가로, 적어도 하나의 다른 추가 인자는 본 발명의 방법에 의해 형성된 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포가 다른 세포 유형을 형성하는 능력을 향상시키거나, 또는 임의의 다른 추가의 분화 단계의 효율을 개선할 수 있다.
적어도 하나의 추가 인자는, 예를 들어, 니코틴아미드, TGF-β1, 2, 및 3을 포함하는 TGF-β 패밀리의 구성원, 혈청 알부민, 섬유아세포 성장 인자 패밀리의 구성원, 혈소판-유래 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부 혈장, 인슐린 성장 인자(IGF-I, II), 성장 분화 인자(GDF-5, -6, -8, -10, 11), 글루카곤 유사 펩티드-I 및 II(GLP-I 및 II), GLP-1 및 GLP-2 미메토바디, 엑센딘-4, 레틴산, 부갑상선 호르몬, 인슐린, 프로게스테론, 아프로티닌, 하이드로코르티손, 에탄올아민, 베타 메르캅토에탄올, 표피 성장 인자(EGF), 가스트린 I 및 II, 예를 들어, 트라이에틸렌 펜타민과 같은 구리 킬레이트제, 포르스콜린, Na-부티레이트, 액티빈, 베타셀룰린, ITS, 노긴, 신경돌기 성장 인자, 노달, 발포릭산, 트리코스타틴 A, 부티르산나트륨, 간세포 성장 인자(HGF), 스핑고신-1, VEGF, MG132 (EMD, 미국 캘리포니아주), N2 및 B27 보충제(깁코, 미국 캘리포니아주), 예를 들어, 사이클로파민(EMD, 미국 캘리포니아주)과 같은 스테로이드 알칼로이드, 각질세포 성장 인자(KGF), 딕코프 단백질 패밀리, 소 뇌하수체 추출물, 소도 신생-연관 단백질(INGAP), 인디안 헤지호그, 소닉 헤지호그, 프로테아솜 억제제, 노치 경로 억제제, 소닉 헤지호그 억제제, 또는 이들의 조합일 수 있다.
적어도 하나의 다른 추가 인자는 췌장 세포주, 예를 들어, PANC-1 (ATCC 번호: CRL-1469), CAPAN-1 (ATCC 번호: HTB-79), BxPC-3 (ATCC 번호: CRL-1687), HPAF-II (ATCC 번호: CRL-1997), 간 세포주, 예를 들어, HepG2 (ATCC 번호: HTB-8065), 및 장 세포주, 예를 들어, FHs 74 (ATCC 번호: CCL-241)로부터 얻은 조절된 배지에 의해 공급될 수 있다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 검출
췌장 내분비 계통의 세포의 특징적인 마커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 췌장 내분비 계통의 특징적인 추가의 마커는 계속 확인되고 있다. 이들 마커는 본 발명에 따라 처리된 세포가 분화하여 췌장 내분비 계통의 특징적인 특성을 획득한 것을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 췌장 내분비 계통 특이적 마커는 예를 들어, NGN-3, NeuroD, Islet-1과 같은 하나 이상의 전사 인자의 발현을 포함한다.
β 세포 계통의 세포의 특징적인 마커는 당업계에 잘 알려져 있으며, β 세포 계통의 특징적인 추가 마커는 계속 확인되고 있다. 이들 마커는 본 발명에 따라 처리된 세포가 β-세포 계통의 특징적인 특성을 획득하도록 분화되었음을 확인하는 데 사용될 수 있다. β 세포 계통의 특징적인 특성은, 그중에서도 특히, 예를 들어, Pdx1(췌장 및 십이지장 호메오박스 유전자-1), Nkx2.2, Nkx6.1, Isl1, Pax6, Pax4, NeuroD, Hnf1b, Hnf-6, Hnf-3베타, 및 MafA와 같은 하나 이상의 전사 인자의 발현을 포함한다. 이들 전사 인자는 내분비 세포의 확인을 위해 당업계에서 잘 확립되어 있다. 예를 들어, 문헌[Edlund (Nature Reviews Genetics 3: 524-632 (2002))]을 참고한다.
분화의 효율은 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제(예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다. 대안적으로, 분화의 효율은 β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제(예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄반응(RT-PCR), 노던 블롯, 원위치 혼성화(예컨대, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역분석, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 상태의 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석(FACS) (예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
본 발명의 일 태양에서, 분화 효율은 처리 이후의 주어진 세포 배양물 중 인슐린 양성 세포의 백분율을 측정함으로써 결정된다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 100% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 90% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 80% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 70% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 60% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 50% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 40% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 30% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 20% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 10% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 5% 인슐린 양성 세포를 생성한다.
본 발명의 일 태양에서, 분화 효율은 세포에 의해 분비된 C-펩티드의 양을 측정함으로써 검출되는 바와 같이, 글루코스-자극된 인슐린 분비를 측정함으로써 결정된다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 1000 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 900 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 800 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 700 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 600 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 500 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 400 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 500 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 400 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 300 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 200 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 100 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 90 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 80 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 70 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 60 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 50 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 40 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 30 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 20 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 10 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다.
치료법
일 태양에서, 본 발명은 제I형 당뇨병을 앓고 있거나 상기 당뇨병이 발병될 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 만능 줄기 세포를 배양하는 단계, 만능 줄기 세포를 시험관 내에서 β-세포 계통으로 분화시키는 단계, 및 β-세포 계통의 세포를 환자 내로 이식하는 단계를 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 제2형 당뇨병을 앓고 있거나, 상기 당뇨병이 발병될 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 만능 줄기 세포를 배양하는 단계, 배양된 세포를 시험관 내에서 β-세포 계통으로 분화시키는 단계, 및 β-세포 계통의 세포를 환자 내로 이식하는 단계를 포함한다.
적절하다면, 환자는 이식된 세포의 생존과 기능을 촉진하는 약학 제제 또는 생물활성제로 추가로 처리될 수 있다. 이들 제제는 예를 들어 다른 것들 중에서도 인슐린, TGF-β1, 2, 및 3을 비롯한 TGF-β 패밀리의 구성원, 골 형성 단백질(BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -11, -12, 및 -13), 섬유아세포 성장 인자-1 및 -2, 혈소판-유래 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부 혈장, 인슐린 성장 인자(IGF-I, II), 성장 분화 인자(GDF-5, -6, -7, -8, -10, -15), 혈관 내피 세포-유래 성장 인자(VEGF), 플레이오트로핀, 엔도텔린을 포함할 수 있다. 다른 약학적 화합물은 예를 들어, 니코틴아미드, 글루카곤 유사 펩티드-I (GLP-1) 및 II, GLP-1 및 2 미메티바디, 엑센딘-4, 레틴산, 부갑상선 호르몬, MAPK 억제제, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0209901호 및 제2004/0132729호에 개시된 화합물을 포함할 수 있다.
만능 줄기 세포는 수령체 내로 이식하기 전에 인슐린-생성 세포로 분화될 수 있다. 구체적 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 수령체 내로 이식하기 전에 β-세포로 완전히 분화된다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미분화 또는 부분 분화 상태로 수령체 내로 이식될 수 있다. 추가 분화는 수령체 내에서 일어날 수 있다.
완성 내배엽 세포 또는 대안적으로, 췌장 내배엽 세포, 또는 대안적으로, β 세포는 분산된 세포로서 이식되거나, 또는 간문맥내로 주입될 수 있는 클러스터로 형성될 수 있다. 대안적으로, 세포는 생체적합성 분해성 중합체성 지지체, 다공성 비분해성 장치로 제공되거나 또는 캡슐화되어 숙주 면역 반응으로부터 보호될 수 있다. 세포는 수령체에서 적절한 부위 내로 이식될 수 있다. 이식 부위는 예를 들어, 간, 천연 췌장, 신장 피막하 공간, 장막, 복막, 장막하 공간, 장, 위, 또는 피하 주머니를 포함한다.
추가 분화, 이식된 세포의 생존 또는 활성을 향상시키기 위하여, 성장 인자, 산화방지제 또는 항염증제와 같은 추가 인자를 세포의 투여 전에, 세포의 투여와 동시에, 또는 세포의 투여 후에 투여할 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 성장 인자는 생체 내에서 투여된 세포를 분화시키기 위해 사용된다. 이들 인자는 내인성 세포에 의해 분비되어 원위치에서 투여된 세포에 노출될 수 있다. 이식된 세포는 내부 및 외부 투여된 당업계에 알려진 성장 인자의 임의의 조합에 의해 분화되도록 유도될 수 있다.
이식에 사용되는 세포의 양은 환자의 상태 및 치료법에 대한 반응을 비롯한 다양한 많은 인자에 의존하며, 당업자에 의해 결정될 수 있다.
일 태양에서 본 발명은 당뇨병을 앓고 있거나 상기 당뇨병이 발병될 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 만능 줄기 세포를 배양하는 단계, 시험관 내에서 배양된 세포를 β-세포 계통으로 분화시키는 단계, 및 세포를 3차원 지지체 내로 혼입하는 단계를 포함한다. 세포는 환자 내로 이식되기 전에 이 지지체 상에서 시험관 내에서 유지될 수 있다. 대안적으로, 세포를 함유한 지지체는 추가의 시험관 내 배양 없이 환자에서 직접 이식될 수 있다. 지지체에는 이식된 세포의 생존과 기능을 촉진하는 적어도 하나의 약학 제제가 선택적으로 혼입될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해 사용하기에 적합한 지지체 물질은 조직 복구에 유용한 조직 주형, 도관, 장벽, 및 저장부를 포함한다. 구체적으로, 생물학적 조직을 재구성하거나 재생시키기 위해서뿐만 아니라 조직 성장을 유도하기 위한 주화성 제제를 전달하기 위해 시험관 내 및 생체 내에서 사용된 폼, 스펀지, 젤, 하이드로젤, 직물, 및 부직 구조체 형태의 합성 및 천연 물질이 본 발명의 방법의 실시에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 미국 특허 제5,770,417호, 미국 특허 제6,022,743호, 미국 특허 제5,567,612호, 미국 특허 제5,759,830호, 미국 특허 제6,626,950호, 미국 특허 제6,534,084호, 미국 특허 제6,306,424호, 미국 특허 제6,365,149호, 미국 특허 제6,599,323호, 미국 특허 제6,656,488호, 미국 특허 출원 공개 제2004/0062753 A1호, 미국 특허 제4,557,264호 및 미국 특허 제6,333,029호에 개시된 물질을 참고한다.
약학 제제가 혼입된 지지체를 형성하기 위하여, 약학 제제는 지지체를 형성하기 전에 중합체 용액과 혼합될 수 있다. 대안적으로, 약학 제제는 바람직하게는 약학적 담체의 존재 하에서, 제작된 지지체 상에 코팅될 수 있다. 약학 제제는 액체, 미분 고체, 또는 임의의 다른 적절한 물리적 형태로 존재할 수 있다. 대안적으로, 부형제는 약학 제제의 방출 속도를 변경하기 위하여 지지체에 첨가될 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 지지체에는 예를 들어, 미국 특허 제6,509,369호에 개시된 화합물과 같은 항염증 화합물인 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입된다.
지지체에는 예를 들어, 미국 특허 제6,793,945호에 개시된 화합물과 같은 항-아폽토시스(anti-apoptotic) 화합물인 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입될 수 있다.
지지체에는 예를 들어, 미국 특허 제6,331,298호에 개시된 화합물과 같은 섬유증 억제제인 적어도 하나의 약학적 화합물이 또한 혼입될 수 있다.
지지체에는 또한 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0220393호 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0209901호에 개시된 화합물과 같은 혈관신생을 향상시킬 수 있는 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입될 수 있다.
지지체에는 또한 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0171623호에 개시된 화합물과 같은 면역억제 화합물인 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입될 수 있다.
지지체에는 또한 성장 인자, 예를 들어, 다른 것들 중에서도 TGF-β1, 2, 및 3을 비롯한 TGF-β 패밀리의 구성원, 골 형성 단백질(BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -11, -12, 및 -13), 섬유아세포 성장 인자-1 및 -2, 혈소판-유래 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부 혈장, 인슐린 성장 인자(IGF-I, II) 성장 분화 인자(GDF-5, -6, -8, -10, -15), 혈관 내피 세포-유래 성장 인자(VEGF), 플레이오트로핀, 엔도텔린인 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입될 수 있다. 다른 약학적 화합물은 예를 들어, 니코틴아미드, 저산소증 유도성 인자 1-알파, 글루카곤 유사 펩티드-I(GLP-1), GLP-1 및 GLP-2 미메티바디, 및 II, 엑센딘-4, 노달, 노긴, NGF, 레틴산, 부갑상선 호르몬, 테나신-C, 트로포엘라스틴, 트롬빈-유래 펩티드, 카텔리시딘, 데펜신, 라미닌, 피브로넥틴 및 비트로넥틴과 같은 부착성 세포외 매트릭스 단백질의 세포- 및 헤파린-결합 도메인을 함유한 생물학적 펩티드, MAPK 억제제, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0209901호 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0132729호에 개시된 화합물을 포함할 수 있다.
스캐폴드(scaffold) 내로 본 발명의 세포를 혼입시키는 것은 스캐폴드 상에 세포를 간단히 침적시키는 것에 의해 성취될 수 있다. 세포는 간단한 확산에 의해 스캐폴드 내로 들어갈 수 있다 (문헌[J. Pediatr. Surg. 23 (1 Pt 2): 3-9 (1988)]. 세포 접종의 효율을 향상시키기 위하여 몇몇 다른 접근법이 개발되었다. 예를 들어, 스피너 플라스크(spinner flasks)가 폴리글리콜산 스캐폴드 상에 연골세포를 접종하는 데 사용되었다 (문헌[Biotechnol. Prog. 14(2): 193-202 (1998)]. 세포를 접종하기 위한 다른 접근법은 원심분리를 사용하는 것이며, 이것은 접종된 세포에 대해 최소의 스트레스를 생성하며 접종 효율을 향상시킨다. 예를 들어, 양(Yang) 등은 원심분리 세포 고정화(Centrifugational Cell Immobilization, CCI)로 불리는 세포 접종 방법을 개발하였다 (문헌[J.Biomed. Mater. Res. 55(3): 379-86 (2001)]).
본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 예시하지만 하기 실시예에 의해 한정되지는 않는다.
실시예
실시예 1
인간 배아 줄기 세포 배양
인간 배아 줄기 세포주 H1, H7 및 H9를 위셀 리서치 인스티튜트, 인크.(WiCell Research Institute, Inc.)(미국 위스콘신주 매디슨)로부터 입수하였으며 공급처인 상기 인스티튜트에 의해 제공된 설명서에 따라 배양하였다. 요약하면, 세포를 20% 넉아웃(knockout) 혈청 대체물로 보충된 DMEM/F12 (인비트로겐(Invitrogen)/깁코), 100 nM MEM 비필수 아미노산, 0.5 mM 베타 메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민 - 4 ng/ml 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 포함함 - (모두 인비트로겐/깁코로부터 입수)으로 이루어진 ES 세포 배지에서 생쥐 배아 섬유아세포(MEF) 영양 세포 상에서 배양하였다. E13 내지 13.5 생쥐 배아로부터 유래된 MEF 세포를 찰스 리버로부터 구매하였다. MEF 세포를 10% FBS (하이클론), 2 mM 글루타민, 및 100 mM MEM 비필수 아미노산으로 보충된 DMEM 배지에서 확장시켰다. 서브-융합성 MEF 세포 배양물을 3시간 동안 10 ㎍/ml 마이토마이신 C (미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마)로 처리하여 세포 분열을 중지시키고, 이어서 트립신처리하고 0.1% 소과 젤라틴-코팅된 디쉬에 2x104/cm2로 도말하였다. 2 내지 4 계대로부터의 MEF 세포를 영양 세포층으로 사용하였다. MEF 세포 영양 세포층 상에 도말된 인간 배아 줄기 세포를 가습된 조직 배양 인큐베이터 내에서 5% CO2의 분위기에서 37℃에서 배양하였다. 융합성일 때(도말 후 약 5-7일), 인간 배아 줄기 세포를 5-10분 동안 1 mg/mL의 제IV형 콜라게나아제 (인비트로겐/깁코)로 처리하고 이어서 5 ml 피펫을 이용하여 표면으로부터 부드럽게 긁어내었다. 세포를 5분 동안 900 rpm에서 회전시키고, 펠렛을 재현탁시키고 신선한 배양 배지에서 1:3 내지 1:4 비의 세포로 재도말하였다.
실시예 2
매트리젤 ( MATRIGEL )™로 코팅된 조직 배양 기재 상에 배양된 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화.
45 계대에서, 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬 상에서 배양하고(1:30 희석) 0.5% FBS, 및 100 ng/ml 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈(R&D Systems))에 20 ng/ml WNT-3a (카탈로그 번호 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)를 더한 것으로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% FBS 및 100 ng/mL 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 3일 동안 처리하였다. 다음, 배양물을 DMEM/F12 + 2% FBS + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD(#239804, 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)로 3일간 처리하고 이어서 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD + 2 ㎛ 레틴산(RA)(시그마, 미국 미주리주)에서 4일간 인큐베이션하였다.
다음, 세포를 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml 엑센딘-4(시그마, 미국 미주리주) + 1 ㎛ DAPT(칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)에서 6일간 배양하고 이어서 추가 3일간 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml 엑센딘-4(시그마, 미국 미주리주) + 50 ng/ml IGF(페프로테크(Peprotech), 미국 뉴저지주) + 50 ng/ml HGF(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에서 인큐베이션하였다. 과정의 개요를 도 1a에 나타내었다. RNA 샘플을 분화의 다양한 시기들에서 배양물로부터 수집하였다. 도 2는 3기 내지 5기에서 수확된 세포로부터 수득된 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. NeuroD 발현의 증가와 함께, 4기 및 5기의 세포에서 관찰된 인슐린 및 글루카론과 같은 내분비 마커의 발현이 유의하게 증가하였다.
실시예 3
도 1a에 약술된 분화 프로토콜에 따라 처리된 만능 줄기 세포 내 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커의 발현에 대한 다양한 화합물의 효과.
51 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬 상에서 배양하고(1:30 희석) 0.5% FBS, 및 100 ng/ml 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)에 20 ng/ml WNT-3a (카탈로그 번호 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)를 더한 것으로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% FBS 및 100 ng/mL 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 2일 동안 처리하였다. 다음, 배양물을 DMEM/F12 + 2% FBS + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD(#239804, 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)로 3일간 처리하고 이어서 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD + 2 ㎛ 레틴산(RA)(시그마, 미국 미주리주)에서 4일간 인큐베이션하였다.
다음, 세포를 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml 엑센딘-4(시그마, 미국 미주리주) + 1 ㎛ DAPT(칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)에서 6일간 배양하고 이어서 추가 3일간 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml 엑센딘-4(시그마, 미국 미주리주) + 50 ng/ml IGF(페프로테크, 미국 뉴저지주) + 50 ng/ml HGF(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에서 인큐베이션하였다. 배양물의 일부를 3기, 4기, 또는 3 + 4기 중 어느 하나에서 하기 화합물 1 ㎛으로 처리하였다: MEK/MAPK 억제제(2′-아미노-3′-메톡시플라본)(PD98059, 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주), RAF 키나아제 억제제(5-요오도-3-[(3,5-다이브로모-4-하이드록시페닐)메틸렌]-2-인돌리돈)(#553008, 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주), SMAD3 억제제(6,7-다이메틸-2-((2E)-3-(1-메틸-2-페닐-1H피롤로[2,3-b]피리딘-3-일-프로프-2-에노일))-1,2,3,4-테트라하이드로아이소퀴놀린)(#566405, 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주), AKT 억제제(1L6-하이드록시메틸-카이로이노시톨-2-(R)-2-O-메틸-3-O-옥타데실-sn-글리세로카르보네이트)(#124005, 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주), MEK 억제제(#444937 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주), 및 TGF-B 수용체 I 억제제(2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘)(액티빈 수용체-유사 키나아제 5를 억제함, #616452, 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주).
도 3a 내지 도 3e는 지시된 조건으로 처리된, 3기 내지 5기의 마지막에 수확된 세포로부터 수득된 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. 4기 세포에 또는 3기 및 4기 세포에 TGF-B 수용체 I 키나아제 억제제(2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘)를 첨가하면 인슐린, 글루카곤, NeuroD, 및 NKX2.2의 발현은 유의하게 증가시킨 반면 5기의 마지막에서 PDX-1의 발현에는 미미한 영향을 미침을 주목하라. 단지 3기 세포에서의 TGF-B 수용체 I 키나아제 억제제(2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘)의 첨가가 5기 마지막의 세포 내 내분비 마커의 발현을 미미하게 상향 조절하였다.
실시예 4
도 1a에 약술된 분화 프로토콜에 따라 처리된 만능 줄기 세포 내 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커의 발현에 대한 TGF -β 수용체 I 키나아제 억제제의 첨가 효과.
44 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬 상에서 배양하고(1:30 희석) 0.5% FBS, 및 100 ng/ml 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)에 20 ng/ml WNT-3a (카탈로그 번호 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)를 더한 것으로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% FBS 및 100 ng/mL 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 2일 동안 처리하였다. 다음, 배양물을 DMEM/F12 + 2% FBS + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD(#239804, 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)로 3일간 처리하고 이어서 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD + 2 ㎛ 레틴산(RA)(시그마, 미국 미주리주)에서 4일간 인큐베이션하였다.
다음, 세포를 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml 엑센딘-4(시그마, 미국 미주리주) + 1 ㎛ DAPT(칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)에서 6일간 배양하고 이어서 추가 3일간 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml 엑센딘-4(시그마, 미국 미주리주) + 50 ng/ml IGF(페프로테크, 미국 뉴저지주) + 50 ng/ml HGF(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에서 인큐베이션하였다. 배양물의 일부를 4기, 5기, 또는 4기 및 5기에서 1 ㎛의 TGF-B 수용체 I 키나아제 억제제(2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘)(액티빈 수용체-유사 키나아제 5의 억제제, #616452, 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)로 처리하였다.
도 4a 내지 도 4e는 4기 내지 5기에 +/- 키나아제 억제제로 처리된, 3기 내지 5기의 마지막에 수확된 세포로부터의 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. 4기 세포에 또는 4기 및 5기 세포에 TGF-B 수용체 I 키나아제 억제제(2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘)를 첨가하면 인슐린, 글루카곤, NeuroD, 및 NKX2.2의 발현은 유의하게 증가시킨 반면 5기의 마지막에서 PDX-1의 발현에는 미미한 영향을 미침을 주목하라. 단지 5기에서 TGF-B 수용체 I 키나아제 억제제(2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘)의 첨가가 5기의 마지막에서 내분비 마커의 발현을 미미하게 상향 조절하였다.
실시예 5
도 1a에 약술된 분화 프로토콜에 따라 처리된 만능 줄기 세포 내 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커의 발현에 대한 다양한 TGF -β 수용체 I 키나아제 억제제의 효과.
41 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬 상에서 배양하고(1:30 희석) 0.5% FBS, 및 100 ng/ml 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)에 20 ng/ml WNT-3a (카탈로그 번호 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)를 더한 것으로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% FBS 및 100 ng/mL 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 2일 동안 처리하였다. 다음, 배양물을 DMEM/F12 + 2% FBS + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD(#239804, 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)로 3일간 처리하고 이어서 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD + 2 ㎛ 레틴산(RA)(시그마, 미국 미주리주)에서 4일간 인큐베이션하였다.
다음, 세포를 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml 엑센딘-4(시그마, 미국 미주리주) + 1 ㎛ DAPT(칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)에서 6일간 배양하고 이어서 추가 3일간 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml 엑센딘-4(시그마, 미국 미주리주) + 50 ng/ml IGF(페프로테크, 미국 뉴저지주) + 50 ng/ml HGF(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에서 인큐베이션하였다. 배양물의 일부를 4기 및 5기에서 1-10 ㎛의 TGF-B 수용체 I 키나아제 억제제(ALK5 억제제 II) (2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘)(액티빈 수용체-유사 키나아제 5의 억제제, #616452, 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주) 또는 TGF-B 수용체 I 억제제 I(ALK5 억제제 I)([3-(피리딘-2-일)-4-(4-퀴노닐)]- 1H-피라졸)(#616451, 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)로 처리하였다.
도 5a 내지 도 5e는 +/- ALK5 억제제 I 또는 II로 처리된, 4기 내지 5기의 마지막에 수확된 세포로부터의 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. 4기 및 5기에서 1-10 ㎛의 ALK5 억제제 I 또는 II를 첨가하면 대조군(표준 처리)과 비교하여 4기 내지 5기의 마지막에 인슐린, 글루카곤, PDX-1 및 NeuroD의 발현을 유의하게 증가시킴을 주목하라. 모든 샘플은 삼중 샘플이었다.
실시예 6
도 1a에 약술된 분화 프로토콜에 따라 처리된 만능 줄기 세포 내 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커의 발현에 대한 노긴 및 ALK5 억제제의 효과.
41 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬 상에서 배양하고(1:30 희석) 0.5% FBS, 및 100 ng/ml 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)에 20 ng/ml WNT-3a (카탈로그 번호 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)를 더한 것으로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% FBS 및 100 ng/mL 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 2일 동안 처리하였다. 다음, 배양물을 DMEM/F12 + 2% FBS + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD(#239804, 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)로 3일간 처리하고 이어서 4일간 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD + 2 ㎛ 레틴산(RA)(시그마, 미국 미주리주) + 0-500 ng/ml의 노긴 (알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에서 인큐베이션하였다.
다음, 세포를 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml 엑센딘-4(시그마, 미국 미주리주) + 1 ㎛ DAPT(칼바이오캠, 미국 캘리포니아주) + 1 ㎛ ALK5 억제제 II(칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)에서 6일간 배양하고 이어서 추가 3일간 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml 엑센딘-4(시그마, 미국 미주리주) + 50 ng/ml IGF(페프로테크, 미국 뉴저지주) + 50 ng/ml HGF(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주) + 1 ㎛ ALK5 억제제 II 에서 인큐베이션하였다.
도 6a 내지 도 6g는 +/- 0-100 ng/ml 노긴으로 처리된, 3기 내지 5기의 마지막에 수확된 세포로부터의 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. 3기에서 100 ng/ml의 노긴의 첨가는 4기의 마지막에서 인슐린 및 글루카곤의 발현을 미미하게 증가시킨 반면, 비처리 샘플과 비교하여 알부민 및 CDX2의 발현을 유의하게 억제하였다. 500 ng/ml의 노긴의 첨가는 PDX-1의 발현에 영향을 미치지는 않았지만 알부민 및 CDX2와 함께, 내분비 마커의 발현을 유의하게 감소시켰다. 알부민은 간 전구 세포의 마커인 반면, CDX2는 장 세포의 마커이다.
실시예 7
도 1에 약술된 분화 프로토콜에 따라 처리된 만능 줄기 세포 내 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커의 발현에 대한 3기에서의 노긴의 첨가 및 4기 및 5기에서의 ALK5 억제제의 첨가 효과.
44 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬 상에서 배양하고(1:30 희석) 0.5% FBS, 및 100 ng/ml 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)에 20 ng/ml WNT-3a (카탈로그 번호 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)를 더한 것으로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% FBS 및 100 ng/mL 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 2일 동안 처리하였다. 다음, 배양물을 DMEM/F12 + 2% FBS + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD(#239804, 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)로 3일간 처리하고 이어서 4일간 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD + 2 ㎛ 레틴산(RA)(시그마, 미국 미주리주) + 100 ng/ml의 노긴 (알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에서 인큐베이션하였다.
다음, 세포를 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml 엑센딘-4(시그마, 미국 미주리주) + 1 ㎛ DAPT(칼바이오캠, 미국 캘리포니아주) + 1 ㎛ ALK5 억제제 II(칼바이오캠, 미국 캘리포니아주) +/- 100 ng/ml의 노긴에서 6일간 배양하고 이어서 추가 3일간 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml 엑센딘-4(시그마, 미국 미주리주) + 50 ng/ml IGF(페프로테크, 미국 뉴저지주) + 50 ng/ml HGF(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주) + 1 ㎛ ALK5 억제제 II 에서 인큐베이션하였다.
도 7a 내지 도 7f 는 +/- 0-100 ng/ml 노긴으로 처리된, 4기 내지 5기의 마지막에 수확된 세포로부터의 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. 3 + 4기에서 100 ng/ml의 노긴의 첨가에 더하여 ALK5 억제제 II 의 첨가는 4-5기에서 인슐린 및 글루카곤의 발현을 극적으로 증가시켰다. 구체적으로, 3기 및 4기 둘 모두에서 노긴의 첨가는 내분비 전구체 마커인, NGN3의 발현을 유의하게 증가시킨 반면, 비처리 샘플과 비교하여 알부민 및 CDX2의 발현을 유의하게 억제하였다.
도 8a 내지 도 8d는 상기 프로토콜에 따른 배양물의 위상차 이미지를 나타낸다. 일부 배양물에서, 5기는 3일에서 21일로 연장된다. 5기의 배지 중 10-12일의 배양까지, 배양 플레이트의 전체에 걸쳐 인간 췌도와 비슷한 세포의 독특한 클러스터가 존재하였다. 패널 a 및 b는 5기에서 6일째 배양물의 이미지를 나타내는 반면 패널 c 및 d는 5기에서 12일째 배양물의 이미지를 나타낸다. 클러스터의 일부를 수동적으로 제거하고, 5기 배지에서 1:30의 매트리젤-코팅된 플레이트 위에 도말하였다. 2일간의 인큐베이션 후, 클러스터를 인슐린 및 글루카곤에 대해 염색하였다. 도 9a 및 도 9b에 나타낸 바와 같이, 클러스터 내 대다수 세포는 인간 인슐린에 대해 양성이었다. BMP 억제제, 노긴의 용량을 더욱 최적화시키기 위해 배양물을 2-4기에서 0, 10, 50, 또는 100 ng/ml의 노긴으로 처리하였다. 도 10은 2-4기에서 다양한 용량의 노긴으로 처리된 배양물에 있어서 4기에서의 NGN3의 발현을 나타낸다. 50-100 ng/ml의 노긴이 4기에서 NGN3의 최대 발현으로 이어지는 것으로 나타났다.
실시예 8
도 1에 약술된 분화 프로토콜에 따라 처리된 만능 줄기 세포 내 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커의 발현에 대한 3-4기에서의 노긴의 첨가, 4기에서의 네트린의 첨가 및 4기에서의 ALK5 억제제의 첨가 효과.
48 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬 상에서 배양하고(1:30 희석) 2% 지방산 BSA, 및 100 ng/ml 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)에 20 ng/ml WNT-3a (카탈로그 번호 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)를 더한 것으로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% BSA 및 100 ng/mL 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 2일 동안 처리하였다. 다음, 배양물을 DMEM/F12 + 2% FBS + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD(#239804, 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)로 3일간 처리하고 이어서 4일간 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD + 2 ㎛ 레틴산(RA)(시그마, 미국 미주리주) + 100 ng/ml의 노긴 (알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에서 인큐베이션하였다.
다음, 세포를 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml 엑센딘-4(시그마, 미국 미주리주) + 1 ㎛ DAPT(칼바이오캠, 미국 캘리포니아주) + 1 ㎛ ALK5 억제제 II(칼바이오캠, 미국 캘리포니아주) +/- 100 ng/ml의 노긴 + 100 ng/ml 네트린-4에서 3일간 배양하였다.
도 11a 내지 도 11f 는 4기에서 +/- 100 ng/ml 네트린으로 처리된, 4기의 마지막에 수확된 세포로부터의 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. 3기 및 4기에서 100 ng/ml의 노긴의 첨가에 더하여 4기에서 ALK5 억제제 II 및 100 ng/ml의 네트린-4의 첨가는 5기의 마지막에 수확된 세포에서 NGN3, NeuroD, 및 Pax4의 발현을 극적으로 증가시켰다.
4기 배양물의 일부에서, 노긴을 생략한 반면 네트린-4에 더하여 Alk5 억제제를 첨가하였다. 도 12a 내지 도 12d는 4기에서 노긴의 생략은 NGN3, NKX2.2, 및 NeuroD의 발현을 유의하게 감소시킨 반면 5기 마지막에 수확된 세포 내 인슐린 및글루카곤의 발현에는 중간 정도로 영향을 미침을 나타낸다.
실시예 9
도 1b에 약술된 분화 프로토콜에 따라 처리된 만능 줄기 세포에 의한 시험관 내에서의 글루코스 자극된 인슐린 분비( GSIS ).
48 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬 상에서 배양하고(1:30 희석) 2% 지방산 BSA, 및 100 ng/ml 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)에 20 ng/ml WNT-3a (카탈로그 번호 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)를 더한 것으로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% BSA 및 100 ng/mL 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 2일 동안 처리하였다. 다음, 배양물을 DMEM/F12 + 2% FBS + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD(#239804, 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)로 3일간 처리하고 이어서 4일간 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD + 2 ㎛ 레틴산(RA)(시그마, 미국 미주리주) + 100 ng/ml의 노긴 (알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에서 인큐베이션하였다.
다음, 세포를 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml 엑센딘-4(시그마, 미국 미주리주) + 1 ㎛ DAPT(칼바이오캠, 미국 캘리포니아주) + 1 ㎛ ALK5 억제제 II(칼바이오캠, 미국 캘리포니아주) +/- 100 ng/ml의 노긴 + 100 ng/ml 네트린에서 3일간 배양하고, 이어서 추가 3 내지 21일간 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml 엑센딘-4(시그마, 미국 미주리주) + 50 ng/ml IGF(페프로테크, 미국 뉴저지주) + 50 ng/ml HGF(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주) + 1 ㎛ ALK5 억제제 II에서 인큐베이션하였다.
6, 8, 12 및 20일째 5기 배양물을 37℃에서 크렙스(KREBS) 완충액(크렙스 링거액(Krebs-Ringer solution): 0.1% BSA, 10 mM HEPES, 5 mM NaHCO3, 129 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 5mM NaHCO3) 내 1시간 세척에 의해 GSIS에 대해 시험하고, 이어서 크렙스 완충액에 2 mM D-글루코스를 더한 것에서 1시간 인큐베이션, 및 크렙스 완충액에 20 mM D-글루코스를 더한 것에서 추가로 1시간 인큐베이션하였다. 각 인큐베이션 후, 상청액을 제거하고 추가의 분석을 위해 -20℃에 냉동하였다. 분비된 C-펩티드의 수준을 초-민감(ultra-sensitive) C-펩티드 ELISA(알프코 다이아그노스틱스(Alpco Diagnostics), 스웨덴)를 사용해 분석하였다. 도 13a 내지 도 13c는 시험관 내 글루코스 챌린지에 응답하여 분비된 인간 C-펩티드의 수준을 나타낸다. 5기에서 초기 및 중기 인큐베이션 기간은 유의미한 자극 지수(저 글루코스에 대한 고 글루코스에서 분비된 C-펩티드의 정량)로 이어지지 않는 반면, 20일간 5기 배지에서 인큐베이션된 샘플은 글루코스에 응답하여 강력한 자극을 나타내었다. 이는 5기 배지에의 연장된 노출이 클러스터의 성숙으로 이어짐을 나타내는데, 이는 GSIS의 증거를 나타낸다.
실시예 10
도 1b에 약술된 분화 프로토콜에 따라 처리된 만능 줄기 세포 내 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커의 발현에 대한 네트린 -1 또는 네트린 -2의 첨가 효과.
44 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬 상에서 배양하고(1:30 희석) 0.5% FBS, 및 100 ng/ml 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)에 20 ng/ml WNT-3a (카탈로그 번호 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)를 더한 것으로 보충된 DMEM/F12 배지에 2일 동안 노출시키고 이어서 2% FBS 및 100 ng/mL 액티빈 A (AA)로 보충된 DMEM/F12 배지로 추가 2일 동안 처리하였다. 다음, 배양물을 DMEM/F12 + 2% FBS + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD(#239804, 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)로 3일간 처리하고 이어서 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD + 2 ㎛ 레틴산(RA)(시그마, 미국 미주리주)에서 4일간 인큐베이션하였다.
다음, 세포를 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml 엑센딘-4(시그마, 미국 미주리주) + 1 ㎛ DAPT(칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)에서 6일간 배양하고 이어서 추가 3일간 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml 엑센딘-4(시그마, 미국 미주리주) + 50 ng/ml IGF(페프로테크, 미국 뉴저지주) + 50 ng/ml HGF(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에서 인큐베이션하였다. 배양물의 일부에 50 ng/ml의 네트린-1 또는 네트린-2(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)를 2기 내지 5기에 첨가하였다. 도 14는 2기 내지 5기에서 +/- 50 ng/ml의 네트린-1 또는 네트린-2로 처리된, 5기에서 수확된 세포로부터의 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. 네트린-1 또는 네트린-2의 첨가는 5기의 마지막에 수확된 세포 내 글루카곤 및 인슐린의 발현을 유의하게 상향 조절하였다.
실시예 11
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커의 발현을 유도하기 위한 대안적 방법.
48 계대에서, 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬 상에서 배양하고(1:30 희석) 하기 중 어느 하나에 의해 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시켰다:
a. 1% B27 보충물(인비트로젠, 미국 캘리포니아주), 및 50 ng/ml 액티빈-A(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에 더하여 1 mM 부티르산나트륨(시그마, 미국 미주리주)이 보충된 RPMI 배지에서 1일간 배양하고 이어서 1% B27 보충물(인비트로젠, 미국 캘리포니아주), 및 50 ng/ml 액티빈-A(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에 더하여 0.5 mM 부티르산나트륨(시그마, 미국 미주리주)이 보충된 RPMI 배지에서 추가 3일간 처리하거나, 또는
b. 0.5% FBS, 및 100 ng/ml 액티빈-A(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에 더하여 20 ng/ml WNT-3a(카탈로그# 1324-WN-002, 알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)가 보충된 DMEM/F12 배지에서 2일간 배양하고, 이어서 2% FBS 및 100 ng/ml 액티빈-A(AA)가 보충된 DMEM/F12 배지에서 추가 2일간 처리함.
다음, 배양물을 DMEM/F12 + 2% FBS + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD(#239804, 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)로 3일간 처리하고 이어서 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD + 2 ㎛ 레틴산(RA)(시그마, 미국 미주리주)에서 4일간 인큐베이션하였다. 다음, 세포를 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml 엑센딘-4(시그마, 미국 미주리주) + 1 ㎛ DAPT(칼바이오캠, 미국 캘리포니아주) + 1 um ALK5 억제제 II(칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)에서 3일간 인큐베이션하였다.
상기 대안적 방법 a)를 이용한 배양물의 완성 내배엽으로의 유도는, 상기 대안적 방법 b)에 의한 56% CXCR4 발현과 비교하여, FACS에 의해 측정되는 바와 같이 CXCR4의 78% 발현으로 이어졌다. CXCR4는 완성 내배엽 세포의 마커로 간주된다.
도 15a 내지 도 15f는 대안적 방법 a) 또는 b) 중 어느 하나를 이용해 5기의 마지막에서 수확된 세포로부터의 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. 대안적 방법 a)도 췌장 내배엽 및 내분비 마커의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있는 것으로 보인다.
실시예 12
매트리젤 ™로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 , 혈청의 부재 하에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화.
52 계대에서, 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤(등록상표) 코팅된 디쉬 상에서 배양하고(1:30 희석) 2% BSA, 및 100 ng/ml 액티빈-A(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에 더하여 20 ng/ml WNT-3a(카탈로그# 1324-WN-002, 알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에 더하여 8 ng/ml의 bFGF(카탈로그# 100-18B, 페프로테크, 미국 뉴저지주)가 보충된 RPMI 배지에 1일간 노출시키고, 이어서 2% BSA 및 100 ng/ml 액티빈-A에 더하여 8 ng/ml의 bFGF가 보충된 RPMI 배지로 추가 2일간 처리하였다. 다음, 배양물을 DMEM/F12 + 2% BSA + 20 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD(#239804, 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)로 2일간 처리하고 이어서 4일간 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민- KAAD + 2 ㎛ 레틴산(RA)(시그마, 미국 미주리주) + 100 ng/ml의 노긴(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에서 인큐베이션하였다. 다음, 세포를 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 100 ng/ml 노긴 + 1 ㎛ DAPT(칼바이오캠, 미국 캘리포니아주) + 1 ㎛ ALK5 억제제 II(카탈로그# 616452, 칼바이오캠, 미국 캘리포니아주) + 100 ng/ml의 네트린-4(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에서 3일간 배양하고, 이어서 추가 7일간 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 1 ㎛ ALK5 억제제 II (칼바이오캠, 미국 캘리포니아주)에서 인큐베이션하였다. 내분비 배양물을 더욱 성숙시키기 위해 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주)에서 7일간 처리하는 것으로 이루어진 최종 시기를 추가하였다. 최종 시기를 제외하고는, 모든 다른 시기들은 매일 배지를 교환해 주었다. 이 과정의 개요를 도 1c에 나타내었다. 각 시기에서 세포 개수를 혈구계(hemocytometer)를 이용해 계산하였고 PCR 분석을 위해 RNA를 수집하였다. 모든 샘플을 삼중으로 수집하였다.
도 16a 및 도 16b는 3일째 1기에 있어서 FACS에 의해 측정된 CXCR4 발현 및 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. 발현의 변화 배수는 미분화 H1 ES 세포에 관해 도시된다. 도 16c 내지 도 16n은 2기 내지 6기의 마지막에 수확된 세포에서 주요 췌장 및 내분비 마커에 대한 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. 도 17은 1기 내지 6기의 마지막에서의 세포의 개수를 나타낸다.
실시예 13
도 1c에 약술된 분화 프로토콜에 따라 처리된 만능 줄기 세포 내 C-펩티드 및 프로-인슐린 함량.
도 1c에 약술된 프로토콜에 따라 42 계대에서, 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬 상에서 배양하고(1:30 희석) 분화시켰으며, 이는 상기 실시예 12에 기술된 바와 같다.
세포를 크렙스 링거 완충액(129 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 2.5 MM CaCl2, 5mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.3% (wt/vol) BSA)으로 세척하고 크렙스 완충액에 15분간 인큐베이션하고 이어서 37℃, 5% CO2, 95% 공기에서 2 mM D-글루코스로 스파이크된(spiked) 크렙스 완충액 내에서 45분간 인큐베이션하였다. 0.5 ml의 상청액을 수집하고 잔여 배지를 흡인하고 하기 자극원 중 하나로 스파이크된 크렙스 완충액으로 대체하였다: 37℃, 5% CO2, 95% 공기에서 45분간 20 mM D-글루코스 (HG), 30 mM KCl, 100 ㎛ 톨부타미드(tolbutamide, tol), 100 mM IBMX, 2 ㎛ BAY K8644, 또는 10 mM 케토아이소카프로산(ketoisocaproic acid, KIC). 0.5 ml의 상청액을 수집하고 잔여 배지를 버렸다. 상청액을 C-펩티드 ELISA 키트(카탈로그# 80-CPTHU-E01, 알프코 다이아그노스틱스, 미국 뉴햄프셔주)를 사용해 인간 C-펩티드 함량에 대해 분석하였다. 샘플을 키트 내에 제공된 표준물의 선형 범위 내에 속하도록 5-10배로 통상적으로 희석하여야 했다.
도 18은 다양한 자극원을 이용한 자극 이후에 C-펩티드 방출을 나타낸다. 각 제제의 자극 지수(2 mM 글루코스 함유 기본 상청액 내 C-펩티드 농도로 나눈 자극 상청액 내 C-펩티드 농도) 또한 그래프 상에 도시된다.
6기 배양물의 C-펩티드, 프로-인슐린, 및 DNA 함량을 측정하기 위해, 6기 배양물을 함유하는 6-웰 플레이트를 웰당 500 μl의 세포 용해 완충액(10 mM 트리스-HCL + 1 mM EDTA, pH 7.5)으로 처리하고 이어서 30초간 초음파 처리하였다. C-펩티드 함량 및 프로-인슐린 함량은 각각 C-펩티드 ELISA 키트(카탈로그# 80-CPTHU-E01, 알프코 다이아그노스틱스, 미국 뉴햄프셔주) 및 프로-인슐린 ELISA 키트(카탈로그#11-1118-01, 알프코 다이아그노스틱스, 미국 뉴햄프셔주)를 사용해 측정하였다. 용해물의 DNA 함량은 Quant-IT™ DNA 키트(카탈로그# P7589, 인비트로젠, 미국 캘리포니아주)를 사용해 정량화하였다. 샘플을 키트 내에 제공된 표준물의 선형 범위 내에 속하도록 500-1000배로 통상적으로 희석하여야 했다. 도 19는 6기 배양물을 함유하는 6-웰 플레이트의 3개의 상이한 웰에 있어서 DNA에 대해 표준화한 C-펩티드 함량 및 프로-인슐린 함량을 나타낸다. 비교로서, 3개의 상이한 성인 인간 시체 췌도 샘플의 C-펩티드 및 프로-인슐린 함량을 또한 측정하였다. 이 데이터는 배양물 내에 존재하는 클러스터뿐만 아니라 전체 배양물의 인슐린 함량도 반영함을 주목하라.
실시예 14
도 1c에 약술된 분화 프로토콜에 따라 처리된 만능 줄기 세포의 FACS 분석.
도 1c에 약술된 프로토콜에 따라 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬 상에서 배양하고(1:30 희석) 분화시켰으며, 이는 상기 실시예 12에 기술된 바와 같다. 세포를 트립엘이 익스프레스(TrypLE Express)(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드)를 사용해 단층 배양물로부터 단일 세포로 분리하고 냉각 PBS로 세척하였다. 고정을 위해, 세포를 200-300 μl 사이토픽스/사이토펌(Cytofix/Cytoperm) 완충액(BD 554722, BD, 미국 캘리포니아주)에 재현탁하고 4 ℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 세포를 1 ml 펌/워시(Perm/Wash) 완충 용액(BD 554723)으로 2회 세척하고 펌/워시 완충액 내 2% 정상 염소 혈청을 함유하는 100 μl의 염색/차단 용액에 재현탁하였다. 유세포 측정 분석을 위해, 세포를 하기 일차 항체: 항-인슐린(토끼 mAb, 셀 시그널링(Cell Signaling) No. C27C9; 1:100 희석), 항-글루카곤(생쥐 Mab, 시그마 No. G2654, 1:100); 항-시냅토파이신(토끼 다중클론 항체, 다코사이토메이션(DakoCytomation) No A0010, 1:50)로 염색하고; 세포를 4℃에서 30분간 인큐베이션하고 이어서 펌/워시 완충액으로 2회 세척하고 추가로 하기와 같은 적합한 이차 항체에서 30분간 인큐베이션하였다: 염소 항-토끼 알렉사(Alexa) 647(인비트로젠 No. A21246) 또는 염소 항-생쥐 647(인비트로젠 No. A21235); 염소 항-토끼 R-PE(바이오소스(BioSource) No. ALI4407). 모든 이차 항체를 1:200으로 희석시켜 사용하였다. 세포를 펌/워시 완충액으로 적어도 1회 세척하고 BD FACSArray를 사용해 분석하였다. 분석을 위해 적어도 10,000 이벤트(event)를 획득하였다. 대조군은 미분화 H1 세포 및 b-TC(ATCC, VA) 세포주를 포함하였다. 도 20a 내지 도 20c는 6기 배양물 내 인슐린 양성 및 시냅토파이신+ 세포의 백분율을 나타낸다.
실시예 15
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커의 발현을 상향 조절하는 도 1c에 약술된 분화 프로토콜의 3기 및 4기에서의 코딘의 첨가.
50-100 ng/ml의 코딘(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)을 노긴 대신에 3-4기에 첨가하는 것을 제외하고는 도 1c에 약술된 프로토콜에 따라 52 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬 상에서 배양하고(1:30 희석) 분화시켰다. 노긴과 유사하게, 코딘 또한 BMP 시그널링의 공지된 억제제이다. FACS에 의한 6기 배양물의 분석(도 21a 및 도 21b)은 3-4기에서 노긴의 첨가에 의해 관찰된 바와 같이 인슐린 및 시냅토파이신의 매우 유사한 발현을 나타내었다.
실시예 16
매트리젤 ™로 코팅된 조직 배양 기재 상에서 , 혈청의 부재 하에서 배양된 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화.
도 1c에 약술된 프로토콜에 따라 39 계대에서, 인간 배아 줄기 세포주 H9 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬 상에서 배양하고(1:30 희석) 분화시켰으며, 이는 상기 실시예 12에 기술된 바와 같다. RNA를 1-6기의 마지막에서 수집하였다. 도 22a 내지 도 22l은 3-6기의 마지막에 수확된 주요 췌장 및 내분비 마커에 대한 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. H1 세포주에서 수득된 결과와 유사하게, H9 세포는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현할 수 있었다.
실시예 17
췌장 내분비 세포로 분화하는 만능 줄기 세포의 능력에 대한 배지 보충물의 효과.
일부 배양에서 DMEM/F12 기본 배지를 0.25-1% B27 또는 1% N2(인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 2% BSA로 보충하는 것을 제외하고는 도 1c에 약술된 프로토콜에 따라 39 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬 상에서 배양하고(1:30 희석) 분화시켰다. 분화 프로토콜의 모든 다른 구성요소들은 실시예 12에 약술된 바와 같이 유지하였다. 샘플을 3기, 5기 및 6기의 마지막에 삼중으로 수집하고 실시간 PCR로 분석하였다. 도 23a 내지 도 23d는 3기, 5기 및 6기의 마지막에 수확된 세포로부터의 주요 췌장 및 내분비 마커에 대한 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. B27에 대한 대체물로서 N2/BSA의 사용은 주요 췌장 내분비 마커의 매우 유사한 발현으로 이어졌다. 더욱이, B27의 농도는 주요 췌장 내분비 마커의 발현에 유의한 효과를 미치지 않으면서 0.25%로 감소될 수 있었다.
본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 태양이 실시예와 바람직한 실시 형태를 참고로 하여 상기에서 예시되었지만, 본 발명의 범주는 전술한 상세한 설명에 의해서가 아니라 특허법의 원리 하에서 적절하게 해석되는 하기 특허청구범위에 의해 규정됨이 이해될 것이다.

Claims (130)

  1. 하기 단계를 포함하는, 인간 만능 줄기 세포로부터 글루코스-자극된 인슐린 분비를 할 수 있는 세포를 생성하는 방법:
    a. 인간 만능 줄기 세포를 배양하는 단계,
    b. 인간 만능 줄기 세포를 TGF-β 수용체 작용제가 보충된 배지로 처리함으로써, 인간 만능 줄기 세포를 완성 내배엽(definitive endoderm) 세포로 분화시키는 단계,
    c. 완성 내배엽 세포를 레틴산, FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10, 소닉 헤지호그 억제제, BMP를 억제할 수 있는 인자 및 네트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 처리함으로써, 완성 내배엽 세포를 췌장 내배엽 세포로 분화시키는 단계, 및
    d. 췌장 내배엽 세포를 TGF-βR-1 키나아제의 억제제로 처리함으로써, 췌장 내배엽 세포를 췌장 내분비 세포로 분화시키는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 췌장 내배엽 세포를 1일 내지 12일간 TGF-βR-1 키나아제의 억제제로 처리하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 췌장 내배엽 세포를 5일 내지 12일간 TGF-βR-1 키나아제의 억제제로 처리하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 췌장 내배엽 세포를 12일간 TGF-βR-1 키나아제의 억제제로 처리하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, TGF-βR-1 키나아제의 억제제를 0.1 μM 내지 100 μM의 농도로 사용하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, TGF-βR-1 키나아제의 억제제가 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘인 방법.
  7. 제1항에 있어서, TGF-βR-1 키나아제의 억제제가 [3-(피리딘-2-일)-4-(4-퀴노닐)]-1H-피라졸인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 췌장 내배엽 세포를 BMP를 억제할 수 있는 인자 및 네트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 추가로 처리하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 췌장 내배엽 세포를 췌장 내분비 세포로 분화시키는 단계는, 췌장 내배엽 세포를 노치(Notch) 시그널링 경로를 억제하는 인자 및 TGF-βR-1 키나아제의 억제제로 처리함으로써 성취되는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 췌장 내배엽 세포를 1일 내지 12일간 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자 및 TGF-βR-1 키나아제의 억제제로 처리하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 췌장 내배엽 세포를 5일 내지 12일간 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자 및 TGF-βR-1 키나아제의 억제제로 처리하는 방법.
  12. 제9항에 있어서, 췌장 내배엽 세포를 12일간 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자 및 TGF-βR-1 키나아제의 억제제로 처리하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 완성 내배엽 세포를 1일 내지 6일간 레틴산, FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10, 소닉 헤지호그 억제제, BMP를 억제할 수 있는 인자 및 네트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 처리하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 완성 내배엽 세포를 6일간 레틴산, FGF-2, FGF-4, FGF-7, FGF-10, 소닉 헤지호그 억제제, BMP를 억제할 수 있는 인자 및 네트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 처리하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 완성 내배엽 세포를 1일 내지 3일간 소닉 헤지호그 억제제; 및 FGF-2, FGF-4, FGF-7 및 FGF-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 처리(제1 단계)하고, 이어서 이 세포를 1일 내지 4일간 소닉 헤지호그 억제제; 레틴산; 및 FGF-2, FGF-4, FGF-7 및 FGF-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 처리(제2 단계)하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 제1 단계가 3일간 수행되는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 제2 단계가 4일간 수행되는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 완성 내배엽 세포를 1일 내지 3일간 소닉 헤지호그 억제제; 및 FGF-2, FGF-4, FGF-7 및 FGF-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 처리(제1 단계)하고, 이어서 이 세포를 1일 내지 4일간 소닉 헤지호그 억제제; BMP를 억제할 수 있는 인자; 레틴산; 및 FGF-2, FGF-4, FGF-7 및 FGF-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 처리(제2 단계)하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 제1 단계가 3일간 수행되는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 제2 단계가 4일간 수행되는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 완성 내배엽 세포를 1일 내지 3일간 소닉 헤지호그 억제제; 및 FGF-2, FGF-4, FGF-7 및 FGF-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 처리(제1 단계)하고, 이어서 이 세포를 1일 내지 4일간 소닉 헤지호그 억제제; BMP를 억제할 수 있는 인자; 네트린; 레틴산; 및 FGF-2, FGF-4, FGF-7 및 FGF-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 처리(제2 단계)하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 제1 단계가 3일간 수행되는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 제2 단계가 4일간 수행되는 방법.
  24. 제1항에 있어서, 완성 내배엽 세포를 50 pg/ml 내지 50 ㎍/ml 농도의 FGF-7로 처리하는 방법.
  25. 제1항에 있어서, 완성 내배엽 세포를 20 ng/ml 농도의 FGF-7로 처리하는 방법.
  26. 제1항에 있어서, 완성 내배엽 세포를 1 nM 내지 1 mM 농도의 레틴산으로 처리하는 방법.
  27. 제1항에 있어서, 완성 내배엽 세포를 1 μM 농도의 레틴산으로 처리하는 방법.
  28. 제1항에 있어서, 완성 내배엽 세포를 500 ng/ml 내지 100 ㎍/ml 농도의 노긴(noggin)으로 처리하는 방법.
  29. 제1항에 있어서, 완성 내배엽 세포를 100 ng/ml 농도의 노긴으로 처리하는 방법.
  30. 제1항에 있어서, 완성 내배엽 세포를 500 ng/ml 내지 100 ㎍/ml 농도의 네트린으로 처리하는 방법.
  31. 제1항에 있어서, 완성 내배엽 세포를 100 ng/ml 농도의 네트린으로 처리하는 방법.
  32. 제1항에 있어서, 네트린이 네트린 1, 네트린 2 및 네트린 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
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