CN102307990A

CN102307990A - 从干细胞衍生分化细胞的方法

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Publication number: CN102307990A
Application number: CN2009801559570A
Authority: CN
Inventors: N·托洛维茨; L·阿加波娃; A·赛麦金; J·D·杰尼斯
Original assignee: International Stem Cell Corp
Current assignee: International Stem Cell Corp
Priority date: 2008-12-03
Filing date: 2009-12-02
Publication date: 2012-01-04
Also published as: EP2367931A1; RU2576003C2; EP2367931B1; CA2745742A1; JP2013512658A; AU2009322398A1; IL213260A0; JP5694946B2; US8986995B2; US20100173414A1; RU2011126992A; WO2010065679A1; IL213260A; US8268621B2; US20130045534A1; EP2367931A4; AU2009322398A2

Abstract

本发明提供生成定形内胚层、中胚层或外胚层细胞的方法。该方法包括在脱甲基化剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂或其组合存在的情况下培养胚胎干细胞、孤雌生殖细胞或诱导的多潜能干细胞，并且此后在该药剂或药剂组合不存在的情况下培养干细胞，以生成定形内胚层细胞、中胚层或外胚层细胞。

Description

从干细胞衍生分化细胞的方法

发明背景

发明领域

本发明总体涉及干细胞，更具体地涉及利用干细胞衍生内胚层细胞的方法。

背景信息

在胚胎发育过程中，身体组织由三种主要的细胞群形成：外胚层、中胚层和定形内胚层。这些细胞群也被称为初级生殖细胞层，通过被称为原肠胚形成的过程形成。原肠胚形成后，各初级生殖细胞层生成特异的细胞群组和组织。中胚层生成血细胞、内皮细胞、心肌和骨骼肌以及脂肪细胞。定形内胚层生成肝、胰和肺。外胚层生成神经系统、皮肤和肾上腺组织。

人胚胎干细胞(ES)是能分化成多种细胞类型的多潜能细胞。当被注入免疫缺陷小鼠时，胚胎干细胞形成分化的肿瘤(畸胎瘤)。但是，经体外诱导形成胚胎体(EB)的胚胎干细胞提供胚胎干细胞系来源，该胚胎干细胞系在某些生长条件下可分化为几种组织的多种细胞类型特征。例如，ES细胞在神经生长因子和视黄酸存在的情况下分化成神经元。

人ES细胞及其分化子代是用于治疗性移植以及药物测试和开发的重要正常人细胞来源。这两个目的需要提供足够的分化成适合患者需要或适于恰当的药理测试的组织类型的细胞。与此相关的是需要有效且可靠的从胚胎干细胞生成分化细胞的方法。

目前，人胚胎干细胞(hES)得自三个来源：不孕症治疗后保留且捐献用于研究的胚泡、由捐献的配子(卵母细胞和精子)产生的胚泡、以及核移植(NT)产物。死亡胎儿的组织是人胚胎生殖细胞(hEG)的唯一来源。hES和hEG细胞提供显著的科学和治疗可能性，包括生成更加特化的细胞或组织的潜能。然而，关于hES和hEG细胞来源的伦理问题以及研究中NT的应用可导致NT被用于制造人类的忧虑，已产生了大量公众讨论和争论。

哺乳动物卵母细胞的孤雌生殖激活可用作精子/NT受精的变质剂，以制备用于生成胚胎干细胞的卵母细胞。孤雌生殖激活是指在雄性配子的任何贡献不存在的情况下从雌性配子生成胚胎细胞，其最终发育成成人或不发育成成人。

第一个人孤雌生殖干细胞(hpSC)衍生自胚泡内细胞群，该胚泡内细胞群来自通过化学刺激而激活的未受精的卵母细胞。这些细胞证明了人胚胎干细胞(hESC)的典型特征，如广泛的自我更新以及体外和体内分化为全部三个胚层的细胞。人pSC由于纯合子HLA基因型的存在与人群的大量片段具有组织相容性，利用替代卵母细胞激活技术(在所有基因座上是纯合的)或通过具有稀有HLA纯合性(除HLA外多数基因座上是杂合的)的卵母细胞自发性激活得到人pSC。这些普通HLA单倍型匹配的hpSC可降低移植其分化衍生物后发生免疫排斥的风险；由此为hESC应用于基于细胞的治疗提供显著优势，该hESC衍生自具有独特HLA基因组的受精卵母细胞。此外，hpSC的产生克服了与hESC相关的伦理问题，因为hpSC的衍生物来源于未受精的卵母细胞。

多潜能干细胞的两种前景应用包括对于糖尿病或与肝细胞不足有关的某些肝脏疾病的细胞替代疗法。高纯度定形内胚层(DE)的生成是治疗用DE系细胞如肝细胞和胰腺内分泌细胞生成的关键第一步。

定形内胚层随其他两种主要胚层——外胚层和中胚层在原肠胚形成的过程中形成，并且在发育过程中将生成胃肠道和呼吸道以及包括肝脏和胰脏的其他器官。从hESC有效生成DE需要两个条件：通过转化生长因子β家族成员如激活素A或Nodal进行信号传导，以及通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)释放由胰岛素/胰岛素样生长因子信号传导生成的多潜能自我更新信号。此外，Wnt3a与激活素A一起添加增大了DE和中胚层双潜能前体的中内胚层特异性化的效力，并且提高了hESC沿DE形成途径起始的同步性。

hESC衍生的DE的发育能力已在体外和体内得到证明。多种hESC分化方案被用作第一阶段分化方案以富集DE群，其导致呈现成熟肝细胞一些特征的肝细胞样细胞的生成或能合成胰腺激素的胰岛内分泌样细胞的生成。在重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠肾囊下hESC衍生的DE细胞的移植导致其分化为更成熟的内胚层器官细胞，该内胚层器官细胞表达CDX2、绒毛蛋白和肝细胞特异性抗原。在急性肝损伤小鼠模型中，显示hESC衍生的DE进一步分化成肝细胞，以重建受损伤的肝。此外，显示hESC衍生的DE分化的胰腺内胚层细胞在体内发育成葡萄糖响应型内分泌细胞，该葡萄糖响应型内分泌细胞在形态上和功能上类似于胰岛，保护小鼠免于链脲菌素诱导的高血糖。

大量研究已有助于理解多潜能干细胞中的整体基因表达模式，并且其中的改变可部分决定分化能力。基因表达的控制部分地由外遗传机制调控，包括组蛋白的翻译后修饰和DNA的甲基化。破坏整体外遗传机制的分子手段可在阐明干细胞中运行的遗传回路中具有作用。整体外遗传调控的一个候选物是药剂TSA，其是有效的组蛋白脱乙酰酶抑制剂。显示TSA对鼠胚胎干细胞的治疗引起重要的多潜能性因子被抑制——该多潜能性因子包括Nanog，干细胞同一性的主要调节剂——和分化相关的基因被激活。令人感兴趣的是，在该研究中，TSA的效果并不支持分化的保持或进展；在去除TSA时，该细胞恢复为未分化的表型。

本文提供了干细胞分化成定形内胚层细胞的方法，该定形内胚层细胞生成高度富集的分化细胞培养物。

发明概述

本发明基于如下开创性的发现：某些条件对于从干细胞生成定形内胚层细胞是最佳的。

因此，本发明提供了生成定形内胚层、中胚层、外胚层或内胚层细胞方法，该方法通过如下进行：在剂(agent)的存在下培养干细胞，其中该剂改变了细胞的外遗传状态；并且此后，在该剂不存在的情况下培养干细胞，从而生成定形内胚层、中胚层、外胚层或内胚层细胞。一方面，生成定形内胚层细胞。

在一些方面，改变细胞外遗传状态的剂是甲基化修饰剂和/或乙酰化修饰剂。在具体的实施方式中，改变细胞外遗传状态的剂是脱甲基化剂或组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。

在一些实施方式中，干细胞是胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、成体干细胞或诱导的多潜能干(iPS)细胞。在某些实施方式中，干细胞是孤雌生殖细胞。一方面，孤雌生殖细胞是细胞系LLC-6p、LLC-12ph、LLC-2p或LLC-15ph细胞。在另一个实施方式中，干细胞是iPS细胞。

在另一个实施方式中，在剂不存在下培养干细胞发生在激活素A、Wnt3a或其组合存在的情况下。

在一些实施方式中，定形内胚层细胞表达一种或多种标记，该标记选自FoxA2、Sox17、CXCR4、短尾基因(brachyury)和CER1。在某些实施方式中，与未经处理的干细胞相比，定形内胚层细胞不表达选自E-钙粘着蛋白和Oct4的一种或多种标记或其表达水平降低。一方面，在限定培养基条件下实施培养步骤。

在一些实施方式中，定形内胚层细胞被进一步处理，以形成胃肠道细胞、呼吸道细胞或内分泌系统细胞。在其他实施方式中，细胞被进一步处理，以形成肝细胞或胰细胞。

在本发明的另一个实施方式中，提供了通过本发明所述方法生成的定形内胚层细胞培养物。一方面，提供了通过本发明所述方法生成的内胚层细胞分化的肝细胞或胰腺细胞培养物。

附图简述

图1显示了TSA预处理与一些定形内胚层分化关键标记分化程序和基因表达一起的示意图。

图2显示通过实时定量PCR测定的hpSC分化成定形内胚层过程中标记基因表达的时间动态图。由激活素A和Wnt3a对hpSC的处理造成短尾基因(BRACH)——原条状表达的基因——的表达在第24小时达到峰值。SOX17、CER1和CXCR4的表达在72小时达到最大值；0h，分化方案开始前的多潜能hpSC。Y轴表示相对于0h时间点标准化的相对基因表达。

图3显示通过实时定量PCR测定的TSA预处理的hpSC分化成定形内胚层的过程中标记基因表达的时间动态图。图4A显示了TSA预处理随时间对多潜能性基因OCT4、SOX2和分化阶段标记CER1、SOX17、CXCR4表达的影响的图。图4B显示了经TSA预处理和不经TSA预处理的短尾基因(BRACH)的表达图。

发明详述

在对本组合物、方法和培养方法论进行说明之前，要理解的是，由于这些组合物、方法和条件可变，本发明并不限于所述的具体组合物、方法和实验条件。也要理解的是，由于本发明的范围将仅由所附权利要求限定，本文所用的术语用法仅以描述具体实施方式为目的，而非意为限制。

如本说明书和所附权利要求所用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(所述，the)”包括复数指代，除非上下文中明确另外表示。因此，例如，“该方法”的指代包括本文所述的一种或多种方法和/或本文所述类型的一个或多个步骤，在阅读本公开等后其将对于本领域技术人员是显而易见的。

除非另外限定，本文所用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域的普通技术人员一般理解具有相同的含义。任何类似或等同于本文所述的方法和材料均可在本发明的实践或检验中应用，如要理解的是，修改和改变被包括在本公开的精神和范围内。在此并入本文提及的所有公开其全部作为参考。

早期人类发育的重要的阶段被称为原肠胚形成，发生在受精后2-3周。原肠胚形成非常重要，因为在此时三个主要胚层第一次被特化和组织。外胚层负责最终形成身体和整个神经系统的外层包覆物，而心脏、血液、骨、骨骼肌及其他结缔组织衍生自中胚层。如本文所述，“定形内胚层”指负责形成整个消化道——包括食道、胃及小肠和大肠、以及衍生自消化道的器官如肺、肝、胸腺、甲状旁腺和甲状腺、胆囊和胰的胚层。应当在定形内胚层与被称为原内胚层的完全独立的细胞系之间做出非常重要的区分。“原内胚层”主要负责形成外胚胎组织，主要是胎盘卵黄囊的壁内胚层和脏内胚层部分及Reichert膜的胞外基质物。

在原肠胚形成期间，定形内胚层形成的过程随细胞的迁移事件开始，其中中内胚层细胞(能够形成中胚层或内胚层的细胞)通过被称为原条的结构迁移。定形内胚层衍生自通过该条前部和通过节点(该条最前区域的特化结构)迁移的细胞。随着迁移发生，定形内胚层首先形成大部分前消化道，并结束于形成消化道后端。

定形内胚层形成的体内分析，如Conlon等，1994；Feldman等，1998；Zhou等，1993；Aoki等，2002；Dougan等，2003；Tremblay等，2000；Vincent等，2003；Alexander等，1999；Alexander和Stainier，1999；Kikuchi等，2001；Hudson等，1997的斑马鱼(Zebrafish)和非洲蟾蜍属(Xenopus)研究和Kanai-Azuma等，2002的鼠研究为如何可尝试接近在培养皿中使利用人胚胎干细胞的特定胚层细胞类型发育建立了基础。两方面与体外ESC培养有关，该体外ESC培养呈现出尝试在培养皿中重现发育的主要阻碍。首先，不生成组织化的胚层或器官结构。多数胚层和器官特异性遗传标记将在分化hESC培养系统中以异种方式表达。因此，由于缺少器官的具体界限，难以评价特异组织或细胞类型的形成。几乎所有在特定胚层或组织类型的一种细胞类型中表达的基因在不同胚层或组织类型的其他细胞中也表达。没有具体界限就具有相当少地赋予1-3个基因小样本基因表达特异性的手段。因此，必须检测相当多的基因，其中一些应存在，以及其中一些应在目标器官或组织的特定细胞类型中不表达。其次，基因表达模式的时序对于沿特异发育途径进行至关重要。

使问题进一步复杂化的是，应当注意体外干细胞分化相当不同步，与体内相比可能更加如此。因此，一组细胞可能在表达与原肠胚形成有关的基因的同时，另一组可能在开始最终分化。此外，有无外因应用的情况下操纵hESC单层或胚胎体(EB)可造成关于整个基因表达模式和分化状态的巨大差异。为此，外因的应用必须根据异种细胞混合物内的基因表达模式进行定时，从而使培养沿具体分化途径有效进行。考虑培养容器中细胞的形态关联性也有益。在培养容器中对形成所谓胚胎体时的hESC均衡地影响的能力可能不如对生长和分化为单层和或hESC集落的hESC到达最佳。

考虑到需要多潜能细胞有效分化成定形内胚层细胞，本发明的一些方面涉及造成约75-99％多潜能细胞转化成定形内胚层细胞的体外方法论。一般，这样的方法包括以限定和暂时指定的方式应用培养和生长因子条件。通过利用与定形内胚层细胞特异性结合的试剂从细胞群中的其他细胞分离和/或提纯定形内胚层细胞，可实现进一步富集定形内胚层细胞的细胞群。

因此，本发明提供了生成定形内胚层、中胚层、外胚层或内胚层细胞的方法，该方法通过如下进行：在剂的存在下培养干细胞，其中该剂改变细胞的外遗传状态；并且此后，在该剂不存在的情况下培养干细胞，从而生成定形内胚层、中胚层、外胚层或内胚层细胞。一方面，生成定形内胚层细胞。

在一些实施方式中，改变细胞的外遗传状态的剂是甲基化修饰剂和/或乙酰化修饰剂。在具体的实施方式中，改变细胞的外遗传状态的剂是脱甲基化剂或组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。脱甲基化剂可以是DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白甲基化抑制剂和/或组蛋白脱甲基化抑制剂。在一些方面，脱甲基化剂选自5-氮杂胞苷、5-氮-2’-脱氧胞苷、5-氟胞嘧啶、假同胞嘧啶(pseudoisocytosine)、Zebularine、普鲁卡因胺(Procainamide)、多酚(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)和Psammaplin。在某些方面，脱甲基化剂是5-氮杂-2′-脱氧胞苷(DAC)或5-氮杂胞苷。在其他实施方式中，乙酰化修饰剂是组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、组蛋白乙酰转移酶(HAT)抑制剂、组蛋白脱乙酰酶和组蛋白乙酰转移酶。

在一些实施方式中，组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂可以是异羟肟酸，如制滴菌素A(trichostatin A)、vorinostat(SAHA)、belinostat(PXD101)和LAQ824/LBH589；环四肽(如trapoxin B)、缩肽类；苯甲酰胺，如entinostat(MS275)、CI994和mocetinostat(MGCD0103)；亲电子酮类；脂肪酸化合物，如丁酸苯酯和丙戊酸、异戊酸酯、戊酸酯或丙戊酸酯、烟酰胺以及NAD衍生物、二氢香豆素、萘并吡喃酮和2-羟基萘甲醛；apicidin、FK228和丁酸钠。在一个实施方式中，HDAC抑制剂是异羟肟酸；一方面，HDI是制滴菌素A。另一方面，HDI不是丁酸钠。在一些方面，组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂是制滴菌素A(TSA)、丁酸钠、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)或N-亚硝基-n-甲脲。在其他方面，组蛋白乙酰转移酶(HAT)抑制剂是聚异戍二烯苯甲酮(Garcinol)和set/TAF-1β。一方面，使用组蛋白脱乙酰酶抑制剂制滴菌素(TSA)。还有另一方面，使用5-氮杂-2′-脱氧胞苷和制滴菌素(TSA)的组合。

在本发明一个实施方式中，提供了在预处理存在的情况下通过使干细胞分化成多潜能定形内胚层细胞而在培养中生成定形内胚层细胞的方法。因此，在一个实施方式中，本发明所述方法包括在剂的存在下培养干细胞，其中该剂选自丁酸钠、制滴菌素A(TSA)、其功能等价物及其组合；并且此后，在该药剂不存在的情况下培养干细胞，以生成定形内胚层细胞。

在一些实施方式中，干细胞是胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞或诱导的多潜能干(iPS)细胞或成体干细胞。在一些实施方式中，使用造血干细胞(HSC)、脂肪衍生的干细胞、充质干细胞(MSC)、神经干细胞、内皮干细胞、神经嵴干细胞或胚胎样干细胞(ESC)。在某些实施方式中，干细胞是孤雌生殖细胞。一方面，孤雌生殖细胞是细胞系LLC-6p、LLC-12ph、LLC-2p或LLC-15ph细胞。在另一个实施方式中，干细胞是iPS细胞。

在另一个实施方式中，在剂不存在下干细胞的培养发生在存在激活素A、Wnt3a或其组合的情况下。

以足以改变干细胞的外遗传状态量的剂预处理干细胞。所需的剂的量将基于具体剂的效能而不同。该量容易通过技术人员已知的方法和本文提供的方法得到确定。一方面，在TSA存在的情况下进行预处理培养细胞约12-48小时，优选约24小时。另一方面，在TSA不存在的情况下进行培养约6-96小时，或约6-72小时，优选约24-72小时。在另一个实施方式中，TSA以浓度约1nM至1μM或约100nM至1μM存在。在另一个实施方式中，在限定的培养基条件下实施培养步骤。

根据某些实施方式，生成了定形内胚层细胞。这些细胞可以是哺乳动物细胞，如人细胞。在本发明一些实施方式中，定形内胚层细胞表达或不显著表达某些标记。在一非限制性方面，定形内胚层细胞表达选自SOX17、CXCR4、MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1的一种或多种标记。在另一个实施方式中，定形内胚层细胞表达FoxA2和/或Sox17。在另一个实施方式中，定形内胚层细胞不显著表达选自OCT4、α-胎蛋白(AFP)、血栓调节蛋白(TM)、SPARC和SOX7的一种或多种标记。在另一个实施方式中，定形内胚层细胞不表达E-钙粘着蛋白(caherin)和/或Oct4。

在一些实施方式中，进一步处理细胞，形成胃肠道、呼吸道或内分泌系统的细胞。例如，内胚层细胞可分化为胃肠系统、呼吸道或内分泌系统的器官的细胞。在具体方面，进一步处理细胞，形成肝细胞或胰细胞。在本发明一些实施方式中，开始表达AFP(分化第7天或第8天)的肝细胞祖细胞可被用于移植。

在其他实施方式中，生成了中胚层细胞。可进一步处理这些细胞，形成衍生自中胚层系的任何细胞。在一些实施方式中，通过本领域已知的方法，中胚层细胞可分化成骨细胞、肌细胞、结缔组织或血细胞。

在其他实施方式中，生成了外胚层细胞。可进一步处理这些细胞，形成衍生自外胚层系的任何细胞。在一些实施方式中，通过本领域已知的方法，外胚层细胞可分化成神经系统细胞或皮肤细胞。

根据本发明的其他实施方式，述及了由多潜能细胞生成定形内胚层的方法。在一个实施方式中，多潜能细胞衍生自桑椹胚。在另一个实施方式中，多潜能干细胞是干细胞。这些方法所用的干细胞可包括但不限于胚胎干(ES)细胞。ES细胞可衍生自胚胎内细胞群或衍生自胚胎生殖腺嵴。胚胎干细胞可源自多个动物物种，包括但不限于各种哺乳动物物种，包括人。在一个实施方式中，利用人胚胎干细胞生成定形内胚层。

包含本文所述定形内胚层细胞的定形内胚层细胞培养物和组合物可产生自多潜能细胞，如胚胎干细胞。如本文所述，“胚胎”指以单个受精卵开始并且以多细胞结构终止的生物的发育阶段范围，该多细胞结构除已发育的配子细胞外不再包含多潜能或全能细胞。除由配子融合得到的胚胎外，术语“胚胎”还指通过体细胞核转移得到的胚胎。得到定形内胚层细胞的优选方法将人胚胎干细胞(hESC)用作生成定形内胚层的起始物质。该方法所用的胚胎干细胞可以是源自桑椹胚的细胞、胚胎内细胞团或得自胚胎生殖腺嵴的细胞。利用本领域已知的方法，人干细胞可在培养物中以多潜能态保持，而没有实质性分化。该方法在如下中被述及：例如，美国专利号5,453,357、5,670,372、5,690,926、5,843,780、6,200,806和6,251,671，在此引入其公开内容的全部作为参考。

本文所用的人胚胎干细胞可在有血清或无血清的培养物中保持。在一些实施方式中，使用血清替代品。在其他实施方式中，应用了无血清培养技术，如美国专利申请号2003/0190748所述的技术，在此引入其全部作为参考。

通过常规途径，干细胞在培养物中以多潜能态保持，直到需要其分化成定形内胚层。在一个实施方式中，通过以足以促进分化成定形内胚层的量向干细胞培养物提供TGFβ超家族的生长因子，实现分化成定形内胚层。可用于生成定形内胚层的TGFβ超家族生长因子选自Nodal/激活素或BMP亚组。在一个实施方式中，生长因子选自Nodal、激活素A、激活素B和BMP4。此外，生长因子Wnt3a和其他Wnt家族成员用于生成定形内胚层细胞。在另一个实施方式中，可使用任意上述生长因子的组合。

如本文所述，“孤雌生殖”(“孤雌生殖激活的(parthenogenically activated)”和“孤雌生殖激活的(parthenogenetically activated)”可互换使用)指在没有精子侵入的情况下发生卵母细胞激活的过程，并指包含滋养外胚层和内细胞团的早期胚胎发育，该发育得自卵母细胞或胚胎细胞的激活，例如卵裂球，包含全部雌性来源DNA。因此，“孤雌生殖体(parthenote)”指通过这种激活得到的所生成的细胞。进一步，“胚泡”指受精的或激活的卵母细胞的卵裂阶段，该受精的或激活的卵母细胞包含由外滋养层细胞和内细胞团(ICM)组成的细胞空心球。因此，“胚泡形成”指这样的过程：在卵母细胞受精或激活后，随后在培养基中培养卵母细胞一段时间，以能使其发育成由外滋养层细胞和ICM组成的细胞空心球(例如，5至6天)。

如本文所述，“激活”指这样的过程：例如但不限于减数分裂中期中已受精或未受精的卵母细胞进行如下过程——一般包括染色单体对分离、第二极体挤出，造成卵母细胞具有单倍数的染色体，各具有一个染色单体。激活包括如下方法：诱导包含全部雄性或雌性来源DNA的细胞发育成具有可识别内细胞团和滋养外胚层的胚胎，该胚胎可用于生成多潜能细胞，但其本身可能不能发育成可存活后代。激活可在例如下列中的一个条件下进行：(1)不导致第二极体挤出的条件；(ii)导致极体挤出，但极体挤出被抑制的条件；或(iii)抑制单倍体卵母细胞第一次细胞分裂的条件。

虽然孤雌生殖(pathogenesis)并非自然界繁殖的不常见形式，但哺乳动物不被认为能进行这种繁殖形式。但是，10％比例的自发性孤雌生殖可在雌性近交系小鼠品系LT/Sv(Ozil和Huneau，Development(2001)128：917-928；Vrana等，Proc Natl Acad Sci USA(2003)100(Suppl 1)：11911-11916；Berkowitz andGoldstein，New Eng J Med(1996)335(23)：1740-1748)的卵母细胞中被发现。胎盘哺乳动物的卵母细胞可经诱导进行体外孤雌生殖；但是，胚胎发育并不成功。

如本文所述，“多潜能”或“多潜能细胞”指能够产生有限量其他特定细胞类型的细胞类型。如上所述，定形内胚层细胞不分化成由外胚层或中胚层生成的组织，而是分化成消化道和衍生自消化道的器官。在一个实施方式中，定形内胚层细胞衍生自hESC。该过程可为有效生成人内胚层衍生的组织如胰、肝、肺、胃、肠和甲状腺提供基础。例如，定形内胚层的生成可以是干细胞分化成功能性产胰岛素β细胞的第一步。为得到可用量的产胰岛素β-细胞，需要对实现胰岛/β细胞命运前发生的各分化步骤进行高效分化。由于干细胞分化成定形内胚层细胞可能是进行功能性胰岛/β细胞生产的最早一步，因此尤其需要在该步进行高效分化。

如本文所述，“多潜能细胞”指衍生自通过包含全部雌性或雄性来源DNA的细胞的激活产生的胚胎的细胞，其可在体外以未分化的状态保持延长的、理论上无限期的一段时间，其可生成不同的分化组织类型，即外胚层、中胚层和内胚层。细胞的多潜能态优选通过如下保持：培养内细胞团或培养衍生自在适当条件下由雄核发育或雌核发育方法生成的胚胎的内细胞团的细胞，例如，通过在成纤维细胞饲养层或其他饲养层或包含白血病抑制因子(LIF)的培养物上进行培养。这种培养细胞的多潜能态可通过多种方法进行确定，例如，(i)确定多潜能细胞标记特征的表达；(ii)生成嵌合体动物，该嵌合体动物包含表达多潜能细胞基因型的细胞；(iii)将细胞注入动物，例如，SCID小鼠，在体内生成不同的分化细胞类型；和(iv)观察细胞在体外分化(例如，在饲养层或LIF不存在的情况下培养时)成胚胎体和其他分化细胞类型。

如本文所述，“分化”指发生在细胞中、引起那些细胞呈现某些特化功能和丧失变成某些其他特化功能性单元的能力的变化。能进行分化的细胞可以是全能细胞、多潜能(pluripotent)或多潜能(multipotent)细胞中的任一种。对于成熟的成体细胞，分化可以是部分的或完全的。

为确定细胞培养物或细胞群中的定形内胚层细胞的量，需要从培养物或细胞群中的其他细胞辨别这种细胞类型的方法。因此，在一个实施方式中，本方法进一步涉及细胞标记，该细胞标记的存在与否和/或相对表达水平对定形内胚层具有特异性。如本文所述，“表达”指材料或物质的生成和材料或物质的生成水平或生成量。因此，确定特异性标记的表达指检测被表达标记的相对量或绝对量，或简单检测该标记的存在与否。如本文所述，“标记”指可观测或检测的任何分子。例如，标记可包括但不限于核酸，如特定基因的转录体、基因的多肽产物、非基因产物多肽、糖蛋白、糖、糖脂、脂质、脂蛋白或小分子。

例如，在一个实施方式中，通过定量PCR(Q-PCR)确定标记表达存在与否和/或标记表达水平。示例性遗传标记包括但不限于，如可通过定量Q-PCR确定的FoxA2、Sox17、CXCR4、Oct4、AFP、TM、SPARC、Sox7、MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1、CRIP1、E-钙粘着蛋白及其他标记。在另一个实施方式中，利用免疫组织化学检测由上述基因表达的蛋白质。在另一个实施方式中，Q-PCR和免疫组织化学技术均被用于鉴定和确定这种标记的含量或相对比例。

因此，可能识别定形内胚层细胞和确定定形内胚层细胞在细胞培养物或细胞群中的比例。例如，在一个实施方式中，生成的定形内胚层细胞或细胞群表达FoxA2和/或Sox17，但不表达Oct4和/或E-钙粘着蛋白。

在另一个实施方式中，本发明提供包含定形内胚层的细胞培养物和富集于定形内胚层细胞的细胞群。因此，在一个实施方式中，培养物中约50-99％、60-99％、70-99％、75-99％、80-99％、85-99％、90-99％或95-99％的细胞是定形内胚层细胞。在另一个实施方式中，考虑将多潜能细胞群如干细胞群转化为基本上纯的定形内胚层细胞群。

如本文所述，“限定的培养基条件”指培养细胞的环境，其中详细说明了最佳生长所需的其组分浓度。例如，取决于细胞的应用(例如，治疗应用)，将细胞从包含异种蛋白的条件去除是重要的；即，培养条件是无动物条件或无非人动物蛋白。

在一些实施方式中，预处理后的培养条件包括将高水平激活素A用于分化第1、2和3天。其他实施方式包括预处理步骤后，在分化第1天使用Wnt3a。在还有其他实施方式中，培养条件包括在分化第4至8天使用FGF4和BMP2。在另一个实施方式中，可在分化第1至8天使用基础分化培养基：Glutamax I和5％人血清白蛋白补充的RPMI 1640。还有其他实施方式包括在分化第1天使用无血清培养基。一方面，在分化第2和3天使用低血清培养基(0.2％血清)。另一方面，在分化第4至8天使用2％血清分化培养基。

“分化细胞”指非胚胎细胞，其具有特定的分化状态，即非胚胎态。三个最早的分化细胞类型是内胚层、中胚层和外胚层。

本发明所用细胞的多潜能态可通过多种方法确定。例如，可检测细胞是否存在特征性ES细胞标记。在人ES细胞的情况下，这种标记的实例由上述确定，并且包括SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-81和OCT 4，在本领域已知。

同样，多潜能性可通过将细胞注入适当的动物例如SCID鼠，并且观察分化细胞和组织的生成而得到确定。还有另一种确定多潜能性的方法是利用目标多潜能细胞生成嵌合动物，并观察所引入的细胞对不同细胞类型的贡献。生成嵌合动物的方法在本领域公知，并在美国专利号6,642,433中被述及，在引入作为参考。

还有另一种确定多潜能性的方法是观察在有助于分化的条件下(例如，去除成纤维细胞饲养层)培养时ES细胞分化成胚胎体及其他分化细胞类型。这种方法已被使用，并且已确定在组织培养中目标多潜能细胞生成胚胎体和不同的分化细胞类型。

生成的多潜能细胞和细胞系，优选人多潜能细胞和细胞系，衍生自全部雌性来源的DNA，具有多种治疗和诊断应用。这种多潜能细胞可用于多种疾病病症治疗的细胞移植治疗或基因治疗(如遗传修饰)。

对此，已知鼠胚胎干(ES)细胞能分化成几乎任何细胞类型。因此，根据本发明生成的人多潜能(ES)细胞应当具有类似的分化能力。按照已知的方法，根据本发明所述的多潜能细胞将经诱导分化，得到所需的细胞类型。例如，通过在分化培养基中培养该细胞，并且在为细胞分化提供的条件下，根据本发明生成的人ES细胞可经诱导分化成造血干细胞、肌细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、视网膜细胞、软骨细胞、上皮细胞、尿路细胞等。造成ES细胞分化的培养基和方法在本领域已知，适当的培养条件也在本领域已知。

例如，Palacios等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，92：7530-7537(1995)教导了通过使干细胞经过诱导程序而从胚胎细胞系生成造血干细胞，该诱导程序包括先在不含视黄酸的悬浮培养基中培养这种细胞集合体，然后在含有视黄酸的同一培养基中培养，然后将细胞集合体转移到为细胞粘附提供的基底上。

此外，Pedersen，J.Reprod.Fertil.Dev.，6：543-552(1994)是综述文章，其引用了多篇公开胚胎干细胞体外分化以生成多种分化细胞类型——包括造血细胞、肌细胞、心肌细胞、神经细胞等——的方法的文章。

本文提供了如下研究：利用hESC分化方案证明包含未分化的hpSC的TSA预处理可提高定形内胚层(DE)分化的效力。该预处理造成定形内胚层细胞数增加，相对于非预处理hpSC的45％的最大值，高达70％。在不希望受任何具体理论约束的同时，提出由TSA处理引起的组蛋白脱乙酰酶抑制影响了未分化的hpSC的染色质结构重组，其提高了未分化的细胞对培养基中提供的激活素A和Wnt3a信号响应的能力。文献报道显示，多数建构染色质蛋白具有高动力性，并且松散地结合胚胎干细胞中的染色质，但在分化时，高动力性蛋白则固定在染色质上(Meshorer等，Dev Cell 10(1)：105-16，2006)。Karanzali等(Genome Biol 9(4)：R65，2008)提出，在分化表型充分定型前，染色质窗口可能“过分纵容(over-permissiveness)”，未分化的ESC的TSA处理可促进该短暂的阶段。

一个染色质结构重组可能的结果可能是短尾基因表达的能力改变。在以TSA处理24小时的hpSC培养物中，观察到短尾基因转录体的水平显著提高。此外，TSA处理的培养物显示出到分化第2天短尾基因更快地消失。这些观察在所检测的全部四种hpSC系保持一致。在前显示高度富集的定形内胚层源自于呈现短尾基因峰形表达的培养：基因上调被激活素A信号传导前48小时过程中的迅速下调改变(D’Amour等，Nat.Biotechnol 23：1534-41，2005)。尽管不希望受任何具体理论约束，我们假定，所观察到的TSA引起的短尾基因效应可有助于hpSC通过较大部分定形内胚层的形成所产生的原条中间态同时发生转变。

我们的观察结果表明，由TSA处理的hpSC生成的细胞类型是可信的定形内胚层。蛋白质和RNA水平的标记分析与DE形成一致，并且排除了生成显著水平的胚胎外内胚层或其他系的可能性。此外，衍生自hpSC的DE第一次经过表达标记如CER1、SOX17和CXCR4前的短尾基因表达峰而转变。这是DE从脊椎动物胚胎的原条中间态发育的回顾。SOX17表达起始于短尾基因阳性前体的观察结果进一步强化了SOX17阳性细胞是定形内胚层而不是原内胚层的结论，因为在原内胚层系中没有鉴定出短尾基因的表达(WilkinsonD.G.等，Nature 343：657-9，1990)。如在前对DE从hESC形成所述，我们观察到经激活素A处理后E-钙粘着蛋白的表达减少，与关于上皮至间质转变的分化一致，类似于原条中的转变(D’Amour等，Nat.Biotechnol 23：1534-41，2005)。

其他报道已述及在内胚层细胞类型由hESC生成过程中使用不同的组蛋白脱乙酰酶抑制剂，丁酸钠(NaB)。相对于我们的方案，在添加激活素A的同时以延长的方式使用组蛋白脱乙酰酶抑制剂(Jiang J.等，干细胞25(8)：1940-53，2007；Hay D.等，PNAS 105(34)：12301-6，2008；和Hay D.等，干细胞26(4)：894-902，2008)。我们发现，以与TSA类似的形式，hpSC的NaB预处理的应用同样增大了衍生自hpSC的DE比例。但是，与激活素A同时施用的NaB或TSA并不造成得自hpSC的DE比例的任何提高。不希望受任何具体理论约束，可能是hpSC与hESC在它们基态染色质结构上有差异，并且在它们对组蛋白脱乙酰酶抑制剂的响应上有差异。

关于hpSC的分化能力知之甚少，因为所有在前公开的资料仅证明其体外和体内的自发性分化能力(Revazova等，Cloning Stem Cells 9(3)：432-49，2007；Revazova等，Cloning Stem Cells 10(1)：11-24，2008；Lin等，Cell Research17：999-1007，2007；Mai等，Cell Research 17：1008-1019，2007)。涉及动物源孤雌生殖干细胞的一些报道提出，孤雌生殖多潜能干细胞能全方面发育，并且能分化成机体的成熟和功能性细胞。由灵长类动物孤雌生殖干细胞生成的多巴胺神经元显示中脑区和细胞特异性转录因子的持久表达，该表达建立起其固有的同一性，并且使其存活；进一步，这些孤雌生殖多巴胺神经元的移植恢复了半侧帕金森病、6-羟基-多巴胺损伤的大鼠的运动功能。此外，活孤雌生殖体小狗产生自通过四倍体胚胎互补体外培养的小鼠孤雌生殖干细胞，该四倍体胚胎互补有助于胎盘发育。

本文提供的数据显示，hpSC可对至少DE方向的直接分化信号作出响应，并生成同种类型分化细胞的富集群。经发现，通过在应用激活素A信号传导前由组蛋白脱乙酰酶抑制剂TSA处理未分化的hpSC促进生成DE。该研究提供了生成治疗可用的定形内胚层系组织相容性细胞如从hpSC生成肝细胞和胰腺内分泌细胞的第一步。

下列实施例意为举例说明但非限制本发明。

实施例1

定形内胚层细胞的生成

下列实施例证实了衍生自LLC-12ph和LLC-6p孤雌生殖细胞系的内胚层样细胞的生成。根据多种培养基方案(D1-激活素A+Wnt3a；D2-激活素A；D3-激活素A；参见下表1-4)生成这些内胚层样细胞。但是，在培养前，使孤雌生殖细胞接触预处理剂(制滴菌素A(TSA))。

表1：phSC培养基

敲除DMEM/F12
	15％KSR
200x NEAA
	100x GlutaMAX^TM-I
1000x 2-巯基乙醇
	4ng/mL bFGF
20ng/ml激活素A
	100×，青霉素-链霉素原液

表2：分化培养基1(D1)

RPMI 1640
	100x GlutaMAX^TM-1
0.5mg/ml HSA
	0.1％人血清
150ng/ml激活素A
	75ng/ml Wnt3a
100×，青霉素-链霉素原液

表3：分化培养基2(D2)

RPMI 1640
	100x GlutaMAX^TM-I
0.5mg/ml HSA
	0.5％人血清
300ng/ml ITS
	150ng/ml激活素A
100×，青霉素-链霉素原液

表4：分化培养基3(D3)

因此，生成定形内胚层细胞的方案如下：(i)向培养基添加100μM制滴菌素A(TSA)(phSC培养基+TSA)和培养细胞约24小时；(ii)在phSC培养基+TSA中培养细胞约24小时；(iii)从培养物中去除TSA(即，在培养基D1中培养细胞约24小时)；(iv)在培养基D2中培养细胞约24小时；和(v)在培养基D3中培养细胞约24小时。

免疫染色显示出孤雌生殖生成的LLC-6p细胞的FoxA2(转录因子)表面标记表达，并且缺少E-钙粘着蛋白——未分化细胞的标记——的表达。事实上，绝大多数细胞表达FoxA2。

衍生自孤雌生殖干细胞系LLC-6p的分化细胞群落的免疫染色显示，Sox17(转录因子)表达是其中一个定形内胚层标记，但Oct4表达则不是，而是未分化细胞的标记。在示例性实验中，多数细胞表达Sox17，仅一个细胞表达Oct4。Oct4阳性细胞在细胞群落中保持小“帽”状。共定位实验证实，多数细胞表达Sox17或Oct4。因此，细胞成为定形内胚层或不分化，即，没有其他细胞类型。

实施例2

人孤雌生殖干细胞在制滴菌素A预处理后生成富集的定形内胚层细胞群

下列实施例示例了人孤雌生殖干细胞(hpSC)直接分化生成富集的定形内胚层群。此外，发现在应用直接分化方案前通过制滴菌素A(TSA)处理未分化的hpSC，显著增大定形内胚层细胞在最终细胞群中的比例。经TSA预处理和未经TSA处理的hpSC进行向定形内胚层的分化证实了：基因表达时序与发生于脊椎动物原肠胚形成过程中的定形内胚层分化期间和hESC向定形内胚层分化的基因表达时序类似。定形内胚层系从hpSC的生成是肝脏和胰腺疾病的基于细胞治疗的发育的关键第一步，例如，起始于hpSC。

细胞培养。将未分化的hpSC和hESC保持在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上、以15％KnockOut血清替代品(Invitrogen)、0.05mM非必需氨基酸(NEAA)(Invitrogen)、2mM Glutamax-I(Invitrogen)、青霉素/链霉素(Invitrogen)、55μM 2-巯基乙醇(Invitrogen)、5ng/ml重组人FGF碱(PeproTech)和20ng/ml重组人激活素A(R&D系统)补充的KnockOut DMEM/F12(Invitrogen)中；对于TSA预处理培养基，以100nM TSA(Sigma)补充24小时。每5-7天将培养物以1∶4-1∶6的分流比进行人工传代。在以Glutamax-I、青霉素/链霉素、0.5mg/ml人血清白蛋白(Sigma)、100ng/ml重组人激活素A、75ng/ml重组鼠Wnt3a(R&D系统)补充的RPMI 1640(Invitrogen)中仅进行分化第一个24小时。随后天的分化培养基是以0.2％人AB血清(FisherBioReagents)和100ng/ml重组人激活素A补充的RPMI 1640。在开始分化前，在DPBS(HyClone)中给予干细胞短暂的洗涤。图1显示了TSA预处理与分化程序和一些关键的定形内胚层分化标记的基因表达一起的示意图。该方案被分成两个阶段：TSA预处理阶段(橙色)和DE分化阶段(绿色)。针对在“-24”小时至“0”小时的时间间隔支持hpSC的多潜能状态的培养条件背景进行TSA预处理。通过应用激活素A信号传导和Wnt3a信号传导和保持培养基中不含TSA，从时间点“0”小时开始分化。列举了各细胞群的几个标记特征。“+”标记表示分化过程中基因表达的动态，不反映准确的标记mRNA/蛋白质的量。

免疫染色。室温下将培养物在4％wt/vol多聚甲醛的PBS中固定20分钟，并且在0.1％Triton X-100的PBS中渗透40分钟。使用下列抗体和稀释液：大鼠抗Sox17，1∶500(D’Amour等，Nat.Biotechnol 23：1534-41，2005)；羊抗短尾基因(AF 2085，R&D系统)，1∶100；兔抗Oct-4(sc-9081，Santa CruzBiotechnology)；鼠抗E-钙粘着蛋白(13-700，Invitrogen)，1∶100；抗小鼠、羊、大鼠和兔的Alexa-488和Alexa-546结合驴抗体(Invitrogen)，1∶1000。载玻片放在含有DAPI的Vectashield封固剂(Vector Laboratories)中。

实时定量PCR。样本收集、逆转录和实时PCR反应如前述(D’Amour等，Nat.Biotechnol 23：1534-41.2005)。

流式细胞计量术。使用TrypLE(Invitrogen)解离细胞5分钟，然后离心并再次悬浮于3％FBS的PBS(缓冲液)中。在室温下用CXCR4-PE(555976，BD Biosciences)以10μl每1×10⁶细胞进行标记30分钟。将细胞在缓冲液中洗涤，并再次悬浮于1％wt/vol多聚甲醛中。在Beckton Dickinson FACS Caliber上获得流式细胞计量术数据，并利用FACSDiva软件(BD Bioscience)进行分析。

TSA预处理增大了定形内胚层的比例。前述方案(D’Amour等，NatBiotechnol 23：1534-41，2005；和D’Amour等，Nat Biotechnol 24：1392-401，2006)后，应用3天含有激活素A的低血清条件处理，使hpSC分化成定形内胚层(DE)。此外，对第一个24小时的分化添加Wnt3a，从而使hpSC分化同步开始和提高中内胚层的特化。利用该方法，观察到与脊椎动物定形内胚层——包括SOX17和CXCR4——有关的基因表达，并且CER1的表达表明生成了前特征DE。(图2)。观察到在第24小时短尾基因表达的短暂增加，表明转变经过中内胚层中间态。而3天后，部分hpSC已分化成表达SOX17的DE，并且也观察到保持表达多潜能性标记OCT4而不表达SOX17的显著细胞群。在72小时分化后，应用分化条件前，SOX17免疫反应性细胞在TSA处理的hpSC培养物中最多。进行相同的分化程序后，未经处理的hpSC培养物中SOX17+细胞的相对比例小于OCT4免疫反应性细胞。

图2显示通过实时定量PCR测定的hpSC分化成定形内胚层过程中标记基因表达的时间动态图。通过激活素A和Wnt3a处理hpSC，引起短尾基因(BRACH)——在第24小时原条表达的基因——的峰表达。SOX17、CER1和CXCR4的表达在第72小时达到最大值；0h，分化方案开始前的多潜能hpSC。Y轴表示相对于0h时间点标准化的相对基因表达。

为提高定形内胚层的生成效力和减少残留OCT4阳性细胞量，检测数种不同的调控hpSC对分化刺激作出响应的能力的方法。发现用TSA处理hpSC24小时显著增大表达SOX17的定形内胚层的比例。通过SOX17免疫定位显示以TSA预处理或未经TSA预处理生成的hpSC衍生定形内胚层的相对比例。分化72小时后，衍生自用TSA预处理的hpSC的SOX17阳性细胞的比例大于70％。此外，通过对细胞表面趋化因子受体CXCR4进行流式细胞计量，定量定形内胚层细胞的部分。相对于未经处理的hpSC——其总是在分化3天后生成低于45％的CXCR4阳性细胞，TSA预处理的hpSC显示向定形内胚层的分化大幅提高，如由CXCR4阳性细胞比例高达70％所证明。

hpSC通过原条中间态分化成定形内胚层。据观察，未分化hpSC的TSA预处理导致一些细胞死亡和细胞形态改变。但是，多潜能性基因OCT4和SOX2的表达没有发生显著改变，与DE有关的基因包括——CER1、SOX17和CXCR4——的表达也没有发生显著改变，同时我们确实观察到短尾基因的表达略微上调(图3A、3B)。通过添加激活素A和Wnt3a使显著的分化开始，刺激短尾基因表达的迅速诱导，同时SOX2和OCT4的基因表达减少(图3A、3B)。此外，TSA预处理的hpSC相比起未经TSA预处理的培养物显示出在第24小时短尾基因表达的较高峰水平和在第48小时表达减少的锐利动力学(图3B)。CER1和SOX17转录体也呈现在第一个24小时期间表达迅速增加，而CXCR4的表达延长到另一个24小时，并且这些DE标记的表达保持，直到第3天，此时不再检测到短尾基因(图3A)。前述证明，hESC向DE的分化进行经过了在原肠胚形成过程中发生的过程回顾，在该原肠胚形成过程中，hESC经过了与短尾基因表达起始同步的上皮至间质的转变，并且SOX17阳性细胞从短尾基因阳性前体衍生。为追溯hpSC分化过程中表达SOX17的细胞的来源，随时间表征SOX17和短尾基因的免疫反应性。在第24小时，群落外围没有SOX17阳性细胞，但有大量短尾基因阳性核。但是，到分化第48小时，多于一半表达SOX17的细胞也具有短尾基因免疫反应性，在第72小时，多数细胞表达SOX17，而短尾基因蛋白质不再可测。此外，到分化开始后第24小时，我们观察到E-钙粘着蛋白的细胞表面免疫定位尤其在群落外围减少，在此观察到短尾基因阳性细胞。具体地，分化培养物的免疫荧光标记表明SOX17与短尾基因(BRACH)共表达。在TSA预处理后分化方案开始前(0h)对于SOX17和短尾基因没有可测的免疫反应性。因此，在TSA预处理的hpSC分化成定形内胚层的过程中，中内胚层的基因表达和E-钙粘着蛋白表达及定位的动力学类似于hESC分化过程中存在的动力学。

图3显示了通过实时定量PCR测定的TSA预处理的hpSC分化成定形内胚层的过程中标记基因表达的时间动态图。图3A表明hpSC的TSA预处理没有造成多潜能性基因OCT4、SOX2及分化阶段标记CER1、SOX17、CXCR4的表达显著改变(-24h，TSA处理前；0h，TSA预处理后分化方案开始前)。分化条件的应用造成SOX2和OCT4被抑制，同时SOX17、CER1和CXCR4表达被激活，在第72小时达到最大值。(Y轴表示相对于0h时间点标准化的相对基因表达)。图3B表明TSA预处理的hpSC相对于未经TSA处理的培养物(-TSA)显示在第24小时较高水平的短尾基因(BRACH)表达，以及在第48小时短尾基因mRNA消失的锐利动力学(+TSA)。(-24h，TSA处理前；0h，TSA预处理后，分化方案开始前。Y轴表示相对于0h时间点标准化的相对基因表达)

TSA预处理提高了定形内胚层从多hpSC系生成的效力。本TSA预处理程序与所述分化方案一起被用于四种人孤雌生殖干细胞系：phESC-1、phESC-3、phESC-5(Revazova等，Cloning Stem Cells 9(3)：432-49，2007)和hpSC-Hhom-1(Revazova等，Cloning Stem Cells 10(1)：11-24，2008)；迄今全部所示数据是应用phESC-3系生成的。对于全部4种所测系，TSA预处理程序的应用使定形内胚层细胞数比未经预处理的培养物增大1.4-1.8倍，如通过利用流式细胞计量术进行CXCR4阳性细胞定量测定的。此外，在所有经TSA预处理的hpSC系分化成定形内胚层的过程中基因表达的动力学表明，细胞经过相同的发育适当的中间态进行转变，并且表达适当的定形内胚层的合适标记。

虽然本发明参考上述实施例进行了说明，但要理解的是，修改和变化包括在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅由所附权利要求限定。

Claims

1.生成定形内胚层、中胚层、外胚层或内胚层细胞的方法，包括：

a)在剂的存在下培养干细胞，其中所述剂改变细胞的外遗传状态；和

b)其后，在所述剂不存在的情况下培养所述干细胞，

从而生成定形内胚层、中胚层、外胚层或内胚层细胞。

2.权利要求1所述的方法，其中所述改变细胞的外遗传状态的剂选自脱甲基化剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂及其组合。

3.权利要求2所述的方法，其中所述组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂选自制滴菌素A、伏立诺他(SAHA)、belinostat(PXD101)、LAQ824/LBH589、trapoxin B、entinostat(MS-275)、CI994、mocetinostat(MGCD0103)、丁酸苯酯、丙戊酸、异戊酸酯、戊酸酯、丙戊酸酯、烟酰胺、二氢香豆素、萘并吡喃酮和2-羟基萘甲醛、apicidin、FK228及丁酸钠。

4.权利要求3所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是制滴菌素A(TSA)。

5.权利要求1所述的方法，其中所述脱甲基化剂是5-氮杂胞苷或5-氮-2’-脱氧胞苷。

6.权利要求1所述的方法，其中所述干细胞选自胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、诱导的多潜能干细胞和成体干细胞。

7.权利要求6所述的方法，其中所述干细胞是孤雌生殖干细胞或诱导的多潜能干细胞。

8.权利要求6所述的方法，其中所述干细胞是孤雌生殖干细胞。

9.权利要求1所述的方法，其中所述在所述剂不存在的情况下培养所述干细胞发生在激活素A、Wnt3a或其组合存在的情况下。

10.权利要求4所述的方法，其中所述TSA以约1nM至约1μM的浓度存在。

11.权利要求1所述的方法，其中所述在所述剂的存在下的培养发生约24小时。

12.权利要求1所述的方法，其中所述在所述剂不存在的情况下的培养发生约6-72小时。

13.权利要求8所述的方法，其中所述孤雌生殖细胞是LLC-6p、LLC-12ph、LLC-2p或LLC-15ph细胞。

14.权利要求1所述的方法，其中所述定形内胚层细胞表达选自FoxA2、Sox17、CXCR4、短尾基因和CER1的一种或多种标记。

15.权利要求1所述的方法，其中所述定形内胚层细胞与未经处理的干细胞相比不表达E-钙粘着蛋白、Oct4或二者或其表达水平降低。

16.权利要求1所述的方法，其中所述培养步骤在确定成分培养基条件下进行。

17.权利要求1所述的方法，其中生成了定形内胚层细胞。

18.权利要求17所述的方法，其中所述定形内胚层细胞经进一步处理形成胃肠道、呼吸道或内分泌系统的细胞。

19.权利要求17所述的方法，其中所述定形内胚层细胞经进一步处理形成肝细胞或胰腺细胞。

20.定形内胚层细胞培养物，由权利要求1所述的方法生成。

21.肝细胞或胰腺细胞培养物，由权利要求19所述的方法生成。