CN102906248A - 改变细胞分化状态的方法及其组合物 - Google Patents
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- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
Abstract
本发明提供利用创新的编码转录因子的蛋白质表达构建物改变细胞分化状态的方法。本文所述的方法和组合物可用于生成诱导多潜能干（iPS）细胞，和使多种外遗传状态的细胞分化、转分化或去分化。本方法包括将核酸构建物或其表达产物引入细胞，和在使细胞有效转化成为多潜能细胞，增强多潜能状态保持力或使细胞有效转化成为相应于内胚层、中胚层或外胚层的细胞系的细胞的培养条件下培养细胞。
Description
发明背景
发明领域
本发明一般涉及干细胞，更具体地涉及改变细胞分化状态的方法和组合物，以及由其生成的细胞。
背景信息
在胚胎发育期间，机体组织由三个主要细胞群形成：外胚层、中胚层和内胚层。这些细胞群，也被称为主要的生殖细胞层，通过被称为原肠胚形成的过程形成。在原肠胚形成后，各主要生殖细胞层生成细胞群和组织的特定组。例如，中胚层生成血液细胞、内皮细胞、心肌和骨骼肌和脂肪细胞；内胚层生成肝、胰和肺；以及外胚层生成神经系统、皮肤和肾上腺组织。
人胚胎干（hES）细胞是可分化成多种细胞类型的多潜能细胞。当被注入免疫缺陷型小鼠时，胚胎干细胞形成分化的肿瘤（畸胎瘤）。但是，经体外诱导形成胚状体（EBs）的胚胎干细胞提供胚胎干细胞系的来源，该胚胎干细胞系能够在特定生长条件下分化出具有几种组织的特性的多种细胞类型。已知多种方法用于鼠体细胞和人体细胞程序重排成多潜能干细胞——被称为诱导多潜能干（iPS）细胞。在程序重排后，可开始将iPS细胞分化成特定组织类型。
多种干细胞类型及其后代适于程序重排、分化、去分化和转分化，并且是正常人细胞的重要来源，用于治疗性移植——如肝细胞，和用于药物测试和开发。这样的目标需要足够的细胞分化成适于患者需要或适当的药理学测试的组织类型。与此相关，需要有效和可信赖的改变细胞分化状态的方法，如通过程序重排、分化、去分化和转分化细胞。本文提供了这种方法，能够产生同一分化状态的高度富集的细胞群。
发明概述
本发明基于创新的方法和核酸构建物的原始发现，其用于改变细胞分化状态，如程序重排细胞以生成诱导多潜能干（iPS）细胞，和使多种分化状态下的细胞发生分化、转分化或去分化。
因此，本发明提供使目标或受体细胞程序重排、分化、转分化或去分化成不同细胞类型的细胞或者多潜能或分化程度较低的细胞的方法。本方法包括在使细胞转化成多潜能细胞或相应于内胚层、中胚层或外胚层的细胞系的细胞的培养条件下，将核酸构建物或其表达产物引入细胞和培养物。
在多个方面中，本方法利用编码表达盒（cassette）的核酸构建物，该表达盒包括处于可操作连接中的：i）至少一种蛋白质标记；ii）蛋白质转导结构域；iii）融合结构域；iv）核定位信号；和v）至少一种转录因子。因此，本发明进一步提供核酸构建物。
在一个实施方式中，构建物的转录因子是分化或转分化中涉及的核程序重排因子或转录因子。在多个方面，转录因子由SOX族基因、KLF族基因、MYC族基因、SALL4、OCT4、NANOG、LIN28或其组合如OCT4、SOX2、KLF4、NANOG或c-MYC编码。在相关方面，转录因子由如下基因编码：包括OCT4、NANOG、SOX2、SOX17、HNF4、GATA4、HHEX、CEBPβ、CEBPδ、PRDM16、MYOD1、NKX2.5、MEF2c、MYOCARDIN、RUNX2、PDX、NGN、SALL4或SOX9、或其组合，如Oct4、NANOG、Sox2、Sox9、Sox17、HNF4α2、HNF4α4、HNF4α7、HNF4α8、HNF4γ、GATA4、Hhex、CEBPβ、CEBPδ、PRDM16、MyoD1、NKX2.5、Mef2c、心肌素、Runx2-I、Pdx1、Ngn3、Sall4或Runx2-II。
在多个方面，核酸构建物编码至少一种蛋白质标记，如聚(His)、血细胞凝集素（HA）表位、myc表位、几丁质结合蛋白（CBP）、麦芽糖结合蛋白（MBP）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、钙调蛋白结合肽、生物素羧基载体蛋白（BCCP）、FLAG八肽、nus、绿色荧光蛋白（GFP）、硫氧还蛋白（TRX）、聚(NANP)、V5、S-蛋白、链霉抗生物素蛋白、SBP、聚(Arg)、DsbA、c-myc-标记、HAT、纤维素结合结构域、softag1、softag3、小泛蛋白样改造剂（SUMO）、泛蛋白（Ub）、或其组合。在一个实施方式中，核酸构建物编码至少两种蛋白质标记，如亲和标记和表位标记。在相关实施方式中，该至少两种蛋白质标记包括聚(His)标记和血细胞凝集素（HA）表位标记。
在多个方面中，核酸构建物编码融合结构域。在一个实施方式中，融合结构域包括流感血凝素融合肽或其片段。
在相关方面，核酸构建物编码蛋白质转导结构域。在一个实施方式中，蛋白质转导结构域包括TAT蛋白、VP22蛋白、果蝇触角足（Antennapedia，Antp）同源异型转录因子、或其片段。
一方面，核酸构建物编码处于可操作连接中的转录因子、聚(His)标记、血细胞凝集素（HA）标记、TAT蛋白、流感血凝素融合肽和核定位信号（NLS）。在多个实施方式中，各元件被1至10个氨基酸隔开。在示例性实施方式中，各元件间隔至少2个氨基酸，如甘氨酸，以允许各元件自由旋转，而与各单独元件无关。
在多个方面，目标或受体细胞在核酸构建物或其表达产物被引入细胞前可以是未分化、部分分化或完全分化的。在相关方面，目标或受体细胞可以是胚胎干（ES）细胞、多潜能干（PS）细胞、诱导多潜能干（iPS）细胞、单性生殖干细胞、多能性干细胞、双能干细胞、间充质干细胞、内胚层干细胞、外胚层干细胞、体干细胞或体细胞。
另一方面，核酸构建物编码至少一种另外的表达盒，其均包括处于可操作连接中的：i）至少一种蛋白质标记；ii）蛋白质转导结构域；iii）融合结构域；iv）核定位信号；和v）至少一种转录因子。因此，多种转录因子可由单个核酸构建物表达。类似地，为允许表达多于一种转录因子，至少一种另外的核酸构建物或其表达产物如本文所述可被引入细胞。
另一方面，本发明提供表达载体，其包含本发明的核酸构建物。
另一方面，本发明提供分离的蛋白质，其由本发明的核酸构建物编码。核酸构建物的表达生成嵌合蛋白质，其包括融合于至少一种蛋白质标记的转录因子、蛋白质转导结构域、融合结构域和NLS，各元件处于任何顺序。
另一方面，本发明提供生成诱导多潜能干细胞（iPS）的方法，该诱导多潜能干细胞的功效程度高于原始未改变的转录因子。本方法包括利用多种嵌合蛋白质使体细胞程序重排成iPS细胞，该嵌合蛋白质包括融合于至少一种蛋白质标记的转录因子、蛋白质转导结构域、融合结构域和NLS，各元件处于任何顺序。
另一方面，本发明提供增强多潜能干细胞的多潜能性的保持力的方法，该多潜能干细胞包括胚胎干细胞或单性生殖干细胞。本方法包括利用多种嵌合蛋白质使所述多潜能干细胞培养物中存在的分化细胞程序重排成为多潜能干细胞，该嵌合蛋白质包括融合于至少一种蛋白质标记的转录因子、蛋白质转导结构域、融合结构域和NLS，各元件处于任何顺序。
另一方面，本发明提供引导多能性干细胞或多潜能干细胞（包括胚胎干细胞、单性生殖干细胞或诱导多潜能干细胞）分化成目标终点（fate）的方法。本方法包括利用多种嵌合蛋白质使在胚状体形成期间生成的不需要的分化细胞程序重排，该嵌合蛋白质包括融合于至少一种蛋白质标记的转录因子、蛋白质转导结构域、融合结构域和NLS，各元件处于任何顺序。
还有另一方面，本发明提供利用由本文所述方法得到的细胞治疗个体的方法，其中最初生成iPS细胞，随后其分化成特定细胞类型。本方法包括从个体得到体细胞；利用本发明的方法使体细胞程序重排成为诱导多潜能干（iPS）细胞；体外培养诱导多潜能干（iPS）细胞，以使细胞分化成期望的适于治疗病症（状况，condition）的细胞类型；和将分化细胞引入个体，从而治疗病症。
在相关方面，本发明提供利用由本文所述方法得到的细胞治疗个体的方法，其中iPS细胞不最初生成和随后分化。本方法包括使细胞接触本发明的核酸构建物或其表达产物，培养细胞以使细胞分化、转分化或去分化成为期望的适于治疗病症的细胞类型；和将培养的细胞引入个体，从而治疗病症。
附图简述
图1是生成重组蛋白质的两阶段PCR反应的示意图，该重组蛋白质包括本发明一个实施方式所述的羧基端结构域，该羧基端结构域包括第一蛋白质标记（表位血细胞凝集素标记（HA））、转导结构域（TAT）、第二蛋白质标记（聚(His)标记）、融合结构域（流感血凝素融合肽）和核定位序列（NLS，以使蛋白质靶向核），完整的结构域被称为HATHFUN。部分HATHFUN引物序列显示为SEQ ID NO：43（第一PCR反应，5’至3’）和SEQ ID NO：44（第二PCR反应，5’至3’）。
发明详述
本发明提供利用创新的编码转录因子的蛋白质表达构建物改变细胞分化状态的方法。本文所述的方法和组合物可用于生成诱导多潜能干（iPS）细胞，和使多种外遗传状态下的细胞发生分化、转分化或去分化。本方法包括将核酸构建物或其表达产物引入细胞，和在将细胞转化成多潜能细胞或相应于内胚层、中胚层或外胚层的细胞系的细胞的培养条件下培养细胞。
在描述本组合物、方法和培养方法前，要理解的是，本发明不限于所述具体组合物、方法和实验条件，因此，这样的组合物、方法和条件可改变。还要理解的是，在此所用的术语其目的仅为描述具体实施方式，而非意为限制，因为本发明的范围将仅限于所附权利要求。
如本说明书和所附权利要求所用，除非上下文明确另外表示，单数形式“一（a）”、“一（an）”和“该（the）”包括复数参考。因此，例如，“方法”的参考包括一种或多种方法和/或本文所述的类型步骤，在阅读本公开等时其对于本领域技术人员是显而易见的。
除非另外限定，本文所用的所有技术和科学术语均与本发明所述领域的技术人员的常规理解具有相同含义。任何类似或等同于本文所述的方法和材料均可用于本发明的实践或测试，因为要被理解的是，修正和改动被包括在本公开的精神和范围内。在此将本文述及的所有出版物的全部内容引入作为参考。
细胞分化是特化较低的细胞变成特化较高的细胞类型的过程，通常伴有细胞特性如细胞尺寸、形状、膜电位、代谢活性和信号响应性的显著改变。这些改变很大程度上源于基因表达中高度受控的改变。因此，细胞分化是细胞从一种细胞类型转变为另一种细胞类型，并且一般涉及一种基因表达图谱转变为另一种基因表达图谱。
因此，本发明提供利用创新的编码转录因子的蛋白质表达构建物改变细胞分化状态的方法，在细胞中表达或引入编码的蛋白质改变了细胞的分化状态。本发明的蛋白质表达构建物提供使目标或受体细胞程序重排、分化、转分化或去分化成为不同细胞类型的细胞或者多潜能或分化程度较低的细胞的方法。本方法包括将核酸构建物引入细胞或其表达产物，例如，嵌合蛋白质；和在使细胞转化成为多潜能细胞或相应于内胚层、中胚层或外胚层的细胞系的细胞的培养条件下进行培养。
如本文所述，本发明的多个方面涉及在体外导致一种分化状态的细胞转化另一种分化状态的细胞的方法。该方法包括以限定和时间确定的方式应用培养和生长因子条件。在多个实施方式中，本发明的方法生成这样的细胞群：其中10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的细胞具有改变的分化状态。例如，本发明提供这样的细胞群：其中培养物中约50-99%、60-99%、70-99%、75-99%、80-99%、85-99%、90-99%或95-99%的细胞具有相似的分化状态。通过自细胞群中其他细胞分离和/或纯化改变的细胞—例如通过利用本领域已知的特异性地结合特定细胞类型的试剂，可实现特定细胞类型的细胞群的进一步富集。
对核酸构建物已被引入的细胞的培养可在另外的可用于生成特定细胞类型的成熟或生长因子的存在下进行。例如，自人胚胎干细胞的分化可通过向干细胞培养物提供TGFβ超家族的生长因子如结节/激活蛋白或BMP亚组蛋白而得到协助。另外的生长因子，如Wnt3a及其他Wnt家族成员，可用于培养基。虽然任何其他剂或生长因子也可被加入培养基，但在示例性方面中，成熟或生长因子是结节、bFGF、激活蛋白A、激活蛋白B、BMP4，Wnt3a、制瘤素M、胆汁盐及其组合。
在多个方面，本方法利用编码表达盒的核酸构建物，该表达盒包括处于可操作连接中的：i）至少一种蛋白质标记；ii）蛋白质转导结构域；iii）融合结构域；iv）NLS；和v）至少一种转录因子。因此，本发明提供核酸构建物。
此外，本发明提供核酸构建物的表达产物——嵌合蛋白质。嵌合蛋白质包括i）至少一种蛋白质标记；ii）蛋白质转导结构域；iii）融合结构域；iv）NLS；和v）至少一种转录因子。
如本文所用，术语“可操作地连接（operatively linked）”或“可操作连接（operable linkage）”意为两个或更多个分子相对于彼此定位，使得其充当单个单位并产生可归因于一分子或两分子或其组合的作用。例如，编码基因的多核苷酸可以可操作地连接于转录或翻译调节元件，在这种情况下，该元件赋予其对多核苷酸的调节作用，这类似于如下方式：其中调节元件将对其在细胞中通常关联的多核苷酸序列产生作用。
术语“多核苷酸”或“核苷酸序列”或“核酸分子”在本文中宽泛地用于表示通过磷酸二酯键连接在一起的两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的序列。因此，该术语包括RNA和DNA，其可以是基因或其部分、cDNA、合成多脱氧核糖核酸序列或类似物，并可以是单链或双链以及DNA/RNA杂化物（杂交体，hybrid）。此外，该术语如本文所用包括可自细胞分离的天然存在的核酸分子和可——例如，通过化学合成法或酶法如聚合酶链式反应（PCR）的方法制备的合成多核苷酸。应当理解的是，不同的术语仅以便于讨论为目的使用，以区分例如组合物的不同组分。
总体上，核苷酸——包括多核苷酸——是天然存在的脱氧核糖核苷酸，如连接于2'-脱氧核糖的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶，或核糖核苷酸，如连接于核糖的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶。但是，取决于用途，多核苷酸还可包含核苷酸类似物，包括非天然存在的合成的核苷酸或经修饰的天然存在的核苷酸。核苷酸类似物在本领域公知并可商业获得，如包含这种核苷酸类似物的多核苷酸。多核苷酸中连接核苷酸的共价键通常是磷酸二酯键。但是，取决于多核苷酸的用途，共价键还可以是多种其他键中的任一种，包括硫二酯键、硫代磷酸酯键、肽样键或任何其他本领域技术人员已知可用于连接核苷酸以生成合成的多核苷酸的键。
包含天然存在的核苷酸和磷酸二酯键的多核苷酸可化学合成或可应用重组DNA法、用适当的多核苷酸作为模板生成。相比之下，包含核苷酸类似物或除磷酸二酯键外的共价键的多核苷酸通常被化学合成，尽管酶如T7聚合酶可使某些类型的核苷酸类似物掺入多核苷酸，因此，可用于由适当的模板重组生成这样的多核苷酸。
本文所用术语“核酸构建物”或"重组核酸分子"指人为干预制备的多核苷酸。重组核酸分子可包含以产物在自然界的细胞中找不到的方式连接的两个或更多个核苷酸序列。具体地，两个或更多个核苷酸序列可被可操作地连接，如编码转录因子的基因和一个或多个蛋白质标记、功能结构域及类似物。
在多个方面，核酸构建物编码至少一种蛋白质标记。多种蛋白质标记在本领域已知，如表位标记、亲和标记、溶解性增强标记及类似标记。亲和标记是最常用的有助于蛋白质纯化的标记，而表位标记有助于蛋白质识别。本领域技术人员将理解，一些标记可用作多于一种标记类型。例如，聚(His)标记可充当表位标记和亲和标记。可用于本发明的不同标记的实例包括聚(His)、血细胞凝集素（HA）表位、myc表位、几丁质结合蛋白（CBP）、麦芽糖结合蛋白（MBP）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、钙调蛋白结合肽、生物素羧基载体蛋白（BCCP）、FLAG八肽、nus、绿色荧光蛋白（GFP）、硫氧还蛋白（TRX）、聚(NANP)、V5、S-蛋白、链霉抗生物素蛋白、SBP、聚(Arg)、DsbA、c-myc-标记、HAT、纤维素结合结构域、softag1、softag3、小泛蛋白样改造剂（SUMO）、泛蛋白（Ub）、或其组合。在一个实施方式中，核酸构建物编码至少两种蛋白质标记，如亲和标记和表位标记。在相关实施方式中，至少两种蛋白质标记包括聚(His)标记和血细胞凝集素（HA）表位标记。
如本文所用，聚(His)标记是包括至少5个组氨酸残基的氨基酸基序，一般在蛋白质的N端或C端。例如，聚(His)标记可包括约5、6、7、8、9、10或更多个连续的组氨酸残基。
本发明的核酸构建物可被引入所要改造的细胞，因此允许嵌合蛋白质在细胞中表达。多种方法在本领域已知，并适于将核酸引入细胞，包括病毒和非病毒介导的技术。一般的非病毒介导技术的实例包括但不限于，电穿孔、磷酸钙介导转移、核转染、声孔（sonoporation）、热激、磁转染、脂质体介导转移、微注射、微喷射介导转移（纳米粒子）、阳离子聚合物介导转移（DEAE-葡聚糖、聚乙烯亚胺、聚乙二醇（PEG）及类似物）或细胞融合。其他转染方法包括专有的转染试剂，如LipofectamineTM、Doindo HilymaxTM、FugeneTM、jetPEITM、EffecteneTM和DreamFectTM。
可选地，嵌合蛋白质可通过在包括转化有包含核酸构建物的表达载体的细菌细胞的适当细菌表达系统中表达而生成。然后在培养中使嵌合蛋白质接触所要改造的细胞，嵌合蛋白质通过蛋白质转导结构域而能够进入细胞。几种蛋白质和小型肽具有转导或运输通过生物膜的能力，这与经典受体-或内吞作用-介导的途径无关。这些蛋白质的实例包括HIV-1TAT蛋白、单纯疱疹病毒1（HSV-1）DNA-结合蛋白VP22和果蝇触角足（Antp）同源异型转录因子。源自这些蛋白质的小型蛋白质转导结构域（PTDs）可被合并到本发明的嵌合蛋白质中，从而成功将蛋白质运送到细胞。在示例性实施方式中，核酸构建物编码蛋白质转导结构域，该蛋白质转导结构域是TAT蛋白、VP22蛋白、果蝇触角足（Antp）同源异型转录因子或其片段。在示例性实施方式中，核酸构建物编码蛋白质转导结构域，该蛋白质转导结构域具有如下氨基酸序列：
YGRKKRRQRRR（SEQ ID NO：1）。
为有助于蛋白质转导结构域在促进蛋白质进入细胞中的效力，核酸构建物可另外编码融合结构域。多种可用于本发明的合成和天然存在的融合结构域在本领域已知。在示例性实施方式中，融合结构域包括流感血凝素融合肽或其片段。在示例性实施方式中，核酸构建物编码具有如下氨基酸序列的融合结构域：
GLFGAIAGFIENGWEGMIDG（SEQ ID NO：2）。
本发明的核酸构建物进一步包括核定位序列（NLS），其用于将嵌合蛋白质导向细胞核。本领域已知的任何NLS序列可用于本发明。在示例性实施方式中，核酸构建物编码具有如下氨基酸序列的NLS：
KKKRKV（SEQ ID NO：3）。
蛋白质标记、蛋白质转导结构域、融合结构域和NLS可被编码在核酸构建物任何位置和处于任何顺序，只要各元件和转录因子在生成嵌合蛋白质后具有功能性。一般，蛋白质标记、蛋白质转导结构域、融合结构域和NLS被编码在转录因子的下游，以使其排列在嵌合蛋白质的羧基端。
在一个实施方式中，核酸构建物编码处于可操作连接中的：转录因子、聚(His)标记、血细胞凝集素（HA）标记、TAT蛋白或其片段、流感血凝素融合肽或其片段和NLS。在多个实施方式中，各元件被1至10个氨基酸隔开。在示例性实施方式中，各元件间隔2个氨基酸，如甘氨酸，从而允许各元件自由旋转，而与其他各元件无关。在示例性实施方式中，由核酸构建物编码的嵌合蛋白质包括转录因子和包含聚(His)标记、血细胞凝集素（HA）标记、TAT蛋白或其片段、流感血凝素融合肽或其片段和NLS的结构域，该结构域具有如下氨基酸序列：
YPYDVPDYAGGKKKRKVGGYGRKKRRQRRRGGHHHHHHGGGLFGAIAGFIENGWEGMIDG（SEQ ID NO：4）。
在多个方面，编码本发明的表达盒的核酸构建物进一步包括一个或多个启动子。如本文所用，启动子意为能够促进与启动子处于可操作连接中的基因的转录的多核苷酸序列。几种类型的启动子在本领域公知，并适用于本发明，例如组成型启动子，其允许在哺乳动物细胞中不受调控的表达，如巨细胞病毒（CMV）启动子。
可选地，核酸可包括一个或多个可诱导的启动子。可诱导的启动子是这样的启动子：在诱导剂（如化学剂和/或生物剂）不存在的情况下不引导可操作地连接的基因（包括cDNA）表达或引导其低水平表达，而响应于诱导剂，其引导表达的能力增强。示例性可诱导的启动子包括，例如，响应于重金属、热激、激素的启动子和响应于化学剂如葡萄糖、乳糖、半乳糖或抗生素的启动子。
克隆技术的进展允许生成本发明的核酸构建物和载体。例如，InvitrogenInc.开发的
克隆技术能够将多种多核苷酸片段定向和插入到目标载体中。
在本发明多个方面，编码转录因子、被称为核程序重排因子、能够诱导多潜能性的基因被用于使分化的或不完全分化的细胞程序重排成为比原细胞更原始的表型，如iPS细胞的表型。在通过本发明的核酸构建物或通过使宿主细胞引入或接触本发明所述包含核程序重排因子的嵌合蛋白质在宿主细胞中表达一个或多个这种因子后，这种因子能够由分化细胞如体细胞生成iPS细胞。如本文所用，诱导多潜能性或核程序重排因子的基因意指与多潜能性相关并且能够由体细胞生成分化程度较低的细胞如iPS细胞的基因或因子。多潜能基因的表达一般限于多潜能干细胞，并且对于多潜能干细胞的功能一致性是非常重要的。
如本文所用，“多潜能细胞”指可在体外长期——理论上无限期——保持未分化状态、可引起不同的分化组织类型，即外胚层、中胚层和内胚层的细胞。细胞的多潜能状态优选通过培养内细胞团或得自胚胎内细胞团的细胞保持，该细胞在适当条件下通过雄核发育法或雌核发育法生成——例如，通过在包含白血病抑制因子（LIF）的成纤维细胞饲养层（feeder layer）或另一饲养层或培养物上培养。这种培养细胞的多潜能状态可通过多种方法确定，例如，（i）确定表示多潜能细胞特性的标记物的表达；（ii）生成嵌合动物，其包含表达多潜能细胞基因型的细胞；（iii）将细胞注入动物，例如，SCID小鼠，并且在体内生成不同的分化细胞类型；和（iv）观察细胞在体外分化（例如，在饲养层或LIF不存在的情况下培养）成为胚状体及其他分化的细胞类型。
几种基因已被发现与多潜能性有关，并适用于本发明。这种基因在本领域已知，包括，例如，SOX家族基因（SOX1、SOX2、SOX3、SOX15、SOX18）、KLF家族基因（KLF1、KLF2、KLF4、KLF5）、MYC家族基因（C-MYC、L-MYC、N-MYC）、SALL4、OCT4、NANOG、LIN28及其组合。虽然在一些实例中，仅用一种基因诱导多潜能性可以是可能的，但总体上，需要多于一种基因表达以诱导多潜能性。例如，可采用两种、三种、四种或更多种基因。在示例性方面，采用一种或多种编码下列核程序重排因子的基因：OCT4、SOX2、KLF4、NANOG和c-MYC。
如本文所用，程序重排，意指改变或逆转部分或末期分化的体细胞的分化状态的过程。体细胞的程序重排可以是部分或完全逆转体细胞的分化状态。在示例性方面，程序重排是完全的，其中体细胞经程序重排成为诱导多潜能干细胞。但是，程序重排可以是部分的，如逆转成为任何分化程度较低的状态。例如，逆转末期分化的细胞成为分化程度较低状态的细胞，如多能性细胞。
可被程序重排的体细胞可以是原代细胞或无限增殖化细胞。这种细胞可以是原代细胞（非无限增殖化细胞），如刚从动物分离或可得自细胞系（无限增殖化细胞）的细胞。在示例性方面，体细胞是哺乳动物细胞，如，例如，人细胞或鼠细胞。其可通过公知的方法得自不同的器官，如，但不限于皮肤、肺、胰、肝、胃、肠、心脏、生殖器官、膀胱、肾、尿道及其他泌尿器官，或通常得自任何包含活的体细胞的器官或组织，或得自血液细胞。可用于本发明的哺乳动物体细胞包括，例如，成年干细胞、塞尔托利细胞、内皮细胞、粒层上皮细胞（包括视网膜色素上皮细胞）、神经元、胰岛细胞、表皮细胞、上皮细胞、肝细胞、毛囊细胞、角质化细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞（B和T淋巴细胞）、红细胞、巨噬细胞、单核细胞（monocyte）、单核细胞（mononuclear cells）、成纤维细胞、脂肪细胞（棕色和白色）、心肌细胞、其他已知肌细胞和通常任何活的体细胞。在具体实施方式中，应用成纤维细胞。术语体细胞，如本文所用，还意图包括成年干细胞。成年干细胞是能够生成特定组织的所有细胞类型或几种细胞类型的细胞。示例性成年干细胞包括造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞。
因此，本发明进一步提供利用本文所述方法生成的iPS细胞以及这种细胞的细胞群。本发明所述能够分化为多种细胞类型的程序重排细胞具有多种应用和治疗用途。干细胞的基本性质——无限自我更新的能力和分化成为机体各种细胞类型的能力——使其理想用于治疗用途。
此外，除生成iPS细胞外，本发明的方法和组合物可经分化、转分化和去分化用于生成多种其他细胞类型。在多个方面，编码可用于程序重排、分化、去分化或转分化细胞的转录因子的其他基因包括OCT4、NANOG、SOX2、SOX17、HNF4、GATA4、HHEX、CEBPβ、、CEBPδ、PRDM16、MYOD1、NKX2.5、MEF2c、MYOCARDIN、RUNX2、PDX、NGN、SALL4或SOX9或其组合。编码的转录因子包括Oct4、NANOG、Sox2、Sox9、Sox17、HNF4α2、HNF4α4、HNF4α7、HNF4α8、HNF4γ、GATA4、Hhex、CEBPβ、CEBPδ、PRDM16、MyoD1、Nkx2.5、Mef2c、心肌素（Myocardin）、Runx2-I、Pdx1、Ngn3、Sall4或Runx2-II。例如，中胚层或成纤维细胞分化成为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞和肌细胞可利用嵌合蛋白质进行，该嵌合蛋白质包括下列转录因子：CEBPβ/CEBPδ（脂肪细胞）、Sox9（软骨细胞）、Runx2（骨细胞）和MyoD1（肌细胞）。适用于本发明的被称为程序重排因子的另外的基因被公开于美国专利申请号10/997,146和美国专利申请号12/289,873，在此通过引用并入。
所有这些基因常存在于哺乳动物，包括人，因此任何哺乳动物的同源基因均可用于本发明，如得自哺乳动物的基因，该哺乳动物包括但不限于小鼠、大鼠、牛、羊、马和猿。进一步，除野生型基因产物外，还可应用突变基因产物，该突变基因产物包含几种（例如，1至10、1至6、1至4、1至3和1或2）氨基酸的替换、插入和/或缺失并且与野生型基因产物具有类似的功能。此外，因子的组合不限于应用野生型基因或基因产物。例如，可用Oct4嵌合体或其他Oct4变体取代野生型Oct4。
本发明不限于可用于程序重排、分化、去分化或转分化细胞的转录或程序重排因子的任何具体组合。如本文所述，转录或程序重排因子可包括一种或多种基因产物。转录或程序重排因子还可包括本文所述基因产物的组合。各因子可单独或与本文公开的其他因子组合应用。进一步，本发明的转录或程序重排因子可通过筛选方法确定，例如，如美国专利申请号10/997,146所述，在此通过引用将其并入。
还考虑因子组合其他有助于程序重排、分化、去分化或转分化细胞的剂的应用。例如，这种剂可包括上调内源性核程序重排基因的表达或活性从而相对于单独应用程序重排因子增加诱导效力的剂。在多个实施方式中，诱导效力可相对于不应用其他剂的诱导增加10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400或甚至500%。例如，诱导效力可高如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或50%（例如，诱导细胞相对于起始体细胞总数的百分比）。
在诱导过程中，可在细胞接触一种或多种其他剂的同时或之前使体细胞接触核程序重排因子。在多个实施方式中，在细胞诱导开始后使体细胞与其他剂接触约1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。
如本文所用，术语"多肽"、"肽"或"蛋白质"交替使用以命名线性氨基酸残基系列，该氨基酸残基通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键相互连接。
虽然限定本发明的核酸构建物的表达产物的结构域可通过基序序列限定，本领域技术人员将理解，具有相似序列的肽可具有类似的生物学功能。因此，可应用与本文公开的结构域或因子具有基本上相同的序列或具有基本上一致或类似的序列的肽。如本文所用，术语"基本上相同的序列"包括这样的肽：其包含与限定本文所述结构域或因子的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或更多序列同一性的序列，并且具有基本上相同的活性或功能。
两种多肽基本上一致的进一步表示为，一种多肽与第二种多肽具有免疫交叉反应性。进一步，在两种肽仅区别于保守型替换时，两种多肽被认为基本上一致。
术语"保守型替换"关于蛋白质或肽使用，以反映不显著改变分子活性（例如，抗微生物活性）的氨基酸替换。一般，保守型氨基酸替换包括一种氨基酸替换为具有相似化学性质（例如，电荷或疏水性）的另一种氨基酸。下列六组分别包含彼此是典型保守型替换的氨基酸：1）丙氨酸（A）、丝氨酸（S）、苏氨酸（T）；2）天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）；3）天冬酰胺（N）、谷氨酰胺（Q）；4）精氨酸（R）、赖氨酸（K）5）异亮氨酸（I）、亮氨酸（L）、蛋氨酸（M）、缬氨酸（V）；和6）苯丙氨酸（F）、酪氨酸（Y）和色氨酸（W）。
术语"氨基酸"以其最广义使用，包括天然存在的氨基酸和包含氨基酸类似物的非天然存在氨基酸。鉴于此宽泛的定义，本领域技术人员将知道，本文中氨基酸的指代包括，例如，天然存在的蛋白质源（proteogenic）(L)-氨基酸、(D)-氨基酸、经化学修饰的氨基酸如氨基酸类似物、天然存在的非蛋白质源氨基酸如正亮氨酸、和化学合成的具有本领域已知是氨基酸特性的性质的化合物。如本文所用，术语"蛋白质源"表示氨基酸可通过代谢途径被并入细胞的蛋白质中。
术语"一致性"或"同一性″百分比在两个多核苷酸或多肽序列的情况下意指这样的两个或更多个序列或子序列：在进行比较和对齐以获得最大相应性时相同或具有指定的相同氨基酸残基百分比，如利用序列比较算法或通过视觉检查测量的。
短语"基本上一致"在两个多核苷酸或多肽的情况下意指这样的两个或更多个序列或子序列：在进行比较和对齐以得到最大相应性时，具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或更大核苷酸或氨基酸残基同一性，如利用序列比较算法或通过视觉检查测量的。
如本领域公知，最佳的用于比较的序列对齐可通过如下进行：例如，Smith&Waterman的局部同源性算法（（1981）Adv Appl Math2:482）、Needleman&Wunsch的同源性对齐算法（（1970）JMol Biol48:443）、Pearson&Lipman的相似性搜索方法（（1988）Proc NatlAcad Sci USA85:2444）、这些算法的计算机化实施、视觉检查或其他有效方法。
本发明进一步提供利用本文所述方法生成的分化、转分化或去分化的细胞以及这种细胞的细胞群。本发明的细胞具有多种应用和治疗性用途。
原肠胚形成是早期人发育的重要阶段，在此过程阶段三个主要的生殖层第一次确定和形成。如本文所用，“外胚层”是负责最终形成机体外覆层（表皮）和整个神经系统的组织。其第一个出现，并由生殖层的最外层形成。如本文所用，“中胚层”分化产生心脏、血液、骨、骨骼肌及其他结缔组织。不同的中胚层细胞保持不同方向分化的能力，例如，骨髓中的一些细胞（中胚层）可分化成为肝（内胚层）。如本文所用，“内胚层”指代“定形内胚层”和“原始内胚层”。定形内胚层一般指负责形成整个肠道管——包括食管、胃以及小肠和大肠——和自肠道管衍生的器官如肺、肝、胸腺、甲状旁腺和甲状腺、胆囊以及胰腺的生殖层。定形内胚层与完全独立的细胞系——被称为原始内胚层——之间可具有区别。“原始内胚层”主要负责形成胚胎外组织，主要是胎盘卵黄囊的壁和内脏内胚层部分和Reichert膜的胞外基质物。
根据某些实施方式，生成内胚层细胞。这些细胞可以是哺乳动物细胞，如人细胞。在本发明的一些实施方式中，定形内胚层细胞表达或不显著表达某些标记物。在一个非限制性方面，一种或多种标记物选自SOX17、CXCR4、MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1、CRIP1、FoxA2和/或Shh。在另一个实施方式中，选自OCT4、甲胎蛋白（AFP）、血栓调节蛋白（TM）、SPARC、SOX1和SOX7的一种或多种标记物不在定形内胚层细胞中显著表达。在另一个实施方式中，定形内胚层细胞不表达E-钙粘蛋白和/或Oct4。
在一些实施方式中，细胞经进一步处理形成胃肠道、呼吸道或内分泌系统的细胞。例如，内胚层细胞可分化成为胃肠道系统、呼吸道或内分泌系统器官的细胞。在具体方面，细胞经进一步处理形成肝细胞或胰细胞。在本发明的一些实施方式中，开始表达AFP（分化第7天或第8天）的肝细胞祖细胞可用于移植。
在其他实施方式中，生成中胚层细胞。这些细胞可经进一步处理形成任何衍生自中胚层谱系的细胞。在一些实施方式中，中胚层细胞可通过本领域已知的方法分化成为骨细胞、肌细胞、结缔组织或血液细胞。
在其他实施方式中，生成外胚层细胞。这些细胞可经进一步处理形成任何衍生自外胚层谱系的细胞。在一些实施方式中，外胚层细胞可通过本领域已知的方法分化成为神经系统或皮肤的细胞。
根据本发明的其他实施方式，描述了由多潜能细胞生成肝细胞的方法。在一个实施方式中，利用本文所述的方法从体细胞衍生iPS细胞。在另一个实施方式中，多潜能干细胞是干细胞。这些方法所用的干细胞可包括但不限于，胚胎干（ES）细胞。在一个实施方式中，用hES细胞生成肝细胞。
本文所述包含内胚层、中胚层或外胚层细胞的细胞培养物和组合物可由多潜能细胞如单性生殖干细胞（pSC）、iPS细胞或胚胎干细胞生成。iPS细胞可如本文所述生成。如本文所用，“胚胎”指生物体发育阶段的范围，起始于单个受精卵并终止于多细胞结构，该多细胞结构除已发育的配子细胞外不再包含多潜能或全能性细胞。除通过配子融合得到的胚胎外，术语“胚胎”还指通过体细胞核转移得到的胚胎。如本文所用，“单性生殖干细胞（pSC）”指通过单性生殖过程得到的多潜能干细胞。单性生殖导致“单性生殖”胚胎（或“单性生殖体（pathenote）”），其由激活的未受精的卵母细胞形成。得到内胚层、中胚层或外胚层细胞的优选方法利用hES或pSC细胞作为分化起始细胞。本方法所用的胚胎干细胞可以是源自桑椹胚、胚胎内细胞团的细胞或得自胚胎生殖腺脊的细胞。本方法所用的单性生殖干细胞源自单性生殖体。人干细胞可利用本领域已知的方法在培养物中保持多潜能状态，而无显著分化。这种方法被述及于例如，美国专利号5,453,357、5,670,372、5,690,926、5,843,780、6,200,806、6,251,671和美国专利申请号12/082,028和12/629,813，其公开的全部内容通过引用并入本文。
本文所用的人多潜能干细胞可保持在有或无血清的培养物中。在一些实施方式中，使用血清替代品。在其他实施方式中，应用无血清培养物技术。
如本文所用，“多能性”或“多能性细胞”指可生成有限数量的其他特定细胞类型的细胞类型。如上所述，内胚层细胞不分化成为由外胚层或中胚层生成的组织，而是分化成为肠道管以及自肠道管衍生的器官。在一个实施方式中，内胚层细胞衍生自hESCs。该过程可为有效生成人内胚层衍生的组织如胰、肝、肺、胃、肠和甲状腺提供基础。
如本文所用，“分化”指细胞发生的改变，该改变致使那些细胞呈现某些特化功能并丧失变成某些其他特化功能单位的能力。能够分化的细胞可以是任何全能性、多潜能或多能性细胞。分化相对于成熟的成年细胞可以是部分或完全的。
为确定细胞培养物或细胞群中的内胚层细胞量，需要从培养物或细胞群中的其他细胞区分该细胞类型的方法。因此，在一个实施方式中，本方法进一步涉及细胞标记物，其存在、不存在和/或相对表达水平对于定形内胚层是特定的。如本文所用，“表达”指材料或物质的生成以及材料或物质的生成水平或数量。因此，确定特定标记物的表达是指检测标记物表达的相对量或绝对量或简单检测标记物存在或不存在。如本文所用，“标记物”指任何可观察或检测到的分子。例如，标记物可包括，但不限于，核酸如特定基因的转录子、基因的多肽产物、非基因产物多肽、糖蛋白、糖类、糖脂、脂质、脂蛋白或小分子。
例如，在一个实施方式中，标记物的存在、不存在和/或表达水平通过定量PCR（Q-PCR）确定。示例性遗传标记包括，但不限于，如FoxA2、Sox17、CXCR4、Oct4、AFP、TM、SPARC、Sox7、MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1、CRIP1、E-钙粘蛋白及其他标记物，其可通过定量Q-PCR确定。在另一个实施方式中，用免疫组织化学检测由上述基因表达的蛋白质。在另一个实施方式中，Q-PCR和免疫组织化学技术均用于鉴定和确定这种标记物的量或相对比例。
因此，可以鉴定内胚层细胞，和确定内胚层细胞在细胞培养物或细胞群中的比例。例如，在一个实施方式中，生成的定形内胚层细胞或细胞群表达CXCR4、Shh、FoxA2、GSC和/或Sox17，但不表达AFP、SOX1和/或SOX7。
如本文所用，“限定的培养基条件”指培养细胞的环境，在此详细描述了其中最佳生长所需的组分浓度。例如，取决于细胞用途（例如，治疗用途），将细胞从包含异种蛋白质的条件去除是重要的；即，培养条件是无动物条件或无非人动物蛋白质。
“分化细胞”指具有具体的分化状态——即非胚胎状态——的非胚胎、非单性生殖或非多潜能细胞。三种最早的分化细胞类型是内胚层、中胚层和外胚层。
本发明所用细胞的多潜能状态可通过多种方法确定。例如，可测试细胞存在或不存在特征性ES细胞标记物。在人ES细胞的情况下，这种标记物的实例如上文确定，包括SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-81和OCT4，在本领域已知。
而且，多潜能性可通过如下确定：将细胞注入适当的动物，例如SCID鼠，并观察分化细胞和组织的生成。还有另一确定多潜能性的方法是用个体多潜能细胞生成嵌合动物，并观察引入的细胞对不同的细胞类型的作用。生成嵌合动物的方法在本领域公知，并被述及于美国专利号6,642,433，在此将其引入作为参考。
还有另一确定多潜能性的方法是在适于分化的条件（例如，去除成纤维细胞饲养层）下培养时观察ES细胞分化成为胚状体及其他分化细胞类型。本方法已被应用，并且已经确定在组织培养中个体多潜能细胞生成胚状体和不同的分化细胞类型。
多潜能细胞和细胞系——包括使用本文所述方法生成的多潜能细胞和细胞系，优选人多潜能细胞和细胞系，具有多种治疗和诊断用途。这种多潜能细胞可用于多种疾病病症治疗中的细胞移植治疗或基因治疗（如果经过基因改造）。
因此，一方面，本发明提供利用由本文所述方法得到的细胞治疗个体的方法，其中最初生成iPS细胞，其随后分化成为特定细胞类型。本方法包括由个体得到体细胞；利用本发明的方法使体细胞程序重排成为诱导多潜能干（iPS）细胞；体外培养诱导多潜能干（iPS）细胞，以使细胞分化成为期望的适于治疗病症的细胞类型；和将分化细胞引入个体，从而治疗病症。
在相关方面，本发明提供利用由本文所述方法得到的细胞治疗个体的方法，其中iPS细胞不最初生成和随后分化。本方法包括用本发明的核酸构建物或其表达产物接触细胞，培养细胞以使细胞分化、转分化或去分化成期望的适于治疗病症的细胞类型；和将培养的细胞引入个体，从而治疗病症。
本发明的一个优势是其提供基本上无限的适于移植的同基因或同源人细胞供应。iPS细胞被针对患者而特异性定制，避免免疫排斥。因此，排除了与当前移植方法相关的重大问题，如，可因宿主抗移植物或移植物抗宿主排斥而出现的移植组织排斥。
本发明的另一优势是解决了未分化干细胞附随目标分化细胞的特殊问题。pSC、ES或iPS细胞在被引入体内时能够引发畸胎瘤。本发明的核酸构建物或其表达产物的存在将pSC、ES或iPS细胞特异性地导向目标细胞终点。因此，本发明将解决与当前干细胞培养方法相关的危险，并显著增强其安全性。
利用本文所述方法生成的细胞可分化成为多种不同的细胞类型，从而通过本领域已知的方法治疗多种病症。例如，iPS细胞可经诱导分化成为造血干细胞、肌细胞、心肌细胞、肝细胞、软骨细胞、上皮细胞、尿道细胞、神经元细胞及类似细胞。然后分化细胞可被移植回患者机体，以预防或治疗病症。
本发明的方法还可用于治疗或预防神经系统疾病。这种疾病包括，例如，阿尔茨海默症、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化（ALS）、溶酶体贮积病、多发性硬化、脊髓损伤及类似疾病。
类似地，本发明方法生成的细胞可用于修复或再生个体的组织或分化细胞谱系。方法包括得到本文所述程序重排的细胞和将细胞给予个体（例如，患有心肌梗塞、充血性心脏衰竭、中风、缺血、外周血管疾病、肝病、硬变、视网膜疾病、帕金森病、阿尔茨海默症、糖尿病、癌症、关节炎、各种创伤、免疫缺陷、再生障碍性贫血、贫血和遗传疾病的个体）和类似疾病，在此需要增加或替代特定细胞类型/组织或细胞去分化。在一个实施方式中，个体具有组织或器官损伤，给药提供足以增加组织或器官的生物学功能或足以增加组织或器官中存在的细胞数量的细胞剂量。在另一个实施方式中，个体患有疾病、病症或状况，其中给药提供足以改善或稳定疾病、病症或状况的细胞剂量。还有另一实施方式中，个体具有特定细胞类型如循环血液细胞类型缺陷，其中给药恢复了这种循环血液细胞。
类似地，本发明方法生成的细胞可用于评估各种试剂如药物的毒性或效力，或评估各种化学组合物如消费品的安全性，或作为细胞生物学或各种疾病研究的模型。
下列实施例意为示例，而非限制本发明。
实施例1
改变细胞外遗传状态的表达构建物的生成
本实施例描述编码具有特定羧基端元件的重组蛋白质的表达载体的构建。虽然本实施例所用的重组蛋白质是转录因子，但相同方法可用于生成任何类型的具有本文所述羧基端结构域的重组蛋白质。在本实施例中，羧基端结构域被称为HATHFUN结构域，如本实施例中所用的特定羧基端结构域元件确定。因此，重组转录因子蛋白质在本实施例和其余实施例中被称为HATHFUN转录因子。
为表达可改变细胞外遗传状态如细胞分化状态的蛋白质或进一步纯化其所施用的细胞群，生成一连串具有转录因子序列的蛋白质表达构建物。可能的实例包括诱导多潜能干细胞、由间充质干细胞转分化成为内胚层细胞，驱使胚状体倾向目标细胞终点如定形内胚层、或将成纤维细胞转分化成为肌细胞、软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞。
蛋白质均在C端被标记以功能结构域，该功能结构域被称为HATHFUN，其由第一蛋白质标记（表位血细胞凝集素标记（HA））、转导结构域（TAT）、第二蛋白质标记（聚(His)结构域，用于蛋白质纯化）、融合结构域（流感血凝素融合肽，以增强转导结构域）和核定位序列（NLS，使蛋白质靶向核）组成。添加至蛋白质羧基端的这些元件的组合提供创新的蛋白质构建物，用于细胞外遗传状态的靶向性改变。添加创新的羧基端的蛋白质及其登录号和来源以及基因序列的更改显示在表I中。
表I.基因登录记录、来源和转录因子的更改
用于蛋白质表达构建物的HATHFUN的构建如下。利用PCR（Invitrogen，AccuPrimeTMPfx Supermix，12344-040）由融合在一起一连串四种合成的DNA引物（参见表II）生成HATHFUN。它们被设计以相互重叠，并生成最终的序列，187bp长，包括终止密码子和定向克隆所需的5’端的CACC序列。最终的蛋白质序列如下。
YPYDVPDYAGGKKKRKVGGYGRKKRRQRR
RGGHHHHHHGGGLFGAIAGFIENGWEGMID
G（SEQ ID NO：4）
各结构域被两个甘氨酸隔离，以使其相对于其他结构域自由旋转。按照厂家说明书（Invitrogen），将融合的PCR结构域克隆到pENTR/SD/D-TOPOTM进入克隆载体（entry cloning vector）。克隆试剂盒购自Invitrogen（K4240-20）。在确定PCR插入物存在后，通过提交至Retrogen（San Diego，California）的序列检验构建物。
HATHFUN标记的蛋白质的构建采用适于不同蛋白质的一般方案进行。HATHFUN标记的蛋白质的构建全部遵循图1所示的一般方案。设计引物（参见表II），其中在定向克隆开始时正向引物包含CACC，反向引物将消除原内源序列中存在的终止密码子，并提供目标cDNA与HATHFUN序列之间的融合重叠区域。所有引物均购自Integrated DNA Technologies（Coralville，Iowa）。通过PCR扩增目标cDNA，从而引入修饰。这些cDNA其中几种是极富GC或包含二级结构，并且仅在Qiagen OneStepTMRT-PCR试剂盒（210210）的Q溶液存在于反应中的情况下扩增。在琼脂糖凝胶上检验片段大小后，利用QIAquickTM凝胶提取试剂盒（Qiagen，28104）纯化经改造的序列。然后，将经改造的序列置于与HATHFUN序列的第二PCR反应，其中两序列之间的重叠区域将充当启动区，并使其融合在一起。一个扩增循环后，对目标基因和HATHFUN特异的正向和反向引物分别被加入反应。然后，将新融合的序列在纯化后克隆到pENTR/SD/D-TOPOTM载体中，并转化到DH5α（Invitrogen，18265017）中。有效的克隆利用NruI消化剂（digest）（New England Biolabs，R1092S）确定和通过测序证实。
几种cDNA序列购自不同的公司（参见表I），其仅需通过PCR利用构建物特异的引物扩增，该构建物特异引物允许通过如上所述的第二PCR反应融合于HATHFUN。一些所需修复或更改只是难以获得。这些构建物的细节如下所述。
NANOG：相对于野生型序列（登录#NM_024865）包含四个点突变的假基因购自Open Biosystems。其中两个突变导致非保守型氨基酸改变。因此设计PCR引物以将这两个突变变成野生型序列，并将重叠片段融合成整体。按照上述一般方案进行进一步构建。
Sox2、Sox17和Sox9：原哺乳动物序列（登录号分别为BC013923.2、BC140307和NM_000346.2）可不在大肠杆菌（E.coli）蛋白质表达系统中表达。适于大肠杆菌表达的优化构建物生成和购自Mr.Gene。序列如下。
Sox2：
ACCATGTATAATATGATGGAAACCGAGCTGAAACCTCCGGGTCCTCAA
CAAACAAGTGGGGGTGGGGGTGGCAATAGTACTGCTGCTGCTGCTGGG
GGTAACCAAAAAAACTCTCCTGATCGTGTGAAACGCCCGATGAATGCC
TTTATGGTGTGGTCACGTGGACAACGTCGTAAAATGGCCCAAGAGAAT
CCGAAAATGCACAACAGCGAGATCTCAAAACGTCTGGGTGCTGAGTGG
AAACTGCTGAGTGAAACGGAAAAACGCCCTTTCATTGACGAAGCGAAA
CGCCTGCGTGCCCTGCATATGAAAGAACACCCGGACTATAAATATCGT
CCACGCCGTAAAACCAAAACCCTGATGAAAAAAGACAAATATACCCTG
CCTGGTGGTCTGCTGGCACCTGGTGGAAATTCTATGGCAAGCGGTGTCG
GAGTTGGTGCTGGTCTGGGAGCCGGTGTGAATCAGCGTATGGACTCTTA
TGCCCACATGAACGGTTGGAGCAATGGTTCCTATTCGATGATGCAAGAT
CAACTGGGTTATCCTCAACATCCTGGCCTGAATGCTCATGGAGCTGCTC
AGATGCAACCGATGCACCGTTATGACGTGAGTGCACTGCAGTATAACA
GCATGACCTCTTCTCAGACCTATATGAACGGCTCACCGACTTATAGCAT
GTCGTATAGCCAACAGGGGACTCCTGGTATGGCTCTGGGTTCTATGGGT
AGTGTGGTGAAAAGCGAAGCAAGCTCTAGCCCTCCTGTGGTAACATCT
TCCTCACATTCCCGTGCCCCTTGTCAGGCTGGTGACCTGCGTGATATGA
TCAGCATGTATCTGCCTGGAGCAGAAGTTCCTGAACCTGCCGCTCCTTC
TCGTCTGCACATGTCCCAACATTATCAGTCTGGCCCGGTCCCTGGAACA
GCGATTAATGGTACTCTGCCTCTGTCTCACATGGGTGGATATCCGTATG
ATGTCCCGGATTATGCCGGTGGTAAAAAAAAACGTAAAGTGGGGGGTT
ATGGCCGTAAAAAACGTCGCCAACGTCGTCGTGGTGGTCATCACCATC
ACCATCATGGTGGTGGCCTGTTTGGTGCTATCGCCGGCTTTATCGAAAA
CGGGTGGGAAGGCATGATTGATGGCTAA（SEQ ID NO：5）
Sox17：
ACCATGTCTAGCCCTGATGCCGGTTATGCCTCTGATGACCAGTCTCAAA
CACAGTCTGCTCTGCCTGCCGTAATGGCCGGTCTGGGTCCTTGTCCTTG
GGCCGAATCTCTGTCTCCTATTGGCGATATGAAAGTGAAAGGCGAAGC
ACCAGCAAATTCTGGAGCCCCTGCCGGAGCTGCCGGTCGTGCTAAAGG
TGAATCCCGTATTCGTCGTCCGATGAACGCTTTTATGGTATGGGCGAAA
GATGAGCGTAAACGTCTGGCACAACAGAACCCTGATCTGCACAATGCC
GAACTGAGCAAAATGCTGGGCAAATCGTGGAAAGCACTGACTCTGGCC
GAAAAACGTCCGTTTGTGGAAGAAGCCGAGCGTCTGCGCGTACAACAC
ATGCAAGACCATCCGAACTATAAATATCGTCCTCGCCGCCGTAAACAG
GTTAAACGCCTGAAACGTGTGGAGGGTGGTTTTCTGCACGGCCTGGCTG
AACCTCAAGCTGCTGCCCTGGGACCTGAAGGTGGGCGTGTAGCAATGG
ACGGCCTGGGACTGCAATTTCCGGAACAGGGATTTCCAGCTGGTCCTCC
TCTGCTGCCTCCTCATATGGGTGGTCACTATCGTGATTGTCAGTCACTG
GGTGCTCCACCTCTGGATGGATATCCACTGCCAACACCGGATACAAGTC
CTCTGGACGGAGTTGATCCTGATCCTGCCTTTTTTGCCGCTCCTATGCCT
GGTGATTGCCCTGCTGCTGGCACTTATTCTTATGCTCAAGTGAGCGACT
ATGCCGGACCTCCTGAACCGCCTGCCGGACCGATGCATCCTCGTCTGGG
CCCTGAGCCTGCCGGGCCTTCTATTCCTGGACTGCTGGCTCCGCCTAGT
GCACTGCACGTCTATTATGGCGCTATGGGTAGCCCTGGCGCTGGGGGTG
GTCGTGGTTTTCAAATGCAACCTCAACACCAGCACCAACATCAACATCA
GCACCATCCGCCTGGTCCTGGACAACCTTCTCCTCCTCCTGAGGCACTG
CCTTGTCGTGATGGGACGGATCCTTCTCAACCTGCTGAACTGCTGGGTG
AAGTCGATCGTACCGAATTCGAACAGTATCTGCACTTTGTGTGTAAACC
GGAGATGGGTCTGCCATATCAAGGTCATGATAGCGGCGTTAATCTGCC
GGATTCTCATGGCGCTATTAGCAGCGTTGTTTCCGATGCCAGTAGTGCC
GTGTATTATTGTAACTATCCGGATGTGGGTGGCTATCCTTATGATGTGC
CTGATTATGCCGGTGGTAAAAAAAAACGTAAAGTGGGCGGCTATGGTC
GTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTGGGGGACACCATCATCATCATC
ATGGTGGGGGACTGTTTGGCGCTATTGCCGGCTTTATCGAAAATGGCTG
GGAAGGCATGATTGATGGCTAA（SEQ ID NO：6）
Sox9：
ACCATGAACCTGCTGGACCCTTTTATGAAAATGACCGACGAACAGGAG
AAAGGTCTGTCTGGAGCACCTTCACCAACCATGTCCGAAGATTCTGCCG
GTAGTCCTTGCCCTAGTGGTAGTGGTAGTGACACGGAAAACACACGTC
CTCAAGAGAACACGTTCCCGAAAGGCGAACCTGATCTGAAAAAAGAGA
GCGAGGAGGACAAATTTCCGGTTTGTATCCGTGAAGCAGTGAGCCAAG
TGCTGAAAGGATATGACTGGACGCTGGTTCCTATGCCAGTTCGTGTGAA
TGGCAGCTCCAAAAACAAACCTCACGTGAAACGTCCAATGAATGCCTT
CATGGTGTGGGCACAAGCAGCACGTCGTAAACTGGCTGACCAGTATCC
ACATCTGCATAACGCTGAACTGAGCAAAACACTGGGGAAACTGTGGCG
TCTGCTGAATGAAAGCGAGAAACGCCCTTTTGTAGAAGAAGCCGAACG
CCTGCGCGTACAACACAAAAAAGACCACCCGGACTATAAATATCAGCC
TCGCCGCCGTAAAAGTGTGAAAAACGGCCAGGCCGAAGCAGAGGAAG
CAACAGAACAGACACACATTAGCCCGAATGCCATCTTTAAAGCCCTGC
AGGCAGACTCACCTCATAGCAGTAGTGGAATGAGCGAAGTCCATAGCC
CTGGAGAACATTCTGGACAGTCTCAAGGCCCTCCAACACCTCCGACAA
CCCCAAAAACTGACGTTCAACCGGGTAAAGCTGACCTGAAACGTGAAG
GACGTCCACTGCCAGAAGGTGGTCGTCAACCTCCAATCGATTTTCGTGA
CGTGGACATTGGCGAGCTGTCTAGTGATGTGATCAGCAATATCGAAAC
CTTCGATGTTAACGAGTTCGACCAATATCTGCCGCCAAATGGTCATCCT
GGTGTTCCGGCTACACATGGACAAGTGACCTATACGGGCTCATATGGT
ATTAGCAGTACCGCCGCTACACCTGCCTCAGCTGGGCATGTTTGGATGT
CGAAACAGCAAGCACCGCCTCCGCCTCCACAACAACCGCCTCAAGCAC
CTCCGGCCCCTCAGGCACCGCCTCAACCTCAAGCAGCCCCTCCACAACA
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ATTGCCTATTCCCCGTTCAATCTGCCACACTATTCACCATCGTATCCGCC
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GTCGTAAAAAACGCCGTCAACGCCGCCGTGGTGGCCATCATCACCACC
ATCATGGAGGAGGCCTGTTTGGCGCTATTGCCGGCTTTATTGAGAATGG
GTGGGAAGGCATGATTGATGGCTAA（SEQ ID NO：7）
HNF4α2：存在HNF4基因的多种变异，其由两种不同的启动子驱动。极少可商业获得。该具体的同工型（HNF4α2）被报告在肝细胞中表达。其中一种无限增殖肝细胞系——HepG2a，也被报告表达该蛋白质。HepG2a细胞系购自ATCC（CRL-10741），并按照厂家说明书得到生长。设计引物以通过RT-PCR得到该特定的同工型。利用RNeasy Plus MiniTM试剂盒（Qiagen，74134）提取RNA，然后按照厂家说明书（上述试剂盒）对其进行RT-PCR。通过琼脂糖凝胶检验片段大小，然后按照上述一般方案进行进一步构建。
Runx2：在三种报告的同工型中，仅一种可商业获得。该可获得的同工型在N端缺少19个独特的氨基酸，该氨基酸可赋予针对骨细胞分化特异的功能，尽管这需要本系统的实验验证。此较长的同工型还被称为OSF2/CBFA1a。较短的同工型被购得。设计一系列PCR引物以将N端结构域的原始五个氨基酸替换为新的同工型特异的氨基酸，并使其融合于原序列。利用一系列PCR反应生成延长的序列后，按照上述一般方案进行进一步构建。
CEBPδ：该基因不可商业获得。在间充质干细胞分化成为脂肪细胞的过程中表达蛋白质。设计引物以通过RT-PCR得到该基因。诱导本实验室分离的间充质干细胞，并进行脂肪形成。利用RNeasy Plus MiniTM试剂盒（Qiagen，74134）提取RNA，然后按照厂家说明书（上述试剂盒）对其进行RT-PCR。通过琼脂糖凝胶检验片段大小后，按照上述一般方案进行进一步构建。
表II.为构建物改造和标记生成的引物
蛋白质表达和纯化如下进行。利用GATEWAY技术将融合的表达序列重组到pBAD-DEST蛋白质表达载体（Invitrogen，12283-016）中，并将其转化到TOP10（试剂盒中包含）中。利用NruI消化剂确定有效的克隆。通过用0.2%L-阿拉伯糖（Sigma，A91906）诱导刚接种的细菌培养物和在NuPAGE Novex10%Bis-Tris丙烯酰胺凝胶（Invitrogen，NP0302BOX）上运行，确定蛋白质的表达。
确定蛋白质表达后，开始大规模培养。如一般方案，将培养物1500×g离心，用PBS洗涤一次，并在-80°C下冷冻直到处理。将小球在盐酸胍缓冲液（6M GnHCl、500mM NaCl、20mM Tris-HCl pH8.0、20mM咪唑）中解冻，并利用氮解压（1700psi，Parr Instrument Company）裂解三次。将裂解物在购自GE Lifesciences（28-4013-51）的GravitrapTM亲和柱上运行，用尿素缓冲液（8M尿素、250mM NaCl、20mM Tris-HCl、20mM咪唑）洗涤两次，然后用咪唑量渐增（50mM，100mM，250mM，500mM）的尿素缓冲液洗脱，分成部分。将部分分别收集，并在丙烯酰胺凝胶上运行，从而定位目标蛋白质。
组合阳性部分，然后利用超滤离心（Millipore，UFC901008）进一步浓缩。
将浓缩的蛋白质按照厂家说明书在PD10脱盐柱（GE Lifesciences，17-0851-01）上运行，从而将尿素缓冲液交换为磷酸盐缓冲液、Gly-gly缓冲液（25mM Tris-HCl pH7.4，10%甘油，100mM甘氨酸）、500mM精氨酸-HCl或其它使目标蛋白质保持可溶的缓冲液。利用BCA蛋白质分析（ThermoScientific Fisher，23227）确定最终的蛋白质浓度。
实施例2
hESC分化成为肝细胞
通过将可转导的HATHFUN标记的Oct4、Nanog和Sox2蛋白应用于hESC，纯化hESC培养物。胚胎干细胞是最纯的多潜能干细胞在中心的细胞异源培养物。此前已经证明，将可转导的Oct4或Sox2应用于明胶上生长的鼠ESC五天，足以使mESC的纯度从14%分别提高至68%和56%。在抑酶肽（蛋白酶抑制剂）存在的情况下，将HATHFUN标记的Oct4、NANOG和Sox2应用于在MatrigelTM或其他包被表面上生长的hESC，然后通过流式细胞计量术分析标记物如TRA-1-60和SSEA-4是否存在，从而确定蛋白质的作用。将通过两种不同的方法将蛋白质用于细胞，从而评估哪个最有效（图2）。第一种方法直接将蛋白质应用于细胞培养物五天时间，然后监测培养物纯度三代（three passages），从而确定该作用的半衰期。第二种方法将蛋白质仅在培养物传代过程中应用于细胞三代，其利用“粘性”——即负载蛋白质的转导结构域的特性。这种方法将用于减少蛋白质需要量。而且，由于这些蛋白质可将成纤维细胞转化成为iPS细胞，尽管由丝裂霉素C造成遗传损伤，丝裂霉素C（mitomycin C）处理后的成纤维细胞饲养层也可被转化，是可能的。因此，传代过程中的蛋白质处理将证实如果hESC系需要成纤维细胞饲养层的情况下可选的方法。该方法的随后细化将可能包括利用Accutase提高hESC群体的尺寸一致性、利用微孔旋转或AggrewellsTM（干细胞，27845）生成球状体，以进一步提高hESC培养物的纯度。
表2.测量HATHFUN标记的蛋白质的作用的实验设计
定形内胚层的生成可如下进行。由hESC生成胚状体产生三种原始组织类型：内胚层、中胚层和外胚层。早期胚状体（EB）的组构通常具有内胚层外层和ESC内核和外胚层。迄今为止，极少参考文献讨论聚集体或EB的尺寸控制作为引导分化的手段。根据一参考文献，小聚集体对于将细胞导向内胚层途径极其重要。此外，其他文献明确证实，Sox17是定形内胚层形成的重要信号。
HATHFUN标记的Sox17的应用结合解集和胚状体均衡小尺寸应明显使细胞终点变为大量内胚层细胞，并进一步将其指定为定形（相对于胚胎外）内胚层。
可遵循两个可能的方案。第一个是形成纯定形内胚层干细胞的单层培养物，该纯定形内胚层干细胞可被保持或冷冻，用于随后的应用。第二个取决于球状培养物的应用，从而起动当细胞处于三维形式时对于分化存在的固有信号传导机制。
方案1如下进行。纯化的hESC分化成为定形内胚层将通过利用Accutase生成单一细胞悬浮液开始，从而确保所有细胞均接收到等量信号。细胞将仅用HATHFUN-Sox17处理，以实现多能性细胞得到最多保持。然后将细胞铺开并维持在条件化（conditioned）胚胎干细胞培养基中。进一步处理可必要或可不必要，这取决于输入hESC的纯度和条件化ESC培养基保持多潜能性的能力。表征定形内胚层的分析如下所述。如果纯定形内胚层细胞可保持，其将充当进一步分化的细胞库。
方案2如下进行。以下方案由几个实验室得到的合并，并且另外引入HATHFUN-Sox17和AggrewellsTM的应用。类似于方案1，纯化的hESC分化成为定形内胚层将通过利用Accutase生成单一细胞悬浮物开始，从而确保所有细胞均接收到等量信号。可选地，将应用得自方案1的细胞。将HATHFUN标记的Sox17蛋白质和激活蛋白A用于细胞悬浮液，漂洗，然后铺到AggrewellsTM中，形成~250个细胞/EB的内胚层EB。培养基是KnockoutTMDMEM、bFGF、激活蛋白A、Wnt3a和KnockoutTM血清替代品（Invitrogen）。
在AggrewellTM中温育2天后，进行保持内胚层向肝途径分化的第二处理。将内胚层EB用Accutase消化，再用HATHFUN标记的Sox17蛋白质和激活蛋白A处理，并在AggrewellsTM中重新聚集。将EB在相同培养基中再温育2天。
可通过如下分析内胚层细胞的纯度：通过流式细胞计量术，利用细胞表面标记物如CXCR4和c-kit，或通过免疫细胞化学，利用内部标记物如Shh、Foxa2、goosecoid和缺少AFP（甲胎蛋白）、Sox7（原始内胚层标记物）和Sox1（外胚层）。
取决于EB和球状体的松散程度，减少解离和重新聚集的次数。细胞内核对于信号的获得能力将决定是否需要解离。在初始实验后，可尝试球状体尺寸和解离/聚集次数相对于成功率的变化。
成肝细胞/两阶段分化可如下进行。该阶段将使内胚层开始变为新生的成肝细胞。这是第一次已知的尝试，通过利用球状体培养物协助肝细胞的生成和成熟。多个参考文献表明，相对于2D夹层培养物，体内培养衍生的球状体形式的肝细胞导致寿命最长的培养物，其具有所需的药物代谢酶。假设3D形式与HATHFUN标记的转录因子组合生成将在多个方面有助于这些细胞的生成和功能。
分化成为成肝细胞/两阶段阶段将通过利用Accutase生成单一细胞悬浮液开始，从而确保所有细胞均接收到等量信号。将悬浮液用HATHFUN标记的HNF4α2、GATA4、Hhex+激活蛋白A在成肝细胞培养基中处理。通过AggrewellTM使悬浮液聚集，并将其温育1天。
如果存在任何可设定尺寸的非目标细胞群，可在CXCR4+细胞处理前用MACS柱使细胞分类。
肝细胞的成熟可如下进行。该培养阶段意为使肝细胞进一步成熟，并允许其在大量培养中易于操控。从AggrewellsTM中去除球状体然后将其包被，以防止融合和/或有助于成熟。包被物可以是海藻酸盐、胞外基质（ECM）如胶原蛋白I/III混合物、纤连蛋白和硫酸皮肤素蛋白多糖（dermatan sulphateproteoglycans）（DSPG）或ECM掺杂的海藻酸盐。将包被的球状体在肝细胞分化/成熟培养基中温育。本领域已知的其他可能的成熟因子可被包括在内，如制瘤素M和/或胆汁盐。
肝功能的功能分析将包括白蛋白和纤连蛋白分泌、糖原的储存是否存在（雪夫酸染色，Schiff acid stain）、相对于成年人肝细胞的Cyp3A4和Cyp7A1（成年人仅为P450）。
实施例3
中胚层分化成为内胚层
本实验的目的是利用HATHFUN标记的Sox17蛋白质证明中胚层可转分化成为定形内胚层。将脂肪衍生的中胚层干细胞用HATHFUN标记的Sox17蛋白质处理最少2-3天，并每日观察形态变化。培养基是标准ESC培养基，如KnockoutTM DMEM/KnockoutTM血清替代品。ESC-条件化培养基还可被加入培养物，以协助转分化。除形态变化外，将利用上述用于内胚层谱系的标记物对细胞进行进一步分析。
实施例4
中胚层或成纤维细胞分化成为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞和肌细胞
中胚层或成纤维细胞分化成为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞和肌细胞的能力已在文献中被反复证实，并且方案被充分记录（参见Chen et al.，Journal ofCellScience（2007）120:2875-83；和Bartsch et al.，Stem Cells and Development（2005）14:337-348）。
但是，这些方案的效力相当有限，仅小百分比的目标细胞实际上保持多潜能性，并且小部分仅能够分化成为一种或两种组织类型（参见Chen et al.和Bartschet al.）。进行文献搜索，搜索直接控制分化成为目标细胞的独特转录因子。虽然几种因子已被报道处于不同的分化阶段或显示多种功能，但那些所选因子包括CEBPβ/CEBPδ（脂肪细胞）、Sox9（软骨细胞）、Runx2（骨细胞）和MyoD1（肌细胞），并被HATHFUN标记。
分化试剂盒可商业购买或生产。全部四个目标细胞类型需要约三周进行完全分化。将脂肪衍生的间充质细胞或包皮成纤维细胞用分化试剂盒和在处理过程中应用的HATHFUN-标记的蛋白质处理。随后的分化分析将是油红O（Oil Red O）染色（脂肪细胞）、阿尔坎蓝（软骨细胞）、茜素红（骨细胞）和多核融合的肌管（肌细胞）。
虽然已参考上述实施例对本发明进行描述，但要理解的是，更改和改动被包括在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅限于所附权利要求。
Claims (53)
1.使目标或受体细胞程序重排、分化、转分化或去分化成为不同细胞类型的细胞或者多潜能细胞或分化程度较低的细胞的方法，所述方法通过将一种或多种核酸构建物或其表达产物引入所述细胞，和在使所述细胞转化成为多潜能细胞或相应于内胚层、中胚层或外胚层的细胞系的细胞的培养条件下进行培养而实现。
2.权利要求1所述的方法，其中所述构建物编码表达盒，所述表达盒包括处于可操作连接中的：
i）至少一种蛋白质标记；
ii）蛋白质转导结构域；
iii）融合结构域；
iv）核定位信号；和
v）至少一种转录因子。
3.权利要求2所述的方法，其中所述转录因子是核程序重排因子。
4.权利要求3所述的方法，其中所述转录因子由选自以下的基因编码：SOX家族基因、KLF家族基因、MYC家族基因、SALL4、OCT4、NANOG、LIN28或其组合。
5.权利要求4所述的方法，其中所述转录因子是Oct4、Sox2、Klf4、Nanog或c-Myc。
6.权利要求2所述的方法，其中所述转录因子由选自以下的基因编码：OCT4、NANOG、SOX2、SOX17、HNF4、GATA4、HHEX、CEBPβ、CEBPδ、PRDM16、MYOD1、NKX2.5、MEF2c、MYOCARDIN、RUNX2、PDX、NGN、SALL4或SOX9。
7.权利要求6所述的方法，其中所述转录因子是Oct4、Nanog、Sox2、Sox9、Sox17、HNF4α2、HNF4α4、HNF4α7、HNF4α8、HNF4γ、GATA4、Hhex、CEBPβ、CEBPδ、PRDM16、MyoD1、NKX2.5、Mef2c、心肌素、Runx2-I、Pdx1、Ngn3、Sall4或Runx2-II。
8.权利要求1所述的方法，其中所述细胞在所述核酸构建物或其产物被引入所述细胞前是未分化、部分分化或完全分化的。
9.权利要求1所述的方法，其中所述细胞是胚胎干（ES）细胞、多潜能干（PS）细胞、诱导多潜能干（iPS）细胞、单性生殖干细胞、间充质干细胞、中胚层干细胞、内胚层干细胞、外胚层干细胞、多能性干细胞、双能干细胞、体干细胞或体细胞。
10.权利要求9所述的方法，其中所述内胚层干细胞表达选自FoxA2、Sox17、CXCR4、短尾（brachyury）和CER1的一种或多种标记物。
11.权利要求10所述的方法，其中所述内胚层干细胞是肝细胞、胆管细胞、胰腺外分泌或内分泌β-细胞，或所述中胚层干细胞是脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞或肌细胞。
12.权利要求1所述的方法，其中所述细胞在一种或多种成熟因子的存在下被培养。
13.权利要求2所述的方法，其中所述核酸构建物包含至少两种蛋白质标记。
14.权利要求2所述的方法，其中所述核酸构建物包含三种或更多种蛋白质标记。
15.权利要求13所述的方法，其中所述至少两种蛋白质标记包括亲和标记和表位标记。
16.权利要求13所述的方法，其中所述至少两种蛋白质标记包括聚(His)标记和血细胞凝集素（HA）表位标记。
17.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种蛋白质标记选自聚(His)、血细胞凝集素（HA）表位、myc表位、几丁质结合蛋白（CBP）、麦芽糖结合蛋白（MBP）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、钙调蛋白结合肽、生物素羧基载体蛋白（BCCP）、FLAG八肽、nus、绿色荧光蛋白（GFP）、硫氧还蛋白（TRX）、聚(NANP)、V5、S-蛋白、链霉抗生物素蛋白、SBP、聚(Arg)、DsbA、c-myc-标记、HAT、纤维素结合结构域、softag1、softag3、小泛蛋白样改造剂（SUMO）和泛蛋白（Ub）。
18.权利要求2所述的方法，其中所述融合结构域包括流感血凝素融合肽或其片段。
19.权利要求2所述的方法，其中所述蛋白质转导结构域包括TAT蛋白、VP22蛋白、果蝇触角足（Antp）同源异型转录因子或其片段。
20.权利要求1所述的方法，其中（i）至（iv）中每一个被1至10个氨基酸隔开。
21.权利要求20所述的方法，其中（i）至（iv）中每一个间隔2个氨基酸。
22.权利要求21所述的方法，其中所述氨基酸是甘氨酸。
23.权利要求2所述的方法，其中所述核酸构建物编码至少一种另外的表达盒，所述另外的表达盒包括处于可操作连接中的：
i）至少一种蛋白质标记；
ii）蛋白质转导结构域；
iii）融合结构域；
iv）核定位信号；和
v）至少一种转录因子。
24.权利要求1所述的方法，其中至少一种另外的核酸构建物或其表达产物，被引入所述细胞，其中所述至少一种另外的构建物编码处于可操作连接中的：
i）至少一种蛋白质标记；
ii）蛋白质转导结构域；
iii）融合结构域；
iv）核定位信号；和
v）至少一种转录因子。
25.编码表达盒的核酸构建物，所述表达盒包括处于可操作连接中的：
i）至少一种蛋白质标记；
ii）蛋白质转导结构域；
iii）融合结构域；
iv）核定位信号；和
v）转录因子。
26.权利要求25所述的核酸构建物，其中所述转录因子是核程序重排因子。
27.权利要求26所述的方法，其中所述转录因子由选自下述的基因编码：SOX家族基因、KLF家族基因、MYC家族基因、SALL4、OCT4、NANOG、LIN28或其组合。
28.权利要求27所述的方法，其中所述转录因子是Oct4、Sox2、Klf4、Nanog或c-Myc。
29.权利要求26所述的方法，其中所述转录因子由选自下述的基因编码：OCT4、NANOG、SOX2、SOX17、HNF4、GATA4、HHEX、CEBPβ、CEBPδ、PRDM16、MYOD1、NKX2.5、MEF2c、MYOCARDIN、R UNX2、SALL4或SOX9。
30.权利要求26所述的方法，其中所述转录因子是Oct4、NANOG、Sox2、Sox9、Sox17、HNF4α2、HNF4α4、HNF4γ、GATA4、Hhex、CEBPβ、CEBPδ、PRDM16、MyoD1、NKX2.5、Mef2c、心肌素、Runx2-I、Sall4或Runx2-II。
31.权利要求25所述的核酸构建物，其中所述核酸构建物包含至少两种蛋白质标记。
32.权利要求31所述的核酸构建物，其中所述至少两种蛋白质标记包括亲和标记和表位标记。
33.权利要求31所述的核酸构建物，其中所述至少两种蛋白质标记包括聚(His)标记和血细胞凝集素（HA）表位标记。
34.权利要求25所述的核酸构建物，其中所述至少一种蛋白质标记选自聚(His)、血细胞凝集素（HA）表位、myc表位、几丁质结合蛋白（CBP）、麦芽糖结合蛋白（MBP）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、钙调蛋白结合肽、生物素羧基载体蛋白（BCCP）、FLAG八肽、nus、绿色荧光蛋白（GFP）、硫氧还蛋白（TRX）、聚(NANP)、V5、S-蛋白、链霉抗生物素蛋白、SBP、聚(Arg)、DsbA、c-myc-标记、HAT、纤维素结合结构域、softag1、softag3、小泛蛋白样改造剂（SUMO）和泛蛋白（Ub）。
35.权利要求25所述的核酸构建物，其中所述融合结构域包括流感血凝素融合肽或其片段。
36.权利要求25所述的核酸构建物，其中所述蛋白质转导结构域包括TAT蛋白、VP22蛋白、果蝇触角足（Antp）同源异型转录因子或其片段。
37.权利要求25所述的核酸构建物，其中（i）中（iv）中每一个被1至10个氨基酸隔开。
38.权利要求37所述的核酸构建物，其中（i）至（iv）中每一个间隔2个氨基酸。
39.权利要求38所述的核酸构建物，其中所述氨基酸是甘氨酸。
40.权利要求25所述的核酸构建物，其中所述核酸构建物编码第二种表达盒，所述第二种表达盒包括处于可操作连接中的：
i）至少一种蛋白质标记；
ii）蛋白质转导结构域；
iii）融合结构域；和
iv）核定位信号；以及
v）至少一种转录因子。
41.表达载体，其包含权利要求25所述的构建物。
42.分离的蛋白质，其由权利要求25所述的核酸构建物编码。
43.利用由权利要求25所述的核酸构建物编码的分离的蛋白质增强单性生殖干细胞的多潜能性保持力的方法。
44.利用由权利要求25所述的核酸构建物编码的分离的蛋白质增强胚胎干细胞的多潜能性保持力的方法。
45.利用由权利要求25所述的核酸构建物编码的分离的蛋白质使不受调控的ES、iPS或单性生殖干细胞分化的方法，所述不受调控的ES、iPS或单性生殖干细胞另外不响应分化信号。
46.利用由权利要求25所述的核酸构建物编码的分离的蛋白质增强细胞分化、转分化或去分化的方法。
47.治疗个体的方法，包括：
a）从个体得到体细胞；
b）利用权利要求1所述的方法使所述体细胞程序重排成为诱导多潜能干（iPS）细胞；
c）体外培养所述诱导多潜能干（iPS）细胞，以使所述细胞分化成为期望的适于治疗病症的细胞类型；和
d）将所述分化细胞引入所述个体，从而治疗病症。
48.权利要求47所述的方法，其中（c）中所述iPS细胞的分化利用权利要求1所述的方法进行。
49.治疗个体的方法。包括：
a）使细胞接触权利要求25所述的构建物或其表达产物，
b）培养所述细胞以使所述细胞分化、转分化或去分化成期望的适于治疗病症的细胞类型；和
c）将（b）中的细胞引入所述个体，从而治疗病症。
50.权利要求49所述的方法，其中（b）中所述细胞的分化、转分化或去分化利用权利要求1所述的方法进行。
51.进行基于细胞的分析的方法，包括：
a）使细胞接触权利要求25所述的构建物或其表达产物，
b）培养所述细胞以使所述细胞分化、转分化或去分化成期望的适于治疗病症的细胞类型；和
c）使（b）所述的细胞暴露于剂；和
d）检测所述剂对所述细胞的作用。
52.权利要求51所述的方法，其中所述剂是药物或化学组合物。
53.权利要求51所述的方法，进一步包括将（b）所述的细胞用于体外细胞分析和建模系统。
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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Application publication date: 20130130 |