WO2011145615A1 - 多能性幹細胞の製造のための核酸 - Google Patents

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WO2011145615A1
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cells
cell
gene
vector
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榎　竜嗣
敏和 西江
隆宏 円居
扶有子 高島
峰野　純一
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タカラバイオ株式会社
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid for more efficiently producing a pluripotent stem cell having the ability to differentiate into various cells, and an efficient method for producing a pluripotent stem cell using the nucleic acid.
  • Pluripotent stem cells that can differentiate into all cell lineages of organisms have the potential to differentiate into any type of cell and to produce any type of tissue or organ. Therefore, it is expected to be applied to a new treatment method (regenerative medicine) in which the cells are used to regenerate and compensate for lost cells in an organism. Furthermore, it has applicability as a research tool in the fields of embryology, molecular biology, and pharmacy.
  • ES cell embryonic stem cell
  • blastocyst embryonic stem cell
  • pluripotent stem cells which are cell lines induced by artificially introducing genes into somatic cells without using embryos : IPS cells:
  • IPS cells induced pluripotent stem cells
  • the cell is produced by artificially introducing a gene involved in acquiring or maintaining the totipotency of a cell into a somatic cell.
  • active research is being conducted on the production method and usage.
  • Non-patent document 1 introduced human iPS cells by introducing genes encoding four types of polypeptides, OCT4, SOX2, c-MYC, and KLF4, respectively, and expressing these polypeptides individually in the cells. A method is disclosed. In addition, other researchers have reported that human iPS cells were produced by the same operation using genes encoding four kinds of polypeptides of OCT4, SOX2, NANOG, and LIN28 (Non-patent Document 2). ). However, not all somatic cells into which these genes have been introduced are induced by iPS cells, and only a part (0.02% or less of the total number of cells) is actually induced by iPS cells. Not too much.
  • the present inventors previously described a nucleic acid comprising a coding region of a gene encoding five nuclear reprogramming factors of OCT4, KLF4, SOX2, LIN28, and NANOG, which are connected to each other via sequences encoding self-cleaving peptides.
  • OCT4, KLF4, SOX2, LIN28, and NANOG which are connected to each other via sequences encoding self-cleaving peptides.
  • the present inventors have confirmed that iPS cell induction efficiency is changed by a combination of genes encoding nuclear reprogramming factors.
  • iPS cell induction efficiency varies depending on the arrangement (arrangement order) of the genes (Non-patent Document 3).
  • An object of the present invention is to provide a method for producing pluripotent stem cells more efficiently, and to promote research and utilization of the cells.
  • the present inventors can efficiently and stably produce ES cell-like cells suitable for research and other uses from among many nuclear reprogramming factor candidates. A combination of nuclear reprogramming factors was found and the present invention was completed.
  • [1] including coding regions of genes encoding six nuclear reprogramming factors of proteins belonging to the OCT4, KLF4, SOX2, LIN28, NANOG and MYC families connected to each other via sequences encoding self-cleaving peptides Nucleic acid
  • [2] The nucleic acid according to [1], wherein the coding regions of each gene of proteins belonging to the OCT4, KLF4, SOX2, LIN28, NANOG, and MYC families are arranged in order from the 5 ′ end, [3]
  • a vector comprising the nucleic acid according to [1] or [2], [4] (1)
  • the coding region of a gene encoding at least three nuclear reprogramming factors selected from the group consisting of proteins belonging to the OCT4, KLF4, SOX2, LIN28, NANOG and MYC families is included in one molecule.
  • the nucleic acid according to (1) is such that the coding region of a gene encoding at least three nuclear reprogramming factors is selected from a sequence encoding a self-cleaving peptide and an IRES (internal ribosomal entry site) sequence.
  • pluripotent stem cells By using the nucleic acid, the vector, the set of nucleic acids, or the set of vectors of the present invention, pluripotent stem cells can be more efficiently produced, and the pluripotent stem cells have the ability to differentiate into desired cells. It is extremely useful in applied research to basic research and medical development research.
  • nuclear reprogramming factor means a factor involved in nuclear reprogramming among factors related to differentiation, development, or proliferation expressed in ES cells and the like. Many candidates for nuclear reprogramming factors have been reported. For example, Cell, Vol. 126, pages 663-676, 2006 describes 24 candidate nuclear reprogramming factors. Non-Patent Document 2 describes 14 types of nuclear reprogramming factor candidates.
  • the base region of the coding region of the gene encoding the nuclear reprogramming factor used in the present invention can be obtained from registration information of NCBI (National Biotechnology Information Center).
  • NCBI National Biotechnology Information Center
  • a person skilled in the art can obtain a base sequence encoding the C-terminal from the N-terminal of the mature protein or preproprotein of the nuclear reprogramming factor from the base sequence included in the registration information.
  • a primer is designed based on the base sequence, and a DNA fragment encoding a nuclear reprogramming factor can be prepared by PCR or the like using a human cDNA library as a template.
  • the coding region of the wild-type gene can be used as the coding region of the gene encoding the nuclear reprogramming factor used in the present invention. Furthermore, the existence of a plurality of variants (variants) has been reported in the nuclear reprogramming factor, and the coding regions of these variants can also be used in the present invention.
  • a base sequence in which several, preferably 1 to 9, more preferably 1 to 6 bases are artificially substituted, deleted, added or inserted into the base sequence of the coding region of the wild-type gene, A base sequence encoding a polypeptide having the same function as the nuclear reprogramming factor encoded by the type can also be used.
  • a mutant gene has a sequence identity of at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, for example when the sequence is compared to the original sequence using the sequence comparison program BLAST with default settings, or It may mean at least 99%.
  • OCT4 is a transcription factor belonging to the POU family and has been reported as a pluripotency maintenance and undifferentiation marker.
  • the coding region of the gene encoding human OCT4 used in the present invention is RefSeq Acc. No. NM_002701.4.
  • the coding region of the gene encoding human OCT4 is the base sequence represented by base numbers 1405 to 2484 of SEQ ID NO: 13.
  • the coding region of the gene encoding mouse OCT4 used in the present invention is RefSeq Acc. No. It is shown in NM_013633.
  • the coding region of the gene encoding mouse OCT4 is the base sequence represented by base numbers 1396 to 2451 of SEQ ID NO: 10.
  • miRNA-470 a target sequence of miR-470, which is a microRNA (miRNA) that suppresses the expression of the target gene by inhibiting the degradation and translation of mRNA. It suppresses the expression of these target genes. It has been reported that these miRNA target sequences are also conserved in the gene encoding human OCT4. In order to prevent expression inhibition by miRNA after gene introduction, a mutation may be introduced into the coding region of the gene encoding OCT4.
  • KLF4 is a transcription factor that functions as a tumor suppressor or carcinogen.
  • the coding region of the gene encoding human KLF4 used in the present invention is RefSeq Acc. No. NM_004235.3.
  • the coding region of the gene encoding human KLF4 is the base sequence represented by base numbers 2551 to 3960 of SEQ ID NO: 13.
  • the coding region of the gene encoding mouse KLF4 used in the present invention is RefSeq Acc. No. NM — 0103737.
  • the coding region of the gene encoding mouse KLF4 is the base sequence represented by base numbers 2518 to 3966 of SEQ ID NO: 10.
  • SOX2 belongs to the Sox (SRY-related HMG box) gene family and is a transcription factor composed of an HMG domain having a DNA binding ability and a transcription activation domain.
  • the coding region of the gene encoding human SOX2 used in the present invention is RefSeq Acc. No. It is shown in NM_003106.2.
  • the coding region of the gene encoding human SOX2 is the base sequence represented by base numbers 4027 to 4777 of SEQ ID NO: 13.
  • the coding region of the gene encoding mouse SOX2 used in the present invention is RefSeq Acc. No. NM_011443.
  • the coding region of the gene encoding mouse SOX2 is the base sequence shown in base numbers 4051 to 5007 of SEQ ID NO: 10.
  • the miR-134 target sequence is present in the coding region of the gene encoding mouse SOX2, as in the gene encoding OCT4.
  • a mutation may be introduced into the coding region of the gene encoding SOX2.
  • LIN28 is an RNA binding protein that selectively suppresses let-7 miRNA processing.
  • the coding region of the gene encoding human LIN28 used in the present invention is RefSeq Acc. No. NM_024674.4.
  • the coding region of the human LIN28 gene is the base sequence represented by base numbers 5044 to 5670 of SEQ ID NO: 12.
  • the coding region of the gene encoding mouse LIN28 used in the present invention is RefSeq Acc. No. NM_145833.
  • NANOG is a homeobox transcription factor.
  • the coding region of the gene encoding human NANOG used in the present invention is RefSeq Acc. No. It is shown in NM_0244865.2.
  • the coding region of the gene encoding human NANOG is the base sequence represented by base numbers 5743-6657 of SEQ ID NO: 12.
  • the coding region of the gene encoding mouse NANOG used in the present invention is RefSeq Acc. No. XM_132755.
  • Genes encoding proteins belonging to the MYC family used in the present invention include genes encoding c-MYC, genes encoding N-MYC, and genes encoding L-MYC [Journal of Cell Science (J Cell Sci.), 119, 208-216, 2006].
  • the coding region of the gene encoding human c-MYC is RefSeq Acc. No. NM_002467
  • the coding region of the gene encoding human N-MYC is RefSeq Acc. No. NM_005378
  • the coding region of the gene encoding human L-MYC is RefSeq Acc. No. NM_005376.
  • the coding region of the gene encoding human c-MYC contained in the nucleic acid used in the present invention is RefSeq Acc. No. NM_002467.3.
  • the coding region of the gene encoding human c-MYC is the base sequence represented by base numbers 5044 to 6360 of SEQ ID NO: 13.
  • the coding region of the gene encoding mouse c-MYC is RefSeq Acc. No. NM — 010849
  • the coding region of the gene encoding mouse N-MYC is RefSeq Acc. No. NM_008709
  • the coding region of the gene encoding mouse L-MYC is RefSeq Acc. No. NM_008506.
  • the coding region of the gene encoding mouse c-MYC is the base sequence represented by base numbers 5077 to 6393 of SEQ ID NO: 10.
  • self-cleaving peptide means a peptide sequence with a cleavage activity that occurs between two amino acid residues in the peptide sequence itself.
  • self-cleaving peptides include 2A peptides or 2A-like peptides.
  • cleavage occurs between the glycine and proline residues on these peptides. This is caused by a “ribosome skip mechanism” during translation, in which no normal peptide bond is formed between the glycine and proline residues and does not affect downstream translation.
  • the ribosome skip mechanism is known in the art and is used for the expression of multiple proteins encoded by a single messenger RNA (mRNA).
  • the self-cleaving peptide used in the present invention can be obtained from a viral 2A peptide or a 2A-like peptide having the same function.
  • E2A equine rhinitis A virus
  • P2A 2A peptide derived from Porcine teschovirus (PTV-1), and Thosea asina virus (TaV) ) Derived 2A peptide (T2A).
  • T2A having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and P2A having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 can be used.
  • the 2A peptide was reviewed in Expert Opinion on Biological Therapy, Vol. 5, pages 627-638, 2005.
  • an “IRES (internal ribosomal entry site)” sequence refers to a ribosome that facilitates direct entry into the initiation codon of a cistron (protein coding region), eg, AUG, thereby An element that initiates cap-independent translation of genes [Trends Biochem Sci, Vol. 15, No. 12, 477-83, 1990]. Multiple polypeptides are translated from a single mRNA having multiple cistrons linked by an IRES sequence.
  • coding region refers to a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence found in a polypeptide resulting from translation of an mRNA molecule.
  • the nucleic acid may be an isolated and purified nucleic acid molecule. Isolation and purification can be performed using a method that is commonly performed in the art. An isolated and purified nucleic acid molecule is free or substantially free of substances with which the nucleic acid molecule naturally accompanies, eg, other nucleic acid molecules, polypeptides, etc. found with it in cells.
  • somatic cell refers to a cell other than a germ cell among cells constituting an organism. When these somatic cells are brought into contact with a nuclear reprogramming factor, reprogramming takes place and they acquire pluripotency.
  • the first invention of the present invention comprises six nuclear reprogramming factors of proteins belonging to the OCT4, KLF4, SOX2, LIN28, NANOG, and MYC families.
  • the order of the coding regions of the genes encoding the six nuclear reprogramming factors is not limited as long as pluripotent stem cells can be induced.
  • OCT4, KLF4, SOX2, LIN28 A nucleic acid in which the coding regions of protein genes belonging to the NANOG and MYC families are arranged is preferable.
  • the nucleic acid of the first invention of the present invention is transcribed as one mRNA in somatic cells. From the transcribed mRNA, the cleaved form of the polypeptide is translated in the self-cleaving peptide. For example, when the self-cleaving peptide is a 2A peptide, when mRNA transcribed from the nucleic acid of the first invention of the present invention is translated, the ribosome does not link one specific peptide bond within the 2A peptide.
  • the polypeptide encoded on the 5 ′ end side of the peptide sequence and the polypeptide encoded on the 3 ′ end side are translated as different polypeptides.
  • the nuclear reprogramming factor encoded by the nucleic acid occurs as a separate polypeptide. Therefore, the plurality of nuclear reprogramming factors encoded by the nucleic acid of the first invention of the present invention are all expressed with substantially the same number of molecules (equal amount) without lacking one kind.
  • the nucleic acid of the first invention of the present invention includes a plurality of “base sequences encoding self-cleaving peptides”. These may encode self-cleaving peptides having the same amino acid sequence, or may encode self-cleaving peptides having different amino acid sequences. Even if they encode self-cleaving peptides having the same amino acid sequence, the nucleotide sequences may be different from each other. Furthermore, the base sequence may be modified in accordance with the codon usage of the cell in which the nucleic acid of the present invention is expressed. For example, the sequence may be modified into a sequence encoding T2A having the base sequence shown in SEQ ID NOs: 2 to 5 and a sequence encoding P2A having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • the nucleic acid of the first invention of the present invention comprises a gene that can serve as a marker for confirming the expression of a nuclear reprogramming factor (for example, a gene encoding a factor related to drug resistance, a gene encoding a reporter enzyme, or a fluorescent protein).
  • a nuclear reprogramming factor for example, a gene encoding a factor related to drug resistance, a gene encoding a reporter enzyme, or a fluorescent protein.
  • the nucleic acid of the first invention of the present invention can be used by linking with another nucleic acid so as to be expressed under the control of an appropriate promoter.
  • an appropriate promoter any of those that constitutively promote expression and those that are induced by drugs or the like (for example, tetracycline or doxorubicin) can be used.
  • a nucleic acid containing a promoter or other regulatory elements cooperating with the transcription start site for example, an enhancer sequence or a terminator sequence, may be linked.
  • a gene that can serve as a marker for confirming the expression of the nucleic acid (for example, a drug resistance gene, a gene encoding a reporter enzyme, a gene encoding a fluorescent protein, etc. ) May be incorporated.
  • the nucleic acid of the first invention of the present invention can be used by being inserted into a vector for introduction into somatic cells.
  • the vector into which the nucleic acid of the present invention is inserted is not particularly limited, and an appropriate one can be selected from known vectors and used. For example, either a method using a viral vector or a method using a non-viral vector can be used in the present invention. Regarding the details of these vectors, many documents have already been published, and these vectors can be appropriately selected from these documents and used.
  • a vector into which the nucleic acid of the first invention of the present invention has been inserted is also encompassed by the present invention.
  • the above viral vectors are not particularly limited, and are generally known viral vectors used for gene transfer methods, such as retroviral vectors (including oncoretroviral vectors, lentiviral vectors, pseudotype vectors), adenoviruses, and the like.
  • Vectors, adeno-associated virus vectors, simian virus vectors, vaccinia virus vectors, Sendai virus vectors, and the like can be used.
  • an oncoretrovirus vector, a lentivirus vector or an adenovirus vector can be used.
  • the non-viral vector is not particularly limited, and a known non-viral vector used in gene transfer methods, for example, a plasmid vector can be used.
  • a set of nucleic acids containing a gene encoding a nuclear reprogramming factor The second invention of the present invention provides the following set of nucleic acids.
  • A a nucleic acid containing in one molecule the coding region of a gene encoding at least three nuclear reprogramming factors selected from the group consisting of proteins belonging to the OCT4, KLF4, SOX2, LIN28, NANOG and MYC families; and
  • B Other nucleic acids containing the coding region of the gene encoding OCT4.
  • the nuclear reprogramming factors encoded by the nucleic acid (a) are at least three types of nuclear reprogramming factors selected from the group consisting of proteins belonging to the OCT4, KLF4, SOX2, LIN28, NANOG and MYC families.
  • the nucleic acid (a) is a nucleic acid containing a coding region of a gene encoding, for example, three, four, five, or six nuclear reprogramming factors.
  • the nucleic acid of (a) is not limited as long as it can induce pluripotent stem cells.
  • the nucleic acid includes at least a coding region of a gene encoding OCT4 and KLF4, and belongs to at least the OCT4, KLF4, SOX2 and MYC families.
  • Nucleic acids comprising the coding region of the gene encoding the protein, at least including the coding region of the gene encoding OCT4, KLF4, SOX2, LIN28 and NANOG may be used.
  • the order of each nuclear reprogramming factor is not limited as long as pluripotent stem cells can be induced, but the coding regions of genes encoding OCT4 and KLF4 are arranged in order from the 5 ′ end of the nucleic acid of (a).
  • the nucleic acid of (a) above comprises the coding region of a gene encoding a nuclear reprogramming factor contained in the nucleic acid from a sequence encoding a self-cleaving peptide and an IRES sequence. They can be connected to each other through a selected sequence to form a polycistronic nucleic acid.
  • sequence connecting the coding regions of the nuclear reprogramming factor only the sequence encoding the self-cleaving peptide, only the IRES sequence, or both of these sequences can be used.
  • the nucleic acid of the first invention of the present invention can also be used.
  • the nucleic acid of (a) is transcribed as one mRNA containing a sequence encoding a self-cleaving peptide, and cleaved from the transcribed mRNA within the self-cleaving peptide.
  • Forms of the polypeptide are translated.
  • the self-cleaving peptide is a 2A peptide
  • the ribosome does not link a specific single peptide bond in the 2A peptide, and is located on the 5 ′ end side of the 2A peptide sequence.
  • the encoded polypeptide and the polypeptide encoded on the 3 ′ end side are translated as separate polypeptides.
  • the nuclear reprogramming factors encoded by the nucleic acids used in the present invention occur as separate polypeptides. Therefore, a plurality of nuclear reprogramming factors linked by self-cleaving peptides are all expressed with substantially the same number of molecules (equal amount) without lacking one kind.
  • the nucleic acid (a) may contain a plurality of “base sequences encoding self-cleaving peptides”. These may encode self-cleaving peptides having the same amino acid sequence, or may encode self-cleaving peptides having different amino acid sequences. Even if they encode self-cleaving peptides having the same amino acid sequence, the nucleotide sequences may be different from each other. Furthermore, the base sequence may be modified in accordance with the codon frequency of the cell in which the nucleic acid is expressed. For example, a sequence encoding a 2A peptide having the base sequence shown in SEQ ID NOs: 2 to 5 can be used.
  • the nucleic acid of (a) is transcribed as one mRNA containing an IRES sequence, and the ribosome directly enters the cistron start codon contained in the transcribed mRNA. Then, the polypeptide in which the cistron is cleaved is translated.
  • IRES sequence can be used in the present invention.
  • picornavirus derived from picornavirus [Trends Biochem Sci, Vol. 15, No. 12, pp. 477-83, 1990]
  • IRES derived from viruses such as HCV (hepatitis C virus) can be used.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • IRES sequence of mRNA derived from cells including mammalian cells derived from fibroblast growth factor 2, insulin-like growth factor, translation initiation factor eIF4G, yeast transcription factor TFIID and HAP4 can be used.
  • the nucleic acid of the above (a) has both a sequence encoding a self-cleaving peptide and an IRES sequence as a sequence connecting a coding region of a gene encoding a nuclear reprogramming factor.
  • a sequence connecting a coding region of a gene encoding a nuclear reprogramming factor Contains an array.
  • the IRES sequence when used in one place, it encodes the coding region of the gene encoding the first nuclear reprogramming factor and the second nuclear reprogramming factor counted from the 5 ′ end of the nucleic acid. It is preferably arranged between the coding regions of the genes to be processed.
  • the other nucleic acid containing the coding region of the gene encoding (b) OCT4 contained in the nucleic acid set of the second invention of the present invention is transcribed as one mRNA, and OCT4 is translated from the transcribed mRNA. Is done.
  • the nucleic acid (b) is another nucleic acid that is another molecule not linked to the nucleic acid (a), and transcribes mRNA independently of each other.
  • nucleic acid of (a) and the nucleic acid of (b) used in the set of nucleic acids of the second invention of the present invention are used by linking with another nucleic acid so that they are expressed under the control of an appropriate promoter.
  • an appropriate promoter any of those that constitutively promote expression and those that are induced by drugs or the like (for example, tetracycline or doxorubicin) can be used.
  • a nucleic acid containing a promoter or other regulatory elements cooperating with the transcription start site for example, an enhancer sequence or a terminator sequence, may be linked.
  • a gene that can serve as a marker for confirming the expression of the nucleic acid for example, a drug resistance gene, a gene encoding a reporter enzyme, or a gene encoding a fluorescent protein
  • a gene that can serve as a marker for confirming the expression of the nucleic acid for example, a drug resistance gene, a gene encoding a reporter enzyme, or a gene encoding a fluorescent protein
  • the present invention includes a set of vectors in which the nucleic acid (a) and the nucleic acid (b) are inserted into different vectors for introduction into somatic cells.
  • the vector used in the present invention is not particularly limited, and an appropriate one can be selected and used from known vectors. For example, either a method using a viral vector or a method using a non-viral vector can be used in the present invention.
  • a viral vector When a viral vector is used, the nucleic acid (a) and the nucleic acid (b) constituting the nucleic acid set of the present invention are contained in separate virus particles.
  • a set of vectors into which the nucleic acid (a) is inserted and a vector into which the nucleic acid (b) is inserted are also encompassed in the present invention.
  • the above viral vectors are not particularly limited, and are generally known viral vectors used for gene transfer methods, such as retroviral vectors (including oncoretroviral vectors, lentiviral vectors, pseudotype vectors), adenoviruses, and the like.
  • Vectors, adeno-associated virus vectors, simian virus vectors, vaccinia virus vectors, Sendai virus vectors, and the like can be used.
  • an oncoretrovirus vector, a lentivirus vector or an adenovirus vector can be used.
  • the non-viral vector is not particularly limited, and a known non-viral vector used in gene transfer methods, for example, a plasmid vector can be used.
  • the nucleic acid of the first invention of the present invention described in (1) above or the nucleic acid is inserted into a somatic cell.
  • a step of introducing a set of nucleic acids according to the second invention of the present invention described in (2) above or a set of vectors into which the nucleic acids of the set are respectively inserted is performed outside the body.
  • This method can produce pluripotent stem cells more efficiently than conventional methods. For example, about 0.1 to 1.2% of the introduced cells are induced into pluripotent stem cells. .
  • somatic cells derived from mammals such as humans or non-human mammals such as mice, rats, pigs, cows and dogs can be used.
  • the somatic cell used in the method of the present invention is not particularly limited, and any somatic cell can be used.
  • somatic cells such as fibroblasts, preadipocytes, hepatocytes, blood cells, skin keratinocytes, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, adipose stem cells, various cancer cell lines, periodontal ligament fibroblasts or neural stem cells can be used.
  • the somatic cells may be collected from living organisms or established as cell lines. When it is desired to transplant the prepared pluripotent stem cell or a cell differentiated from the cell into a living body, it is preferable to induce the pluripotent stem cell from a somatic cell collected from the living body itself.
  • the step of introducing a nucleic acid or vector into a somatic cell can be appropriately operated depending on the somatic cell and vector to be used.
  • a non-viral vector When a non-viral vector is used, it can be introduced by a method using a carrier such as liposome, cationic lipid, or ligand-polylysine, a calcium phosphate method, an electroporation method, or a particle gun method.
  • a carrier such as liposome, cationic lipid, or ligand-polylysine
  • a calcium phosphate method such as calcium phosphate method
  • an electroporation method such as calcium phosphate
  • a particle gun method a particle gun method.
  • the substance which improves introduction efficiency can also be used in the case of nucleic acid or vector introduction. Examples of substances that improve the introduction efficiency include substances having an activity of binding to a viral vector, such as fibronectin or fibronectin fragments.
  • a fibronectin fragment having a heparin binding site for example, a fragment commercially available as Retronectin (registered trademark, CH-296, manufactured by Takara Bio Inc.) can be used.
  • Retronectin registered trademark, CH-296, manufactured by Takara Bio Inc.
  • the present invention is not particularly limited, the aforementioned substances are particularly suitable for gene transfer using a retroviral vector or a lentiviral vector.
  • the use of fibronectin or fibronectin fragments improves the introduction efficiency in the introduction of nucleic acids into cells by a perforation method (electroporation method, particle gun method, etc.) (International Publication No. 96/17073). Pamphlet).
  • polybrene which is a synthetic polycation having an effect of improving the infection efficiency of retrovirus cells
  • the present inventors use the retroviral vector in the presence of a functional substance having an activity of binding to retrovirus without using polybrene, or the nucleic acid of the first invention of the present invention or the present invention of the present invention.
  • the nucleic acid set of the second invention is introduced into somatic cells, the induction efficiency of pluripotent stem cells is improved as compared with the case of using polybrene, so that pluripotent stem cells can be obtained at a high frequency.
  • a method for producing pluripotent stem cells comprising the step of introducing into a somatic cell in the presence of a functional substance having an activity of binding to a retrovirus.
  • a functional substance having an activity to bind to a retrovirus there is no particular problem as long as it is a substance having the activity.
  • fibronectin fibroblast growth factor, type V collagen, fragment of the above polypeptide , Polylysine or DEAE-dextran.
  • a functional substance having a binding site in a retrovirus derived from the substance can be used in the present invention.
  • the fibronectin fragment those having a heparin-II binding region in the molecule are suitable, and such a fragment is also described in, for example, WO 97/18318.
  • the aforementioned retronectin As a recombinant fibronectin fragment having a heparin-II binding region, the aforementioned retronectin is exemplified. Further, substances functionally equivalent to these functional substances, for example, functional substances having a heparin-binding site can also be used. In addition, a mixture of the functional substance, a polypeptide containing the functional substance, a polymer of the functional substance, a derivative of the functional substance, or the like can be used.
  • a functional substance having an activity to bind to a retrovirus may be used in combination with a functional substance having an activity to bind to a target cell, that is, a somatic cell into which a nucleic acid or vector is to be introduced.
  • a functional substance having target cell binding activity may be used in combination.
  • the functional substance having the target cell binding activity is not particularly limited, and examples thereof include a substance having a ligand that binds to the target cell.
  • ligand examples include cell adhesion proteins (fibronectin, laminin, collagen, etc.) or fragments thereof, hormones, cytokines, antibodies to cell surface antigens, polysaccharides, glycoproteins, glycolipids, glycoproteins or glycolipids derived from glycolipids Or metabolites of target cells.
  • cell adhesion proteins fibronectin, laminin, collagen, etc.
  • the nucleic acid of (a) and the nucleic acid of (b) contained in the set of nucleic acids of the second invention of the present invention or the set of vectors into which the nucleic acids of the set are respectively inserted The amount and ratio can be appropriately set according to the cells to be introduced, the vector to be used, the production efficiency of pluripotent stem cells, and the like.
  • the functional substance is immobilized on a suitable solid phase, for example, a container (plate, petri dish, flask, bag, etc.) used for cell culture or a carrier (microbeads, etc.). Used in.
  • a suitable solid phase for example, a container (plate, petri dish, flask, bag, etc.) used for cell culture or a carrier (microbeads, etc.). Used in.
  • feeder cells feeder cells used for ES cell culture can be used as appropriate. For example, primary cultured cells of mouse 14-15 day embryos, STO cells that are fibroblast-derived cell lines, etc. Cells such as mitomycin C or cells treated with radiation can be used. Culture of somatic cells into which the nucleic acid or the like of the present invention has been introduced is preferably carried out on feeder cells, but ES cell culture methods that do not use feeder cells have also been reported.
  • somatic cells into which the nucleic acid of the first invention of the present invention or the vector into which the nucleic acid is inserted, the set of nucleic acids of the second invention of the present invention or the set of vectors into which the nucleic acid of the set has been inserted, respectively
  • nuclear reprogramming proceeds autonomously, and pluripotent stem cells can be produced from somatic cells.
  • a known medium that can be used for ES cells and iPS cells can be used for the culture.
  • the cell After introducing the nucleic acid or the like of the present invention into a somatic cell, the cell is preferably cultured for a time sufficient for the somatic cell to acquire pluripotency and proliferate.
  • the culture density of somatic cells after introduction is preferably continued at a cell density of 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 5 cells / mL per dish for cell culture, for example.
  • a cell into which a nucleic acid or vector has been introduced is preferably used for a period of, for example, 1 to 12 days, using a medium for culturing normal somatic cells from the time when the step of introducing is performed until the medium is replaced with a medium for ES cells. Is cultured for 2-10 days. Thereafter, the medium is changed to a medium for ES cells, and cultured for, for example, 5 to 40 days, preferably 10 to 35 days.
  • the somatic cells obtained by the above operation have acquired pluripotency, for example, markers unique to undifferentiated cells, such as Rex1, Oct4, Fbx15, NANOG, alkaline phosphatase (ALP), SSEA-3, SSEA-4 It can be easily determined by detecting ABCG-2, E-cadherin, and the like.
  • markers unique to undifferentiated cells such as Rex1, Oct4, Fbx15, NANOG, alkaline phosphatase (ALP), SSEA-3, SSEA-4 It can be easily determined by detecting ABCG-2, E-cadherin, and the like.
  • markers and determination means are described in detail and in detail in known literature (for example, Cell, Vol. 126, pp. 663-676, 2006, Cell, Vol. 131, pp. 861-872, 2007) ).
  • a somatic cell having a DNA in which a marker gene such as GFP is incorporated downstream of the promoter of an ES cell-specific expression gene it is possible to identify a pluripotent stem cell using the expression of the marker gene as an index.
  • the acquisition of pluripotency can also be determined by colony formation.
  • a colony is usually a cell population of 500 to 1000 cells and is known to exhibit a characteristic appearance, so that a colony formed by proliferation of pluripotent stem cells can be easily identified.
  • a cell containing the nucleic acid of the first invention of the present invention or the nucleic acid set of the second invention of the present invention is prepared, Among them, cells that have acquired pluripotency can be selected.
  • a pluripotent stem cell line from which cells having no pluripotency have been removed can be established by isolating colonies of the pluripotent stem cells thus obtained and performing cloning.
  • the pluripotent stem cells thus obtained are induced by applying known differentiation operations to induce desired differentiation, so that nerve cells, cardiomyocytes, hepatocytes, pancreatic cells, adipocytes, epidermal cells, cartilage, intestinal tract Arbitrary cells and tissues such as endoderm tissue can be produced.
  • PrimeSTAR registered trademark
  • MAX PreMix or HS DNA polymerase both Takara Bio
  • cDNA synthesized from HumanBrainPolyA + RNA (Clontech)
  • a primer pair corresponding to the coding region of the gene encoding each nuclear reprogramming factor PCR was performed.
  • the reaction solution is subjected to 1.0% agarose gel electrophoresis, about 1.5 kbp DNA fragment containing hKLF4 gene, about 1 kbp DNA fragment containing hSOX2 gene, and about 1.3 kbp containing hc-MYC gene.
  • the DNA fragments were extracted and purified.
  • a DNA fragment of about 1.1 kbp containing the hOCT4 gene and a DNA of about 0.7 kbp containing the hLIN28 gene was chemically synthesized.
  • T2A and P2A The 2A peptide sequence, T2A and P2A derived from Thesea assigna virus and Porcine teschovirus-1 were obtained from known literature (Nature Biotechnology, Vol. 22, No. 5, pp. 589-94, 2004).
  • the amino acid sequence of T2A is shown in SEQ ID NO: 1.
  • T2A four different base sequences optimized for human codons were designed and named T2A1, T2A2, T2A3, and T2A4, respectively.
  • the respective base sequences are shown in SEQ ID NOs: 2, 3, 4, and 5.
  • the amino acid sequence of P2A is shown in SEQ ID NO: 6, and the base sequence is shown in SEQ ID NO: 7.
  • DNA fragments having the base sequences of T2A1, T2A2, T2A3, T2A4, and P2A were synthesized.
  • Preparation Example 2 Construction of iPS cell induction plasmid pDON5-hc-MYC plasmid and 2A peptide-linked iPS cell induction plasmids pDON5-hOKSM, pDON5-hOKSLM, pDON5-hOKSLNM plasmid RefSeq Acc. No. Based on the sequence information of NM_002467.3 (c-MYC gene), synthetic primers for gene amplification were respectively synthesized.
  • PCR was performed with PrimeSTAR (registered trademark) HS DNA Polymerase (Takara Bio) using a cDNA synthesized from HumanBrainPolyA + RNA (Clontech) as a template and a primer pair corresponding to the c-MYC gene.
  • the reaction solution was subjected to 1.0% agarose gel electrophoresis to obtain a c-MYC gene fragment of about 1.3 kb. This was cleaved with a restriction enzyme and inserted into pDON-5 which was also cleaved with a restriction enzyme, and the resulting plasmid vector was designated as pDON5-hc-MYC.
  • pDON5-hOKS pDON5-hOKSL
  • pDON5-hOKSLN P2A constructed in Preparation Example 1 by directional cloning using In-Fusion Advantage PCR cloning kit (Clontech)
  • T2A4 fragment and c-MYC gene PDON5-hOKSM, pDON5-hOKSLM, and pDON5-hOKSLNM were constructed.
  • the structure of each inserted DNA fragment is shown in Table 2.
  • the primers used for the construction were designed according to the instruction manual of the kit, and the plasmid of Preparation Example 1 and the pDON5-hc-MYC were used as templates.
  • each inserted DNA fragment is shown in FIG.
  • the base sequence of the insert fragment of pDON5-hOKSLNM is shown in SEQ ID NO: 8.
  • Retroviral Vector G3Thi cells (manufactured by Takara Bio Inc.) were treated with 10F-DMEM [10% fetal bovine serum (manufactured by Invitrogen) at 5 ⁇ 10 5 cells / mL. And 50 U / mL penicillin / 50 mg / mL streptomycin (manufactured by Nacalai) -containing D-MEM (manufactured by Sigma)], 4 mL of the suspension was seeded in a 6 cm collagen-coated dish (manufactured by Iwaki), and CO 2 at 37 ° C. The cells were cultured for 24 hours in an incubator.
  • 10F-DMEM 10% fetal bovine serum (manufactured by Invitrogen) at 5 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • OPTI-MEM manufactured by Invitrogen
  • 10 ⁇ L of TransIT (registered trademark) -293 manufactured by Takara Bio Inc.
  • 2 ⁇ g of pGP plasmid manufactured by Takara Bio Inc.
  • 1 ⁇ g of pE-Ampho plasmid Teakara Bio Inc.
  • 2 ⁇ g of each of the recombinant plasmids prepared in Preparation Examples 1 and 2 were added and mixed, and the mixture was further allowed to stand at room temperature for 15 minutes.
  • This mixed solution was added to the above G3Thi cells and the culture was continued.
  • the mixture was replaced with 4 mL of 10F-DMEM medium. After further culturing for 24 hours, the virus-containing medium was collected and filtered through a 0.45 ⁇ m filter to prepare a virus solution containing a retrovirus vector.
  • the virus solution was stored frozen at ⁇ 80 ° C. and dissolved in a 37 ° C. constant temperature water bath at the time of use.
  • retroviral vectors pDON-5 OCT3 / 4-SOX2, LIN28, and NANOG are used to translate OCT4 and SOX2 into polycistronic through IRES (Internal Ribosome Entry Site) derived from Encephalomyocarditis virus.
  • IRES Internal Ribosome Entry Site
  • retroviral vector pDON-5 LIN28-NANOG for translation into polycistronic and the human iPS Cell Generation (registered trademark) Vector Set (manufactured by Takara Bio Inc.) consisting of the retroviral vector pDON-5 KLF4 expressing KLF4 It was.
  • each virus was mixed and then diluted 10 times for use in the experiment. Table 3 shows the vector name and the name of each virus solution.
  • Example 1 Induction of iPS cells (1) Immobilization of retronectin on a culture plate Phosphate buffer aqueous solution (PBS) so that each well of a non-treatment 12-well culture plate (Becton Dickinson) has a concentration of 20 ⁇ g / mL. 1 mL of a retronectin (Takara Bio) solution diluted in step 1 was added and immobilized at 4 ° C. overnight. Thereafter, the solution was removed from each well, washed once with PBS, and stored at 4 ° C. until used for each experiment.
  • PBS Phosphate buffer aqueous solution
  • a virus-coated plate for the second gene transfer was prepared at the same time, and PBS containing 1.5% buminate was added instead of the cell suspension and stored at 4 ° C.
  • the gene transfer by polybrene was performed by the following method. That is, 1 day before culturing, 1 ml of human dermal fibroblasts suspended in 10F-DMEM was seeded in a 12-well culture plate at 4 ⁇ 10 4 cells / mL and cultured for 1 day.
  • Second gene transfer by retroviral vector The second gene transfer was performed on the first day of culture.
  • the cells into which the gene had been transferred the day before were detached and suspended in 10F-DMEM, and then seeded in each well of the virus-coated plate prepared in Example 1- (1).
  • the cell supernatant on which the gene was transferred the day before was removed, and a virus solution prepared by mixing polybrene was added in the same manner as in Example 1- (2), and the culture was continued. In any of the infection methods, the supernatant was removed the next day and 1 mL of 10F-DMEM medium was added, and the culture was continued.
  • Each well 20000 Cells was seeded on the feeder cells and cultured overnight. The next day, the supernatant was removed on the 7th day of culture, and medium for ES cells [80% D-MEM / F-12 (Invitrogen), 20% KnockOut Serum Replacement (Invitrogen), 4 ng / mL human basic FGF] (CALBIOCHEM), 1 ⁇ Non-essential amino acids solution (Lonza), 2 mM L-Glutamine (Lonza), 110 ⁇ M 2-mercaptoethanol (Invitrogen), 50 U / mL penicillin / 50 mg / mL streptomycin 2 mL of each well was added, and the culture was continued until the 28th day of culture. During this time, the medium was changed every two days.
  • Example 2 Induction of iPS cells from periodontal ligament fibroblasts and preadipocytes Human cells other than human adult skin fibroblasts, human periodontal ligament fibroblasts (manufactured by Lonza) and human subcutaneous fat-derived preadipocytes ( Pluripotent stem cells were induced targeting Lonza).
  • Retronectin was immobilized on a culture plate in the same manner as in Example 1- (1). Gene transfer by retronectin was performed twice using the virus solution B shown in Table 3 by the same method as in Examples 1- (2) and (3).
  • As the culture medium SCGM medium (Lonza's stromal cell culture medium kit) is used when cultivating periodontal ligament fibroblasts, and PGM-2 medium (Lonza's preadipocyte culture medium) is used when culturing preadipocytes. Kit-2) was used.
  • Example 2- (1) Seeding onto feeder cells
  • suitable culture media were used for recovering the transgenic cells and culturing up to the seventh day of culture, as in Example 2- (1).
  • (3) Counting of iPS cell colonies The number of iPS cell colonies was counted on the 28th day of culture by the same method as in Example 1- (5). The results are shown in Table 5.
  • pluripotent stem cells can be induced not only from skin fibroblasts but also from periodontal ligament fibroblasts and preadipocytes by using pDON5-hOKSLNM and retronectin.
  • Preparation Example 4 Construction of mouse iPS cell-derived plasmid vectors pDON5-mOct4, pDON5-mKlf4, pDON5-mSox2, pDON5-mc-Myc RefSeq Acc. No. Based on sequence information of NM_013633.2 (mOct4 gene), NM_010637.3 (mKlf4 gene), NM_011443.3 (mSox2 gene), and NM_010849.4 (mc-Myc gene), it has a restriction enzyme recognition sequence for introduction into a vector. Synthetic primers for gene amplification were synthesized.
  • RNA was prepared from Mouse ES cells (manufactured by DS Pharma) and Mouse Splen cells, cDNA was synthesized, and PrimeSTAR (registered trademark) GXL DNA Polymerase (Takara) using a primer pair corresponding to the gene of each nuclear reprogramming factor as a template. PCR was performed by Bio Inc.). Table 6 shows combinations of the template-derived cells and the genes of each nuclear reprogramming factor. After completion of the reaction, the reaction solution is subjected to 1.0% agarose gel electrophoresis, about 1.1 kbp DNA fragment containing mOct4 gene, about 1.5 kbp DNA fragment containing mKlf4 gene, and about 1.0 kbp containing mSox2 gene.
  • DNA fragments of about 1.3 kbp containing the mc-Myc gene were extracted and purified. These DNA fragments were digested with restriction enzymes and retroviral vectors pDON-5 (manufactured by Takara Bio Inc.) that were also digested with restriction enzymes.
  • -MSox2 and pDON5-mc-Myc is shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.
  • Preparation Example 5 Construction of 2A peptide-linked mouse iPS cell-derived plasmid vectors pDON5-mOKS, pDON5-mOKSM and pDON5-mOKSMO A DNA fragment derived from the coding region of the gene encoding the nuclear reprogramming factor of Preparation Example 4 and of Preparation Example 1 Using the DNA fragment encoding the 2A peptide, subcloning into a vector, PCR, restriction enzyme digestion, and ligation reaction are repeated, and the coding region of the gene encoding the nuclear reprogramming factor and the DNA fragment encoding the 2A peptide are at the 5 ′ end A DNA fragment containing mOct4, T2A1, mKlf4, T2A2, and mSox2 in this order was prepared.
  • This DNA fragment was inserted into the retroviral vector pDON-5 DNA, and the resulting plasmid vector was named pDON5-mOKS.
  • Table 7 shows the structure of the inserted DNA fragment of the plasmid vector.
  • pDON5-mOKSM in which a T2A3 fragment and a DNA fragment encoding mc-Myc are further linked to pDON5-mOKS by directional cloning
  • pDON5-mOKSMO was constructed in which a T2A4 fragment and a DNA fragment encoding mOct4 were linked.
  • Primers used for the construction were designed according to the instruction manual of the kit, pDON5-mOKS and pDON5-mOKSM were used as templates for the linearization vector, and pDON5-mc-Myc constructed in Preparation Example 4 was used as the template for the inserted gene. pDON5-mOct4 was used.
  • the structure of the inserted DNA fragment of each plasmid vector is shown in Table 7, and the base sequence of pDON5-mOKSM is shown in SEQ ID NO: 10 of the Sequence Listing.
  • Preparation Example 6 Construction of Mouse iPS Cell Induced Plasmid Vector pDON5-mO-IR-KSM pDON5, a retroviral vector in which one T2A1 sequence of the retroviral vector pDON5-mOKSM constructed in Preparation Example 5 is replaced with the sequence of IRES2 -MO-IR-KSM was constructed.
  • the IRES2 fragment was amplified by PCR using pIRES2-ZsGreen (manufactured by Clontech) as a template, and directional cloning was performed using the In-Fusion Advantage PCR cloning kit to obtain the pDON5-mO-IR-KSM plasmid.
  • Primers used for the construction were designed according to the instruction manual of the kit, and pDON5-mOKSM of Preparation Example 2 was used as a template for the linearized vector.
  • the structure of the inserted DNA fragment is shown in Table 8, and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing.
  • Preparation Example 7 Construction of 2A peptide-linked human iPS cell-derived plasmid vectors pDON5-hOKS, pDON5-hOKSLN, pDON5-hOKSM, and pDON5-hOCT4 DNA fragment derived from the coding region of the gene encoding the nuclear reprogramming factor of Preparation Example 1 And the DNA fragment encoding the 2A peptide, repeated subcloning into the vector, PCR, restriction enzyme digestion, ligation reaction, and 5 ′ of the coding region of the gene encoding the nuclear reprogramming factor and the DNA fragment encoding the 2A peptide.
  • DNA fragments were prepared from the ends in the order shown in Table 9, and inserted into the retroviral vector pDON-5 DNA to prepare pDON5-hOKS and pDON5-hOKSLN.
  • the base sequence of pDON5-hOKSLN is shown in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing.
  • pDON5-hOKSM was constructed in which the T2A4 fragment and a DNA fragment encoding hc-MYC were further linked to the pDON5-hOKS.
  • the structure of the inserted DNA fragment is shown in Table 9.
  • Primers used for the construction were designed according to the instruction manual of the kit, and pDON5-hOKS and pDON5-hc-MYC in which a DNA fragment encoding hc-MYC was inserted into pDON5 DNA were used as templates.
  • the base sequence of pDON5-hOKSM is shown in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing.
  • the artificially synthesized DNA fragment encoding the aforementioned hOCT4 was inserted into the retroviral vector pDON-5 DNA, and the resulting plasmid vector was designated as pDON5-hOCT4.
  • the base sequence of pDON5-hOCT4 is shown in SEQ ID NO: 14 in the sequence listing.
  • Retroviral Vector G3T-hi cells (manufactured by Takara Bio Inc.) were treated with 10F-DMEM [10% fetal bovine serum (Hyclone) to 5 ⁇ 10 5 cells / mL. 1% penicillin / streptomycin (manufactured by Nacalai Tesque) -containing D-MEM (manufactured by Sigma)], 4 mL of the suspension was seeded in a 6 cm collagen-coated dish (manufactured by Iwaki), and a CO 2 incubator at 37 ° C. For 24 hours.
  • 10F-DMEM 10% fetal bovine serum (Hyclone) to 5 ⁇ 10 5 cells / mL. 1% penicillin / streptomycin (manufactured by Nacalai Tesque) -containing D-MEM (manufactured by Sigma)
  • 4 mL of the suspension was seeded in a 6 cm collagen-coated dish (manufactured
  • OPTI-MEM manufactured by Invitrogen
  • 10 ⁇ L of TransIT-293 manufactured by Takara Bio Inc.
  • 2 ⁇ g of pGP plasmid manufactured by Takara Bio Inc.
  • 1 ⁇ g of pE-Eco plasmid Manufactured by Takara Bio Inc.
  • pE-Ampho plasmid manufactured by Takara Bio Inc.
  • This mixed solution was added to the G3T-hi cells and the culture was continued. After 24 hours, the mixture was replaced with 4 mL of 10F-DMEM. After further culturing for 24 hours, the virus-containing medium was collected and filtered through a 0.45 ⁇ m filter to prepare a virus solution containing a retrovirus vector. When not used immediately after preparation, the virus solution was stored frozen at ⁇ 80 ° C. and thawed before use.
  • Example 3 Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast (MEF) MEF was prepared as a target cell for iPS cell induction. The preparation was performed according to the method described in the paper. [Takahashi K, et al., Nature Protocol, Vol. 2, pages 3081-3089, 2007]
  • Example 4 Induction of mouse iPS cells (1) Immobilization of retronectin on culture plate Phosphate buffer aqueous solution (PBS) so that each well of a non-treatment 12-well culture plate (Becton Dickinson) has a concentration of 25 ⁇ g / mL. 1 ml each of the RetroNectin (registered trademark, manufactured by Takara Bio Inc.) solution diluted in (1) was added and immobilized at 4 ° C. overnight. Thereafter, the solution was removed from each well, washed twice with 1 mL of PBS, and stored at 4 ° C. until used for each experiment.
  • PBS Phosphate buffer aqueous solution
  • the supernatant was removed from each well, washed once with PBS containing 1.5% HSA (Human Serum Albumin), and suspended in 10F-DMEM to 4 ⁇ 10 4 cells / mL. 3 mL of 3 MEFs were seeded in each well. After sowing, the plate was cultured in a 37 ° C. CO 2 incubator (culture day 0). The medium was changed on the first day and the third day of culture.
  • HSA Human Serum Albumin
  • a 6-well culture plate (manufactured by Corning) is added with a gelatin (Sigma) aqueous solution having a final concentration of 1 mg / mL and fixed at room temperature for 1 hour or overnight at 4 ° C and then washed. Thus, a gelatin-fixed petri dish was prepared.
  • SNL76 / 7 cells (DS Pharma) treated with mitomycin C (manufactured by Nacalai Tesque) at a final concentration of 12 ⁇ g / mL were seeded at 1 ⁇ 10 6 cells per plate in a 37 ° C. CO 2 incubator. Feeder cells were prepared by culturing overnight.
  • the gene-introduced cells on the fourth day of culture prepared in Example 4- (2) are collected, and the conditions A, B, D, F, H, I, and J in the table are 5 ⁇ 10 3 cells / mL. Suspended in 10F-DMEM, conditions C, E, and G were suspended in 10F-DMEM so as to be 1.5 ⁇ 10 3 cells / mL. 2 mL of this suspension was seeded on the feeder cells, and the culture was continued.
  • mice ES cells On the day after seeding, the culture supernatant was removed, and the medium for mouse ES cells [85% knockout DMEM (manufactured by Invitrogen), 15% knockout serum replacement (manufactured by Invitrogen), 1 ⁇ non-essential amino acid mixture (manufactured by LONZA), 1 mM 2 mL of sodium pyruvate (LONZA), 2 mM L-glutamine (LONZA), 100 ⁇ M 2-mercaptoethanol (Invitrogen)] were added, and the culture was continued until the 28th day of culture. During this time, the medium was changed every 1-2 days.
  • the retroviral vector in which the 4 factors are bound by the 2A peptide is much less efficient than the retrovirus vector in which the 4 factors are individually loaded.
  • the induction efficiency is dramatically increased by mixing a retroviral vector carrying mOct4 alone.
  • the induction efficiency was very low in the retroviral vector in which 4 factors + mOct4 were connected by 2A peptide as in Condition D, and simply increasing the expression level of Oct4 did not improve the induction efficiency.
  • Condition F using a vector loaded with mOct4 and mKlf4 changed from 2A peptide to IRES is about 8 times more efficient than the condition of B loaded with all 2A peptides.
  • factors downstream of IRES are known to have lower translational efficiency than upstream, and therefore strong expression of any of the inducers downstream from IRES (mKlf4, mSox2, mc-Myc) This was thought to be due to negative effects on induction.
  • the induction efficiency dramatically increases under the condition G in which the mOct4-only retrovirus vector is added to the F condition.
  • Example 5 Establishment of mouse iPS cell clones iPS cell colonies derived from the condition G of Example 4 (pDON5-mO-IR-KSM, pDON5-mOct4) were picked up to prepare iPS cell clones for use in various assays. .
  • ES cell FBS manufactured by Invitrogen
  • Example 6 Confirmation of Expression of Mouse ES Cell Marker Gene It was confirmed by RT-PCR whether each iPS cell clone established in Example 5 expressed a mouse ES cell marker gene. Note that mouse ES cells were used as a positive control.
  • cDNA synthesis cDNA was synthesized using the total RNA extracted in Example 6- (1) as a template.
  • PrimeScript registered trademark
  • RT reagent Kit Perfect RealTime
  • a premix was prepared according to the protocol for SYBR Green Assay, and 200 ng of total RNA was added.
  • TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient manufactured by Takara Bio Inc.
  • PCR was carried out using 10 ng as a template in terms of the total RNA amount of the cDNA obtained in Example 6- (2).
  • sterilized distilled water was added to make a total volume of 25 ⁇ L.
  • reaction solution is set in TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient, 10 cycles at 98 ° C, 15 seconds at 60 ° C, 15 seconds at 68 ° C, and 35 cycles when Fbx15 is detected. Other gene transcripts At the time of detection, 30 cycles of reaction were performed.
  • Example 7 Confirmation of Expression of SSEA-1 (Stage-specific Embryonic Antigen-1) Cell Surface Marker It was confirmed by immunostaining whether the iPS cell clone established in Example 5 expressed the cell surface marker of ES cell. .
  • Example 8 Evaluation of iPS cell clone pluripotency in vivo
  • the iPS cell clone established in Example 5 has pluripotency in the same manner as mouse ES cells, it was transplanted subcutaneously into SCID mice and teratoma. The forming ability was evaluated.
  • Example 8- (1) Subcutaneous administration of iPS cell suspension to SCID mice
  • the iPS cell suspension prepared in Example 8- (1) was subcutaneously administered to SCID mice at 5 ⁇ 10 5 cells / 100 ⁇ L.
  • Example 4 Since the tissue derived from the three germ layers [ectoderm, endoderm, mesoderm] was observed, the condition G of Example 4 (pDON5-mO It was possible to evaluate that iPS cell clones established from -IR-KSM, pDON5-mOct4) have pluripotency.
  • Example 9 Verification of additional effect of retroviral vector loaded with OCT4 alone
  • iPS cell induction was performed using human fibroblasts.
  • nuclear reprogramming factors a combination of 4 factors hOCT4, hSOX2, hKLF4 and hc-MYC, and a combination of 5 factors hOCT4, hSOX2, hKLF4, hLIN28 and hNANOG not containing hc-MYC were examined. .
  • the supernatant was removed from each well, washed once with PBS containing 1.5% HSA, and then 1 mL of human skin fibroblasts suspended in 10F-DMEM to 4 ⁇ 10 4 cells / mL. Each well was seeded in each well. After sowing, the plate was cultured in a 37 ° C. CO 2 incubator (culture day 0). The medium was changed on the first day and the third day of the culture.
  • Example 9- (2) The gene-introduced cells on the sixth day of culture prepared in Example 9- (2) were collected and suspended in 10F-DMEM so as to be 5 ⁇ 10 3 cells / mL. 2 mL of this suspension was seeded on the feeder cells, and the culture was continued.
  • the culture supernatant was removed, and medium for human ES cells (80% DMEM / F12 (Invitrogen), 20% knockout serum replacement, 1 ⁇ non-essential amino acid mixture, 2 mM L-glutamine, 100 ⁇ M 2-mercaptoethanol) 2 ng of 4 ng / mL bFGF (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)) was added, and the culture was continued until the 28th day of culture. During this time, the medium was changed every 1-2 days.
  • medium for human ES cells 80% DMEM / F12 (Invitrogen), 20% knockout serum replacement, 1 ⁇ non-essential amino acid mixture, 2 mM L-glutamine, 100 ⁇ M 2-mercaptoethanol) 2 ng of 4 ng / mL bFGF (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • the present invention provides a nucleic acid group and a vector group for efficiently producing pluripotent stem cells.
  • the nucleic acid group and vector group are used in a method for efficiently and safely producing pluripotent stem cells, and are extremely useful in basic research and medical application research fields.
  • SEQ ID NO: 1 T2A peptide fragment
  • SEQ ID NO: 2 Nucleotide sequence of T2A1 DNA fragment
  • SEQ ID NO: 3 Nucleotide sequence of T2A2 DNA fragment
  • SEQ ID NO: 4 Nucleotide sequence of T2A3 DNA fragment
  • SEQ ID NO: 5 Nucleotide sequence of T2A4 DNA fragment
  • SEQ ID NO: 6 P2A peptide fragment
  • SEQ ID NO: 7 Nucleotide sequence of P2A DNA fragment
  • SEQ ID NO: 8 Nucleotide sequence of pDON5-hOKSLNM insertion fragment
  • SEQ ID NO: 9 Nucleotide sequence of pDON5-mOct4
  • SEQ ID NO: 10 Nucleotide sequence of pDON5-mOKSM
  • SEQ ID NO: 11 Nucleotide sequence of pDON5-mO-IR-KSM
  • SEQ ID NO: 12 Nucleotide sequence of

Abstract

　本発明は、多能性幹細胞を効率よく製造するための方法を提供し、当該細胞の研究ならびに利用を促進することを課題とする。本発明は、相互に自己切断ペプチドをコードする配列を介して接続されたＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ及びＭＹＣファミリーに属するタンパク質の６種の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域を含む核酸、又は（ａ）相互に自己切断ペプチドをコードする配列又はＩＲＥＳ配列を介して接続されたＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ及びＭＹＣファミリーに属するタンパク質の６種の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域から選択された領域を含む核酸、及び（ｂ）ＯＣＴ４をコードする遺伝子のコード領域を含む他の核酸、そして当該核酸を含むベクターのセットを提供する。

Description

多能性幹細胞の製造のための核酸
　本発明は、種々の細胞への分化能力を保持した多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）をより効率よく製造するための核酸及び当該核酸を使用する多能性幹細胞の効率のよい製造方法に関する。
　生物体のすべての細胞系列に分化可能な多能性幹細胞は、任意のタイプの細胞に分化し、また、任意のタイプの組織又は器官等を生みだす潜在的能力を有している。そのため、当該細胞を使用して、生物体において失われた細胞を再生し補うという新しい治療法（再生医療）に応用することが期待されている。更に、発生学、分子生物学、薬学分野における研究ツールとしても利用可能性を有している。
　多能性幹細胞として、胚盤胞と呼ばれる段階の初期胚のうちの内部細胞塊から樹立される細胞株である胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）が知られている。しかしながら、ヒト胚を破壊して作製されるヒトＥＳ細胞は倫理的観点からの反対も多く、その研究が制限されるケースも少なくない。
　これらＥＳ細胞の問題点を解消するため、胚を使用することなく体細胞に人為的に遺伝子を導入して誘導される細胞株である多能性幹細胞（誘導多能性幹細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞：例えば非特許文献１）が開発された。当該細胞は細胞の全能性の獲得や維持に関与する遺伝子を人為的に体細胞に導入することにより作製される。現在、その作製手法、利用方法に関して、盛んに研究が進められている。
　前記の非特許文献１にはＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ及びＫＬＦ４の４種のポリペプチドをそれぞれコードする遺伝子を導入し、これらポリペプチドを細胞内で個別に発現させることによってヒトｉＰＳ細胞を作製する方法が開示されている。また、他の研究者からはＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８の４種のポリペプチドをコードする遺伝子を用いた同様の操作によってヒトｉＰＳ細胞を作製したとの報告がなされている（非特許文献２）。しかしこれらの遺伝子を導入されたすべての体細胞がｉＰＳ細胞に誘導されることはなく、実際にはその一部のみ（総細胞数の０．０２％以下）がｉＰＳ細胞へと誘導されるに過ぎない。本発明者らは先に、相互に自己切断ペプチドをコードする配列を介して接続されたＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧの５種の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域を含む核酸を含有するベクターを開発し、ｉＰＳ細胞誘導効率の改善に成功した。その一方で、本発明者らは核初期化因子をコードする遺伝子の組合わせによりｉＰＳ細胞誘導効率が変化することを確認している。また、複数の核初期化因子をコードする遺伝子を保持するベクターでは、前記遺伝子の配置（並び順）によりｉＰＳ細胞誘導効率が変化することが報告されている（非特許文献３）。更に、従来報告されているベクターを使用してもｉＰＳ細胞誘導の材料とする細胞の種類によっては高い効率でのｉＰＳ細胞の取得に困難な場合がある。このように、未だ細胞研究用や臨床研究用のｉＰＳ細胞作製技術は十分に確立したとはいえない状況にある。
セル（Ｃｅｌｌ）、第１３１巻、８６１－８７２頁、２００７年 サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第３１８巻、１９１７－１９２０頁、２００７年 サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第３２２巻、９４９－９５３頁、２００８年
　多能性幹細胞の利用を図るためには、当該細胞を更に効率よく製造する手法の開発が急務である。本発明の目的は、多能性幹細胞をより効率よく製造するための方法を提供し、当該細胞の研究ならびに利用を促進することにある。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、多くの核初期化因子の候補の中から、研究やその他の用途に適したＥＳ細胞様の細胞を効率よく安定して製造できる核初期化因子の組合せを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明を概説すれば、
［１］相互に自己切断ペプチドをコードする配列を介して接続されたＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ及びＭＹＣファミリーに属するタンパク質の６種の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域を含む核酸、
［２］５’末端より順にＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ、ＭＹＣファミリーに属するタンパク質のそれぞれの遺伝子のコード領域が並んで配置されている［１］記載の核酸、
［３］［１］又は［２］に記載の核酸を含むベクター、
［４］（１）ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ及びＭＹＣファミリーに属するタンパク質からなる群より選択される少なくとも３種の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域を１つの分子内に含む核酸、及び
（２）ＯＣＴ４をコードする遺伝子のコード領域を含む他の核酸、
を含む核酸のセット、
［５］（１）の核酸が、少なくとも３種の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域が、自己切断ペプチドをコードする配列及びＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ）配列から選択される配列を介して相互に接続された核酸である、［４］に記載の核酸のセット、
［６］（１）の核酸において、少なくとも３種の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域のうち、５’末端の２種のコード領域が順にＯＣＴ４、ＫＬＦ４をコードする遺伝子のコード領域であり、それらがＩＲＥＳ配列を介して接続されている、［４］又は［５］に記載の核酸のセット、
［７］［４］～［６］のいずれか１項に記載の核酸のセットを構成する核酸をそれぞれ含む２種のベクターからなるベクターのセット、
［８］［１］に記載の核酸又は［４］に記載の核酸のセットを含む細胞、
［９］体細胞に［１］に記載の核酸又は［４］に記載の核酸のセットを導入する工程を包含することを特徴とする、多能性幹細胞の製造方法、
［１０］ベクターを使用して核酸又は核酸のセットを体細胞に導入する［９］記載の多能性幹細胞の製造方法、
［１１］核酸又は核酸のセットを導入する工程がフィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントの存在下に実施される［９］記載の方法、
［１２］体細胞に［３］に記載のベクター又は［７］に記載のベクターのセットを導入して多能性幹細胞を製造する工程、及び前記の多能性幹細胞の分化を誘導する工程、を包含することを特徴とする、分化細胞の製造方法、
に関する。
　本発明の核酸、ベクター、核酸のセット、又はベクターのセットを使用することにより多能性幹細胞をより効率よく製造することが可能であり、当該多能性幹細胞は所望の細胞への分化能を有しており、基礎研究、医療開発研究への応用研究において極めて有用である。
実施例において作製した多能性幹細胞のマーカー遺伝子の発現を示す図である。 実施例において作製した多能性幹細胞の細胞表面マーカーの発現を示す図である。 実施例において作製した多能性幹細胞の多分化能を示す図である。 実施例において作製した核酸の構造を示す図である。
　以下に本発明について詳細に説明する。
　本明細書において「核初期化因子」とは、ＥＳ細胞などで発現している分化、発生又は増殖などに関係する因子のうち、核の初期化（リプログラミング）に関与する因子を意味する。核初期化因子となる候補は多数報告されている。例えば、セル（Ｃｅｌｌ）、第１２６巻、６６３－６７６頁、２００６年には、２４種の核初期化因子の候補が記載されている。非特許文献２には、１４種の核初期化因子の候補が記載されている。
　本発明に使用される核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域は、ＮＣＢＩ（米国国立バイオテクノロジー情報センター）の登録情報からその塩基配列を入手することができる。当業者は登録情報に含まれる塩基配列から、核初期化因子の成熟タンパク質又はプレプロタンパク質のＮ末端からＣ末端をコードする塩基配列を入手することができる。次に、前記塩基配列に基づいてプライマーを設計し、ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲなどにより核初期化因子をコードするＤＮＡフラグメントを調製することができる。
　本発明に使用される核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域には、野生型遺伝子のコード領域が使用できる。更に、前記核初期化因子には複数の変異型（バリアント）の存在が報告されており、これらの変異型遺伝子のコード領域も本発明に使用できる。野生型遺伝子のコード領域の塩基配列に人為的に数個、好ましくは１～９個、より好ましくは１～６個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列であって、野生型がコードする核初期化因子と同様の機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列も使用できる。あるいは、変異型遺伝子は、例えば配列比較プログラムＢＬＡＳＴをデフォルト設定で用いてその配列を元の配列と比較したとき、配列同一性が少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であることを意味していてもよい。
　ＯＣＴ４は、ＰＯＵファミリーに属する転写因子で、多能性の維持、未分化マーカーとして報告されている。本発明に使用されるヒトＯＣＴ４をコードする遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００２７０１．４に示される。例えば、ヒトＯＣＴ４をコードする遺伝子のコード領域は、配列番号１３の塩基番号１４０５～２４８４に示される塩基配列である。本発明に使用されるマウスＯＣＴ４をコードする遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿０１３６３３に示される。例えば、マウスＯＣＴ４をコードする遺伝子のコード領域は、配列番号１０の塩基番号１３９６～２４５１に示される塩基配列である。
　また、マウスＯＣＴ４をコードする遺伝子のコード領域には、ｍＲＮＡの分解と翻訳の阻害によって標的遺伝子の発現を抑制するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であるｍｉＲ－４７０の標的配列が存在し、分化した細胞においてこれらの標的遺伝子の発現を抑制している。これらのｍｉＲＮＡ標的配列はヒトＯＣＴ４をコードする遺伝子においても保存されていることが報告されている。遺伝子導入後にｍｉＲＮＡによる発現阻害が起こることを防ぐためにＯＣＴ４をコードする遺伝子のコード領域に変異を導入してもよい。
　ＫＬＦ４は、腫瘍抑制因子又は発癌因子として機能する転写因子である。本発明に使用されるヒトＫＬＦ４をコードする遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００４２３５．３に示される。例えば、ヒトＫＬＦ４をコードする遺伝子のコード領域は、配列番号１３の塩基番号２５５１～３９６０に示される塩基配列である。本発明に使用されるマウスＫＬＦ４をコードする遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿０１０６３７に示される。例えば、マウスＫＬＦ４をコードする遺伝子のコード領域は、配列番号１０の塩基番号２５１８～３９６６に示される塩基配列である。
　ＳＯＸ２は、Ｓｏｘ（ＳＲＹ－ｒｅｌａｔｅｄ　ＨＭＧ　ｂｏｘ）遺伝子ファミリーに属し、ＤＮＡ結合能を持つＨＭＧドメインと転写活性化ドメインから成る転写因子である。本発明に使用されるヒトＳＯＸ２をコードする遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００３１０６．２に示される。例えば、ヒトＳＯＸ２をコードする遺伝子のコード領域は、配列番号１３の塩基番号４０２７～４９７７に示される塩基配列である。本発明に使用される、マウスＳＯＸ２をコードする遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿０１１４４３に示される。例えば、マウスＳＯＸ２をコードする遺伝子のコード領域は、配列番号１０の塩基番号４０５１～５００７に示される塩基配列である。
　また、マウスＳＯＸ２をコードする遺伝子のコード領域には、前記ＯＣＴ４をコードする遺伝子と同様にｍｉＲ－１３４の標的配列が存在する。遺伝子導入後にｍｉＲＮＡによる発現阻害が起こることを防ぐためにＳＯＸ２をコードする遺伝子のコード領域に変異を導入してもよい。
　ＬＩＮ２８は、選択的にｌｅｔ－７ｍｉＲＮＡプロセシングを抑制するＲＮＡ結合タンパク質である。本発明に使用されるヒトＬＩＮ２８をコードする遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿０２４６７４．４に示される。例えば、ヒトＬＩＮ２８遺伝子のコード領域は、配列番号１２の塩基番号５０４４～５６７０に示される塩基配列である。本発明に使用されるマウスＬＩＮ２８をコードする遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿１４５８３３に示される。
　ＮＡＮＯＧは、ホメオボックス転写因子である。本発明に使用されるヒトＮＡＮＯＧをコードする遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿０２４８６５．２に示される。例えば、ヒトＮＡＮＯＧをコードする遺伝子のコード領域は、配列番号１２の塩基番号５７４３～６６５７に示される塩基配列である。本発明に使用されるマウスＮＡＮＯＧをコードする遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＸＭ＿１３２７５５に示される。
　本発明で使用されるＭＹＣファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子は、ｃ－ＭＹＣをコードする遺伝子、Ｎ－ＭＹＣをコードする遺伝子、Ｌ－ＭＹＣをコードする遺伝子が含まれる［ジャーナル　オブ　セル　サイエンス（Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ．）、第１１９巻、２０８－２１６頁、２００６年］。
　例えば、ヒトｃ－ＭＹＣをコードする遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００２４６７、ヒトＮ－ＭＹＣをコードする遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００５３７８、ヒトＬ－ＭＹＣをコードする遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００５３７６に示される。本発明の一態様として、本発明に使用される核酸に含まれるヒトｃ－ＭＹＣをコードする遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００２４６７．３に示される。例えば、ヒトｃ－ＭＹＣをコードする遺伝子のコード領域は、配列番号１３の塩基番号５０４４～６３６０に示される塩基配列である。
　マウスｃ－ＭＹＣをコードする遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿０１０８４９、マウスＮ－ＭＹＣをコードする遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００８７０９、マウスＬ－ＭＹＣをコードする遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００８５０６に示される。例えば、マウスｃ－ＭＹＣをコードする遺伝子のコード領域は、配列番号１０の塩基番号５０７７～６３９３に示される塩基配列である。
　本明細書において「自己切断ペプチド」とは、ペプチド配列自体の中の２つのアミノ酸残基の間に生じる切断活性を伴うペプチド配列を意味する。自己切断ペプチドとしては、例えば２Ａペプチド又は２Ａ様ペプチドが例示される。例えば２Ａペプチド又は２Ａ様ペプチドでは、切断はこれらのペプチド上のグリシン残基とプロリン残基との間で生じる。これは翻訳の間に、グリシン残基とプロリン残基との間の正常なペプチド結合の形成が行われない「リボソームスキップ機構」によって生じ、下流の翻訳には影響することはない。リボソームスキップ機構は当分野において知られており、そして１分子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によりコードされる複数のタンパク質の発現のために使用される。
　本発明で使用する自己切断ペプチドは、ウイルスの２Ａペプチド又はそれと同等の機能を有する２Ａ様ペプチドから得ることが可能である。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来の２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）由来の２Ａペプチド（Ｅ２Ａ）、Ｐｏｒｃｉｎｅ　ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ（ＰＴＶ－１）由来の２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）及びＴｈｏｓｅａ　ａｓｉｇｎａ　ｖｉｒｕｓ（ＴａＶ）由来の２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）から成る群から選択することができる。例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＴ２Ａ、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＰ２Ａを使用することができる。２Ａペプチドは、エキスパート　オピニオン　オン　バイオロジカル　セラピー、第５巻、６２７－６３８頁、２００５年に総説されている。
　本明細書において「ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ：内部リボソーム進入部位）」配列とは、リボソームがシストロン（タンパク質コード領域）の開始コドン、例えばＡＵＧへ直接的に進入することを促進し、それによって、遺伝子のキャップ非依存的な翻訳を開始させるエレメントをいう［トレンズ　イン　バイオケミカル　サイエンス（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｓｃｉ）、第１５巻、第１２号、第４７７－８３頁、１９９０年］。ＩＲＥＳ配列により連結された複数のシストロンを有する単一のｍＲＮＡから、複数のポリペプチドが翻訳される。
　本明細書において「コード領域」とは、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果生じるポリペプチドに見られるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をいう。
　本発明において、核酸は単離精製された核酸分子であってもよい。単離精製は、当該技術分野において通常実施される方法を用いて行うことができる。単離精製された核酸分子は、当該核酸分子が天然に随伴する物質、例えば細胞においてそれと共に見出される他の核酸分子、ポリペプチド等を含まないか、または実質的に含まない。
　本明細書において「体細胞」とは、生物を構成する細胞のうち、生殖細胞以外の細胞のことを示す。これら体細胞は、核初期化因子を接触させることにより、リプログラミングが起こり、多能性を獲得する。
（１）６種の核初期化因子をコードする遺伝子を含む核酸
　本発明の第１の発明は、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ、ＭＹＣファミリーに属するタンパク質の６種の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域を含み、それぞれの遺伝子のコード領域の間に自己切断ペプチドをコードする配列を含む核酸である。前記６種の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域の順は、多能性幹細胞を誘導し得る限りにおいて限定はないが、例えば核酸の５’末端から順にＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ、ＭＹＣファミリーに属するタンパク質遺伝子のそれぞれのコード領域が並ぶ核酸が好ましい。
　本発明の第１の発明の核酸は体細胞内で１つのｍＲＮＡとして転写される。転写されたｍＲＮＡからは自己切断ペプチド内において切断された形態のポリペプチドが翻訳される。例えば自己切断ペプチドが２Ａペプチドである場合、本発明の第１の発明の核酸から転写されたｍＲＮＡが翻訳される時に、リボソームは２Ａペプチド内において特定の１カ所のペプチド結合を連結せず、２Ａペプチド配列の５’末端側にコードされるポリペプチドと３’末端側にコードされるポリペプチドを別のポリペプチドとして翻訳する。結果、前記の核酸にコードされる核初期化因子は別々のポリペプチドとして生じる。
　したがって、本発明の第１の発明の核酸がコードする複数の核初期化因子は、１種も欠けることなくすべて、ほぼ同じ分子数（等量）で発現する。
　本発明の第１の発明の核酸は複数の「自己切断ペプチドをコードする塩基配列」を含む。これらは、同じアミノ酸配列の自己切断ペプチドをコードするものであってもよく、異なるアミノ酸配列の自己切断ペプチドをコードするものであってもよい。同じアミノ酸配列の自己切断ペプチドをコードするものであっても、塩基配列がそれぞれ異なっていてもよい。更に、本発明の核酸が発現される細胞のコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）に合わせて、塩基配列を改変させてもよい。例えば、配列番号２～５に示される塩基配列を有するＴ２Ａをコードする配列、配列番号７に示される塩基配列を有するＰ２Ａをコードする配列に改変させてもよい。
　更に、本発明の第１の発明の核酸は、核初期化因子の発現を確認するためのマーカーとなりうる遺伝子（例えば薬剤耐性に関する因子をコードする遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子等）のコード領域を含みうる。
　本発明の第１の発明の核酸は、適当なプロモーターの制御下に発現されるように別の核酸と連結して使用することができる。プロモーターとしては構成的に発現を促進するもの、薬剤等（例えば、テトラサイクリン又はドキソルビシン）により誘導されるもの等のいずれも用いることができる。また、効率のよい転写を達成するために、プロモーター又は転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列又はターミネーター配列を含む核酸を連結してもよい。また、更に本発明の第１の発明の核酸に加えて、当該核酸の発現を確認するためのマーカーとなりうる遺伝子（例えば薬剤耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子等）を組み込んでもよい。
　本発明の第１の発明の核酸は、体細胞へ導入するためにベクターに挿入して使用することができる。本発明の核酸が挿入されるベクターには特に限定はなく、公知のベクターより適切なものを選択して使用することができる。例えば、ウイルスベクターを使用する方法、又は非ウイルスベクターを使用する方法のいずれもが本発明に使用できる。これらのベクターの詳細についてはすでに多くの文献が公表されており、これら多くの文献より適宜選択して使用すればよい。本発明の第１の発明の核酸が挿入されたベクターも本発明に包含される。
　上記のウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター（オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター等が使用できる。特に好適には、オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はアデノウイルスベクターが使用できる。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。
　また、上記の非ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知の非ウイルスベクター、例えば、プラスミドベクターが使用できる。
（２）核初期化因子をコードする遺伝子を含む核酸のセット
　本発明の第２の発明は、以下の核酸のセットを提供する。
（ａ）ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ及びＭＹＣファミリーに属するタンパク質からなる群より選択される少なくとも３種の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域を１つの分子内に含む核酸、及び
（ｂ）ＯＣＴ４をコードする遺伝子のコード領域を含む他の核酸。
　前記（ａ）の核酸がコードする核初期化因子は、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ及びＭＹＣファミリーに属するタンパク質からなる群より選択される少なくとも３種類の核初期化因子である。前記（ａ）の核酸は、例えば３種類、４種類、５種類又は６種類の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域を含む核酸である。前記（ａ）の核酸は、多能性幹細胞を誘導し得る限りにおいて限定はないが、例えば少なくともＯＣＴ４及びＫＬＦ４をコードする遺伝子のコード領域を含む核酸、少なくともＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びＭＹＣファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子のコード領域を含む核酸、少なくともＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧをコードする遺伝子のコード領域を含む核酸が使用され得る。各核初期化因子の順は、多能性幹細胞を誘導し得る限りにおいて限定はないが、（ａ）の核酸の５’末端から順にＯＣＴ４及びＫＬＦ４をコードする遺伝子のコード領域が配置されることが好ましく、例えば、５’末端から順にＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びＭＹＣファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子のコード領域の順又はＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧをコードする遺伝子のコード領域の順に並ぶ核酸が好ましい。
　本発明の第２の発明の１つの態様において、前記（ａ）の核酸は、当該核酸に含まれる核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域を、自己切断ペプチドをコードする配列及びＩＲＥＳ配列から選択される配列を介して相互に接続させて、ポリシストロニックな核酸とすることができる。核初期化因子のコード領域を接続する配列は、自己切断ペプチドをコードする配列のみ、ＩＲＥＳ配列のみ、又はこれらの両方の配列を使用することができる。例えば、本発明の第１の発明の核酸を用いることもできる。
　本発明の第２の発明の１つの態様において、前記（ａ）の核酸は自己切断ペプチドをコードする配列を含む１つのｍＲＮＡとして転写され、転写されたｍＲＮＡからは自己切断ペプチド内において切断された形態のポリペプチドが翻訳される。例えば自己切断ペプチドが２Ａペプチドである場合、核酸から転写されたｍＲＮＡが翻訳される時に、リボソームは２Ａペプチド内において特定の１カ所のペプチド結合を連結せず、２Ａペプチド配列の５’末端側にコードされるポリペプチドと３’末端側にコードされるポリペプチドを別のポリペプチドとして翻訳する。結果、本発明に使用される核酸にコードされる核初期化因子は別々のポリペプチドとして生じる。
　したがって、自己切断ペプチドにより連結された複数の核初期化因子は、１種も欠けることなくすべて、ほぼ同じ分子数（等量）で発現する。
　前記（ａ）の核酸は複数の「自己切断ペプチドをコードする塩基配列」を含んでいてもよい。これらは、同じアミノ酸配列の自己切断ペプチドをコードするものであってもよく、異なるアミノ酸配列の自己切断ペプチドをコードするものであってもよい。同じアミノ酸配列の自己切断ペプチドをコードするものであっても、塩基配列がそれぞれ異なっていてもよい。更に、前記核酸が発現される細胞のコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）に合わせて、塩基配列を改変させてもよい。例えば、配列番号２～５に示される塩基配列を有する２Ａペプチドをコードする配列を使用することができる。
　本発明の第２の発明の１つの態様において、前記（ａ）の核酸はＩＲＥＳ配列を含む１つのｍＲＮＡとして転写され、転写されたｍＲＮＡに含まれるシストロンの開始コドンへ、リボソームが直接的に進入し、シストロンが切断された形態のポリペプチドが翻訳される。本発明は、任意のＩＲＥＳ配列が使用可能である。例えば、ピコルナウイルス由来［トレンズ　バイオケミカル　サイエンス（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｓｃｉ）、第１５巻、第１２号、第４７７－８３頁、１９９０年］、ＥＭＣＶ（脳心筋炎ウイルス）由来、ＦＭＤＶ（口蹄疫ウイルス）由来、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）由来等のウイルス由来のＩＲＥＳが使用可能である。また、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）由来、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）由来［モレキュラー　セル　バイオロジー（Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ）、第１８巻、第１１号、第６１７８－６１９０頁、１９９８年］、線維芽細胞成長因子２由来、インスリン様成長因子由来、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇ由来、酵母転写因子ＴＦＩＩＤ及びＨＡＰ４由来の哺乳動物細胞を含む細胞由来のｍＲＮＡのＩＲＥＳ配列が使用可能である。
　本発明の第２の発明の１つの態様において、前記（ａ）の核酸は核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域を接続する配列として、自己切断ペプチドをコードする配列及びＩＲＥＳ配列の両方の配列を含む。特に限定はないが、例えばＩＲＥＳ配列を１カ所に使用する場合は、核酸の５’末端から数えて第１の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域と第２の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域の間に配置することが好ましい。
　本発明の第２の発明の核酸のセットに含まれる、前記（ｂ）ＯＣＴ４をコードする遺伝子のコード領域を含む他の核酸は、１つのｍＲＮＡとして転写され、転写されたｍＲＮＡからはＯＣＴ４が翻訳される。（ｂ）の核酸は（ａ）の核酸とは連結していない別の分子である他の核酸であり、互いに独立してｍＲＮＡを転写する。
　本発明の第２の発明の核酸のセットに使用される（ａ）の核酸及び（ｂ）の核酸は、適当なプロモーターの制御下に発現されるように別の核酸と連結して使用することができる。プロモーターとしては構成的に発現を促進するもの、薬剤等（例えば、テトラサイクリン又はドキソルビシン）により誘導されるもの等のいずれも用いることができる。また、効率のよい転写を達成するために、プロモーター又は転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列又はターミネーター配列を含む核酸を連結してもよい。また、更に本発明の核酸のセットに加えて、当該核酸の発現を確認するためのマーカーとなりうる遺伝子（例えば薬剤耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子等）を組み込んでもよい。
　本発明は、前記（ａ）の核酸及び（ｂ）の核酸を、体細胞へ導入するためにそれぞれ別のベクターに挿入したベクターのセットを含む。本発明に使用されるベクターには特に限定はなく、公知のベクターより適切なものを選択して使用することができる。例えば、ウイルスベクターを使用する方法、又は非ウイルスベクターを使用する方法のいずれもが本発明に使用できる。ウイルスベクターを使用する場合は、本発明の核酸のセットを構成する（ａ）の核酸及び（ｂ）の核酸は、別々のウイルス粒子に含まれる。これらのベクターの詳細についてはすでに多くの文献が公表されており、これら多くの文献より適宜選択して使用すればよい。（ａ）の核酸が挿入されたベクター及び（ｂ）の核酸が挿入されたベクターのセットも本発明に包含される。
　上記のウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター（オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター等が使用できる。特に好適には、オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はアデノウイルスベクターが使用できる。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。
　また、上記の非ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知の非ウイルスベクター、例えば、プラスミドベクターが使用できる。
（３）本発明の多能性幹細胞の製造方法
　本発明の多能性幹細胞の製造方法は、体細胞に前記（１）に記載する本発明の第１の発明の核酸又は当該核酸を挿入されたベクター、又は前記（２）に記載する本発明の第２の発明の核酸のセット又は当該セットの核酸がそれぞれ挿入されたベクターのセットを導入する工程を包含することを特徴とする。当該工程は体外で実施される。当該方法は、従来の方法に比べて、多能性幹細胞を高効率で製造することができ、例えば、導入された細胞の約０．１～１．２％が多能性幹細胞に誘導される。
　本発明の方法は、哺乳動物、例えばヒト又はマウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ等の非ヒト哺乳動物由来の体細胞が使用できる。
　本発明の方法に使用される体細胞に特に限定はなく、任意の体細胞を使用することができる。例えば、線維芽細胞、前駆脂肪細胞、肝細胞、血球細胞、皮膚角化細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪幹細胞、各種癌細胞株、歯周靭帯線維芽細胞又は神経幹細胞等の体細胞を使用することができる。前記の体細胞は生体より採取されたもの、又は細胞株として樹立されたもののどちらでもよい。作製された多能性幹細胞もしくは当該細胞より分化させた細胞を生体に移植することが望まれる場合には、その生体自身から採取された体細胞より多能性幹細胞を誘導することが好ましい。
　本発明の方法において、体細胞へ核酸又はベクターを導入する工程は、使用する体細胞、ベクターに応じて適宜操作することができる。非ウイルスベクターを使用する場合、リポソーム、カチオニックリピッドもしくはリガンド－ポリリジンなどの担体を使用して導入する方法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、又はパーティクルガン法などで導入することができる。また、ウイルスベクターを使用する場合、核酸又はベクター導入の際に、導入効率を向上させる物質を用いることもできる。導入効率を向上させる物質としては、ウイルスベクターに結合する活性を有する物質、例えばフィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントなどの物質が挙げられる。好適には、ヘパリン結合部位を有するフィブロネクチンフラグメント、例えばレトロネクチン（登録商標、ＣＨ－２９６、タカラバイオ社製）として市販されているフラグメントを用いることができる。更に、本発明を特に限定するものではないが、前記の物質は特にレトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターを使用する遺伝子導入に好適である。さらに、穿孔法（エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等）による細胞への核酸の導入において、フィブロネクチンやフィブロネクチンフラグメントの使用が導入効率を向上させることが知られている（国際公開第９６／１７０７３号パンフレット）。
　従来、多能性幹細胞の誘導を目的としたレトロウイルスベクターによる遺伝子導入では、レトロウイルスの細胞への感染効率を向上させる作用を有する合成ポリカチオンであるポリブレンが使用されてきた。本発明者らは、ポリブレンを使用せず、レトロウイルスに結合する活性を有する機能性物質の存在下に、レトロウイルスベクターを使用して本発明の第１の発明の核酸又は本発明の本発明の第２の発明の核酸のセットを体細胞に導入した場合には、ポリブレンを使用した場合に比較して多能性幹細胞の誘導効率が向上する結果、高頻度で多能性幹細胞を取得できることを見出した。すなわち、本発明の１つの態様として、レトロウイルスに結合する活性を有する機能性物質の存在下に体細胞に導入する工程を包含することを特徴とする、多能性幹細胞の製造方法が提供される。
　また、レトロウイルスに結合する活性を有する機能性物質としては、当該活性を有する物質であれば特に問題はないが、例えば、フィブロネクチン、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲン、前記のポリペプチドのフラグメント、ポリリジン又はＤＥＡＥ－デキストラン等がある。更に、前記物質由来のレトロウイルスに結合部位を有する機能性物質を本発明に使用することができる。フィブロネクチンフラグメントとしては分子内にヘパリン－ＩＩ結合領域を有するものが好適であり、そのようなフラグメントは例えば国際公開第９７／１８３１８号パンフレットにも記載されている。ヘパリン－ＩＩ結合領域を有する組換えフィブロネクチンフラグメントとしては前出のレトロネクチンが例示される。またこれらの機能性物質と機能的に同等な物質、例えば、ヘパリン結合性部位を有する機能性物質も使用することができる。また、該機能性物質の混合物、該機能性物質を含有するポリペプチド、該機能性物質の重合体、又は該機能性物質の誘導体等を使用することができる。
　更に、レトロウイルスに結合する活性とともに標的細胞、すなわち核酸又はベクターを導入しようとする体細胞への結合活性を有する機能性物質を併用してもよく、レトロウイルスに結合する活性を有する機能性物質及び標的細胞結合活性を有する機能性物質を併用してもよい。標的細胞結合活性を有する機能性物質にも、特に限定はないが、例えば、標的細胞に結合するリガンドを有する物質が挙げられる。該リガンドとしては細胞接着性のタンパク質（フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン等）もしくはそのフラグメント、ホルモン、サイトカイン、細胞表面の抗原に対する抗体、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、糖タンパク質もしくは糖脂質由来の糖鎖、あるいは標的細胞の代謝物などが挙げられる。
　本発明の多能性幹細胞の製造方法において、本発明の第２の発明の核酸のセット又は当該セットの核酸がそれぞれ挿入されたベクターのセットに含まれる（ａ）の核酸及び（ｂ）の核酸の量や比率は、導入する細胞、使用するベクター、多能性幹細胞の製造効率等に応じて適宜設定することができる。例えば、体細胞に導入される（ａ）の核酸及び（ｂ）の核酸を、分子数が等量となるように、重量が等量となるように、又はウイルスベクターを使用する場合はウイルスタイターが同等となるように使用することができる。
　本発明の好適な態様において、前記の機能性物質は適切な固相、例えば細胞培養に使用される容器（プレート、シャーレ、フラスコもしくはバッグ等）又は担体（マイクロビーズ等）に固定化された状態で使用される。
　前記の核酸、ベクター、又はそれらのセットを体細胞に導入する場合には、フィーダー細胞上に培養された体細胞に対して導入を行ってもよいが、フィーダー細胞を使用することなく体細胞に導入を行ってもよい。フィーダー細胞としては、ＥＳ細胞の培養に用いられるフィーダー細胞を適宜使用することができるが、例えばマウス１４～１５日胚の繊維芽細胞初代培養細胞や繊維芽細胞由来細胞株であるＳＴＯ細胞等をマイトマイシンＣ等の薬剤や放射線により処理した細胞などを使用することができる。本発明の核酸などが導入された体細胞の培養はフィーダー細胞上で行うことが好ましいが、フィーダー細胞を使用しないＥＳ細胞の培養方法も報告されている。
　本発明の第１の発明の核酸又は当該核酸が挿入されたベクター、又は本発明の第２の発明の核酸のセット又は当該セットの核酸がそれぞれ挿入されたベクターのセットを導入した体細胞を適切な条件下で培養することにより、自律的に核のリプログラミングが進行し、体細胞から多能性幹細胞を製造することができる。当該培養には、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞に使用可能な公知の培地を使用することができる。本発明の核酸などを体細胞に導入した後、体細胞が多能性を獲得して増殖するのに十分な時間にわたり細胞を培養することが好ましい。導入後の体細胞の培養密度は、例えば細胞培養用ディッシュあたり１×１０４～１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で培養を継続することが好ましい。
　核酸又はベクターが導入された細胞は、導入する工程を実施してからＥＳ細胞用の培地に交換するまで、通常の体細胞を培養するための培地を使用して、例えば１～１２日間、好ましくは２～１０日間培養する。その後ＥＳ細胞用培地に交換して、例えば５～４０日間、好ましくは１０～３５日間培養する。
　上記の操作で得られた体細胞が多能性を獲得したことは、例えば未分化細胞に特有のマーカー、例えばＲｅｘ１、Ｏｃｔ４、Ｆｂｘ１５、ＮＡＮＯＧ、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＡＢＣＧ－２及びＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎなどを検出することにより容易に判定することができる。マーカーの種類や判定手段については公知文献により具体的かつ詳細に説明されている（例えば、セル、第１２６巻、６６３－６７６頁、２００６年、セル、第１３１巻、８６１－８７２頁、２００７年）。ＥＳ細胞特異的発現遺伝子のプロモーター下流にＧＦＰ等のマーカー遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する体細胞を使用した場合は、当該マーカー遺伝子の発現を指標として多能性幹細胞を特定することが可能である。また、一般的に多能性の獲得はコロニー形成により判定することもできる。コロニーは通常５００～１０００ｃｅｌｌｓの細胞集団であり、特徴的な外観を呈することが知られているので、多能性幹細胞が増殖して形成したコロニーを容易に特定することができる。
（４）本発明の細胞
　上記の、本発明の多能性幹細胞の製造方法により、本発明の第１の発明の核酸又は本発明の第２の発明の核酸のセットを含む細胞を調製し、その中から多能性を獲得した細胞を選択することができる。こうして得られた多能性幹細胞のコロニーを単離してクローニングを実施することにより、多能性を有しない細胞が除去された、多能性幹細胞の細胞株を樹立することができる。更に、こうして得られた多能性幹細胞について、公知の分化操作を適用して所望の分化を誘導することにより、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、膵細胞、脂肪細胞、表皮細胞、軟骨、腸管様内胚葉組織といった任意の細胞、組織を製造することができる。
　以下に実施例をもって本発明を更に具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに何ら限定されるものではない。
調製例１　２Ａペプチド連結型ｉＰＳ細胞誘導プラスミドｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳ、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬ、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＮ、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮ（Ｐ２Ａ）、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮ（Ｔ２Ａ）プラスミドの構築
　ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００４２３５．３（ｈＫＬＦ４遺伝子）、ＮＭ＿００３１０６．２（ｈＳＯＸ２遺伝子）、ＮＭ＿００２４６７．３（ｈｃ－ＭＹＣ遺伝子）の配列情報より、遺伝子増幅用合成プライマーをそれぞれ合成した。ＨｕｍａｎＢｒａｉｎＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クロンテック社製）より合成したｃＤＮＡを鋳型とし、各核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域に対応するプライマー対を用いてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　ＭＡＸ　ＰｒｅＭｉｘ又はＨＳ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（いずれもタカラバイオ社製）によりＰＣＲを行った。反応終了後、反応液を１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、ｈＫＬＦ４遺伝子を含む約１．５ｋｂｐのＤＮＡフラグメント、ｈＳＯＸ２遺伝子を含む約１ｋｂｐのＤＮＡフラグメント、ｈｃ－ＭＹＣ遺伝子を含む約１．３ｋｂｐのＤＮＡフラグメントをそれぞれ抽出、精製した。また、ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００２７０１．４（ｈＯＣＴ４遺伝子）、ＮＭ＿０２４６７４．４（ｈＬＩＮ２８遺伝子）、ＮＭ＿０２４８６５．２（ｈＮＡＮＯＧ遺伝子）の配列情報により、ｈＯＣＴ４遺伝子を含む約１．１ｋｂｐのＤＮＡフラグメント、ｈＬＩＮ２８遺伝子を含む約０．７ｋｂｐのＤＮＡフラグメント、ｈＮＡＮＯＧ遺伝子を含む約１ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを化学的に合成した。
　Ｔｈｏｓｅａ　ａｓｉｇｎａ　ｖｉｒｕｓ及びＰｏｒｃｉｎｅ　ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ－１由来の２Ａペプチド配列、Ｔ２Ａ及びＰ２Ａを公知文献（ネイチャー　バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第２２巻、第５号、５８９－９４頁、２００４年）より得た。Ｔ２Ａのアミノ酸配列を配列番号１に示す。Ｔ２Ａのアミノ酸配列に対して、ヒトのコドンに最適化した４種類の異なる塩基配列を設計し、それぞれＴ２Ａ１、Ｔ２Ａ２、Ｔ２Ａ３、Ｔ２Ａ４と命名した。それぞれの塩基配列を配列番号２、３、４、５に示す。また、Ｐ２Ａのアミノ酸配列を配列番号６に、塩基配列を配列番号７に示す。Ｔ２Ａ１、Ｔ２Ａ２、Ｔ２Ａ３、Ｔ２Ａ４、Ｐ２Ａの塩基配列を有するＤＮＡフラグメントをそれぞれ合成した。
　前記の核初期化因子のコード領域由来のＤＮＡフラグメント及び２ＡペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを用いて、ベクターへのサブクローニング、ＰＣＲ、制限酵素消化、ライゲーション反応を繰り返し、核初期化因子のコード領域及び２ＡペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを５’末端から表１に記載される順に含むＤＮＡフラグメントを調製し、レトロウイルスベクターｐＤＯＮ－５　ＤＮＡ（タカラバイオ社製）に挿入し、それぞれｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳ、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬ、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮ（Ｐ２Ａ）と命名した。更に、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮ（Ｐ２Ａ）のＰ２ＡフラグメントをＴ２Ａ４フラグメントに置換したｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮ（Ｔ２Ａ）を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
調製例２　ｉＰＳ細胞誘導プラスミドｐＤＯＮ５－ｈｃ－ＭＹＣプラスミド及び２Ａペプチド連結型ｉＰＳ細胞誘導プラスミドｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＭ、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＭ、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮＭプラスミドの構築
　ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００２４６７．３（ｃ－ＭＹＣ遺伝子）の配列情報より、遺伝子増幅用合成プライマーをそれぞれ合成した。ＨｕｍａｎＢｒａｉｎＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クロンテック社製）より合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ｃ－ＭＹＣ遺伝子に対応するプライマー対を用いてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）によりＰＣＲを行った。反応終了後、反応液を１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、約１．３ｋｂのｃ－ＭＹＣ遺伝子フラグメントを得た。これを制限酵素により切断し、同じく制限酵素により切断したｐＤＯＮ―５に挿入し、得られたプラスミドベクターをｐＤＯＮ５－ｈｃ－ＭＹＣとした。
　Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲクローニングキット（クロンテック社製）を用いてディレクショナルクローニングにより、調製例１で構築したｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳ、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬ、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮ（Ｐ２Ａ）に、更にＴ２Ａ４フラグメントとｃ－ＭＹＣ遺伝子が連結したｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＭ、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＭ、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮＭを構築した。各挿入ＤＮＡフラグメントの構造を表２に示す。構築に使用したプライマーはキットの取扱説明書に従って設計し、鋳型には調製例１のプラスミド及び前記ｐＤＯＮ５－ｈｃ－ＭＹＣを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　各挿入ＤＮＡフラグメントの構造を図４に示す。ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮＭの挿入フラグメントの塩基配列を配列番号８に示す。
調製例３　レトロウイルスベクターの調製
（１）レトロウイルスベクターの産生
　Ｇ３Ｔｈｉ細胞（タカラバイオ社製）を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ－ＤＭＥＭ［１０％牛胎児血清（インビトロジェン社製）及び５０Ｕ／ｍＬペニシリン／５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（ナカライ社製）含有Ｄ－ＭＥＭ（シグマ社製）］に懸濁し、その４ｍＬを６ｃｍコラーゲンコートディッシュ（イワキ社製）に播種して３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。
　５００μＬのＯＰＴＩ－ＭＥＭ（インビトロジェン社製）に１０μＬのＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３（タカラバイオ社製）を混合し、室温で５分放置後、２μｇのｐＧＰプラスミド（タカラバイオ社製）、１μｇのｐＥ－Ａｍｐｈｏプラスミド（タカラバイオ社製）及び２μｇの調製例１及び２で調製した各組換えプラスミドをそれぞれ加えて混合し、更に１５分間室温で放置した。この混合液を上記のＧ３Ｔｈｉ細胞に添加して培養を継続し、２４時間後に４ｍＬの１０Ｆ－ＤＭＥＭ培地に交換した。更に２４時間培養を継続した後、ウイルスを含む培地を回収し、０．４５μｍのフィルターでろ過してレトロウイルスベクターを含むウイルス液を調製した。ウイルス液は－８０℃で凍結保存し、使用時に３７℃恒温水槽にて溶解した。
（２）ウイルス液の混合及び希釈
　レトロウイルスは特に記載のない限り１０Ｆ－ＤＭＥＭにて３０倍希釈して使用した。なおコントロールとして、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２をＥｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ由来のＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｒｉｂｏｓｏｍｅ　Ｅｎｔｒｙ　Ｓｉｔｅ）を介してポリシストロニックに翻訳させるためのレトロウイルスベクターｐＤＯＮ－５　ＯＣＴ３／４－ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧをＩＲＥＳを介してポリシストロニックに翻訳させるためのレトロウイルスベクターｐＤＯＮ－５　ＬＩＮ２８－ＮＡＮＯＧ、及びＫＬＦ４を発現するレトロウイルスベクターｐＤＯＮ－５　ＫＬＦ４からなるＨｕｍａｎ　ｉＰＳ　Ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（登録商標）　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｅｔ（タカラバイオ社製）を用いた。コントロールは各ウイルスを混合した後１０倍希釈して実験に供した。表３にベクター名と各ウイルス液の名称を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例１　ｉＰＳ細胞の誘導
（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
　ノントリートメント１２穴培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製）の各ウエルに２０μｇ／ｍＬとなるように、リン酸緩衝水溶液（ＰＢＳ）で希釈したレトロネクチン（タカラバイオ社製）溶液を１ｍＬずつ添加し、４℃で一晩固定化を行った。その後、各ウエルより溶液を除去し、ＰＢＳで１回洗浄の後、各実験に供するまで４℃で保存した。
（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
　実施例１－（１）で調製したレトロネクチン固定化培養プレートの各ウエルに、表３に示すウイルス液Ａ、Ｂ及びＣを１ｍＬずつ添加し、３２℃、２、０００×ｇで２時間遠心した。その後、各ウエルより上清を除去して、１．５％ブミネート（献血アルブミン、バクスター社製）を含むＰＢＳで１回洗浄後、４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ－ＤＭＥＭで懸濁したヒト成人皮膚繊維芽細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を１ｍＬずつ各ウエルに播種し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養を開始した（培養０日目）。
　このとき、２回目の遺伝子導入のためのウイルスコートプレートも同時に調製し、細胞懸濁液の代わりに１．５％ブミネートを含むＰＢＳを添加し４℃で保存した。ポリブレンによる遺伝子導入に関しては、以下の方法で行った。すなわち、培養１日前に１２穴培養プレートに、４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ－ＤＭＥＭで懸濁したヒト皮膚繊維芽細胞を１ｍＬずつ各ウエルに播種し１日培養した。その後、細胞培養プレートより上清を除去し、ウイルス液Ａ、Ｂ、Ｃに終濃度８μｇ／ｍＬとなるようにポリブレン（ヘキサジメトリン・ブロミド；アルドリッチ社製）を加えた調製液を各ウエル１ｍＬ添加、培養を開始した（培養０日目）。
（３）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
　２回目の遺伝子導入は培養１日目に行った。レトロネクチンによる遺伝子導入に関しては、前日遺伝子導入を行った細胞を剥離し１０Ｆ－ＤＭＥＭに懸濁した後、実施例１－（１）で調製したウイルスコートプレートの各ウエルに播種した。ポリブレンによる感染については、前日遺伝子導入を行った細胞上清を除去し、実施例１－（２）と同様にポリブレンを混合して調製したウイルス液を添加し培養を継続した。いずれの感染法においても、翌日上清を除去し１０Ｆ－ＤＭＥＭ培地を１ｍＬ添加して培養を継続した。
（４）フィーダー細胞上への播種
　６穴培養プレート（コーニング社製）に終濃度１ｍｇ／ｍＬのゼラチン（シグマ社製）水溶液を各ウエル１ｍＬ添加し、３７℃、３０分で固定化した。ここに終濃度１２μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（ナカライテスク社製）で処理したＳＮＬ７６／７細胞（ＤＳファーマ社製）を、各ウエル２．５×１０５ｃｅｌｌｓずつ播種し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで終夜培養することによりフィーダー細胞を調製した。実施例１－（３）で作製した培養６日目の遺伝子導入細胞を回収し１０Ｆ－ＤＭＥＭ培地に懸濁した。各ウエル２００００Ｃｅｌｌｓを前記のフィーダー細胞上に播種し、終夜培養した。翌日、培養７日目に上清を除去し、ＥＳ細胞用培地［８０％　Ｄ－ＭＥＭ／Ｆ－１２（インビトロジェン社製）、２０％　ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）、４ｎｇ／ｍＬ　ｈｕｍａｎ　ｂａｓｉｃ　ＦＧＦ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）、１×Ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｏｎｚａ社製）、２ｍＭ　Ｌ－Ｇｌｕｔｈａｍｉｎｅ（Ｌｏｎｚａ社製）、１１０μＭ　２－メルカプトエタノール（インビトロジェン社製）、５０Ｕ／ｍＬペニシリン／５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン］を各ウエル２ｍＬ添加し、培養２８日目まで培養を継続した。この間、２日おきに培地を交換した。
（５）ｉＰＳ細胞コロニーの計測
　培養２６日目にＴＲＡＣＰ＆ＡＬＰ　ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔａｉｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）によってアルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性をもつ細胞を染色した。ＡＰ活性を示しヒトＥＳ細胞様の形態を示すｉＰＳ細胞コロニー数を計測した。その結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示すように、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮＭは（条件Ｂ）ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮ（Ｔ２Ａ）（条件Ａ）を超える高い多能性幹細胞の誘導効率を示した。また、ポリブレンによる感染に比べレトロネクチンを用いた方がはるかに効率よく多能性幹細胞を誘導できることが再度確認された。
実施例２　歯周靭帯線維芽細胞と前駆脂肪細胞からのｉＰＳ細胞誘導
　ヒト成人皮膚線維芽細胞以外のヒト細胞、ヒト歯周靭帯線維芽細胞（Ｌｏｎｚａ社製）及びヒト皮下脂肪由来前駆脂肪細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を標的として多能性幹細胞を誘導した。
（１）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入
　レトロネクチンの培養プレートへの固定化は、実施例１－（１）と同様の方法により行った。レトロネクチンによる遺伝子導入は、表３に示すウイルス液Ｂを用い、実施例１－（２）及び（３）と同様の方法により２回行った。また培地として、歯周靭帯線維芽細胞を培養する際にはＳＣＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ社製ストローマ細胞培地キット）を、前駆脂肪細胞を培養する際にはＰＧＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ社製前駆脂肪細胞培地キット－２）を使用した。
（２）フィーダー細胞上への播種
　培養６日目に実施例１－（４）と同様の方法によりフィーダー細胞上に播種し培養を継続した。ただし、遺伝子導入細胞の回収と培養７日目までの培養には、実施例２－（１）と同様にそれぞれに適した培地を使用した。
（３）ｉＰＳ細胞コロニーの計測
　培養２８日目に実施例１－（５）と同様の方法によりｉＰＳ細胞コロニー数を計測した。その結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示すように、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮＭとレトロネクチンを用いることで、皮膚線維芽細胞以外にも歯周靭帯線維芽細胞及び前駆脂肪細胞からも多能性幹細胞が誘導できることが明らかとなった。
調製例４　マウスｉＰＳ細胞誘導プラスミドベクターｐＤＯＮ５－ｍＯｃｔ４、ｐＤＯＮ５－ｍＫｌｆ４、ｐＤＯＮ５－ｍＳｏｘ２、ｐＤＯＮ５－ｍｃ－Ｍｙｃの構築
　ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿０１３６３３．２（ｍＯｃｔ４遺伝子）、ＮＭ＿０１０６３７．３（ｍＫｌｆ４遺伝子）、ＮＭ＿０１１４４３．３（ｍＳｏｘ２遺伝子）、ＮＭ＿０１０８４９．４（ｍｃ－Ｍｙｃ遺伝子）の配列情報より、ベクターに導入するための制限酵素認識配列を有する遺伝子増幅用合成プライマーをそれぞれ合成した。ＭｏｕｓｅＥＳ細胞（ＤＳファーマ社製）及びＭｏｕｓｅＳｐｌｅｅｎ細胞よりＴｏｔａｌＲＮＡを調製、ｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として各核初期化因子の遺伝子に対応するプライマー対を用いてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）によりＰＣＲを行った。鋳型の由来細胞と各核初期化因子の遺伝子の組合わせを表６に示す。反応終了後、反応液を１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、ｍＯｃｔ４遺伝子を含む約１．１ｋｂｐのＤＮＡフラグメント、ｍＫｌｆ４遺伝子を含む約１．５ｋｂｐのＤＮＡフラグメント、ｍＳｏｘ２遺伝子を含む約１．０ｋｂｐのＤＮＡフラグメント、ｍｃ－Ｍｙｃ遺伝子を含む約１．３ｋｂｐのＤＮＡフラグメントをそれぞれ抽出、精製した。これらのＤＮＡフラグメントを制限酵素により切断し、同じく制限酵素により切断したレトロウイルスベクターｐＤＯＮ－５（タカラバイオ社製）　ＤＮＡに挿入して得られたプラスミドベクターを各々ｐＤＯＮ５－ｍＯｃｔ４、ｐＤＯＮ５－ｍＫｌｆ４、ｐＤＯＮ５－ｍＳｏｘ２、及びｐＤＯＮ５－ｍｃ－Ｍｙｃとした。このうち、ｐＤＯＮ５－ｍＯｃｔ４の塩基配列を配列表の配列番号９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
調製例５　２Ａペプチド連結型マウスｉＰＳ細胞誘導プラスミドベクターｐＤＯＮ５－ｍＯＫＳ、ｐＤＯＮ５－ｍＯＫＳＭ及びｐＤＯＮ５－ｍＯＫＳＭＯの構築
　調製例４の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域由来のＤＮＡフラグメント及び調製例１の２ＡペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを用いて、ベクターへのサブクローニング、ＰＣＲ、制限酵素消化、ライゲーション反応を繰り返し、核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域及び２ＡペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを５’末端からｍＯｃｔ４、Ｔ２Ａ１、ｍＫｌｆ４、Ｔ２Ａ２、及びｍＳｏｘ２の順に含むＤＮＡフラグメントを調製した。このＤＮＡフラグメントをレトロウイルスベクターｐＤＯＮ－５　ＤＮＡに挿入、得られたプラスミドベクターをｐＤＯＮ５－ｍＯＫＳと命名した。プラスミドベクターの挿入ＤＮＡフラグメントの構造を表７に示す。
　次に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲクローニングキット（クロンテック社製）を用いて、ディレクショナルクローニングによりｐＤＯＮ５－ｍＯＫＳに更にＴ２Ａ３フラグメントとｍｃ－ＭｙｃをコードするＤＮＡフラグメントが連結したｐＤＯＮ５－ｍＯＫＳＭと、ｐＤＯＮ５－ｍＯＫＳＭに更にＴ２Ａ４フラグメントとｍＯｃｔ４をコードするＤＮＡフラグメントが連結したｐＤＯＮ５－ｍＯＫＳＭＯを構築した。構築に使用したプライマーはキットの取扱説明書に従って設計し、線状化ベクターの鋳型にはｐＤＯＮ５－ｍＯＫＳ及びｐＤＯＮ５－ｍＯＫＳＭを、挿入遺伝子の鋳型には調製例４で構築したｐＤＯＮ５－ｍｃ－Ｍｙｃ及びｐＤＯＮ５－ｍＯｃｔ４を用いた。各プラスミドベクターの挿入ＤＮＡフラグメントの構造を表７に、ｐＤＯＮ５－ｍＯＫＳＭの塩基配列を配列表の配列番号１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
調製例６　マウスｉＰＳ細胞誘導プラスミドベクターｐＤＯＮ５－ｍＯ－ＩＲ－ＫＳＭの構築
　調製例５で構築したレトロウイルスベクターｐＤＯＮ５－ｍＯＫＳＭの１箇所のＴ２Ａ１配列がＩＲＥＳ２の配列に置換されたレトロウイルスベクターであるｐＤＯＮ５－ｍＯ－ＩＲ－ＫＳＭを構築した。ｐＩＲＥＳ２－ＺｓＧｒｅｅｎ（クロンテック社製）を鋳型にＰＣＲでＩＲＥＳ２フラグメントを増幅、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲクローニングキットによりディレクショナルクローニングを行い、ｐＤＯＮ５－ｍＯ－ＩＲ－ＫＳＭプラスミドを得た。構築に使用したプライマーはキットの取扱説明書に従って設計し、線状化ベクターの鋳型には調製例２のｐＤＯＮ５－ｍＯＫＳＭを用いた。挿入ＤＮＡフラグメントの構造を表８に、塩基配列を配列表の配列番号１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
調製例７　２Ａペプチド連結型ヒトｉＰＳ細胞誘導プラスミドベクターｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳ、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮ、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＭ、及びｐＤＯＮ５－ｈＯＣＴ４の構築
　調製例１の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域由来のＤＮＡフラグメント及び２ＡペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを用いて、ベクターへのサブクローニング、ＰＣＲ、制限酵素消化、ライゲーション反応を繰り返し、核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域及び２ＡペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを５’末端から表９に記載される順に含むＤＮＡフラグメントを調製し、レトロウイルスベクターｐＤＯＮ－５　ＤＮＡに挿入し、ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳ及びｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮを調製した。ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＬＮの塩基配列を配列表の配列番号１２に示す。
　Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲクローニングキットを用いたディレクショナルクローニングにより、前記ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳに、更にＴ２Ａ４フラグメントとｈｃ－ＭＹＣをコードするＤＮＡフラグメントが連結したｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＭを構築した。挿入ＤＮＡフラグメントの構造を表９に示す。構築に使用したプライマーはキットの取扱説明書に従って設計し、鋳型にはｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳ及びｐＤＯＮ５　ＤＮＡにｈｃ－ＭＹＣをコードするＤＮＡフラグメントを挿入したｐＤＯＮ５－ｈｃ－ＭＹＣを用いた。ｐＤＯＮ５－ｈＯＫＳＭの塩基配列を配列表の配列番号１３に示す。
　また、前述のｈＯＣＴ４をコードする人工合成ＤＮＡフラグメントを、レトロウイルスベクターｐＤＯＮ－５　ＤＮＡに挿入し、得られたプラスミドベクターをｐＤＯＮ５－ｈＯＣＴ４とした。ｐＤＯＮ５－ｈＯＣＴ４の塩基配列を配列表の配列番号１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
調製例８　レトロウイルスベクターの調製
（１）レトロウイルスベクターの産生
　Ｇ３Ｔ－ｈｉ細胞（タカラバイオ社製）を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ－ＤＭＥＭ［１０％牛胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ナカライテスク社製）含有Ｄ－ＭＥＭ（シグマ社製）］に懸濁し、その４ｍＬを６ｃｍコラーゲンコートディッシュ（イワキ社製）に播種して３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。
　５００μＬのＯＰＴＩ－ＭＥＭ（インビトロジェン社製）に１０μＬのＴｒａｎｓＩＴ－２９３（タカラバイオ社製）を混合し、室温で５分放置後、２μｇのｐＧＰプラスミド（タカラバイオ社製）、１μｇのｐＥ－Ｅｃｏプラスミド（タカラバイオ社製）又はｐＥ－Ａｍｐｈｏプラスミド（タカラバイオ社製）及び２μｇの調製例４～７で調製した各組換えプラスミドをそれぞれ加えて混合し、更に１５分間室温で放置した。この混合液を上記のＧ３Ｔ－ｈｉ細胞に添加して培養を継続し、２４時間後に４ｍＬの１０Ｆ－ＤＭＥＭに交換した。更に２４時間培養を継続した後、ウイルスを含む培地を回収し、０．４５μｍのフィルターでろ過してレトロウイルスベクターを含むウイルス液を調製した。ウイルス液は調製後すぐに使用しない場合は－８０℃で凍結保存して、使用時に解凍して用いた。
実施例３　マウス胎児線維芽細胞（Ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＭＥＦ）の調製
　ｉＰＳ細胞誘導のための標的細胞としてＭＥＦを調製した。調製は論文記載の方法に従い行った。〔Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋら、ネイチャープロトコル（Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）、第２巻、３０８１－３０８９頁、２００７年〕
実施例４　マウスｉＰＳ細胞の誘導
（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
　ノントリートメント１２穴培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製）の各ウエルに２５μｇ／ｍＬとなるように、リン酸緩衝水溶液（ＰＢＳ）で希釈したレトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）溶液を１ｍＬずつ添加し、４℃で一晩固定化を行った。その後、各ウエルより溶液を除去し、１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄の後、各実験に供するまで４℃で保存した。
（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入
　調製例８で調製したレトロウイルスベクターを含むウイルス液を、以下の表１０の条件Ａ～Ｊの組合せで等量ずつ混合し、更にこの混合液に各ウイルス液と等量の蛍光タンパク質搭載レトロウイルスベクター液を混合後、１０Ｆ－ＤＭＥＭ培地で２倍に希釈した。実施例４－（１）で調製したレトロネクチン固定化培養プレートの各ウエルにそれぞれ１ｍＬずつ添加し、３２℃、２，０００×ｇで２時間遠心した。
　その後、各ウエルより上清を除去して１．５％ＨＳＡ（Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ）を含むＰＢＳで１回洗浄後、４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ－ＤＭＥＭで懸濁した実施例３のＭＥＦを１ｍＬずつ各ウエルに播種した。播種後はプレートを３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養を開始した（培養０日目）。なお、培養１日目、３日目に培地交換を行った。
（３）フィーダー細胞上への播種
　６穴培養プレート（コーニング社製）に終濃度１ｍｇ／ｍＬのゼラチン（シグマ社製）水溶液を添加し室温１時間あるいは４℃で一晩固定化後、洗浄してゼラチン固定化シャーレを作成した。ここに終濃度１２μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（ナカライテスク社製）で処理したＳＮＬ７６／７細胞（ＤＳファーマ社製）をプレート１枚当たり１×１０６ｃｅｌｌｓずつ播種し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで終夜培養することによりフィーダー細胞を調製した。
　実施例４－（２）で作製した培養４日目の遺伝子導入細胞を回収し、表の条件Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｊは５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ－ＤＭＥＭに懸濁、条件Ｃ、Ｅ、Ｇは１．５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ－ＤＭＥＭに懸濁した。この懸濁液２ｍＬを前記のフィーダー細胞上に播種し、培養を継続した。播種翌日に培養上清を除去し、マウスＥＳ細胞用培地［８５％　ノックアウトＤＭＥＭ（インビトロジェン社製）、１５％ノックアウト血清リプレースメント（インビトロジェン社製）、１×非必須アミノ酸混合物（ＬＯＮＺＡ社製）、１ｍＭ　ピルビン酸ナトリウム（ＬＯＮＺＡ社製）、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン（ＬＯＮＺＡ社製）、１００μＭ　２－メルカプトエタノール（インビトロジェン社製）］を２ｍＬ添加し、培養２８日目まで培養を継続した。この間、１～２日おきに培地を交換した。
（４）ｉＰＳ細胞コロニーの計測
　培養２８日目に各条件のｉＰＳ細胞コロニー数を、マウスＥＳ細胞と類似した形態的特徴を持ち、蛍光タンパク質が陰性で、アルカリホスファターゼが陽性であることを指標に計測した。その結果を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０の条件Ａ、Ｂ、Ｃが示すように、４因子をそれぞれ単独で搭載したレトロウイルスベクターから誘導するよりも、４因子を２Ａペプチドで結合し搭載したレトロウイルスベクターは誘導効率が極めて低かったが、ここにｍＯｃｔ４を単独で搭載するレトロウイルスベクターを混合することで誘導効率は飛躍的に上昇することがわかった。
　一方、条件Ｄのように４因子＋ｍＯｃｔ４を２Ａペプチドでつないで搭載したレトロウイルスベクターでは誘導効率は極めて低く、単純にＯｃｔ４の発現量を増加しただけでは誘導効率は向上しないことがわかった。
　また、条件Ｆが示すようにｍＯｃｔ４とｍＫｌｆ４の間を２ＡペプチドからＩＲＥＳに変更し搭載したベクターを用いると、すべて２Ａペプチドでついないで搭載したＢの条件よりも約８倍効率的であることがわかった。一般的に、ＩＲＥＳより下流の因子は上流よりも翻訳効率が落ちることが知られているため、ＩＲＥＳより下流の誘導因子（ｍＫｌｆ４、ｍＳｏｘ２、ｍｃ－Ｍｙｃ）のいずれかの強発現がｉＰＳ細胞の誘導に負の影響を与えているためであると考えられた。また、Ｆの条件にｍＯｃｔ４単独搭載レトロウイルスベクターを追加する条件Ｇで、誘導効率は飛躍的に上昇することがわかった。
　以上のことから、ｍＯｃｔ４とｍＫｌｆ４をコードするＤＮＡフラグメントの間をＩＲＥＳでつなぐことで、単一ベクターからのｉＰＳ細胞誘導用効率を飛躍的に高めることができることを示した。加えて、ｍＯｃｔ４を単独で搭載するレトロウイルスベクターを別途追加することにより、更に飛躍的にｉＰＳ細胞誘導効率が上昇することが明らかとなった。
実施例５　マウスｉＰＳ細胞クローンの樹立
　実施例４の条件Ｇ（ｐＤＯＮ５－ｍＯ－ＩＲ－ＫＳＭ、ｐＤＯＮ５－ｍＯｃｔ４）から誘導したｉＰＳ細胞コロニーをピックアップし、各種アッセイに用いるためのｉＰＳ細胞クローンを作製した。
（１）ｉＰＳ細胞の誘導
　実施例４－（１）、（２）、（３）と同様の方法によりｉＰＳ細胞を誘導した。
（２）ピックアップ
　培養２１日目の培養容器上に形成されたｉＰＳ細胞コロニーを実体顕微鏡（ＳＺ６１；ＯＬＹＭＰＵＳ社製）下でピックアップした。ピックアップしたｉＰＳ細胞コロニーを、あらかじめ０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ溶液を１００μＬ添加した９６ウエルプレートに移し、３７℃で５分間インキュベート後に数回ピペッティングを行ってｉＰＳ細胞懸濁液を調製した。マイトマイシン処理済みのＳＮＬ７６／７細胞を１ウエル当たり５．４×１０４ｃｅｌｌｓずつ播種した２４ウエルプレート（コーニング社製）を調製し、ここに前記のｉＰＳ細胞懸濁液全量を接種して継代を行った。継代時には、細胞の剥離を防ぐためにＥＳ細胞用ＦＢＳ（インビトロジェン社製）を１０％になるように培養液中に添加した。継代後は毎日培地交換を行い、十分に増殖したｉＰＳ細胞を随時継代してｉＰＳ細胞クローンを樹立した。
実施例６　マウスＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現確認
　実施例５で樹立された各ｉＰＳ細胞クローンがマウスＥＳ細胞のマーカー遺伝子を発現しているかどうかをＲＴ－ＰＣＲにより確認した。なお、陽性コントロールとしてマウスＥＳ細胞を用いた。
（１）ＲＮＡ抽出
　６穴培養プレートで培養した各ｉＰＳ細胞クローンから、ＦａｓｔＰｕｒｅ（登録商標）　ＲＮＡ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）によりＴｏｔａｌＲＮＡを回収した。方法はＫｉｔに添付の培養細胞からのＴｏｔａｌＲＮＡ抽出のプロトコルに従った。
（２）ｃＤＮＡ合成
　実施例６－（１）で抽出したＴｏｔａｌＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡの合成を行った。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　ＲｅａｌＴｉｍｅ）（タカラバイオ社製）を用い、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ａｓｓａｙの場合のプロトコルに従ってプレミックスを調製し、ＴｏｔａｌＲＮＡを２００ｎｇ添加した。ＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ社製）を用いて３７℃で１５分、８５℃で５秒の反応を行い、ｃＤＮＡを得た。
（３）ＰＣＲ反応
　まず、表１１に記載の塩基配列を有する合成プライマーの塩基配列を有する合成プライマーをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　実施例６－（２）で得られたｃＤＮＡのうちＴｏｔａｌＲＮＡ量に換算して１０ｎｇ分を鋳型としてＰＣＲを行った。５μＬの５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　Ｂｕｆｆｅｒ、２μＬのｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ　ｅａｃｈ）（タカラバイオ社製）、５ｐｍｏｌのフォワードプライマー、５ｐｍｏｌのリバースプライマー、０．５μＬのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１．２５Ｕ／μＬ）を加え、滅菌蒸留水を加えて全量を２５μＬとした。前記反応液をＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｇｒａｄｉｅｎｔにセットし、９８℃で１０秒、６０℃で１５秒、６８℃で１５秒を１サイクルとし、Ｆｂｘ１５の検出時は３５サイクル、その他の遺伝子転写産物の検出時には３０サイクルの反応を行った。
（４）アガロースゲル電気泳動による確認
　反応終了後、該反応液５μＬを２．０％アガロースゲル電気泳動に供し、ＥＳ細胞マーカー遺伝子のｍＲＮＡに由来する増幅産物を確認した。ｉＰＳ細胞クローン１～８の結果を図１に示す。図１から明らかなように、元のマウス胎児線維芽細胞（図中に示すＭＥＦ）では確認されない各ＥＳ細胞マーカーの発現が、ｉＰＳ細胞クローンならびにマウスＥＳ細胞で確認された。すなわち、樹立されたｉＰＳ細胞クローンはＥＳ細胞と同様の遺伝子発現パターンを示していることが確認された。
実施例７　ＳＳＥＡ－１（Ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ－１）細胞表面マーカーの発現確認
　実施例５で樹立されたｉＰＳ細胞クローンがＥＳ細胞の細胞表面マーカーを発現しているかどうかを免疫染色により確認した。
（１）ｉＰＳ細胞の固定
　２４ウエルプレートで培養したｉＰＳ細胞クローンを含む各ウエルをＰＢＳで２回洗浄した。その後、４％パラホルムアルデヒド溶液（和光純薬社製）を各ウエルに添加し、室温で１０分間インキュベートした。インキュベート後、ＰＢＳで２回洗浄を行い、固定液を完全に除去した。
（２）一次抗体反応
　１％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ）を含むＰＢＳを各ウエルに添加し、室温で一時間インキュベートすることでブロッキング反応を行った。ブロッキング溶液を除去したのち、抗ＳＳＥＡ－１　マウスＩｇＭ抗体（Ｒ＆Ｄシステム社製）を１％ＢＳＡを含むＰＢＳで５０倍に希釈した溶液を添加し、４℃で一晩インキュベートを行った。
（３）二次抗体反応
　翌日、各ウエルをＰＢＳで３回洗浄後、二次抗体としてＡｌｅｘａ４８８結合抗マウスＩｇＭ抗体（インビトロジェン社製）をブロッキング溶液で１０００倍希釈した溶液を添加した。その後、４℃で一晩インキュベートを行った。翌日、ＰＢＳで３回洗浄後、蛍光顕微鏡にて検鏡・写真撮影を行った。その結果を図２に示す。図２に示すように、樹立されたｉＰＳ細胞クローンは細胞表面全体が蛍光標識され、マウスＥＳ細胞の表面マーカーであるＳＳＥＡ－１を細胞表面に発現していることが示された。
実施例８　ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるｉＰＳ細胞クローンの多分化能の評価
　実施例５で樹立されたｉＰＳ細胞クローンがマウスＥＳ細胞と同様に多分化能を持つことを確認するため、ＳＣＩＤマウスに皮下移植しテラトーマ形成能について評価した。
（１）ｉＰＳ細胞懸濁液の作製
　培養したｉＰＳ細胞を０．２５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡを用いて回収し、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調製した。
（２）ｉＰＳ細胞懸濁液のＳＣＩＤマウスへの皮下投与
実施例８－（１）で調製したｉＰＳ細胞懸濁液をＳＣＩＤマウスの皮下に５×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬで投与した。
（３）形成されたテラトーマの凍結切片作製
　ｉＰＳ細胞を投与後、５週目に剖検を行いＳＣＩＤマウスからテラトーマを取り出し、ＴＩＳＳＵＥ　ＭＯＵＮＴ（千葉メディカル社製）で包埋して凍結ブロックを作成した。凍結ブロックは使用まで－８０℃に保存した。クライオスタットを用いて凍結切片を作製し、標準的な方法でＨＥ染色後、検鏡を行った。図３に示すように、三胚葉［外胚葉（Ｅｃｔｏｄｅｒｍ）、内胚様（Ｅｎｄｏｄｅｒｍ）、中胚様（Ｍｅｓｏｄｅｒｍ）］由来の組織が観察できたことから、実施例４の条件Ｇ（ｐＤＯＮ５－ｍＯ－ＩＲ－ＫＳＭ、ｐＤＯＮ５－ｍＯｃｔ４）から樹立したｉＰＳ細胞クローンは多分化能を持つと評価することができた。
実施例９　ＯＣＴ４単独搭載レトロウイルスベクター追加効果の検証
　ＯＣＴ４単独搭載レトロウイルスベクター追加効果を更に検証するため、ヒト線維芽細胞を用いてｉＰＳ細胞誘導を行った。なお、核初期化因子としてはｈＯＣＴ４、ｈＳＯＸ２、ｈＫＬＦ４、ｈｃ－ＭＹＣの４因子の組合せ、及びｈｃ－ＭＹＣを含まないｈＯＣＴ４、ｈＳＯＸ２、ｈＫＬＦ４、ｈＬＩＮ２８、ｈＮＡＮＯＧの５因子の組合せ、について検討を行った。
（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
　実施例４－（１）と同様の方法で行った。
（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入
　調製例８で調製した各ウイルス液を、以下の表１２の条件Ａ～Ｄの組合せで等量ずつ混合し、更に１０Ｆ－ＤＭＥＭで３０倍希釈した。このウイルス溶液をレトロネクチン固定化培養プレートの各ウエルにそれぞれ添加し、３２℃、２，０００×ｇで２時間遠心した。
　その後、各ウエルより上清を除去して１．５％ＨＳＡを含むＰＢＳで１回洗浄後、４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ－ＤＭＥＭで懸濁したヒト皮膚線維芽細胞を１ｍＬずつ各ウエルに播種した。播種後はプレートを３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養を開始した（培養０日目）。なお、培養１日目、３日目には培地交換を行った。
（３）フィーダー細胞上への播種
　６穴培養プレート（コーニング社製）に終濃度１ｍｇ／ｍＬのゼラチン（シグマ社製）水溶液を添加し、室温１時間あるいは４℃で一晩固定化後、洗浄してゼラチン固定化シャーレを作成した。ここに終濃度１２μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（ナカライテスク社製）で処理したＳＮＬ７６／７細胞をプレート１枚当たり１×１０６ｃｅｌｌｓずつ播種し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで終夜培養することによりフィーダー細胞を調製した。
　実施例９－（２）で作製した培養６日目の遺伝子導入細胞を回収し、５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ－ＤＭＥＭに懸濁した。この懸濁液２ｍＬを前記のフィーダー細胞上に播種し、培養を継続した。播種翌日に培養上清を除去し、ヒトＥＳ細胞用培地（８０％　ＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社製）、２０％ノックアウト血清リプレースメント、１×非必須アミノ酸混合物、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン、１００μＭ　２－メルカプトエタノール、４ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ（和光純薬社製））を２ｍＬ添加し、培養２８日目まで培養を継続した。この間、１～２日おきに培地を交換した。
（４）ｉＰＳ細胞コロニーの計測
　培養２８日目に各条件のヒトｉＰＳ細胞コロニー数を形態的特徴、アルカリホスファターゼ陽性であることを指標に計測した。その結果を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表１２に示すように、ｈＯＣＴ４、ｈＳＯＸ２、ｈＫＬＦ４、ｈｃ－ＭＹＣの４因子の組合せ、及びｈｃ－ＭＹＣを含まないｈＯＣＴ４、ｈＳＯＸ２、ｈＫＬＦ４、ｈＬＩＮ２８、ｈＮＡＮＯＧの５因子の組合せのいずれの場合においてもＯＣＴ４を単独で搭載するレトロウイルスベクターを追加すると誘導効率が飛躍的に向上することがわかった。
　本発明により、多能性幹細胞を効率よく製造するための核酸群及びベクター群が提供される。当該核酸群及びベクター群は、多能性幹細胞を効率よくかつ安全に製造する方法に使用され、基礎研究、医療への応用研究分野において極めて有用である。
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Claims (12)

  1. 　相互に自己切断ペプチドをコードする配列を介して接続されたＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ及びＭＹＣファミリーに属するタンパク質の６種の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域を含む核酸。
  2. 　５’末端より順にＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ、ＭＹＣファミリーに属するタンパク質のそれぞれの遺伝子のコード領域が並んで配置されている請求項１記載の核酸。
  3. 　請求項１又は２に記載の核酸を含むベクター。
  4. 　（１）ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ及びＭＹＣファミリーに属するタンパク質からなる群より選択される少なくとも３種の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域を１つの分子内に含む核酸、及び
    （２）ＯＣＴ４をコードする遺伝子のコード領域を含む他の核酸、
    を含む核酸のセット。
  5. 　（１）の核酸が、少なくとも３種の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域が、自己切断ペプチドをコードする配列及びＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ）配列から選択される配列を介して相互に接続された核酸である、請求項４に記載の核酸のセット。
  6. 　（１）の核酸において、少なくとも３種の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域のうち、５’末端の２種のコード領域が順にＯＣＴ４、ＫＬＦ４をコードする遺伝子のコード領域であり、それらがＩＲＥＳ配列を介して接続されている、請求項４又は５に記載の核酸のセット。
  7. 　請求項４～６のいずれか１項に記載の核酸のセットを構成する核酸をそれぞれ含む２種のベクターからなるベクターのセット。
  8. 　請求項１に記載の核酸又は請求項４に記載の核酸のセットを含む細胞。
  9. 　体細胞に請求項１に記載の核酸又は請求項４に記載の核酸のセットを導入する工程を包含することを特徴とする、多能性幹細胞の製造方法。
  10. 　ベクターを使用して核酸又は核酸のセットを体細胞に導入する請求項９記載の多能性幹細胞の製造方法。
  11. 　核酸又は核酸のセットを導入する工程がフィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントの存在下に実施される請求項９記載の方法。
  12. 　体細胞に請求項３に記載のベクター又は請求項７に記載のベクターのセットを導入して多能性幹細胞を製造する工程、及び前記の多能性幹細胞の分化を誘導する工程、を包含することを特徴とする、分化細胞の製造方法。
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