KR101689461B1 - 히스톤데아세틸효소 억제제 또는 메틸전달효소 억제제를 이용한 비골 유래 세포의 골형성세포로의 전환분화 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본원은 비-골 세포를 제공하는 단계; 및 상기 비-골 세포에 HDAC (histone deacetylase) 억제제 및/또는 메틸전달효소 억제제를 처리하는 단계를 포함하며, 상기 처리에 의해 상기 비-골 세포가 골형성세포로 전환되는 것인, 비골형성 세포의 골형성 세포로의 전환분화 방법, 이에 사용되는 조성물 및 키트를 개시한다. 본원에 따른 방법에 의해 분화된 세포는 골다공증 등 골 재생 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

히스톤데아세틸효소 억제제 또는 메틸전달효소 억제제를 이용한 비골 유래 세포의 골형성세포로의 전환분화 방법 및 조성물 {Method and composition for transdifferentiating non-osteogenic cells to ostogenic cells using histone deacetylase inhibitor and demethylating agent}

본원은 특정한 세포를 다른 유형의 비골세포를 다른 특성의 성숙 세포로 분화하는 기술에 관한 것이다.

분화된 중간엽세포는 일반적으로 자신의 표현형을 쉽게 바꾸지 않는다. 이는 분화적 안정성을 유지하기 위한 것으로 성숙한 분화세포를 다른 종류의 분화세포로 만드는 것은 매우 드물게 일어나는 현상이다.

일반적으로는 성숙한 분화세포를 다른 종류의 세포로 변화시키는 것은 역분화현상을 통해 전분화능을 가진 줄기세포로 변화시키고(dedifferentiation) 이를 다시 다른 종류의 분화신호를 가함으로서 일어나는 방향으로 진행된다.

하지만 이러한 역분화 및 분화 신호 전달을 통한 조직 재생은 역분화 자체의 어려움 및 특정 종류의 세포의 분화 신호 자체가 잘 알려져 있지 않기 때문에 그 조건 설정의 어려움으로 인해 연구 및 실제 임상적 적용에는 어렵다.

위의 방법보다 보다 진보된 방법은 분화된 체세포 또는 이의 전구 세포에 특정 신호전달계 만을 조절하여 다른 종류의 세포로 분화시킬 수 있는 전환분화 방법이다.

골 노화는 인체의 노화현상에 수반되는 일반적인 현상으로서 그 대표적인 현상으로서 골수 조직의 지방세포 축적으로 대표될 수 있으며 결과적으로 골 재생 감소 및 골소실로 연결된다. 이와는 다른 경우로서 골조직에 외상이 가해지는 경우 건강한 골은 일반적으로 새로운 골조직으로 재생이 쉽게 일어나나 특정한 경우 골조직으로 재생이 일어나지 않고 섬유아세포 등으로 채워지면서 섬유성 재생이 일어나게 되며 이는 골을 약하게 만드는 원인이 된다.

이러한 경우 골 재생만이 유일한 치료방법으로 전환분화 방법과 같은 보다 간편하고 근본적인 방법을 이용한 치료법 개발이 필요하다.

미국 공개 특허공보 제2007-0298495호는 세포의 전환분화방법에 관한 것으로 골모세포를 신경세포로 전환분화하는 방법을 개시하고 있다.

기존에 비-골유래 세포를 전환분화 방법을 통해 골세포로 분화시키는 방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 비-골 세포를 제공하는 단계; 및 상기 비-골 세포에 HDAC (histone deacetylase) 억제제 또는 메틸전달효소 억제제 중 하나 이상을 처리하는 단계를 포함하며, 상기 물질이 모두 사용되는 경우, 상기 물질은 동시에 또는 순차적으로 세포에 처리될 수 있으며, 상기 처리에 의해 상기 비-골세포가 골형성 세포로 전환되는 것인, 인비트로에서 비-골 세포의 골형성 세포로의 전환분화 방법을 제공한다.

일 구현예에서 상기 방법은 Wnt3a 단백질을 처리하는 단계를 추가로 포함하며, 본원에 따른 효과를 달성하는 한, HDAC (histone deacetylase) 억제제 또는 메틸전달효소 억제제와 동시에 또는 그 후 또는 그 전에 처리 될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 HDAC 억제제 또는 메틸전달효소 억제제 중 하나 이상을 포함하는, 인비트로에서 비-골 세포의 골형성 세포로의 전환분화 조성물 또는 키트를 제공하며, 일 구현예에서 상기 조성물은 필요한 경우 Wnt3a 단백질을 추가로 포함할 수 있다.

본원에 따른 방법 및 조성물은 노화된 골 또는 외상을 받은 골에서 다수 존재하는 지방세포 또는 섬유아세포를 후성유전적 조절물질을 이용하여, 전능세포로의 역분화없이 다른 성숙세포인 골세포로 전환분화가 가능하여, 따라서 특별한 치료 방법이 없는 노화된 골조직과 같은 골재생 치료 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 Wnt3a가 골형성세포에서 Bmp2 및 Alp 발현을 자극한다는 것으로 나타내는 결과로, A는 Alp 염색결과를 나타내는 것으로 MC3T3-E1, C2C12, ST2, C3H10T1/2, 3T3-L1, 및 NIH3T3 세포를 Bmp2 (50 ng/ml) 또는 Wnt3a (50 ng/ml)로 처리한 후에 3일 간 배양한 후 Alp에 대한 세포화학염색 결과이고, B는 세포를 Wnt3a (50 ng/ml)로 24 h 처리한 후에 실시간 정량 PCR로 분석한 결과이다. 결과는 Wnt3a 처리결과 대비 증가한 배수로 나타냈다. Bmp2 및 Alp mRNA는 실시간 정량 PCR로 분석하였으며, GAPDH 발현에 대하여 적정화(normalize)하였다. 결과는 각 mRNA에 대한 3중 실험 및 최소 3회 반복의 결과이며, means±S.D.로 나타내며 p < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 하였다.
도 2는 비-골형성 세포의 Bmp2 및 Alp 프로모터 영역이 높은 메틸화정도를 나타내는 결과로, A 및 B의 다이아그램은 Bmp2 (A, -1500 내지 +500 bp) 및 Alp (B, -1000 내지 +1000 bp) 프로모터 영역의 CpG 아일랜드를 분포를 나타낸다. 다이아그램에서 메틸화 PCR에 의한 검출영역은 화살표로 나타냈고 서열은 표 1에 기재되어 있다. C 및 D 는 Bmp2 (C) 및 Alp (D) 프로모터 영역의 MSP 분석 결과로 각각 메틸화 (M) 및 비메틸화 (U) 대립유전자의 증폭을 나타낸다. 아래 패널은 MSP 분석의 밴드강도를 정량한 결과로 비메틸화 및 메틸화 DNA의 퍼센트를 표시하였다. 사용한 프라이머는 표 1에 기재되어 있으며, 결과는 3중 실험 결과로 mean±S.D.로 나타냈다.
도 3은 후성유전적조절에 의해 3T3-L1 전구-지방세포에서 Bmp2 및 Alp의 발현이 조절되는 것을 나타내는 결과로, 3T3-L1 세포를 5‘-aza-dC (10μM) 또는 TSA (100 nM)로 24시간 처리한 후에 Wnt3a (50 ng/ml)를 추가한 후 24시간 추가 배양하였다. Bmp2 (A) and Alp (B) mRNA 발현은 실시간 정량 PCR로 분석하였고, GAPDH 농도에 대하여 적정화하였다. 결과는 각 mRNA에 대한 3중 실험 및 최소 3회 반복의 결과이며, means±S.D.로 나타내며 p < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 하였다. 모든 수치는 각 대조군의 수치와 비교한 유도 배수로 나타냈다. C 및 D는 Bmp2 (C) 및 Alp (D)의 MSP 분석 결과이다. M 및 U은 메틸화 및 비메틸화 대립유전자의 증폭결과이다. 아래 패널은 MSP 분석의 밴드 밀도를 정량한 결과로 비메틸화 및 메틸화 대립유전자의 퍼센트를 나타낸다. 사용한 프라이머는 표 1에 기재되어 있으며, 결과는 3중 실험 결과로 means±S.D.로 나타냈다. E 및 F는 acetyl-histone H3 (Lys-9), trimethyl histone H3 (Lys-9), MeCP2 및 Lef-1 (E) 항체를 이용한 ChIP (chromatin immunoprecipitation) 분석 결과이다. 크로마틴 단편은 표 1의 프라이머를 이용하여 Bmp2 (E) 및 Alp (F)에 대하여 PCR 증폭하였다.
도 4는 후성유전적조절에 의해 NIH3T3 섬유아세포에서 Bmp2 및 Alp의 발현이 조절되는 것을 나타내는 결과로, NIH3T3 세포를 5‘-aza-dC (10μM) 또는 TSA (100 nM)로 24시간 처리한 후에 Wnt3a (50 ng/ml)를 추가한 후 24시간 추가 배양하였다. Bmp2 (A) 및 Alp (B) mRNA 발현은 실시간 정량 PCR로 분석하였고, GAPDH 농도에 대하여 적정화하였다. 결과는 각 mRNA에 대한 3중 실험 및 최소 3회 반복의 결과이며, means±S.D.로 나타내며 p < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 하였다. 모든 수치는 각 대조군의 수치와 비교한 유도 배수로 나타냈다. C 및 D는 Bmp2 (C) 및 Alp (D)의 MSP 분석 결과이다. M 및 U은 메틸화 및 비메틸화 대립유전자의 증폭결과이다. 아래 패널은 MSP 분석의 밴드 밀도를 정량한 결과로 비메틸화 및 메틸화 대립유전자의 퍼센트를 나타낸다. 사용한 프라이머는 표 1에 기재되어 있으며, 결과는 3중 실험 결과로 means±S.D.로 나타냈다. E 및 F는 acetyl-histone H3 (Lys-9), trimethyl histone H3 (Lys-9) 및 MeCP2 항체를 이용한 ChIP (chromatin immunoprecipitation) 분석 결과이다. 크로마틴 단편은 표 1의 프라이머를 이용하여 Bmp2 (E) 및 Alp (F)에 대하여 PCR 증폭하였다.
도 5는 프로모터 영역의 CpG 섬(CpG island)의 메틸화가 유전자 발현을 조절하는 것을 보여주는 결과로, A는 인비트로 메틸화 상태 확인을 위해 CpG 섬을 포함하는 BMP2 및 ALP 프로모터를 삽입한 벡터를 SSSI 메틸화효소로 5-사이토신(Cytosine)의 메틸화를 유도하고, HpyCH4IV 효소로 절단한 것으로, 메틸화에 민감한 엔도뉴클레아제인 HpyCH4IV는“ACGT”를 인식하지만, 5-메틸사이토신이 있는 경우에는 인식할 수 없어 절단할 수 없다. B는 C2C12 세포에서 인비트로 DNA 메틸화 존재 또는 부재하에서 Bmp2 및 Alp 프로모터 리포터 벡터의 루시퍼라제 활성을 측정한 결과로 C2C12 세포에 SssI 메틸화효소를 처리 하거나 하지 않은 Bmp2 또는 Alp 프로모터 리포터 벡터 및 Lef-1 또는 Dlx5 발현벡터를 각각 전달이입한 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 결과는 3중 실험 및 각 조건에서 3회 독립적 실험의 결과로, mean±S.D.로 나타냈고 p < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 하였다.
도 6은 후성유전적조절에 의해 비-골형성세포로부터 골모세포로의 분화를 유도할 수 있음을 나타내는 결과로, A는 세포를 5‘-aza-dC (10μM) 또는 TSA (100 nM)로 각각 24시간 처리한 후에 Wnt3a (50 ng/ml)를 추가한 후 골 형성 배지 (베타-글리세로포스페이트 5mM, 아스코르브산 50μg/ml 포함)에서 3일 간 배양하였다. Day 0은 분화개시를 나타낸다. B 및 C는 Alp 염색을 나타내며, 3T3-L1 세포 (B)는 5‘-aza-dC 로 처리하였고 NIH3T3 세포 (C)는 TSA로 처리하였다. ALP 활성은 세포화학염색법으로 측정하였다.

본원은 HDAC (histone deacetylase) 억제제 및/또는 메틸전달효소 (methyltransferase) 억제제와 같은 후성유전적 조절 방법을 이용하여 성숙한 비-골 유래 세포인 지방세포와 섬유아세포를 전환분화 (transdifferentiation) 시켜 골형성계의 세포로 분화할 수 있다는 발견에 근거한 것이다.

구체적으로 본원에서는 비-골 유래세포에서 골조직 분화에 핵심유전자 중 하나인 Bmp2와 Alp가 CpG 아일랜드의 메틸화로 인해 유전자 발현이 억제되어 있음을 밝혔으며, 후성유전적 조절물질로서 5‘-aza-dC(5-aza-2'-deoxycytidine)와 TSA(Tricostatin A)가 이러한 메틸화의 탈메틸화 촉진 및/또는 히스톤 데아세틸화를 억제하는 기작을 통해서 골조직으로 직접 분화를 유도할 수 있음을 발견하였다.

따라서 한 양태에서 본원은 비-골세포를 제공하는 단계; 및 상기 비-골 세포에 HDAC (histone deacetylase) 억제제 및/또는 메틸전달효소 억제제를 처리하는 단계를 포함하며, 상기 처리에 의해 상기 비-골세포가 골형성 세포로 전환되는 것인, 비-골 세포의 골형성 세포로의 전환분화 방법에 관한 것이다.

본원에서 사용된 용어 “전환분화(transdifferentiation)”는 계통재프로그래밍 (lineage reprogramming)이라고도 불리우며, 성숙한 체세포가 다른 성숙한 체세포로 전환 (transform)되며 중간 단계의 전능단계 (pluripotent) 또는 전구 세포 단계를 거치지 않는 분화를 일컫는 것이다 (Graf, T.; Enver, T. (2009). "Forcing cells to change lineages". Nature 462 (7273): 587-594).

즉, 전환분화는 성숙한 한 종류의 세포를 성숙한 다른 종류의 세포로 전환하는 것으로서, 전환여부는 각 세포의 형태 또는 특정 유전자 발현여부를 검출하여 확인할 수 있으며, 본원에서는 골형성 세포로의 분화여부는 골세포에서 특이적으로 발현되는 마커인 Bmp2 및 Alp 발현을 통해 확인할 수 있다.

골 노화는 인체의 노화현상에 수반되는 일반적인 현상으로서 그 대표적인 현상으로서 골수 조직의 지방세포 축적으로 대표될 수 있으며 결과적으로 골 재생 감소 및 골소실로 연결된다. 이와는 다른 경우로서 골조직에 외상이 가해지는 경우 건강한 골은 일반적으로 새로운 골조직으로 재생이 쉽게 일어나나 특정한 경우 골조직으로 재생이 일어나지 않고 섬유아세포 등으로 채워지면서 섬유성 재생이 일어나게 되며 이는 골을 약하게 만드는 원인이 된다.

따라서 일 구현예에서 비-골세포로서 본원에 따른 방법에 사용되는 세포는 성숙한 비-골형성계 (nonosteogenic lineage), 또는 비-골 유래 세포로서, 골세포 (예를 들면 골모세포, 조골전구세포, 조골모세포, 골모세포 등)가 아닌 것을 의미하며, 노화 또는 외상이 일어난 골조직에서 수득할 수 있는 예를 들면 전구 지방세포, 지방세포 또는 섬유아세포를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다.

본원에서는 비-골세포에서 Bmp2와 Alp가 CpG 섬의 메틸화로 인해 유전자 발현이 억제되어 있음을 밝혔으며, 이에 후성유전적 조절물질로서 5-aza-dC(5-aza-2'-deoxycytidine) 및/또는 TSA(Tricostatin A)등과 같은 물질을 처리하여 메틸화의 탈메틸화 촉진 및/또는 히스톤 데아세틸화를 억제하는 기작을 통해서 골조직으로 전환분화를 유도할 수 있다.

따라서 본원에 따른 방법에서 비-골 세포는 후성유전적 조절물질, 특히 본원 실시예에 기재된 바와 같은 프로모터 영역의 CpG 섬의 탈메틸화 또는 염색체를 감고 있는 단백질인 히스톤 데아세틸화를 억제할 수 있는 물질로 처리된다.

본원에서 메틸전달효소(methyltransferase)는 공여자의 메틸기를 수용자로 옮기는 것을 촉매하는 효소를 일컫는 것이다. 수용자(acceptor)는 DNA 상의 뉴클레오타이드 염기일 수 있다. DNA 상의 메틸화의 전환에 관여하는 경우를 DNA 메틸전달효소라고 한다. 따라서 본원에 사용되는 “메틸전달효소 억제제”는 이러한 효소의 기능을 억제하는 것으로, 예를 들면 DNA 메틸전달효소 억제제를 포함하며, 일 구현예에서는 통상 유전자의 프로모터 영역에 존재하는 CpG 아일랜드의 메틸화를 억제할 수 있는 것이다. 본원에 사용될 수 있는 메틸전달효소 억제제는 예를 들면 5-AZA-2'-데옥시사이티딘, 제불라린 (Zebularine), 3'-데아자네플라노신 A 하이드로클로리드 (3'-Deazaneplanocin A hydrochloride), 로메구아트리브 (Lomeguatrib), 카에토신 (Chaetocin), 또는 데시타빈 (Decitabine)를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에서 히스톤 탈아세틸화효소 억제제는 히스톤의 탈아세틸화효소의 기능을 저해하는 화합물로서, 정신과, 신경과에서 기분 조절제 및 항간질제로 사용되어 왔으며, 공지된 종전의 히스톤 탈아세틸화효소 억제제가 본원에 사용될 수 있다.

본원에 사용될 수 있는 “히스톤 탈아세틸화효소 (HDAC, histone deacetylase) 억제제 또는 저해제”는 하이드록삼산류, 원형 테트라펩티드류, 벤자미드류, 친전자적 케톤류 및 지방족 산류 등과 같은 전통적 저해제뿐만 아니라, 2세대 히스톤 탈아세틸화효소 저해제로 히드록삼산류 및 벤자미드류가 포함되며, 상세하게는 전통적 제해제 및 2세대 제해제의 히드록삼산류가 포함되고, 더욱 상세하게는 수베로일아닐리드 하이드록삼산(suberoylanilide hydroxamic acid, 또는 vorinostat 또는 N-hydroxy-N, SAHA), 트리코스타틴 A (trichostatin A, 7-[4-(dimethylamino)phenyl]-N-hydroxy-4,6-dimethyl-7-oxohepta -2,4-dienamide, 베리노스타트 Belinostat, (2E)-N-Hydroxy-3-[3-(phenyl sulfamoyl)phenyl]prop-2-enamide) 및 파노미노스타트 (Panobinostat, (2E)-N- hydroxy-3-[4-([2-(2-methyl-1H-indol-3-yl)ethyl]aminomethyl)phenyl] acrylamide)를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

상술한 바와 같이 HDAC (histone deacetylase) 억제제 또는 메틸전달효소 억제제가 본원에 따른 효과를 달성하는 한, 상기 두 가지 물질이 모두 사용되는 경우에는 동시에 또는 순차적으로 예를 들면 HDAC 처리 후, 메틸전달효소 억제제를 처리할 수 있으며, 그 반대의 순서도 가능하다.

일 구현예에서, 상기 방법은 WNT (wingless/int-1 class) 신호전달계에 관여하는 Wnt3a 단백질을 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 골조직의 분화과정 및 조골모세포의 분화과정은 크게 WNT (wingless/int-1 class) 신호전달계와 Bmp(Bone Morphogenetic Proteins) 신호전달계에 의해서 지배된다. Wnt3a는 골유도 분자인 Bmp2의 생성 및 분비를 촉진하여 조골세포 분화과정 및 골조직 생성과정을 촉진하는 것으로 알려져 있다 (Cho, Y. D. et al (2012) J. Cell. Physiol. 227, 2287-2296; Rawadi, G. et al (2003) J. Bone Miner. Res. 18, 1842?1853). Bmp는 골세포분화과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 세린/쓰레오인 카이나제인 BmpR-II/BmpR-I 수용체에 부착하여 신호전달을 시작한다. 하지만 이런 현상은 단지 골유래 세포에 대해서만 국한 된 것으로서 골조직으로 분화되지 않는 세포에 대해서는 다른 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 즉 비-골 유래세포인 3T3-L1이나 섬유아세포의 세포주인 NIH3T3에 Wnt3a를 처리하는 경우 Wnt3a 처리에 따른 세포 분열 증가 또는 세포이동성 증가 등의 일반적인 현상만 나타낼 뿐, Bmp2의 분비가 증가하지 않는 것으로 나타났다. 하지만 본원에 따른 방법에서 Wnt3a를 HDAC (histone deacetylase) 억제제 및 메틸전달효소 억제제 중 하나 이상의 처리 후 또는 이와 함께 비-골 세포에 처리할 경우, Bmp2 발현 증가로 이어졌다. 본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 Wnt3a는 유전자 또는 단백질이 형태로 사용될 수 있으며, 재조합, 천연에서 발견되는 것을 모두 포함하는 것이다. 상기 단백질은 본원 실시예에 기재된 것과 같이 시중에서 구입할 수 있으며, 바로 앞의 참고문헌을 참고할 수 있다. 따라서 상기와 같은 기능을 달성하는 한, Wnt3a 단백질의 처리 순서는 특히 제한되는 것은 아니며, HDAC (histone deacetylase) 억제제 또는 메틸전달효소 억제제 처리 후 또는 동시에 또는 그 전에 처리될 수 있다.

본원에 따른 방법은 성숙한 비골형성 계통의 세포를 골을 형성할 수 있는 골형성 세포로 전환할 수 있다. 본원에 따른 방법에 의해 전환될 수 있는 골형성 세포는 골로 분화될 수 있는 세포로, 예를 들면 골형성계 (Osteogenic) 세포, 전구조졸모세포, 조골모세포 (preosteoblast), 골모세포 (Osteoblast) 및 골세포 (Ostocyte) 등을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.

골조직에서는 생리적으로 Bmp와 WNT신호전달에 대한 자극이 지속적으로 일어나는 조직인바, 여기에 후성유전적 조절물질을 투여하는 것만으로 그 조직에 존재하는 다른 종류의 세포-예로서 지방세포 또는 섬유아세포를 전분화능세포로 역분화시키는 과정없이 골세포로 전환분화 시키는 것이 가능할 것이다.

다른 양태에서 본원은 또한 HDAC (histone deacetylase) 억제제 및/또는 메틸전달효소 억제제를 포함하는, 비골 세포의 골형성계 세포로의 전환분화용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 히스톤 탈아세틸화효소 저해제 및 메틸전환 효소 억제제는 상기 언급한 바와 같다. 본원 조성물에 포함되는 HDAC 억제제는 그 자체로 또는 약학적으로 허용되는 여러 가지 염 형태로 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 약학적으로 허용되는 염은 생리적으로 허용되고 인간에게 투여될 때 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알러지 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 이들 염은 물이나 유기 용매 또는 이들 두 용매의 혼합물 중에서 적절한 염기 또는 산의 화학량론을 반응시켜 제조하는 것이다. 이들은 무기 염기와의 염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기 산과의 염 및 염기성 또는 산성 아미노산과의 염이 포함된다. 무기 염기와의 염은 예를 들면 나트륨 염 및 칼륨 염과 같은 알칼리 금속 염, 칼슘 염 및 마그네슘 염과 같은 알칼리코금속 염, 알루미늄 염 및 암모늄 염이 포함된다. 유기 염기와의 염으로는 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 사이클로헥실아민, 디사이클로헥실아민 및 N,N디벤질에틸렌디아민과의 염 등을 예로 들 수 있다. 무기 산과의 염의 예로는 염산, 붕산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레산, 시트르산, 숙신산, 말산, 메틸설폰산, 벤질설폰산 또는 p-톨루엔설폰산과의 염 등이 포함된다. 염기성 아미노산과의 염은 예를 들면 아르기닌, 라이신 및 오르니틴이 포함된다. 산성 아미노산과의 염의 예로는 아스파르트산 및 글루탐산과의 염을 들 수 있다. 본원에 따른 염은 예컨대 이온 교환과 같은 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다.

본원에 따른 조성물은 본원에 따른 방법에 사용될 수 있으며, 특히 엑스비보 및/또는 인비트로에서 수 있다. 전환분화를 위한 조성물에 사용되는 통상의 제조방법을 고려하여 제조될 수 있다.

이하 본원에 따른 실시예를 기재하나, 본원은 하기 실시예에 제한되는 것은 아니다.

실시예

실험재료 및 방법

세포 배양

전구 조골세포인 마우스 MC3T3-E1 세포는 alpha-minimal essential medium (α-MEM)을 사용하여 배양. 다분화능을 갖는 ST2 간엽 전구 세포 (mesenchymal progenitor cells)는 RPMI 1640 배지를, 마우스 C2C12 전구 근원세포, 3T3-L1 전구 지방세포 그리고 NIH3T3 섬유아세포는 Dulbecco's modified Eagles's medium(DMEM,Logan,UT)를 사용하여 배양하였다. 모든 배지는 10% 소태아혈청이나 우아혈청, 그리고 1%의 페니실린/스트렙토마이신을 포함. 모든 세포주는 ATCC(Manassas, VA)로 부터 구하였으며 골형성 배지는 β-glycerophosphate 50mM과 ascorbic acid 50μg/ml 을 포함하였다.

마우스 재조합 Wnt3a와 인간 재조합 Bmp2 단백질은 R&D Systems(USA)에서 구입. 5`-aza-dC 와 trichostatin-A(TSA)는 Sigma 로 부터 구입하였다.

역전사 중합효소 연쇄반응과 실시간 유전자 정량 증폭

QIAzol lysis reagent (Qiagen,USA)를 사용하여 RNA 분리 및 정제하였다. Primescript^TM RT-reagent kit (Takara Bio, Japan)을 사용하여 역전사 중합효소 연쇄반응 실시하였다. 종전에 기재된 프라이머 (Cho, Y. D. et al (2012) J. Cell. Physiol. 227, 2287-2296)를 사용하여 각각 마우스 Bmp2와 Alp에 대해서 실시간 유전자 정량 증폭을 실시하였다. 실시간 유전자정량 증폭은 Takara SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio, Japan)과 Applied Biosystems 7500 Real Time PCR system (Life technology, USA)을 사용하였다. 유전자 증폭 프라이머는 Integrated DNA technology (IDT; Coraville, IA)을 통하여 제작하였다. 모든 샘플은 세번씩 반복 실험하였으며 상대적 mRNA 발현 정도는 GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) mRNA을 상대로 정규화하였다.

CpG Island 인 실리코 분석(In Silico Analysis)

CpG 아일랜드를 찾기 위해서 EMBOSS CpGPlot 프로그램, UCSC 게놈 브라우저 공용 데이터베이스, 그리고 MethPrimer를 사용하였다. 이러한 프로그램들을 사용하여 Bmp2 프로모터(NCBI gene accession number 12156)의 경우 -1500 ~ +500bp 길이의 CpG 섬을, Alp 프로모터(NCBI gene accession number 11647)의 경우 -1000 ~ +1000bp 길이의 CpG 섬을 확인하였다. CpG 아일랜드 예측은 다음과 같은 한도에 맞춰 실시하였다 : 100-bp window, 관측/예상되는 CpG 비율>0.6 그리고 G와 C 의 백분율>50%.

메틸화-특이적 중합효소 연쇄반응 (Methylation-specific PCR)

LaboPass tissue miniprep kit (Cosmo Genetech, Korea)를 사용하여 세포로 부터 유전체 DNA를 추출하였다. 중아황산염(bisulfite) 전환에는 EpiTect Fast DNA bisulite kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하였다. 중합효소 연쇄반응에는 Lugen^TM Sensi 5X PCR premix(Lugen Science Co, Korea) 사용하였다. 중합효소 연쇄반응에 사용한 프라이머 목록은 표 1에 표시하였다. MethPrimer 프로그램을 이용하여 메틸레이션-특이적 중합효소 연쇄반응 프라이머 제작하였다.

[표 1]

*M과 U는 각각 메틸화 되어있는, 그리고 탈메틸화 되어있는 대립 형질을 나타냄.

면역침강정제분석 (Chromatin Immunoprecipitation(ChIP)Analysis)

면역침강정제법은 종전 논문에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Cho, Y. D. et al (2012) J. Cell. Physiol. 227, 2287-2296). Protein G 자석비드와 단일가닥 DNA는 각각 Upstate Bio-technology(Charlottesville, VA)와 Sigma에서 구입하였다. Acetyl histone H3 (Lys-9), methyl histone H3 (Lys-9) 그리고 immunoglobulin G에 대한 항체는 Millipore (USA)에서 구입하였다. Anti-MeCP2 항체는 Abcam (USA), 그리고 anti-Lef-1 항체는 Santa Cruz Biotechnology (USA)에서 구입하였다. 3T3-L1 또는 NIH3T3 세포는 100-mm 배양접시에 70% 밀도로 배양 후 5`-aza-dC (10μM)와 TSA (100nM)을 24시간 동안 처리하고, 이어 Wnt3a(50ng/ml)을 24시간 동안 처리하였다. 면역침강정제법에서 DNA 가닥을 검출하기 위해서 사용한 프라이머는 표 1 에 표시하였다.

알칼리성 인산가수 분해효소 (Alkaline Phosphatase, ALP) 염색법

표준화된 ALP 염색 키트는 Sigma에서 구입하였다. 세포를 PBS로 두 번 헹군 뒤 제조사의 사용 설명에 따라 염색을 진행하였다.

DNA 구축

CpG 섬과 이전 논문(Cho, Y. D. et al (2012) J. Cell. Physiol. 227, 2287-2296)에서 검증한 Lef-1-결합 요소가 포함되어 있는 -1200 ~ +200 bp의 Bmp2 프로모터 루시퍼라제 리포터 벡터를 사용하였다. Alp 프로모터(-1200 ~ +1000 bp)의 경우 In-Fusion HD cloning kit (Clontech)와 프라이머 (forward : 5‘-TCT TAC GCG TGC TAG CCT TCA GGG TAG AAG TGA TCA-3‘, reverse : 5’-CCG GAA TGC CAA GCT TAG CCA AAC GTT CTT TCA GGC-3‘) 를 사용하여 in-fusion primer design tool을 사용하여 제조자 사용 설명에 따라서 제작하였다. 중합효소 연쇄반응을 이용하여 증폭한 뒤 pGL3-basic vector (Promega, USA) 에 삽입하여 제작하였다. Lef-1 및 Dlx5 각각의 벡터에서 발현되는 단백질은 웨스턴블랏을 사용하여 확인하였다. 모든 플라스미드 DNA는 DNA Maxi-prep kit(Genomed, Germany)를 이용하여 분리 및 정제하였다.

일시적 전달이입

C2C12 세포를 100-mm 배양 접시에 90-100% 밀도로 배양한 후 Neon^TM transfection system (Invitrogen)의 10μl gold tip을 이용하여 전기천공법으로 제조사 사용 설명에 따라 전달이입을 수행하였다. 전달이입은 0.5μg 의 Lef-1 및 Dlx5 발현 벡터를 사용하였으며, 대조군으로는 pcDNA3.1 벡터, 그리고 0.15μg의 Bmp2 이나 Alp 프로모터 루시퍼라제 리포터 벡터를 사용하였다.

In Vitro 메틸화

메틸화된 리포터 벡터의 경우 S-adenosyl methionine과 CpG methyltransferase M.SssI (New England Biolabs, USA)을 37℃에서 8시간 동안 반응시켜 제조사 사용 설명에 따라 제조하였다. 메틸화 여부는 HpyCH4IV 제한효소(New England Biolabs)를 사용한 선택적 유전자 절단방법으로 확인하였다.

루시퍼라제 리포터 분석

수동적융해완충액으로 세포를 융해한 뒤 Bright Glo^TM luciferase assay system 과 GloMax-Multi Detection system machine(Promega, USA)을 제조자의 방법대로 이용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다.

통계학적 분석

정량 분석 결과는 평균값±표준편차로 나타냄. 각 실험은 최소 3번 실행하였으며, 대표 실험 결과만 나타내었다. 유의차는 Student's t test 로 분석. p<0.05는 통계적으로 유의성이 있는 것으로 고려하였다.

실시예 1. Wnt3a에 의한 골형성세포에서 Bmp2 및 Alp 발현 자극

본 실시예에서는 다수의 골형성 세포주 (MC3T3-E1, C2C12, C3H10T1/2, 및 ST2) 및 비-골세포 (3T3-L1 및 NIH3T3)를 포함하는 중간엽세포주가 Bmp2 및/또는 Wnt3a의 존재하에서 골모세포로 분화할 수 있는지 여부를 실험방법 부분에 기재된 바와 같이 분석하였다.

결과는 도 1에 기재되어 있다. 골형성 세포 유형인 MC3T3-E1, C2C12, C3H10T1/2, 및 ST2 세포에서 Bmp2 투여에 의해 Alp 가 발현되어 강하게 염색되었으며, 특히 전구 골모세포인 MC3T3-E1와 전구 근아세포인 C2C12는 Bmp2에 의해 보다 효과적으로 유도되었지만, C3H10T1/2 중간엽 기원세포 및 ST2 골수 스트로마 세포는 Wnt3a에 의해 보다 효과적으로 발현이 유도되었다 (도 1의 A 참조). 이러한 결과는 분화가 덜 된 세포 (C3H10T1/2 및 ST2))가 Wnt3a에 의해 높은 반응성을 나타내며, 분화된 세포 ((MC3T3-E1 and C2C12)는 Bmp2에 보다 높은 반응성을 나타내는 것을 의미한다. Bmp2 발현은 Wnt3a에 의해 MC3T3-E1, C2C12, C3H10T1/2, 및 ST2 세포에서만 유도되며, 3T3-L1 및NIH3T3 세포에서는 유도되지 않았다 (도 1B 참조). 상기한 네 종류의 Wnt3a에 반응하는 세포에서는 Bmp2 발현이 상향 조절되었으며, Alp 염색결과에 의하면 Wnt3a의 존재 중에서 골모세포로 분화될 수 있는 공통점이 있다. 특히 Alp 자체가 Bmp2 신호전달 경로의 다운스트림 표적으로, Alp mRNA 발현이 Wnt3a에 의해 유도되는 것으로 나타났다 (도 1의 B 참조). 이러한 결과는 Wnt3a는 골형성 세포에서는 Bmp2와 Alp를 증가시키나, 비-골세포에는 이러한 기작이 없는 것을 나타낸다. Wnt3a에 의해 3T3-L1 및 NIH3T3 세포가 골세포로 분화할 수 없는 이유가 이들 세포가 Bmp2를 발현할 수 없기 때문임을 나타낸다.

실시예 2 골세포 유도성 및 비유도성 세포주간에 CpG 메틸화 차이

실시예 1에서 기술한 바와 같이 Wnt3a 및 Bmp2에 반응하는 마우스세포주 간의 차이가 후성유전적 조절에 의한 것인지를 조사하였다. CpG plot tool, EMBOSS CpGPlot 및 MethPrimer 인실리코 분석 프로그램을 종전에 기술된 바 (Li, L. C., and Dahiya, R. (2002) Bioinformatics 18, 1427-1431)와 같이 사용하여 분석한 결과 Bmp2 및 Alp 프로모터 1.5kb (전사개시 부위부터 5‘ 방향)에서 CpG 섬이 존재하는 것을 규명하였다 (도 2의 A 및 B). 실험방법 부분에 기재된 바와 같이 메틸화 특이적 PCR을 수행한 결과 골유도성 세포의 Bmp2 및 Alp 프로모터 영역의 CpG 아일랜드는 비유도성 세포와 비교하여 매우 저-메틸화되어있는 것으로 나타났다 (도 2의 C 및 D). 이러한 Bmp2 및 Alp 프로모터 영역의 CpG 아일랜드의 후성유전적 조절이 상술한 골세포로의 유도여부 차이를 가져오는 것을 나타낸다.

실시예 3. 3T3-L1 전구 지방세포에서 후성유전적 조절에 의한 Bmp2 및 Alp 발현 유도

실험방법에 기재된 바와 같이 DNA 메틸화 여부를 조절 또는 변형하기 위해, 메틸화가 가능하지 않은 뉴클레오타이드 유사체인 5‘-aza-dC를 세포에 처리하여 CpG의 메틸화를 억제하였다. 또한 히스톤데아세틸라제 억제제인 TSA를 처리하여 히스톤 H3 및 H4의 아세틸화를 촉진하여 유전자의 발현을 촉진할 수 있도록 크로마틴 상태를 과아세틸화 (hyper-acetylated) 상태로 유도하였다.

결과는 도 3에 기재되어 있다. 5-aza-dC (10μM) 또는 TSA (100 nM) 처리에 의해 Bmp2 또는 Alp mRNA 발현이 3T3-L1 세포에서 제한적으로 증가한 것으로 나타났다 (도 3, A 및 B). 하지만 5‘-aza-dC 또는 TSA 처리 후에 Wnt3a를 투여한 결과, Bmp2 및 Alp를 발현하지 않았던 세포에서 24시간 내에 이들 유전자의 발현이 현격하게 증가한 것으로 나타났다 (도 3, A 및 B). 또한 Wnt3a 신호전달 활성화를 모방할 수 있는 글리코겐 합성 카이나제 3 억제제인 LiCl 및 SB213763의 효과를 조사한 결과, 이들 또한 Bmp2 and Alp 유전자 발현을 유도하는 것으로 나타났다. Wnt3a 및 5’-aza-dC 또는 TSA의 연속적 투여가 Alp mRNA 발현과 비교하여 Bmp2 mRNA 발현을 보다 효과적으로 유도하는 것으로 나타났다 (도 3, A 및 B). 또한 3T3-L1 세포에서 5‘-aza-dC and Wnt3a의 조합처리가 Alp mRNA 발현 증가가 약간 더 효과적인 것으로 나타났다(도 3의 B).

실시예 4. Bmp2 및 Alp 프로모터의 CpG 메틸화 상태에 의한 Wnt3a 매개 유전자 발현 결정

상술한 결과는 후성유전적 변형에 의해, 통상적으로는 Wnt3a에 의해 골형성 유전자가 발현되지 않는 세포에서 골형성 유전자 발현을 유도할 수 있음을 나타내는 것이다. 따라서 본 실시예에서는 Bmp2 및 Alp 프로모터의 CpG 아일랜드의 DNA 메틸화상태를 조사하였다. 이를 위해 메틸화 특이적 PCR (MSP)를 수행하여 메틸화를 방해하고 탈메틸화 상태를 조사하였다. CpG 아일랜드를 에워싸는 바이설파이트 민감성 프라이머를 MethPrimer 프로그램으로 디자인하여 사용하였다 (Li, L. C. and Dahiya, R. (2002) Bioinformatics 18, 1427-1431). 결과는 도 3의 C 및 D에 있다. 3T3-L1 세포에서 메틸화된 DNA 단편의 PCR 증폭이 감소된 것으로부터 알 수 있듯이 5’-aza-dC 및 TSA의 처리로 인해 CpG 아일랜드의 5‘ 사이토신이 저메틸화가 발생하였다. 나아가 이러한 비메틸화는 Bmp2 및 Alp 유전자 발현 정도와 일치한다. 프로모터의 메틸화 퍼센트는 유전자 발현 수준과 밀접하게 관련되어 있다 (도 3의 C, D 아래 패널). ChIP 분석 결과에 의하면 DNA 메틸화 상태는 MeCP2 (methyl CpG binding protein 2)와 Bmp2 및 Alp 프로모터의 상호작용을 나타낸다 (도 3의 E 및 F). 이러한 MSP 및 ChIP 분석 결과는 Bmp2 및 Alp 유전자 프로모터의 DNA 메틸화 상태가 후성유전적 변형에 의해 조절되며 메틸화정도는 유전자의 발현 수준과 역의 관계에 있음을 나타내는 것이다.

실시예 5. 히스톤 H3의 후성유전적 단백질 변형과 DNA 메틸화 및 유전자 발현과의 관계

CpG 메틸화의 변화는 히스톤 변형과 기능적으로 관련되어 있으며, 전사의 활성 또는 비활성을 매개하는 크로마틴의 프로모터 접근성을 조절하는 것으로 알려져 있다 (Cedar, H. and Bergman, Y. (2009) Nat. Rev. Genet. 10, 295-304). ChIP 분석 결과 TSA를 이용한 히스톤 데아세틸라제의 억제는 H3의 라이신 9 (H3-K9)의 아세틸화를 촉진하는 것으로 나타났으며, 이는 전사적 활성상태의 마커이며, 동시에 이의 메틸화를 하향 조절하며, 이는 전사 억제 상태의 마커이다 (도 3의 E 및 F). H3-K9의 아세틸화 증가는 Bmp2 및 Alp 발현 수준과 일치하며 H3-K9의 메틸화패턴은 Bmp2 및 Alp 발현과 역의 관계에 있다 (도 3의 A,B,E 및 F). 나아가 동일한 단편을 이용하여 H3-K9의 아세틸화 증가에서 Lef-1에 대한 ChIP 분석 결과, Lef-1 결합이 5‘-aza-dC 및 Wnt3a 처리 및 TSA-Wnt3a 의 연속적 처리에 의해 향상되는 것으로 나타났다 (도 3의 E). 따라서 이러한 결과는 전사의 억제 및 유도 조절과 관련된 CpG 메틸화 및 히스톤의 해독후 변형이 중간엽세포에서 Bmp2 및 Alp 유전자의 후성유전적 사일런싱 및 활성을 매개 하는 것을 나타낸다.

실시예 6. 비-골세포인 섬유아세포에서 후성유전적 변형에 의한 유전자 발현 변화 검증

골유도성 세포주와 비교를 위해, 비-골유도성 세포주인 NIH3T3 섬유아세포에서 후성유전 조절 약물에 의한 유전 발현 변화를 조사하였다. 결과는 도 4에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 한번의 5‘-aza-dC (10 μM) 또는 TSA (100 nM) 처리로 Bmp2 및 Alp 발현이 증가하였으며, 상기 처리 후 Wnt3a 투여로 인해 24시간내에 상기 유전자의 발현이 현격하게 증가한 것으로 나타났다 (도 4의 A, B). 3T3-L1 세포의 경우와 유사하게, Wnt3a의 처리결과는 Alp보다는 Bmp2에 보다 효과적인 것으로 나타났다. 나아가 Wnt3a는 골관련 유전자 발현 수준을 향상시키는데 5’-aza-dC 보다는 TSA와 보다 상승적인 효과를 나타냈다 (도 4의 A, B). 동일한 조건에서 MSP (도 4의 C, D)와 ChIP 분석 (도 4의 E,F) 결과도 위와 일치하였다. 이러한 결과는 골형성 세포 커미트먼트 및 비골세포에서 골모세포 관련 유전자의 활성화 커미트먼트에 필요한 Wnt3a 자극에 5‘-aza-dC 또는 TSA의 후성유전적 변형이 요구되는 것을 나타낸다.

실시예 7. Bmp2 및 Alp 발현에 미치는 CpG 메틸화의 영향

Bmp2 및 Alp 발현에 미치는 CpG 메틸화의 영향을 분석하기 위해, SssI 메틸트랜스페라제를 사용한 루시퍼라제 분석을 실시하였다 (31, 32). Bmp2 및 Alp 프로모터 영역은 PCR로 증폭하여 루시퍼라제 리포터 벡터에 클로닝하였다. 이어 SssI 메틸트렌스페라제를 이용하여 CpG를 인비트로에서 메틸화하였고, 이는 메틸화 민감 절단효소인 HpyCH4IV로 절단하여 확인하였다. 메틸화되지 않은 부위는 상기 효소로 절단되나, 메틸화된 부위는 절단되지 않았다 (도 5의A). 그 결과 Bmp2 및 Alp를 포함하는 각각의 루시퍼라제 리포터 벡터는 인비트로에서 메틸화되었음을 나타낸다. 이러한 이렇게 메틸화된 벡터를 Wnt 의존성 전사인자인 Lef-1 또는 Bmp2 유도성 전사인자인 Dlx5 발현벡터와 함께 공전달이입하였다 (도 5의 B). 발현벡터 없이 전달이입된 리포터 벡터는 메틸화된 경우 베이스 루시퍼라제 활성이 감소된 것으로 나타났다. 나아가 각 경우에 Bmp2 및 Alp 프로모터의 메틸화는 Lef-1 및 Dlx-5 전사인자와 함께 발현시 루시퍼라제 활성을 억제하는 것으로 나타났다 (도 5의 B).

실시예 8. 후성유전적 변형에 의한 비골세포의 골모세포로의 전환분화

Bmp2 및 Alp 발현이 3T3-L1 및 NIH3T3 세포에서 5‘-aza-dC 또는 TSA 및 Wnt3a 처리로 인해 급격하게 증가하였다는 상기 결과에 근거하여, 장기간 배양된 세포에서 Alp를 골모세포 분화 마커로 선택하여 염색하였다. 세포를 5’-aza-dC 또는 TSA로 24시간 동안 처리한 후 Wnt3a로 처리한 후 골형성 배지에서 3일 동안 추가로 배양하였다 (도 6의 A). 3T3-L1 세포에서 5’-aza-dC의 처리가 Alp 발현 촉진에 보다 효과적인 것으로 나타났으며 (도 3의 B), 반면 TSA는 NIH3T3 세포에서 보다 효과적인 것으로 나타났다 (도 4의 B). 따라서 5’-aza-dC 및 TSA를 각각 3T3-L1 및 NIH3T3 세포의 골모세포 분화 유도에 사용하였다 (도 6의 B, C). Alp 염색 결과에 따르면 Wnt3a 와 5’-aza-dC 또는 TSA 의 처리로 인해 전구 지방세포 및 섬유아세포에서 골모세포로의 분화가 촉진된 것으로 나타났다 (도 6의 B, C). 이러한 결과는 후성유전적 변형이 비골세포에서 Wnt3a 반응성의 억제에 있어 세포 타입 특이성을 결정한다는 것을 나타낸다. 또한 이는 후성유전적 변형에 의해 비골세포를 골형성세포로 분화시킬 수 있음을 나타내는 것이다.

즉, 후성유전적 조절은 생리적인 양의 Wnt 신호가 존재하는 경우 비-골세포 를 골형성 세포 (Osteogenic cell)로 바로 전환분화시키는 것이 가능한 것으로, 지방전구세포의 세포주인 3T3-L1세포 또는 섬유아세포의 세포주인 NIH3T3등에 해당 후성유전적 조절물질을 처리하고, 이 후 생리학적 수준의 Wnt3a를 처리 및 골분화 조건과 맞는 환경을 조성할 경우 지방세포에서 골조직 특유의 유전자인 Alp가 발현되는 것을 나타내며, 인비트로에서 전환분화가 가능함을 보여준다. 이는 임상적으로는 자가유래의 지방세포 또는 섬유세포를 추출한 후 이를 인비트로에서 전환분화하여 다시 환자에게 처리함으로써, 골형성 유도가 가능함을 나타내는 것이다.

Claims (11)

1. 줄기세포가 아닌 지방전구세포 또는 섬유아세포를 제공하는 단계; 및
   상기 지방전구세포 또는 섬유아세포에 HDAC (histone deacetylase) 억제제 또는 메틸전달효소 억제제 중 하나 이상을 처리하는 단계; 및
   Wnt3a 단백질을 처리하는 단계를 포함하며, 상기 처리에 의해 상기 지방전구세포 또는 섬유아세포가 골형성 세포로 전환되는 것인, 인비트로에서 지방전구세포 또는 섬유아세포의 골형성 세포로의 전환분화 방법.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 골형성 세포는 골형성계 (Osteogenic) 세포, 조골모세포 (prosteoblast), 골모세포 (Osteoblast), 또는 골세포 (Ostocyte)인, 인비트로에서 비-골 세포의 골형성 세포로의 전환분화 방법.
   
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 메틸전달효소 억제제는 5-AZA-2'-데옥시사이티딘, 제불라린 (Zebularine), 3'-데아자네플라노신 A 하이드로클로리드 (3'-Deazaneplanocin A hydrochloride), 로메구아트리브 (Lomeguatrib), 카에토신 (Chaetocin), 또는 데시타빈 (Decitabine) 인, 인비트로에서 비-골 세포의 골형성 세포로의 전환분화 방법.
   
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 HDAC 억제제는 수베로일아닐리드 하이드록삼산, 트리코스타틴 A, 보리노스타트, 벨리노스타트 및 파노비노스타트, 벤자미드, 엔티노스타트, 또는 모쎄티노스타를 포함하는 것인, 인비트로에서 비-골 세포의 골형성 세포로의 전환분화 방법.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 방법에서, 상기 HDAC (histone deacetylase) 억제제 및 메틸전달효소 억제제가 모두 사용되며, 상기 HDAC 억제제 및 메틸전달효소 억제제는 동시에 상기 세포에 처리되거나 또는 HDAC 억제제 처리 후 메틸전달효소 억제제로 처리되거나, 또는 그 반대의 순서로 처리되는 것인, 인비트로에서 비-골 세포의 골형성 세포로의 전환분화 방법.
   
8. 제 1 항에 있어서,
   상기 Wnt3a 단백질의 처리는 상기 HDAC (histone deacetylase) 억제제 또는 메틸전달효소 억제제와 동시에 또는 그 전 또는 그 후에 처리되는 것인, 인비트로에서 비-골 세포의 골형성 세포로의 전환분화 방법.
   
9. HDAC (histone deacetylase) 억제제 또는 메틸전달효소 억제제 중 하나 이상 및 Wnt3a 단백질을 포함하는, 인비트로에서 줄기세포가 아닌 지방전구세포 또는 섬유아세포의 골형성 세포로의 전환분화 조성물.
   .
10. 삭제
11. 제 9 항에 따른 조성물을 포함하는, 인비트로에서 비-골 세포의 골형성 세포로의 전환분화 키트.

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