CN112656814A

CN112656814A - 毛壳素、unc0642或间充质干细胞在间充质干细胞损伤的疾病和延缓衰老中的应用

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Publication number: CN112656814A
Application number: CN201911113755.1A
Authority: CN
Inventors: 施松涛
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-11-14
Filing date: 2019-11-14
Publication date: 2021-04-16

Abstract

本发明涉及与间充质干细胞损伤有关的疾病的预防和治疗。具体地，本发明涉及毛壳素(Chaetocin)、UNC0642或间充质干细胞移植在预防和治疗与间充质干细胞损伤有关的疾病中的应用。

Description

毛壳素、UNC0642或间充质干细胞在间充质干细胞损伤的疾病和延缓衰老中的应用

技术领域

本发明涉及与间充质干细胞损伤有关的疾病的预防和治疗领域。具体地，本发明涉及毛壳素(Chaetocin)、UNC0642或间充质干细胞移植用于预防和治疗与间充质干细胞损伤有关的疾病。

背景技术

衰老是由外部刺激和内部过程引起的生理完整性的终身恶化。为了延缓衰老和维持身体内环境稳定，需要持续的组织更新和再生。这些功能主要归功于成体干细胞(Zhang等，2016)。

在许多哺乳动物细胞中，细胞衰老的特征在于几种分子和细胞标记，例如大的扁平形态，衰老相关的β-半乳糖苷酶活性(SA-β-gal)的表达，以及点状高度凝聚的衰老结构域的形成。相关的异染色质灶(SAHF)，表明染色质结构变化通常伴随着衰老进展(Narita等，2003，Campisi，2005)。SAHF是高度组织化的核结构，其中组蛋白H3上的组成型异染色质标记物赖氨酸9三甲基化(H3K9me3)形成核心，其被一层兼性异染色质标记物H3K27me3包围。这些抑制性标记产生与外转录活性区域分离的区域，以在细胞衰老期间抑制基因表达，从而促进SAHF形成(Chandra和Narita，2013，Sadaie等，2013)。Sirtuin1(SIRT1)参与调节各种重要的物理和生物过程，如线粒体生物发生，基因沉默，蛋白质去乙酰化和炎症，以及细胞衰老和长寿(Chung等，2010，LaRocca等，2014，Revollo和Li，2013)。SIRT1过表达可减少SAHF的形成和衰老，表明SIRT1与衰老相关的染色质重排有关(Huang等，2008)。此外，SIRT1通过激活成骨维持正常的骨骼重塑，这意味着SIRT1通过稳定骨髓间充质干细胞(BMMSC)功能促进骨骼稳态(Edwards等，2013)。然而，SIRT1在调节MSC衰老中的作用是未知的。

间充质干细胞移植(MSCT)通过调节受体免疫应答和代谢来改善多种疾病表型。已经批准全身间充质干细胞(MSC)给予以治疗多种免疫和非免疫疾病(Le Blanc等，2004，Sun等，2009，Ren等，2012)。在分子水平上，MSCT使用旁分泌细胞因子分泌机制来调节受体免疫应答，从而实现治疗效果(Meisel等，2004，Ren等，2008，Nemeth等，2009)。全身输注MSCs不是将MSCs植入有缺陷的器官，而是通过Fas配体介导的Fas死亡途径诱导短暂的T细胞凋亡和免疫耐受，并改善自身免疫性系统性硬化症和结肠炎小鼠模型中的疾病表型(Akiyama等，2012，Chen等人，2014)。基于MSC的治疗可以通过调节表观遗传级联来挽救受损的受体干细胞功能(Liu等，2015，Chen等，2017)。MSCT的适应症主要为系统免疫相关疾病。从目前的已经发表的文献分析，现有技术中MSC治疗涉及到心脑血管疾病、消化系统疾病、呼吸系统疾病、免疫系统疾病、造血系统疾病、神经系统疾病，还有运动医学等。现有技术多为针对机体其他成熟分化的细胞损伤相关疾病应用化学试剂或干细胞治疗等进行预防和治疗，而鲜有针对衰老MSC自身损伤的相关治疗药物与方法。因此，MSCT能否在自然条件下延长哺乳动物的寿命仍然未知。

毛壳素和UNC0642是一类组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferase)抑制剂，毛壳素可有效的抑制肿瘤细胞的增殖以及克隆体形成。UNC0642是一种有效的、选择性的组蛋白甲基转移酶G9a/GLP抑制剂，单次腹腔注射5mg/kg的UNC0642可充分抑制成年小鼠中G9a活性。UNC0642可改善m+/pΔS-U小鼠的寿命和体重增加，使PWS相关基因长期激活。但是，目前尚未存在毛壳素或UNC0642用于改善受损MSC功能的相关研究。

因此，现有技术存在对延缓哺乳动物衰老和/或预防或治疗与间充质干细胞损伤有关的新药物或已知化合物的所述新用途的强烈需求。

发明内容

本发明通过提供毛壳素、UNC0642或间充质干细胞的新用途解决了现有技术中的需求。

本发明的第一方面涉及毛壳素、UNC0642或间充质干细胞在制备用于预防和治疗与间充质干细胞损伤有关的疾病的药物中的用途。

在一些实施方案中，其中所述与间充质干细胞损伤有关的疾病是与骨髓间充质干细胞损伤有关的疾病。

在一些实施方案中，其中所述与间充质干细胞损伤有关的疾病是骨质疏松症、骨丢失或骨衰老。

本发明的第二方面涉及毛壳素、UNC0642或间充质干细胞，其用于治疗和预防与间充质干细胞损伤有关的疾病。

在一些实施方案中，其中所述与间充质干细胞损伤有关的疾病是与骨髓间充质干细胞损伤有关的疾病是骨质疏松症、骨丢失或骨衰老。

本发明的第三方面涉及毛壳素、UNC0642或间充质干细胞在哺乳动物中预防和治疗与间充质干细胞损伤有关的疾病的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的所述毛壳素、UNC0642或间充质干细胞。

本发明的第四方面涉及毛壳素、UNC0642或间充质干细胞在制备用于延长哺乳动物的寿命或延缓哺乳动物衰老的药物中的用途。

在一些实施方案中，其中所述药物通过恢复衰老宿主骨髓间充质干细胞的核异染色质结构实现延长哺乳动物的寿命或延缓哺乳动物衰老。

在一些实施方案中，其中所述药物通过恢复受损宿主骨髓间充质干细胞的干细胞的增殖和分化实现延长哺乳动物的寿命或延缓哺乳动物衰老。

本发明的第五方面涉及毛壳素、UNC0642或间充质干细胞，其用于延长哺乳动物的寿命或延缓哺乳动物衰老。

在一些实施方案中，其中所述毛壳素、UNC0642或间充质干细胞通过恢复衰老宿主骨髓间充质干细胞的核异染色质结构实现延长哺乳动物的寿命或延缓哺乳动物衰老。

在一些实施方案中，其中所述毛壳素或UNC0642或间充质干细胞通过恢复受损宿主骨髓间充质干细胞的干细胞的增殖和分化实现延长哺乳动物的寿命或延缓哺乳动物衰老。

本发明的第六方面涉及毛壳素、UNC0642或间充质干细胞延长哺乳动物的寿命或延缓哺乳动物衰老的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的所述毛壳素、UNC0642或间充质干细胞。

本发明的第七方面涉及囊泡及其制备方法和在上述用途中的应用。

附图说明

图1.MSCT拯救了衰老的BMMSCs。(A)描述BMMSC移植治疗老年小鼠(每组n＝10)的程序的实验概要。(B)甲苯胺蓝染色显示来自6个月大(6M)，24个月大(24M)和MSCT处理的24个月大(MSCT)BMMSC的CFU-F数。(C)24M BMMSCs中群体倍增(PD)的数量低于6M BMMSC，而MSCT挽救了24M BMMSC中的PD数量。(D)BrdU染色显示6M，24M和MSCT BMMSC的增殖率。(E)衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色显示6M，24M和MSCT BMMSC的衰老状态。比例尺，25μm。定量分析显示每组中SA-β-gal阳性细胞的数量。(F)茜素红染色显示在6M，24M和MSCTBMMSC中在骨诱导条件下形成矿化结节的能力。Western印迹分析显示在6M，24M和MSCTBMMSC中骨诱导条件下成骨基因RUNX2和ALP的表达水平。β-肌动蛋白用作蛋白质上样对照。(G)在免疫受损小鼠中皮下植入6M，24M和MSCT BMMSC，在植入后8周显示HA/TCP(HA)载体周围的新骨(B)，骨髓(BM)和结缔组织(CT)再生。比例尺，25μm。半定量分析显示BMMSC植入物中从头骨形成的量。(H)油红O染色显示在脂肪诱导条件下6M，24M和MSCT BMMSC中的脂肪细胞数。比例尺，25μm。蛋白质印迹分析显示在脂肪诱导条件下6M，24M和MSCT BMMSC中脂肪形成基因PPARγ和LPL的表达水平。所有实验数据在至少三次独立实验中得到验证。误差线表示均值±标准差。***P<0.005；**P<0.01；*P<0.05。

图2.MSCT在衰老的BMMSC中拯救异染色质。(A)从24MPrx1Cre分离的BMMSC；与6MBMMSC相比，tdTomato报告小鼠显示出大而扁平的形态。(B)和(C)组蛋白H3K9me3(B)和H3K4me3(C)的免疫荧光(IF)染色显示，与6M BMMSCs相比，24M BMMSCs中衰老相关的异染色质灶(SAHF)和巨核化(nucleomegaly)，而MSCT显着挽救了24M BMMSCs中的SAHF表型。蓝色染色表明DAPI。比例尺，25μm。(D)通过Western印迹分析评估的6M，24M和MSCT处理的24MBMMSC中组蛋白H3K9me3，H3K27me3和H3K4me3的水平。(E)通过透射电子显微镜(TEM)对细胞核大小的二维分析显示在6M，24M和MSCT处理的24M BMMSC中的巨核化。MSCT在24M BMMSCs中减少了具有核体增生的细胞数量。比例尺，25μm。(F)6M，24M和MSCT处理的24M BMMSC(每组n＝20)中细胞核的体积分数。(G)ALP免疫组织化学(IHC)染色显示与6M小鼠相比，24M年龄小鼠的骨髓中具有巨核化(箭头)的细胞数量增加。MSCT减少了24M年龄小鼠骨髓中具有巨核化的细胞数量。比例尺，25μm。(H)定量分析显示在6M和24M小鼠中MSCT处理的具有巨核化的24M BMMSC的数量。所有实验数据在至少三次独立实验中得到验证。误差线表示均值±标准差。***P<0.005；**P<0.01；*P<0.05。

图3.H3K9me3抑制衰老BMMSC中的SIRT1表达。(A)Western印迹分析显示在6M，24M和MSCT处理的24M BMMSC中衰老相关基因SIRT1，TERT，p-mTOR，mTOR和LC3-I/II的表达水平。(B)ChIP-qPCR测定显示抑制性组蛋白修饰标记物H3K9me3在6M，24M和MSCT处理的24MBMMSC中对Sirt1启动子的直接结合的富集。(C)ChIP-qPCR测定显示活性组蛋白标记物H3K4me3在24M BMMSC中的Sirt1启动子上的直接缔合水平降低。(D)在用特异性H3K9甲基转移酶抑制剂毛壳素处理后，SIRT1，H3K9me3和H3K4me3的IF染色显示SAHF和24M BMMSC的数量减少，具有巨核化。比例尺，25μm。(E)毛壳素治疗增加了24M BMMSCs的PD数量。(F)SA-β-gal染色显示，毛壳素处理挽救了24M BMMSCs的衰老状态。(G)茜素红染色显示在骨诱导条件下，受毛壳素处理的24M BMMSC中矿化结节形成增加。(H)Western印迹分析显示在骨诱导条件下载体和毛壳素处理的24M BMMSC中成骨基因RUNX2和ALP的表达水平。(I)在脂肪诱导条件下培养的毛壳素处理的24M BMMSC中油红O阳性细胞的数量减少。比例尺，25μm。(J)蛋白质印迹显示在脂肪诱导条件下培养时载体和毛壳素处理的24M BMMSC中脂肪形成基因PPARγ和LPL的表达水平。所有实验数据在至少三次独立实验中得到验证。误差线表示均值±标准差。***P<0.005；**P<0.01；*P<0.05。

图4.在衰老的BMMSC中H3K9甲基转移酶G9a/GLP调节的SIRT1表达。(A)定量PCR分析显示6M和24M BMMSC中H3K9甲基转移酶的表达水平，鉴定24M BMMSC中G9a和GLP的高表达水平。(B)Western印迹分析显示24M BMMSC中G9a和GLP表达水平升高。(C)ChIP-qPCR测定显示，与6M BMMSC相比，在24M BMMSC中G9a和GLP向Sirt1启动子的募集增强。(D)ChIP-Western印迹分析显示，与6M组相比，24M BMMSC中G9a/GLP复合物在Sirt1启动子上的直接结合富集。(E)对G9a，SIRT1，H3K9me3和H3K4me3的IF染色显示用G9a siRNA处理减少了具有SAHF和巨核化的24M BMMSC的数量。比例尺，25μm。(F)G9a siRNA处理增加了24M BMMSC的PD数。(G)SA-β-gal染色显示G9a siRNA处理挽救了24M BMMSC的衰老状态。(H)茜素红染色显示在骨诱导条件下G9a siRNA处理的24M BMMSC中矿化结节形成增加。(I)Western印迹分析显示在骨诱导条件下对照siRNA-和G9a siRNA-处理的24M BMMSC中成骨基因RUNX2和ALP的表达水平。(J)油红O染色显示在脂肪诱导条件下G9a siRNA处理的24M BMMSC中脂肪形成减少。比例尺，25μm。(K)Western印迹显示在脂肪诱导条件下对照siRNA-和G9a siRNA-处理的24M BMMSC中脂肪形成基因PPARγ和LPL的表达水平。所有实验数据在至少三次独立实验中得到验证。误差线表示均值±标准差。***P<0.005；**P<0.01；*P<0.05。

图5.MSCT将KDM4C转移到老化的BMMSC中以使H3K9me3去甲基化。(A)Western印迹分析显示H3K9me3去甲基化酶的表达水平，以鉴定MSCT处理的24M BMMSC中KDM4C水平的增加。(B)Western印迹显示在24M BMMSC中KDM4C过表达(KDM4C-OE)后H3K9me3水平降低以及KDM4C和SIRT1水平升高。(C)ChIP-qPCR测定显示与24M BMMSC相比，KDM4C-OE BMMSC中KDM4C向Sirt1启动子的募集增强。(D)KDM4C，SIRT1，H3K9me3和H3K4me3的IF染色显示具有SAHF和巨核化的KDM4C-OE BMMSC的数量减少。比例尺，25μm。(E)KDM4C过表达增加24MBMMSC的PD数。(F)SA-β-gal染色显示KDM4C过表达挽救了24M BMMSCs的衰老状态。(G)茜素红染色显示在骨诱导条件下KDM4C-OE BMMSC中矿化结节形成增加。(H)Western印迹分析显示在骨诱导条件下24M和KDM4C-OE BMMSC中成骨基因RUNX2和ALP的表达水平。(I)在脂肪诱导条件下，KDM4C-OE BMMSC中油红O阳性细胞的数量减少。比例尺，25μm。(J)蛋白质印迹显示在脂肪诱导条件下培养时，24M和KDM4C-OE BMMSC中脂肪形成基因PPARγ和LPL的表达水平。所有实验数据在至少三次独立实验中得到验证。误差线表示均值±标准差。***P<0.005；**P<0.01；*P<0.05。

图6.在衰老的BMMSC中EV介导的KDM4C转移调节的H3K9me3诱导的异染色质。(A)当使用transwell系统将24M年龄的BMMSC与6M BMMSC共培养时，Western印迹分析显示24MBMMSC中KDM4C的水平升高而H3K9me3水平降低。通过rab27a siRNA阻断来自6M BMMSC的EV/外泌体释放减弱了24M BMMSC中KDM4C水平的增加。(B)茜素红染色显示形成矿化结节的能力，Western印迹显示成骨基因RUNX2和ALP在6M和24M中的表达水平，在骨诱导条件下与或不与sirab27a处理的BMMSC共培养。(C)左图：在将KDM4C-EGFP转染到BMMSC中后，收获条件培养基(CM)并加载到24M BMMSC上以显示KDM4C-EGFP转移到24M BMMSC中。中图：使用transwell共培养系统，将KDM4C-EGFP转染的BMMSC与24M BMMSC共培养，以显示KDM4C-EGFP能够从6M转移至24M BMMSC。右图：将KDM4C-EGFP转染到BMMSC中后，分离EV/外泌体并加载到24M BMMSC上以显示KDM4C-EGFP能够通过EV/外泌体转移至24M BMMSC。比例尺，25μm。(D)为了检查Rab27a在EV/外泌体介导的KDM4C转移中的作用，将Rab27a siRNA与KDM4C-EGFP共转染到BMMSC中，以显示与乱序siRNA转染组相比，转染的BMMSC中积累了KDM4C-EGFP。比例尺，25μm。(E)代表性图像，其显示在EV/外泌体处理后24小时的骨髓细胞中全神贯注的PKH67标记的外泌体。比例尺，25μm。(F)Western印迹分析显示在24M BMMSC中EV/外泌体处理后，KDM4C水平升高，H3K9me3水平降低。(G)EV治疗增加了24M BMMSC的PD数。(H)SA-β-gal染色显示EV处理挽救了24M BMMSC的衰老状态。(I)EV处理后，通过茜素红染色评估，矿化结节形成升高，并且通过蛋白质印迹评估，成骨基因Runx2，ALP和OCN的表达增加。(J)将CD63-GFP报告载体转染到BMMSC中，并对老年小鼠进行MSCT。MSCT后，IF染色显示CD63与24M小鼠骨髓中的BMMSC标记CD105共定位。(K)CD63-GFP转染的BMMSC用PKH26(红色)标记，然后在老年小鼠中全身输注，以显示移植的BMMSC未植入骨髓中。(L)CD63-GFP报道载体与BMMSC中的KDM4C-mCherry共转染，并对老年小鼠进行MSCT。代表性图像显示MSCT分泌的CD63-GFP EV与KDM4C-mCherry共定位，表明MSCT与老年小鼠中外泌体KDM4C的分泌相关。比例尺，25μm。所有实验数据在至少三次独立实验中得到验证。误差线表示均值±标准差。***P<0.005；**P<0.01；*P<0.05。

图7.MSCT延长了老年小鼠的寿命并改善了骨质减少。(A)说明使用BMMSCs全身输注治疗老年小鼠的方案。(B)Kaplan-Meier生存曲线显示老年组和MSCT组的累积生存概率(每组n＝30)。MSCT显着延长了老年小鼠的寿命(P＝0.000195)。(C和D)MicroCT分析显示MSCT治疗的老年小鼠(每组n＝10)股骨远端的骨小梁中的骨矿物质密度(BMD)和骨体积相对于总体积(BV/TV)显着升高。比例尺，1毫米。(E)H&E染色显示，与对照组相比，MSCT处理的老年小鼠股骨远端的骨小梁(TB)体积(黄色圆圈面积)增加。比例尺，1毫米。(F)与对照组相比，IHC染色显示MSCT处理的老年小鼠中ALP阳性成骨细胞数量增加。比例尺，25μm。(G)IF染色显示在Prx1Cre；tdTomato报道小鼠中MSC输注后具有减少的H3K9me3染色的KDM4C和SIRT1阳性细胞升高。计算来自五个不同领域的KDM4C/tdTomato，SIRT1/tdTomato和H3K9me3/tdTomato双阳性BMMSC的百分比，并与tdTomato阳性BMMSC的总数进行比较。比例尺，25μm。(H)与对照相比，钙黄绿素双标记测定显示MSCT处理的老年小鼠的骨形成率显着增加。比例尺，25μm。(I)代表性的远端股骨组织学图像显示，通过油红O染色，MSCT处理的老年小鼠的骨髓中脂肪细胞的数量显着减少。比例尺，25μm。所有实验数据在至少三次独立实验中得到验证。误差线表示均值±标准差。***P<0.005；**P<0.01；*P<0.05。

图8.与6M和24M MSCT处理的BMMSC相比，组蛋白H3K27me3的免疫荧光(IF)染色显示24M BMMSC中衰老相关的异染色质灶(SAHF)和巨核化。蓝色染色表示DAPI。比例尺，25μm。所有实验数据在至少三次独立实验中得到验证。

图9.(A)Western印迹显示载体和毛壳素处理的24M BMMSC中H3K9me3和SIRT1的表达水平。(B)Western印迹显示对照siRNA-和G9a siRNA-处理的24M BMMSC中G9a和H3K9me3的表达水平。(C)Western印迹显示载体和UNC0642处理的24M BMMSC中G9a和H3K9me3的表达水平。所有实验数据在至少三次独立实验中得到验证。

图10.(A)UNC0642治疗增加了24M BMMSCs的PD数量。(B)SA-β-gal染色显示UNC0642处理挽救了24M BMMSC的衰老状态。(C)茜素红染色显示在骨诱导条件下UNC0642处理的24M BMMSC中矿化结节形成增加。(D)Western印迹分析显示在骨诱导条件下载体和UNC0642处理的24M BMMSC中成骨基因RUNX2和ALP的表达水平。(E)在脂肪诱导条件下，UNC0642处理的24M BMMSC中油红O阳性细胞的数量减少。比例尺，25μm。(F)Western印迹显示在脂肪诱导条件下培养时载体和UNC0642处理的24M BMMSC中脂肪形成基因PPARγ和LPL的表达水平。所有实验数据在至少三次独立实验中得到验证。误差线表示均值±标准差。***P<0.005；**P<0.01；*P<0.05。

图11.(A)代表性图像，显示KDM4C与MSC表面标志物CD105在KDM4C-EGFP转染的BMMSC中的共定位。比例尺，25μm。(B)从Prx1Cre分离的tdTomato+BMMSC中转染KDM4C-EGFP；tdTomato报道小鼠显示KDM4C与TdTomato的共定位。比例尺，25μm。

图12.(A)Western印迹显示载体和Rab27a siRNA处理的WT BMMSC中Rab27a的表达水平。β-肌动蛋白用作蛋白质加载对照。(B)Western印迹显示外泌体和WT BMMSC中外泌体特异性表面标志物CD63和CD81的表达水平。(C)为了检查KDM4C是否能够通过外泌体转移，将KDM4C-EGFP转染到WT BMMSC中。CD63阳性红色免疫荧光与KDM4C-EGFP共定位，表明外泌体含有KDM4C。比例尺，25毫米。

图13.毛壳素和UNC0642治疗挽救了老年小鼠的骨质减少。(A)描述使用毛壳素和UNC0642治疗老年小鼠(每组n＝6)的实验概要。(B和C)MicroCT分析显示毛壳素或UNC0642处理的老年小鼠股骨远端BMD和BV/TV增加。(D)H&E染色显示在毛壳素-或UNC0642-处理的老年小鼠股骨远端股骨中TB体积升高(黄色圆圈面积)。比例尺，1毫米。(E)与对照组相比，IHC染色显示在毛壳素或UNC0642处理的老年小鼠中ALP阳性成骨细胞数量增加。比例尺，25μm。(F)IF染色显示在Prx1Cre；tdTomato报告小鼠中的毛壳素或UNC0642处理后具有降低的H3K9me3染色的KDM4C和SIRT1阳性细胞升高。(G)与对照相比，钙黄绿素双标记测定显示在毛壳素或UNC0642处理的老年小鼠中骨形成率显着增加。比例尺，25μm。(H)远端股骨的组织学图像显示通过油红O染色在老年小鼠的毛壳素或UNC0642处理的小鼠骨髓中脂肪细胞的数量减少。比例尺，25μm。所有实验数据在至少三次独立实验中得到验证。误差线表示均值±标准差。***P<0.005；**P<0.01；*P<0.05。

图14.KDM4C从供体MSC向衰老的受体MSC转移至去甲基化H3K9me3，调节SIRT1转录表达的示意图。

发明详述

定义

本文所使用的术语“毛壳素”具有下述结构：

其分子式是C₃₀H₂₈N₆O₆S₄，分子量696.84。

本文所使用的术语“UNC0642”具有下述结构：

其分子式是C₂₉H₄₄F₂N₆O₂，分子量546.7。

本文中所使用的毛壳素和UNC0642可商购获得。

本文所使用的术语“间充质干细胞”是指一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。所述间充质干细胞来源于骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺、口腔、颅颌面(脱落乳牙、牙髓、牙周膜、牙龈、根尖牙乳头等)等组织以及羊水、脐带血，即所述间充质干细胞是骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、骨骼间充质干细胞、肌肉间充质干细胞、肺间充质干细胞、肝间充质干细胞、胰腺间充质干细胞、羊水间充质干细胞、脐带血间充质干细胞等。

本文所述的术语“间充质干细胞移植”是指使用上述的“间充质干细胞”进行移植。在本文中上下文的情况下，术语“间充质干细胞移植”可与“间充质干细胞”或“给予间充质干细胞”互换使用。

本文所述的术语“哺乳动物”是指小鼠、大鼠、犬、猫、兔、候或人类。

在本文使用的术语“预防”是指当用于疾病或病症时，与未给予化合物或药物的受试者相比，所述化合物或药物能降低受试者体内的医学病症症状的频率或推迟其发病。

在本文中使用的术语“治疗”是指减轻、缓解或改善疾病或病症的症状，改善潜在的代谢引起的的症状，抑制疾病或症状，例如阻止疾病或病症的房展、缓解疾病或病症、引起疾病或病症的消退、缓解疾病或病症引起的病况、或阻止疾病或病症的症状。

在本文中使用的术语“有效量”或“预防和/或治疗有效量”是指给予的药物或化合物的足够量(例如，剂量)，其将在一定程度上减轻被治疗的疾病或病症的一种或多种症状。结果可以是缩小和/或减轻病症或疾病原因或任意其它期望的生物系统的改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是提供以使疾病或病症的临床症状显著减轻、而不产生过度的毒副作用的化合物或药物的量。

如本文中使用的术语“剂量”是指每千克(kg)哺乳动物体重的活性物质的重量(例如，毫克(mg))。

如本文使用的术语“室温”是指25℃±1℃。同时，若没有具体指明实验温度，均为室温。

如本文使用的术语“约”是指该术语所修饰的数值的±10％，更优选为±5％，最优选为±2％，因此本领域的普通技术人员能够清楚地根据所修饰的数值确定术语“约”的范围。

如本文使用的细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，其直径30nm至1000nm。进一步，所述囊泡的直径为30nm-200nm，所述囊泡是包含复杂RNA和蛋白质的小囊泡(所述小囊泡呈CD63,CD81等表面标记物阳性)，或称为外泌体。

在一些实施方案中，所述药物可以通过下述方式给予：口服、吸入、舌下、直肠、透皮、阴道粘膜、透黏膜、局部或肠道给药；注射给药，如眼内注射、肌肉注射、皮下注射、髓内注射、腹腔内、静脉注射、以及鞘内、原位、关节内、滑膜内、胸骨内、肝内、病灶内、颅内、鼻腔给药或其他药物递送方式。

在一些实施方案中，所述毛壳素、UNC0642或间充质干细胞可以通过下述方式给予：口服、吸入、舌下、直肠、透皮、阴道粘膜、透黏膜、局部或肠道给药；注射给药，如眼内注射、肌肉注射、皮下注射、髓内注射、腹腔内、静脉注射、以及鞘内、原位、关节内、滑膜内、胸骨内、肝内、病灶内、颅内、鼻腔给药或其他药物递送方式。

本发明的第四方面涉及毛壳素、UNC0642或间充质干细胞在制备用于延长哺乳动物的寿命或延缓哺乳动物衰老的药物中的用途。进一步地，所述衰老是指间充质干细胞衰老损伤及成骨能力降低。

本发明的第五方面涉及毛壳素、UNC0642或间充质干细胞，其用于延长哺乳动物的寿命或延缓哺乳动物衰老。进一步地，所述衰老是指间充质干细胞衰老损伤及成骨能力降低。

本发明的第六方面涉及毛壳素、UNC0642或间充质干细胞延长哺乳动物的寿命或延缓哺乳动物衰老的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的所述毛壳素、UNC0642或间充质干细胞。进一步地，所述衰老是指间充质干细胞衰老损伤及成骨能力降低。

在本发明的第七方面涉及毛壳素、UNC0642或间充质干细胞在制备促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物中的用途。

在本发明的第八方面涉及囊泡及其制备方法和在上述用途(预防和治疗与间充质干细胞损伤有关的疾病以及用于延长哺乳动物的寿命或延缓哺乳动物衰老)中的应用，所述囊泡是外泌体类囊泡，所述囊泡是从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体。

在一些实施方案中，所述细胞是指本文上述定义的间充质干细胞(例如，BMMSC)，所述囊泡直径为30nm至1000nm，30nm-200nm，50nm至800nm，100nm至500nm，200nm至400nm以及它们之间的任意。进一步，所述囊泡的直径为30nm-200nm，所述囊泡是包含复杂RNA和蛋白质的小囊泡(所述小囊泡呈CD63,CD81等表面标记物阳性)，或称为外泌体。

在一些实施方案中，制备所述囊泡的方法包括，将细胞在去除外泌体的培养基培养24-48小时，通过差速离心以100-1000g离心5-15分钟，1000-2000g离心5-15分钟，5000-15000g离心10-40分钟和50000-150000g离心50-80分钟来分离来自细胞培养上清液中的囊泡。

在一些实施方案中，制备所述囊泡的方法包括，通过超速离心从C57BL/6J衍生的BMMSC分离细胞外囊泡。进一步，所述方法包括，将BMMSC在去除外泌体的培养基(通过在100,000g中过夜离心而去除FBS衍生的外泌体的完全培养基)培养48小时；通过差速离心以300g离心10分钟，2,000g离心10分钟，10,000g离心30分钟和100,000g离心70分钟来分离来自细胞培养上清液中的囊泡。

具体实施方式

下面通过具体的实施例、对照例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例、对照例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例

实施例1本发明涉及的一般实验方法

1.实验材料

(1)动物。C57BL/6J，B6.Cg-Tg(Prrx1-cre)1Cjt/J(Prx1Cre)，B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J(tdTomato)小鼠购自Jackson Lab并保持在C57BL/6J背景。在所有实验中使用年龄匹配的雌性同窝仔畜。雌性免疫妥协的裸鼠(Beige nu/nu XIDIII)购自Harlan。

2.实验方法

(1)小鼠BMMSCs的分离。将来自股骨的骨髓衍生的所有核细胞(ANCs，15×10⁶)的单一悬浮液接种在100mm培养皿(Corning)中，并在37℃下用5％CO 2温育。24小时后，除去非粘附细胞，并在补充有20％胎牛血清(FBS)，2mM L-谷氨酰胺的α最小必需培养基(α-MEM，Invitrogen)中培养贴壁细胞另外14天(Invitrogen)，55μM2-巯基乙醇(Invitrogen)，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Invitrogen)。这些粘附的单菌落在第一代传代，频繁更换培养基以消除潜在的造血细胞污染(Zhu等，2010，Soleimani和Nadri，2009)。对于集落形成单位-成纤维细胞(CFU-F)测定，将1×10⁶单悬浮ANCs接种在60mm培养皿(Corning)中。16天后，用PBS洗涤培养物，并用含有2％多聚甲醛(PFA，Sigma-Aldrich)的1％甲苯胺蓝溶液染色。在显微镜下计数细胞簇，将具有超过50个细胞的细胞簇视为菌落。

(2)老年小鼠的同种异体MSCT。将第8代从8周龄C57BL/6J小鼠中分离的BMMSC悬浮于200μlPBS中，并在18个月龄时静脉内输注到小鼠(每10g体重0.1×10⁶个细胞)中，并且每月重复注射。直至小鼠死亡以产生累积存活概率测定。对于进一步的体外和体内实验，在多轮MSCT后24个月龄时分离BMMSC。背景匹配的老年小鼠静脉注射PBS作为对照组。

(3)群体倍增(PD)测定。用胰蛋白酶消化集落形成细胞，并在60×培养皿中以0.5×10⁶接种。在达到汇合时，收获细胞并以相同的数量接种。根据等式PD＝log2(收获细胞数/接种细胞数)在每次传代计算PD数。通过累积添加每次传代产生的总数直至细胞停止分裂来确定最终的PD数。对于每个实验组，用五个独立批次的分离的MSC重复PD测定。

(4)衰老相关的β-半乳糖苷酶测定。为了确定衰老，将BMMSC以每孔1×10 4个细胞接种在12孔板上，一式三份。24小时后，使用衰老检测试剂盒(Millipore)测定SA-β-Gal活性。简言之，将细胞固定并用X-gal染色溶液混合物染色。观察显示蓝色的细胞(SA-β-Gal阳性细胞)并在显微镜下定量。SA-β-Gal阳性细胞的数量表示为细胞总数的百分比。

(5)细胞增殖试验。使用溴脱氧尿苷(BrdU)掺入测定评估BMMSC的增殖。简而言之，将BMMSC以每孔1×10 4个细胞接种在12孔板上并培养24小时。然后将培养物与BrdU溶液(1：100)(Invitrogen)一起温育24小时，并根据制造商的说明用BrdU染色试剂盒(Invitrogen)染色。每个受试者在10个图像中计数BrdU阳性和总细胞数。BrdU阳性细胞的数量表示为细胞总数的百分比。对于每个实验组，用五个独立样品重复BrdU测定。

(6)体外成骨分化。BMMSCs在成骨诱导条件下培养，包括在生长培养基中的2mMβ-甘油磷酸盐(Sigma-Aldrich)，100μML-抗坏血酸2-磷酸(Wako)和10nM地塞米松(Sigma-Aldrich)。诱导3周后，通过1％茜素红S(Sigma-Aldrich)染色检测基质矿化，并使用NIHImageJ软件定量染色的阳性面积，并显示为总面积的百分比。

(7)Western印迹。用PBS洗涤细胞，并在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Roche)的M-PER哺乳动物蛋白质提取试剂(Thermo)中裂解。使用蛋白质浓度测定法(Bio-RadLaboratories)定量蛋白质水平。通过NE-PER核提取试剂盒(Thermo)提取核蛋白。通过SDS-PAGE(Invitrogen)分离20μg蛋白质，并转移至0.2μm硝酸纤维素膜(Millipore)。然后将膜用5％脱脂奶粉和0.1％吐温-20封闭1小时，然后用在封闭溶液中稀释的一抗孵育过夜。小鼠ALP(sc-28904)，LPL(sc-32382)，PPARγ(sc-7273)，TERT(sc-7212)和CD105(sc-18838)的抗体购自Santa Cruz Biotechnology，Inc。Antibodies to mouse三甲基组蛋白H3-Lys4(9751)，三甲基组蛋白H3-Lys27(9733)，磷-mTOR(Ser2448,5536)，mTOR(2983)，LC3B(3868)，G9a(3306)和KDM4B(8639)获自Cell Signaling Technology。小鼠SIRT1(NBP1-51641)，GLP/EHMT1(PP-B0422)，KDM4A(NBP1-49602)，KDM4C(NBP1-49600)和KDM4D(NBP1-03357)的抗体购自Novus Biologicals。小鼠Runx2(ab76956)和Tri-Methyl-Histone H3-Lys9(13969)的抗体购自Abcam。小鼠β-肌动蛋白(A5441)的抗体获自Sigma-Aldrich。然后洗涤膜并在阻断溶液中以1：10,000稀释的HRP缀合的二抗(Santa Cruz)中孵育1小时。使用SuperSignal？West Pico化学发光底物(Thermo)和BioMax胶片(Kodak)检测免疫反应蛋白。通过NIH ImageJ软件测量条带的强度并标准化为β-肌动蛋白。

(8)体内BMMSC植入测定。将约4.0×10⁶个BMMSC与羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)陶瓷粉末(40mg，Zimmer Inc.)混合，并皮下植入8周龄免疫功能不全的小鼠中。在植入后8周，收获植入物，在4％多聚甲醛(PFA)中固定，并用10％EDTA(pH 7.4)脱钙，然后进行石蜡包埋。用H&E化学染色对10μm石蜡切片染色。通过NIH ImageJ软件量化每总体积的总骨量。

(9)体外脂肪形成分化。对于脂肪形成诱导，500nM异丁基甲基黄嘌呤(Sigma-Aldrich)，60μM吲哚美辛(Sigma-Aldrich)，500nM氢化可的松(Sigma-Aldrich)，10μg/ml胰岛素(Sigma-Aldrich)和100nM L-抗坏血酸磷酸盐将其加入常规小鼠BMMSC生长培养基中。诱导7天后，将培养的细胞用油红O(Sigma-Aldrich)染色，并在显微镜下定量阳性细胞，并显示为阳性细胞数与总细胞的百分比。

(10)免疫荧光显微镜。将BMMSC在2孔腔室载玻片(Nunc)(1×10 4/孔)上培养，然后用4％PFA固定。室载玻片用10％山羊血清(Jackson ImmunoResearch)和0.3％Triton X-100(Sigma-Aldrich)封闭1小时，然后在4℃下与一抗(1：400稀释)一起温育过夜。用PBS洗涤后，然后将载玻片用AlexaFluor 568-缀合的或AlexaFluor 488-缀合的第二抗体(1：200，Invitrogen)在室温下处理30分钟。最后，用含有DAPI(Abcam)的FluoroshieldMounting Medium安装载玻片，并在显微镜下观察和定量。

(11)透射电子显微镜。将BMMSC在0.5％戊二醛中固定2小时，然后脱水和聚合。将超薄切片置于铜网上并用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色。在透射电子显微镜下研究和拍照网格。

(12)组织学。为了评估骨小梁和骨髓面积，将股骨固定在4％PFA中，然后用10％EDTA(pH7.4)脱钙，接着进行石蜡包埋。将10μm厚的石蜡切片用苏木精和曙红(H&E)染色，并使用NIH ImageJ软件分析。对于免疫组织化学染色，将石蜡包埋的切片与ALP抗体(1：400稀释)在4℃温育过夜，然后根据制造商的说明用VECTASTAIN UNIVERSAL elite ABC试剂盒和ImmPACT VIP过氧化物酶底物试剂盒(VECTOR)染色。对于双钙黄绿素标记组织形态学分析，在处死前10天和3天，给小鼠腹膜内注射在2％碳酸氢钠溶液中制备的钙黄绿素(Sigma，15mg/Kg体重)。根据荧光显微镜(Olympus IX71)下骨组织形态学的标准化命名法，对MAR和BFR/BS进行骨动态组织形态学分析。

(13)染色质免疫沉淀分析。将在100mm细胞培养皿中生长的BMMSC在室温下用1％多聚甲醛在生长培养基中固定10分钟。将细胞在补充有完全蛋白酶抑制剂混合物的冷PBS中洗涤两次，并从培养皿中轻轻刮下。使用ChIP Assay Kit(Millipore)进行细胞裂解和染色质免疫沉淀。对于染色质片段化，使用Branson Sonifier 450在功率设定4下以30秒的速度对细胞进行超声处理，在冰上冷却1分钟，总超声时间为4分钟。对于免疫沉淀，使用1：100稀释的抗体捕获蛋白质-DNA复合物，并将同种型匹配的IgG用作阴性对照。用实时PCR定量所有得到的沉淀的DNA样品，并表示为输入DNA的百分比。为了检测G9a和GLP蛋白质-蛋白质相互作用，通过蛋白质印迹进一步分析与一抗捕获的蛋白质-蛋白质复合物的免疫沉淀。

(14)实时聚合酶链反应(PCR)。根据制造商的说明，使用miRNeasy Mini Kit(Qiagen)从培养的细胞中分离总RNA。对于mRNA的实时PCR，使用SuperScript III(LifeTechnologies)合成cDNA。使用SYBR green supermix(Bio-Rad)和基因特异性引物进行实时PCR。在CFX96 TM实时PCR系统(Bio-Rad)上检测实时PCR。

(15)RNAi和化学处理。对于体外siRNA处理，将BMMSC(0.5×10⁶)接种在6孔培养板中，并根据制造商的说明用g9a，rab27a siRNA或载体siRNA对照(Santa Cruz)和脂质转染胺试剂(Invitrogen)处理。。转染后，将细胞用于蛋白质提取，用于Western免疫印迹，免疫荧光染色或体外共培养实验。对于体外化学试剂处理，血清饥饿的BMMSC用100nM毛壳素或5μMUNC0642(Cayman Chemical Company)处理24小时。为了诱导分化，在siRNA或药物存在下在诱导条件下培养BMMSC，然后进行染色和基因表达分析。对于老年模型中的体内化学治疗，每天腹膜内注射UNC0642(2.5mg/kg，在含有0.02％DMSO的PBS中稀释)或毛壳素(1mg/kg)至24M老年小鼠，持续14天。年龄匹配的对照小鼠仅用载体处理。

(16)KDM4C过表达。将用于慢病毒生产的293T细胞接种在100mm培养皿(Corning)中直至80％汇合。根据制造商的方案，将具有适当比例的质粒(kdm4c基因表达载体：psPAX：pCMV-VSV-G＝5：3：2)在opti-MEM(Invitrogen)中与Lipofectamin LTX(Invitrogen)混合。EGFP表达质粒(Addgene)用作对照。转染后48小时收集上清液，并通过0.45μm过滤器过滤以除去细胞碎片。对于感染，在4μg/ml聚凝胺(Sigma)存在下将含有慢病毒的上清液加入到靶细胞培养物中，并且在显微镜观察下通过GFP验证转基因表达。

(17)6M BMMSC与24M BMMSC的共培养。用于12孔板(Corning)的transwell系统用于共培养实验。将24M BMMSC(每孔0.2×10⁶个细胞)加载到每个下室中。将用荧光标记的KDM4C，Rab27a siRNA或阴性对照siRNA转染的6M BMMSC(每孔0.2×10⁶个细胞)加载到每个上室中。共培养三天后，将24M BMMSC用于显微成像，蛋白质提取和成骨分化分析。

(18)细胞外囊泡(EV)分离。通过超速离心从C57BL/6J衍生的BMMSC分离细胞外囊泡(EV)。简言之，将BMMSC在去除外泌体的培养基(通过在100,000g中过夜离心而去除FBS衍生的外泌体的完全培养基)培养48小时。通过差速离心以300g离心10分钟，2,000g离心10分钟，10,000g离心30分钟和100,000g离心70分钟来分离来自细胞培养上清液的EV。所述囊泡的直径为30nm-200nm，所述囊泡是包含复杂RNA和蛋白质的小囊泡(所述小囊泡呈CD63,CD81等表面标记物阳性)，或称为外泌体。

老年小鼠的EV治疗。对于体内EV追踪，将PKH-26(Sigma)标记的EV静脉内输注到24M小鼠中。在输注后24小时，将股骨固定在4％PFA中，然后用5％EDTA脱钙，接着是最佳切割温度化合物(OPT，Sakura Finetek，Torrance，CA，USA)包埋。制备冷冻切片，并用含有DAPI(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)的Vectashield封固剂固定载玻片。对于体内治疗，将悬浮在200μlPBS或PBS(模拟物)中的EV(100μg)每周静脉内输注到24M小鼠中，持续4周。处理四周后，处死小鼠并分离BMMSC用于进一步分析。

(19)MicroCT分析。收获并固定在4％PFA中后，使用高分辨率ScancoμCT50扫描仪(Scanco Medical AG)分析股骨。使用20μm的体素尺寸在70kVp和200μA下扫描样本。使用Amira 5.3.1软件(Visage Imaging)分析数据集以重建图像并测量骨矿物质密度。

(20)体内油红O染色。为了量化小梁区周围的脂肪细胞，将股骨固定在4％多聚甲醛中并用10％EDTA(pH7.4)脱钙，然后冷冻切片并用油红O溶液染色。在显微镜下量化阳性面积并显示为总面积的百分比。

2.统计学。使用独立的非成对双尾学生t检验分析两组之间的比较，并使用具有Bonferroni调整的单向ANOVA分析两组以上的比较。对于Kaplan-Meier分析，使用对数秩检验检查对照组和治疗组之间的统计学差异。P值小于0.05被认为具有统计学意义。

实施例2.间充质干细胞移植(MSCT)挽救了衰老BMMSC的受损细胞功能和异染色质结构。

1.实验材料

(1)动物。C57BL/6J小鼠购自Jackson Lab。雌性免疫缺陷的鼠(Beige nu/nuXIDIII)购自Harlan，其它参考实施例1第1部分实验材料。

2.实验方法

请参考实施例1第2部分实验方法第(1)-(10)。

3.实验结果

老年小鼠表现出骨量和骨髓生态位的显着减少，导致脂肪细胞积聚和造血功能受损(Lopez-Otin等，2013，Chan和Duque，2002，Chen等，2015)。由于MSCT能够改善骨质疏松症，重组功能性骨髓生态位，并将细胞成分转移到宿主细胞(Yamaza等，2009，Liu等，2015，Chen等，2017)，假设多轮系统性MSC输注可以挽救衰老宿主BMMSCs并延长其在老年小鼠中的寿命。因此，使用同种异体MSCT每月治疗小鼠6个月，从18个月开始，并在此期间结束时检查治疗效果(图1A)。为了检查MSCT是否在这些24个月大的(24M)老年小鼠中拯救了衰老的BMMSC，从MSCT处理的和未处理的24M小鼠中分离了BMMSC。发现与对照6个月大的(6M)BMMSC相比，24M BMMSCs中形成粘附性克隆形成细胞集落的能力(称为集落形成单位成纤维细胞(CFU-F))显着降低，而MSCT显着提高了数量。CFU-F(图1B)。与通过连续细胞培养测定和溴脱氧尿苷(BrdU)掺入分析评估的6M BMMSC相比，24M BMMSC还显示减少的群体倍增数(PD)和降低的细胞增殖速率(图1C和1D)。MSCT显着增加了来自MSCT处理的24M小鼠的BMMSC中PD的数量和增殖速率(图1C和1D)。连续传代后，与6M组相比，24M BMMSCs的SA-β-gal阳性细胞数量显着增加，而MSCT减少了SA-β-gal阳性细胞的数量(图1E)，表明MSCT挽救了细胞衰老。当在成骨诱导下培养时，24M BMMSC显示受损的成骨，如通过减少的矿化结节形成和成骨基因瘤相关转录因子2(RUNX2)和碱性磷酸酶(ALP)的表达所示(图1F)。通过增加矿化结节形成和RUNX2和ALP的表达观察，MSCT能够拯救来自24M小鼠的BMMSC受损的成骨分化(图1F)。接下来显示，使用已建立的体内BMMSC植入测定法，在植入后8周，24M BMMSC比来自6M小鼠的BMMSC产生更少的新骨，其中具有羟基磷灰石磷酸三钙(HA/TCP)颗粒作为载体的4×10⁶BMMSC是皮下植入免疫功能不全的小鼠(图1G)。MSCT挽救了受损的24M BMMSC，如体内骨形成增加所示(图1G)。除了成骨受损外，老化的24M BMMSCs显示出油红O阳性脂肪细胞数量显着增加，以及脂肪形成基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ)和脂蛋白脂酶(LPL)的表达上调。MSCT显着降低了24M BMMSC中油红O阳性脂肪细胞的数量和PPARγ和LPL的表达水平(图1H)。

由于细胞形态可以作为细胞衰老标记物(Narita等，2003，Campisi，2005)，然后使用Prx1-Cre；tdTomato条件报告基因小鼠模型显示骨髓细胞形成的所有CFU-F集落是tdTomato积极。与来自6M骨髓的细胞相比，来自24M骨髓的CFU-F集落显示出大而扁平的细胞形态以及增大的细胞核，而MSCT显着挽救了24M BMMSC的细胞和核大小(图2A)。有趣的是，24M BMMSCs表现出明显的核DAPI染色模式，细胞核和异染色质结构明显增大，表明染色质结构可能发生变化并形成SAHF(图2B)。由于表观遗传改变被认为是衰老的标志(Lopez-Otin等，2013)，然后使用异染色质标记物H3K9me3和H3K27me3的染色检查了24M BMMSC中的组蛋白组织。与6M BMMSC相比，免疫荧光(IF)染色显示24M BMMSC中H3K9me3和H3K27me3的水平增加，而MSCT显着减少24M BMMSC中的异染色质标记和结构(图2B和S1)。相反，常染色质纤维标记物H3K4me3在24M BMMSC中显着降低，而MSCT将H3K4me3升高至与6M BMMSC中观察到的水平相似的水平(图2C)。Western印迹分析证实，与6M BMMSCs相比，24M BMMSCs显示H3K9me3和H3K27me3水平升高，同时H3K4me3水平降低；MSCT显着降低了H3K9me3和H3K27me3异染色质标记物的水平，并且在24m BMMSC中增加了常染色质标记物H3K4me3(图2D)。为了进一步证实在衰老的BMMSC中发生SAHF结构形成，进行透射电子显微镜(TEM)分析以显示24M BMMSC中的核和异染色质结构与6M和MSCT处理的24M BMMSC相比(图2E和2F)。这些发现促使用体内扩大的体内骨髓细胞进行检查。在24M年龄小鼠的骨髓中观察到具有增大的细胞核的细胞，而在6M和MSCT处理的24M组中具有巨核化的骨髓细胞是罕见的(图2G和2H)。基于这些结果，得出结论，来自24M年龄小鼠的衰老BMMSC与SAHF结构相关，导致谱系分化改变和低增殖和自我更新率。MSCT通过拯救异染色质组蛋白结构成功改善了24M BMMSCs的细胞衰老。

4.讨论

基于上述实验可知：间充质干细胞移植能够显著逆转衰老小鼠来源BMMSC体外增殖能力、成骨能力降低、成脂能力增高等表征(这些表征出现代表干细胞干性下降、骨生成能力降低)；间充质干细胞移植能够显著逆转衰老小鼠来源BMMSC在体内成骨能力降低的表征(图1G)。同时，间充质干细胞移植能够显著逆转衰老小鼠来源BMMSC的细胞衰老症状；间充质干细胞移植减少了衰老小鼠来源BMMSC中SA-β-gal(衰老细胞标志物)阳性细胞的数量(图.1E)，表明间充质干细胞移植挽救了老年小鼠的MSC细胞衰老；细胞形态可以作为细胞衰老标记物，大而扁平的细胞形态以及增大的细胞核，代表着细胞的衰老。实验表明，间充质干细胞移植可以显著减少老年老鼠骨髓中BMMSC细胞核增大的现象。

总之，上述实验说明间，间充质干细胞移植能够促进衰老小鼠BMMSC的自我更新和成骨能力，逆转老年小鼠细胞的衰老表征。为本发明所述间充质干细胞移植预防间充质干细胞衰老损伤及成骨能力降低提供了实验证据。

实施例3.组蛋白赖氨酸甲基转移酶G9a/GLP表观遗传地抑制衰老BMMSC中的SIRT1表达。

1.实验材料

(1)动物。C57BL/6J小鼠购自Jackson Lab，其它请参考实施例1第1部分实验材料。

2.实验方法

请参考实施例1第2部分实验方法第(1)-(7)、(9)-(11)、(13)-(15)。

3.实验结果

由于SIRT1通过维持端粒长度和自噬参与长寿调节(Chen等，2011，Wang等，2016，Yen and Klionsky，2008，Ou等，2014)，检查了MSCT是否调节SIRT1和衰老BMMSCs中与寿命相关的基因表达。蛋白质印迹分析显示下调的SIRT1，端粒酶逆转录酶(TERT)和微管相关蛋白1A/1B轻链3B(LC3B)的表达，以及24M BMMSC中磷酸化mTOR(p-mTOR)的上调表达(图3A)。MSCT显着增加SIRT1，TERT和LC3B的表达水平，但降低了p-mTOR的表达水平，表明MSCT通过调节SIRT1表达系统地挽救了BMMSCs的寿命(图3A)。由于H3K9me3水平在衰老的BMMSCs中高度升高，随后询问抑制性标志物H3K9me3是否负调节SIRT1表达。使用染色质免疫沉淀-qPCR(ChIP-qPCR)测定，鉴定sirt1启动子区域内的活性结合共有序列以确认募集H3K9me3的能力。ChIP-qPCR测定显示H3K9me3在sirt1启动子内的第五个候选位点富集，但不在候选位点1-4富集。24M BMMSC中的富集显着高于6M或MSCT处理的24M BMMSC中的富集，表明H3K9me3可以作为抑制剂来减少sirt1表达(图3B)。由于活性H3K4me3和抑制性H3K9me3二价染色质结构域在维持基因激活和沉默中发挥关键作用(Rugg-Gunn等，2010)，接下来使用ChIP-qPCR测定法揭示活性H3K4me3被募集到预测的候选位点。并且当与24M BMMSC相比时，6K和MSCT处理的24M BMMSC中的sirt1启动子显着富集H3K4me3募集(图3C)。

这些数据表明H3K9me3异染色质标记物直接抑制衰老BMMSCs中的sirt1转录和H3K9me3去甲基化。因此，假设毛壳素是一种非特异性组蛋白赖氨酸甲基转移酶抑制剂，可作为衰减衰老BMMSCs衰老相关表型的关键调节因子。通过蛋白质印迹分析证实毛壳素处理使H3K9me3显着去甲基化并激活SIRT1表达(图9)，进行IF染色以显示24M BMMSC中存在降低的SIRT1和H3K4me3水平以及H3K9me3水平升高，以及扩大细胞核和异染色质结构(图3D)。毛壳素处理显着降低了H3K9me3的水平，同时增加了SIRT1和H3K4me3的水平，这降低了SAHF形成以维持24M BMMSC中的核大小(图3D)。接下来，检查了降低的H3K9me3甲基化状态是否有助于恢复衰老的BMMSC中受损的自我更新和分化。毛壳素处理显着增加了24M BMMSC中PD的数量(图3E)。SA-β-gal染色显示在24M BMMSC中毛壳素处理后细胞衰老显着降低(图3F)。同时，毛壳素处理极大地改善了24M BMMSC的成骨分化，如茜素红染色所示，显示矿化结节形成增加，Western印迹分析显示RUNX2和ALP的表达水平升高(图3G和3H)。相反，在毛壳素治疗组中24M BMMSC中升高的脂肪形成分化显着降低，如油红O阳性细胞数量减少和PPARγ和LPL下调表达所示(图3I和3J)。这些数据促使进一步确定衰老BMMSCs中组蛋白赖氨酸甲基转移酶的特定靶标。

尽管几种组蛋白赖氨酸甲基转移酶的水平略微增加，但定量PCR分析显示在24MBMMSC中g9a和g9a样蛋白(glp)的基因表达水平显着升高(图4A)。Western印迹分析进一步证实，与6M对照组相比，24M BMMSC中G9a和GLP的表达水平显着增加(图4B)。由于G9a和GLP形成G9a/GLP异二聚体以建立和维持H3K9me2和H3K9me3修饰(Shinkai和Tachibana，2011)，然后检查了G9a/GLP异二聚体是否直接结合衰老BMMSC中候选位点的sirt1启动子。ChIP-qPCR分析证明预测位点处的G9a和GLP结合的DNA富含24M BMMSC，但不富集6M BMMSC，表明G9a和GLP可与H3K9me3形成复合物以抑制sirt1表达(图4C)。为了进一步证实G9a和GLP在结合sirt1启动子中的作用，进行了G9a或GLP抗体对核蛋白的免疫沉淀。结果显示24M BMMSC中G9a和GLP的表达水平相对于6M BMMSC显着增加，并且它们在24M BMMSC中形成异二聚体，但在6M对照组中不形成(图4D)，表明G9a/GLP异二聚体复合物。H3K9me3可作为sirt1表达的转录调节因子。在通过蛋白质印迹分析证实g9a siRNA可以敲低G9a表达水平并使H3K9me3去甲基化后(图9B)，进行IF染色以显示g9a siRNA处理显着降低24M BMMSC中的核大小，SAHF形成和G9a和H3K9me3水平，并且降低了这些细胞中SIRT1和H3K4me3的升高水平(图4E)。在g9a siRNA处理后，24M BMMSC中PD的数量减少和SA-β-gal阳性细胞数量的增加显着挽救(图4F和4G)。此外，g9a siRNA处理改善了24M BMMSC的成骨分化，如茜素红染色所示，显示矿化结节形成增加，Western印迹显示RUNX2和ALP表达升高(图4H和4I)。相反，g9asiRNA处理的24M BMMSC显示脂肪形成分化显着减少，如油红O阳性细胞数量减少和脂肪形成基因PPARγ和LPL下调所示(图4J和4K)。总的来说，这些数据表明G9a/GLP异二聚体主动维持H3K9me3修饰以抑制sirt1表达。为了解决G9a/GLP表达的特异性抑制是否能够拯救衰老的BMMSC，使用选择性G9a/GLP抑制剂UNC0642通过Western印迹分析显示24M BMMSC中G9a和H3K9me3甲基化状态的表达降低(图9C)。当用UNC0642处理时，24M BMMSC显示出PD数量的显着增加和SA-β-gal阳性衰老细胞百分比的降低(图10A和S3B)。此外，显示UNC0642治疗显着激活24M BMMSCs中的成骨分化，表现为矿化结节形成减少和RUNX2和ALP表达水平降低(图10C和10D)，以及脂肪形成分化减少，如油减少所示。红色O阳性细胞和PPARγ和LPL的表达水平(图10E和10F)。这些数据表明G9a/GLP/H3K9me3级联的激活有助于BMMSC中与衰老相关的表型，并且阻断组蛋白赖氨酸甲基转移酶可能是一种有前途的治疗方法，用于挽救BMMSC衰老。

4.讨论

基于上述实验可知：本实验从表观遗传学角度阐明了间充质干细胞移植预防、治疗BMMSC衰老的分子机制(靶点)；发现了间充质干细胞移植通过将赖氨酸特异性脱甲基酶4C(KDM4C)转移到衰老的宿主MSC细胞核中，从而抑制核异染色质形成，延迟细胞衰老；进而首次发现化合物毛壳素和UNC0642可以促进衰老小鼠BMMSC的自我更新、成骨分化等能力，抑制BMMSC成脂分化，并能逆转老年小鼠BMMSC的衰老表征。这些实验是毛壳素和UNC0642能够促进衰老BMMSC成骨能力的直接证据。

实施例4.间充质干细胞移植(MSCT)通过细胞外囊泡将KDM4C转移至受体衰老的BMMSC，以挽救与衰老相关的表型。

1.实验材料

2.实验方法

请参考实施例1第2部分实验方法第(1)-(7)、(9)-(10)、(13)-(18)。

3.实验结果

鉴于H3K9me3去甲基化正调节sirt1表达以挽救衰老相关表型，接下来评估MSCT是否可以调节衰老BMMSC中赖氨酸特异性脱甲基酶水平。在H3K9赖氨酸特异性脱甲基酶(KDM)亚家族4的成员中，Western印迹分析显示在24M BMMSC中仅KDM4C显着降低(图5A)。在MSCT处理后，24M BMMSC中KDM4C的水平显着增加，表明在MSCT治疗中可通过KDM4C调节H3K9me3去甲基化(图5A)。为了进一步证实KDM4C的功能作用，在24M BMMSCs中用绿色荧光蛋白(GFP)报告基因过表达KDM4C(图11A和11B)，发现KDM4C和SIRT1的表达水平显着增加，同时还有H3K9me3去甲基化。通过Western印迹分析(图5B)。ChIP-qPCR分析证明KDM4C被募集到预测的候选位点，并且在24M BMMSC中KDM4C过表达后，sirt1启动子的募集显着富集(图5C)。IF染色显示KDM4C过表达显着降低24M BMMSC中的核大小，SAHF形成和H3K9me3水平，而KDM4C，SIRT1和H3K4me3的水平显着升高(图5D)。为了解决KDM4C过表达是否挽救了与衰老相关的表型，KDM4C过表达的24M BMMSCs显示出显着增加的PD数量(图5E)，SA-β-gal阳性细胞数量减少(图5F)，成骨分化增加(图5G)并且拯救了成骨基因RUNX2和ALP的表达(图5H)。相反，与未处理组相比，KDM4C过表达的24M BMMSC显示脂肪形成分化显着降低，如油红O阳性细胞数量减少和脂肪形成基因PPARγ和LPL下调所示(图5I和5J)。

为了确定MSCT如何将KDM4C转移到受体细胞，在transwell系统中共培养6M BMMSC和24M BMMSC，以检查KDM4C是否可以在体外转移。共培养3天后，观察到KDM4C的细胞内水平升高，H3K9me3水平降低，并且通过蛋白质印迹和茜素红染色评估24M BMMSC中的成骨分化改善(图6A和6B)。这些数据表明年轻的BMMSC可以释放KDM4C以调节24M BMMSC。

接下来检查了年轻BMMSCs分泌EV可以挽救受损的衰老BMMSCs。使用siRNA方法敲低rab27a表达(图12A)并由此阻断EV/外泌体分泌(Ostrowski等，2010)，发现rab27a敲低减弱了6M BMMSC介导的细胞内KDM4C水平和H3K9me3去甲基化以及成骨的拯救。在24M BMMSC中的分化(图6A和6B)。接下来，证实来自BMMSCs的纯化的EV/外泌体通过蛋白质印迹表达外泌体特异性制剂CD63和CD81(图12B)，然后转染KDM4C-GFP以显示其与BMMSC中的外泌体表面标记物CD63的共定位(图12C)。为了检查KDM4C是否可以在培养的BMMSC之间转移，共培养24M BMMSC与KDM4C-GFP转染的6M BMMSC，来自转染的BMMSC的条件培养基和来自转染的BMMSC的EV。显示KDM4C可通过EV转移至24M BMMSC(图6C)。为了进一步证实EV/外泌体介导的KDM4C转移，使用rab27a siRNA阻断来自6M BMMSC的EV/外体释放，并发现KDM4C-GFP转移被显著抑制(图6D)。接下来将EV注入24M小鼠中以观察体内循环能力和治疗效果。在静脉内输注到24M小鼠中后，在移植后24小时在骨髓细胞中检测到EV(图6E)。源自EV处理的24M小鼠的BMMSC显示出KDM4C和H3K9me3去甲基化的细胞内水平升高(图6F)。EV处理显着增加PD的数量，但是在24M小鼠中SA-β-gal阳性细胞的数量减少(图6G和6H)。在EV处理后也观察到增加的成骨分化，如通过茜素红染色评估显示矿化结节形成增加和蛋白质印迹显示成骨基因RUNX2和ALP的上调(图6I)。为了解决MSCT是否确实涉及24M小鼠中EV/外泌体的分泌，将CD63-GFP报告载体转染到BMMSC中并在24M小鼠中进行MSCT。在MSCT后，IF染色显示CD63与BMMC标记物CD105共定位于24M小鼠的股骨中(图6J)。接下来，用红色荧光染料标记BMMSC，然后转染CD63-GFP报告载体，并在24M小鼠中进行MSCT，以显示移植的BMMSC未植入24M小鼠的股骨中(图6K)。为了评估EV/外泌体是否在体内转移KDM4C，在BMMSC中与KDM4C-mCherry报告载体共转染CD63-GFP报告载体，并在24M小鼠中进行MSCT。数据显示移植的MSC分泌的CD63-GFP阳性EV与KDM4C-mCherry共定位，表明MSCT与24M小鼠中外泌体KDM4C的分泌相关(图6L)。总之，这些实验数据表明，移植的MSC分泌的EV通过拯救表观遗传组蛋白修饰将KDM4C转移至24M BMMSC以挽救与衰老相关的表型。

4.讨论

基于上述实验可知：间充质干细胞移植通过分泌外泌体将KDM4C转移至衰老小鼠细胞内，以治疗老年小鼠BMMSC衰老相关损伤。阐明了间充质干细胞移植治疗通过转运KDM4C至宿主细胞以达到治疗效果的分子机制。

实施例5.间充质干细胞移植(MSCT)和组蛋白赖氨酸甲基转移酶抑制剂挽救了骨骼结构，延长了寿命。

1.实验材料

(1)动物。C57BL/6J小鼠购自Jackson Lab，B6.Cg-Tg(Prrx1-cre)1Cjt/J(Prx1Cre)，B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J(tdTomato)小鼠购自JacksonLab并保持在C57BL/6J背景。在所有实验中使用年龄匹配的雌性同窝仔畜。

2.实验方法

请参考实施例1第2部分实验方法第(1)-(2)、(6)、(10)、(12)和(19)-(21)。

3.实验结果

为了探寻MSC移植是否能够延长老年小鼠的寿命，进行了下述实验。在18个月大时静脉内进行MSCT并每月重复注射直至小鼠死亡(图7A)。Kaplan-Meier估计对照组和治疗组的中位生存时间(95％置信区间)表明MSCT将中位生存时间延长了16.5％。累积存活概率测定显示多轮MSCT显着延长寿命，暗示MSCT介导的衰老延迟与衰老宿主BMMSC的挽救相关(图7B)。由于骨骼结构和骨髓生态位的变化与衰老过程高度相关(Lopez-Otin等，2013，Chan和Duque，2002)，然后检查了有和没有MSCT的老年小鼠的骨表型。MicroCT和组织学分析显示，24M小鼠的骨矿物质密度(BMD)，骨量与总体积(BV/TV)和股骨远端骨小梁结构显着减少并且表现出骨质减少表型，但在6M对照组中则没有(图7C-7E)。ALP免疫组织化学染色后的组织形态学分析显示，与6M对照组相比，24M小鼠股骨中成骨细胞的数量显着减少(图7F)。为了检查MSCT是否将KDM4C转移到衰老宿主BMMSC，通过H3K9me3去甲基化驱动sirt1转录，在Prx1-Cre；tdTomato条件报道小鼠中进行IF染色。发现KDM4C/Tomato和SIRT1/Tomato双阳性细胞的数量显着减少，并且与6M对应物相比，24M小鼠的tdTomato阳性BMMSC中H3K9me3甲基化状态升高(图7G)。MSCT显着增加KDM4C/Tomato和SIRT1/Tomato双阳性细胞数量，而24K小鼠骨髓中H3K9me3/Tomato双阳性细胞减少，提示MSCT介导的组蛋白修饰挽救了SRIT1的表达水平以维持骨骼/骨髓稳态(图7G)。为了进一步证实通过MSCT可以挽救24MBMMSC中的成骨减少，进行了钙黄绿素标记测定以显示24M小鼠中骨转换率降低，而MSCT大大改善了骨形成(图7H)。相反，油红O染色显示，与6M对照组相比，老年骨髓中脂肪细胞的数量显着增加(图7I)。MSCT显着降低24M小鼠骨髓中油红O阳性脂肪细胞的数量(图7I)。

这些数据促使使用H3K9甲基转移酶抑制剂毛壳素和UNC0642试图改善老年相关的骨表型。将毛壳素或UNC0642腹膜内给予24M小鼠连续14天，收获股动脉样品用于进一步评估(图13A)。MicroCT分析显示毛壳素或UNC0642治疗挽救了降低的BMD和BV/TV，表明与衰老相关的骨质减少(图13B和13C)。组织学分析显示，与未处理组相比，毛壳素或UNC0642处理的24M小鼠的骨小梁体积显着增加(图13D)。ALP染色后的组织形态学分析显示，与未处理组相比，毛壳素-或UNC0642-处理的24M小鼠的股骨中的成骨细胞数量显着增加(图13E)。为了评估毛壳素或UNC0642是否通过降低体内衰老BMMSC中的G9a水平来去甲基化H3K9me3以调节SIRT1表达，在Prx1-Cre；tdTomato条件报道小鼠中进行IF染色。结果显示，与未处理的24M小鼠相比，毛壳素或UNC0642处理的24M小鼠中，SIRT1/Tomato双阳性细胞显着增加，而G9a/Tomato双阳性细胞数减少，而tdTomato阳性BMMSCs中H3K9me3甲基化减少(图13F)。为了进一步证实毛壳素-或UNC0642处理增加了24M小鼠的成骨，进行了钙黄绿素标记试验，以显示在24M小鼠中毛壳素或UNC0642处理后骨形成率显着升高(图13G)。相反，油红O染色显示，与未处理组相比，在毛壳素或UNC0642处理后，老年骨髓中通常见到的脂肪细胞显着减少(图13H)。总的来说，的研究结果表明，MSCT通过异染色质标记物H3K9me3的去甲基化，在衰老的宿主BMMSC中激活SIRT1，从而通过EV介导的KDM4C转移挽救受损的自我更新和谱系分化来改善老年小鼠中与衰老相关的骨质减少(图14)。总之，这些结果意味着H3K9me3去甲基化可能是针对衰老的靶特异性疗法。

(3)基于上述实验可知：体内实验说明，间充质干细胞移植可以延长正常小鼠寿命；而间充质干细胞移植以及毛壳素或UNC0642注射可以治疗老年鼠的骨质疏松、骨衰老等症状，并抑制老年小鼠骨髓中脂肪的形成。

4.讨论

本发明首次提出间充质干细胞治疗可以恢复衰老宿主骨髓间充质干细胞(BMMSC)的核异染色质结构，恢复受损宿主BMMSC的干细胞功能(例如，增殖和分化等)，并且延长哺乳动物(例如，小鼠)的寿命。同时，本发明首次提出毛壳素或UNC0642(能够恢复受损/衰老宿主BMMSC的干细胞功能(例如，增殖和分化等)，包括BMMSC的体外成骨能力；给予衰老哺乳动物(例如，小鼠)注射毛壳素和UNC0642能够促进衰老小鼠成骨，改善老年小鼠与衰老相关的骨质减少症状等。

另外，本发明首次发现从移植MSCs通过EVs/外泌体将赖氨酸特异性脱甲基酶4C(KDM4C)转移至宿主细胞并转运至细胞核室以使H3K9me3去甲基化并随后激活SIRT1表达，从而挽救衰老BMMSC中与衰老相关的表型。在这项研究中，发现给予多剂量的MSCs将赖氨酸特异性去甲基化酶4C(KDM4C)转移到老年受体细胞，拯救衰老的BMMSCs，并通过调节H3K9me3介导的SIRT1表达来延长寿命。MSCT可以有效地拯救受损的受体骨髓间充质干细胞(BMMSCs)，并通过恢复核异染色质结构增加其寿命。在机制上，显示供体MSC将赖氨酸特异性脱甲基酶4C(KDM4C)转移至受体MSC以特异性地将三甲基组蛋白H3赖氨酸9残基(H3K9me3)转化为其二甲基化形式以抑制异染色质形成，从而增强Sirtuin1(SIRT1)转录表达至延迟细胞衰老。此外，多轮MSCT的使用显着延长了18个月大的小鼠的寿命并挽救了骨骼结构。系统递送H3K9甲基转移酶抑制剂，毛壳素和UNC0642，能够挽救受损的MSCs并延长其寿命，这表明H3K9me3可能是延长寿命的特定目标。本发明研究结果确定了以前未被认识到的MSCT在将核蛋白转移到受体干细胞以通过表观遗传组蛋白修饰延长寿命方面的作用。

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Claims

1.毛壳素、UNC0642或间充质干细胞在制备用于预防和治疗与间充质干细胞损伤有关的疾病的药物中的用途。

2.根据权利要求1的所述用途，其中所述与间充质干细胞损伤有关的疾病是与骨髓间充质干细胞损伤有关的疾病。

3.根据权利要求1的所述用途，其中所述与间充质干细胞损伤有关的疾病是骨质疏松症、骨丢失或骨衰老。

4.毛壳素、UNC0642或间充质干细胞，其用于治疗和预防与间充质干细胞损伤有关的疾病。

5.根据权利要求4的所述毛壳素或UNC0642或间充质干细胞，其中所述与间充质干细胞损伤有关的疾病是与骨髓间充质干细胞损伤有关的疾病。

6.根据权利要求4的所述毛壳素或UNC0642或间充质干细胞移植，其中所述与间充质干细胞损伤有关的疾病是与骨髓间充质干细胞损伤有关的疾病是骨质疏松症、骨丢失或骨衰老。

7.毛壳素、UNC0642或间充质干细胞在哺乳动物中预防和治疗与间充质干细胞损伤有关的疾病的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的所述毛壳素、UNC0642或间充质干细胞。

8.毛壳素、UNC0642或间充质干细胞在制备用于延长哺乳动物的寿命或延缓哺乳动物衰老的药物中的用途。

9.根据权利要求8的所述用途，其中所述药物通过恢复衰老宿主骨髓间充质干细胞的核异染色质结构实现延长哺乳动物的寿命或延缓哺乳动物衰老。

10.根据权利要求8的所述用途，其中所述药物通过恢复受损宿主骨髓间充质干细胞的干细胞的增殖和分化实现延长哺乳动物的寿命或延缓哺乳动物衰老。

11.毛壳素、UNC0642或间充质干细胞，其用于延长哺乳动物的寿命或延缓哺乳动物衰老。

12.根据权利要求11的所述毛壳素或UNC0642或间充质干细胞，其中所述毛壳素、UNC0642或间充质干细胞通过恢复衰老宿主骨髓间充质干细胞的核异染色质结构实现延长哺乳动物的寿命或延缓哺乳动物衰老。

13.根据权利要求11的所述毛壳素、UNC0642或间充质干细胞，其中所述毛壳素或UNC0642或间充质干细胞通过恢复受损宿主骨髓间充质干细胞的干细胞的增殖和分化实现延长哺乳动物的寿命或延缓哺乳动物衰老。

14.毛壳素、UNC0642或间充质干细胞延长哺乳动物的寿命或延缓哺乳动物衰老的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的所述毛壳素、UNC0642或间充质干细胞。

15.囊泡，所述囊泡是外泌体类囊泡，所述囊泡是从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体。

16.根据权利要求15的囊泡，所述细胞是指间充质干细胞，所述囊泡直径为30nm至1000nm。

17.制备权利要求15-16中任一项的囊泡的方法，将细胞在去除外泌体的培养基培养24-48小时，通过差速离心以100-1000g离心5-15分钟，1000-2000g离心5-15分钟，5000-15000g离心10-40分钟和50000-150000g离心50-80分钟来分离来自细胞培养上清液中的囊泡。