JP2022512159A - 免疫治療用の神経型酸化物合成酵素阻害剤 - Google Patents

Abstract

本明細書には、必要とする被験者に免疫治療を施すための方法及び組成物並びに必要とする被験者を治療するための方法及び組成物が開示され、この方法においては、この被験者の免疫治療応答を誘導し、この被験者を治療するための有効量のｎＮＯＳ阻害剤をこの被験者に投与する。開示される方法及び組成物を、黒色腫などの細胞増殖性疾患又は障害を有する被験者を治療するために利用してもよい。

Description

本発明の技術分野は、必要とする被験者に免疫治療を施すための方法に関する。本発明の技術分野は特に、特に黒色腫であるがんなどの細胞増殖性疾患又は障害を有する被験者に免疫治療を施すための方法における神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）阻害剤の使用に関する。

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国立保健研究所から授与されたＧＭ０４９７２５に基づく政府支援によりなされた。政府は本発明に対して一定の権利を有する。

関連特許出願に対する相互参照
本出願は、２０１８年１２月５日に出願された、米国仮特許出願第６２／７７５，５３４号に対して３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権の利益を主張し、その内容は全体を参照により本明細書に援用される。

ヒト皮膚黒色腫（ＣＭ）の発症率は、最近の数十年間で上昇し続けており、この疾患に対する公衆衛生上の懸念が高まっている。黒色腫の症例数は皮膚がんの全症例数の１％未満を占めるにすぎないが、皮膚がん死亡者数の圧倒的多数を占める。ゲノムの変異率が高く（４３）、遠隔転移患者の５年生存率が１５～２０％と皮膚がんのなかで最も致命的で最も悪性度の高い形態である（１）（例えば、Ｌａｗｒｅｎｃｅら，“Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｎｅｗ ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ ４９９：２１４－２１８，２０１３；及び２０１７．Ｋｅｙ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｓｋｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ．ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｍｅｌａｎｏｍａ－ｓｋｉｎ－ｃａｎｃｅｒ／ａｂｏｕｔ／ｋｅｙ－ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．ｈｔｍｌ ２０１７ Ａｐｒｉｌ １７を参照することとし、その内容は全体を参照により本明細書に援用される）。外科的切除と合わせて早期発見できると患者の予後が最も良好となる（例えば、Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉら，“Ｓｕｒｇｅｒｙ ｏｆ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｍｅｌａｎｏｍａｓ，”Ｃａｎｃｅｒｓ．２０１０ Ｊｕｎ；２（２）：８２４－８４１；及びＶｏｓｓら．，“Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｌａｎｏｍａ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｅｎｓｕｒｅ ａｎ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，”Ｐａｔｉｅｎｔ Ｒｅｌａｔ Ｏｕｔｃｏｍｅ Ｍｅａｓ．２０１５；６：２２９－２４２；を参照することとし、その内容は全体を参照により本明細書に援用される）。疾患が利用する多種多様な抵抗メカニズムにより、伝統的な細胞障害性化学療法の効率は非常に限定的であり、作用メカニズムに特異性がないので重度の毒性にも関連する。

ヒト免疫細胞が産生するインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）は、黒色腫の発症及び進行にある役割を果たすことが分かっている。本発明者らは、ＩＦＮ－γが神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）の発現を誘導することを見出した。さらに、発明者らは、ｎＮＯＳを阻害することにより、ＩＦＮ－γによって増加するシグナル伝達性転写因子１及び３（ＳＴＡＴ１／３）の発現及びＰＤ－Ｌ１の発現が抑制されることを見出した。ＰＤ－Ｌ１があると、免疫抑制に関連した黒色腫進行が増大する。

発明者らは、インビトロ及びインビボの両方でのＩＦＮ－γで刺激された黒色腫進行における神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）の役割を初めて実証し、これによりｎＮＯＳ選択的阻害剤の使用が黒色腫治療のための革新的なファースト・イン・クラス手法によって誘導されたとして強く意味づけられる。発明者らの研究からはまた、ＩＦＮ－γによって誘導されたＰＤ－Ｌ１発現の制御におけるｎＮＯＳの重要で新規な役割も実証され、これによりｎＮＯＳが、ｎＮＯＳ選択的阻害剤を使用する黒色腫患者の有効な免疫療法の開発に対する新しい標的であると明らかにされる。このように、発明者らは、ｎＮＯＳを阻害することにより、黒色腫の増殖を効果的に抑制できることを見出した。

発明者らの知見には、黒色腫を治療する意義がある。しかしながら、この発明者らの知見にはまた、増殖又は進行がｎＮＯＳ発現量の上昇により刺激される全ての細胞増殖性疾患又は障害を治療する意義があってよい。特に、発明者らの知見には、増殖又は進行がｎＮＯＳのＩＦＮ－γ誘導型発現及びその後のＰＤ－Ｌ１などの患者の免疫調節性タンパク質の発現によって刺激される細胞増殖性疾患又は障害を治療する意義がある。

本明細書には、必要とする被験者に対して免疫治療を施すための方法及び組成物並びに必要とする被験者を治療するための方法及び組成物が開示され、この方法においては、この被験者の免疫治療応答を誘導し、この被験者を治療するための有効量のｎＮＯＳ阻害剤をこの被験者に投与する。開示される方法及び組成物を、黒色腫などの細胞増殖性疾患又は障害を有する被験者を治療するために利用してもよい。

開示される方法及び組成物を、増殖又は進行がＩＦＮ－γで刺激される、黒色腫などの細胞増殖性疾患又は障害を有する被験者を治療するために利用してもよい。この方法は典型的には、例えば被験者のＰＤ－Ｌ１発現を低減させるための有効量のｎＮＯＳ阻害剤などの、被験者の免疫調節性タンパク質の発現を低減させるための有効量のｎＮＯＳ阻害剤を被験者に投与することを含む。

開示される方法においては、ｎＮＯＳ阻害剤を被験者に投与する。開示される方法においてはまた、ＰＤ－Ｌ１阻害剤又はＰＤ－１阻害剤などの追加の治療薬も被験者に投与してよい。

Ａ）マトリゲル浸潤活性アッセイにより検出された黒色腫浸潤能力に対するＩＦＮ－γの効果。代表データは、ＩＦＮ－γで処理したＡ３７５転移性メラノーマ細胞由来のものである。＊コントロールと比較してｐ＜０．０５。Ｂ）接着分析。Ａ３７５メラノーマ細胞を単層線維芽細胞の上部に播種し、ＩＦＮ－γと共に１時間インキュベートし、その後ＭＴＴアッセイを行った。＊コントロールと比較してｐ＜０．０５。Ａ）マトリゲル浸潤活性アッセイにより検出された黒色腫浸潤能力に対するＩＦＮ－γの効果。代表データは、ＩＦＮ－γで処理したＡ３７５転移性メラノーマ細胞由来のものである。＊コントロールと比較してｐ＜０．０５。Ｂ）接着分析。Ａ３７５メラノーマ細胞を単層線維芽細胞の上部に播種し、ＩＦＮ－γと共に１時間インキュベートし、その後ＭＴＴアッセイを行った。＊コントロールと比較してｐ＜０．０５。 Ａ～Ｃ）ヒトメラノーマＷＭ３２１１初代細胞（Ａ～Ｂ）及び転移性メラノーマＡ３７５細胞中のｎＮＯＳ発現レベルに対するＩＦＮ－α及びＩＦＮ－γ処理の効果。Ｃ）Ａ３７５転移性メラノーマ細胞のｎＮＯＳ発現に対するＩＦＮ－α及びＩＦＮ－γの異なる効果。Ａ３７５細胞を５００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＩＦＮ－α又はＩＦＮ－γで４８時間処理し、全細胞溶解物を集めた。試料をｎＮＯＳに対するウエスタンブロット分析にかけた。タンパク質ローディングのコントロールは、アクチンを検出することにより実行した。Ｄ）ＩＦＮ－α又はＩＦＮ－γ処理後２４時間でＤＡＦ－ＦＭ蛍光プローブを使用するマイクロプレートリーダーにより検出された細胞内一酸化窒素レベル。Ｅ）ｎＮＯＳ枯渇メラノーマ細胞では、ＩＦＮ－γ誘導型ｎＮＯＳ発現が抑制した。ｓｈＲＮＡ－ｎＮＯＳを遺伝子導入したＡ３７５細胞をＩＦＮ－γで２４時間処理し、その後ウエスタンブロット分析にかけた。Ａ～Ｃ）ヒトメラノーマＷＭ３２１１初代細胞（Ａ～Ｂ）及び転移性メラノーマＡ３７５細胞中のｎＮＯＳ発現レベルに対するＩＦＮ－α及びＩＦＮ－γ処理の効果。Ｃ）Ａ３７５転移性メラノーマ細胞のｎＮＯＳ発現に対するＩＦＮ－α及びＩＦＮ－γの異なる効果。Ａ３７５細胞を５００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＩＦＮ－α又はＩＦＮ－γで４８時間処理し、全細胞溶解物を集めた。試料をｎＮＯＳに対するウエスタンブロット分析にかけた。タンパク質ローディングのコントロールは、アクチンを検出することにより実行した。Ｄ）ＩＦＮ－α又はＩＦＮ－γ処理後２４時間でＤＡＦ－ＦＭ蛍光プローブを使用するマイクロプレートリーダーにより検出された細胞内一酸化窒素レベル。Ｅ）ｎＮＯＳ枯渇メラノーマ細胞では、ＩＦＮ－γ誘導型ｎＮＯＳ発現が抑制した。ｓｈＲＮＡ－ｎＮＯＳを遺伝子導入したＡ３７５細胞をＩＦＮ－γで２４時間処理し、その後ウエスタンブロット分析にかけた。Ａ～Ｃ）ヒトメラノーマＷＭ３２１１初代細胞（Ａ～Ｂ）及び転移性メラノーマＡ３７５細胞中のｎＮＯＳ発現レベルに対するＩＦＮ－α及びＩＦＮ－γ処理の効果。Ｃ）Ａ３７５転移性メラノーマ細胞のｎＮＯＳ発現に対するＩＦＮ－α及びＩＦＮ－γの異なる効果。Ａ３７５細胞を５００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＩＦＮ－α又はＩＦＮ－γで４８時間処理し、全細胞溶解物を集めた。試料をｎＮＯＳに対するウエスタンブロット分析にかけた。タンパク質ローディングのコントロールは、アクチンを検出することにより実行した。Ｄ）ＩＦＮ－α又はＩＦＮ－γ処理後２４時間でＤＡＦ－ＦＭ蛍光プローブを使用するマイクロプレートリーダーにより検出された細胞内一酸化窒素レベル。Ｅ）ｎＮＯＳ枯渇メラノーマ細胞では、ＩＦＮ－γ誘導型ｎＮＯＳ発現が抑制した。ｓｈＲＮＡ－ｎＮＯＳを遺伝子導入したＡ３７５細胞をＩＦＮ－γで２４時間処理し、その後ウエスタンブロット分析にかけた。Ａ～Ｃ）ヒトメラノーマＷＭ３２１１初代細胞（Ａ～Ｂ）及び転移性メラノーマＡ３７５細胞中のｎＮＯＳ発現レベルに対するＩＦＮ－α及びＩＦＮ－γ処理の効果。Ｃ）Ａ３７５転移性メラノーマ細胞のｎＮＯＳ発現に対するＩＦＮ－α及びＩＦＮ－γの異なる効果。Ａ３７５細胞を５００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＩＦＮ－α又はＩＦＮ－γで４８時間処理し、全細胞溶解物を集めた。試料をｎＮＯＳに対するウエスタンブロット分析にかけた。タンパク質ローディングのコントロールは、アクチンを検出することにより実行した。Ｄ）ＩＦＮ－α又はＩＦＮ－γ処理後２４時間でＤＡＦ－ＦＭ蛍光プローブを使用するマイクロプレートリーダーにより検出された細胞内一酸化窒素レベル。Ｅ）ｎＮＯＳ枯渇メラノーマ細胞では、ＩＦＮ－γ誘導型ｎＮＯＳ発現が抑制した。ｓｈＲＮＡ－ｎＮＯＳを遺伝子導入したＡ３７５細胞をＩＦＮ－γで２４時間処理し、その後ウエスタンブロット分析にかけた。Ａ～Ｃ）ヒトメラノーマＷＭ３２１１初代細胞（Ａ～Ｂ）及び転移性メラノーマＡ３７５細胞中のｎＮＯＳ発現レベルに対するＩＦＮ－α及びＩＦＮ－γ処理の効果。Ｃ）Ａ３７５転移性メラノーマ細胞のｎＮＯＳ発現に対するＩＦＮ－α及びＩＦＮ－γの異なる効果。Ａ３７５細胞を５００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＩＦＮ－α又はＩＦＮ－γで４８時間処理し、全細胞溶解物を集めた。試料をｎＮＯＳに対するウエスタンブロット分析にかけた。タンパク質ローディングのコントロールは、アクチンを検出することにより実行した。Ｄ）ＩＦＮ－α又はＩＦＮ－γ処理後２４時間でＤＡＦ－ＦＭ蛍光プローブを使用するマイクロプレートリーダーにより検出された細胞内一酸化窒素レベル。Ｅ）ｎＮＯＳ枯渇メラノーマ細胞では、ＩＦＮ－γ誘導型ｎＮＯＳ発現が抑制した。ｓｈＲＮＡ－ｎＮＯＳを遺伝子導入したＡ３７５細胞をＩＦＮ－γで２４時間処理し、その後ウエスタンブロット分析にかけた。 Ａ）黒色腫中のＳＴＡＴ３及びリン酸化ＳＴＡＴ３発現レベルに対するＩＦＮ－γの効果。Ａ３７５細胞を１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ及び２５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＩＦＮ－γ又はＩＦＮ－αで２４時間処理し、ウエスタンブロット分析用に全細胞溶解物及び核抽出物を使用してＳＴＡＴ３及びｐＳＴＡＴ３をそれぞれ検出した。ｎＮＯＳの特異的阻害剤ＭＡＣ－３－１９０（３μＭ）は、Ａ３７５細胞中でＩＦＮ－γにより誘導されるＢ）ＳＴＡＴ３及びＣ）ＳＴＡＴ１の活性化を抑制した。Ａ３７５転移性メラノーマ細胞を、ＭＡＣ－３－１９０がある場合とない場合においてＩＦＮ－γで４８時間処理した。Ａ）黒色腫中のＳＴＡＴ３及びリン酸化ＳＴＡＴ３発現レベルに対するＩＦＮ－γの効果。Ａ３７５細胞を１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ及び２５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＩＦＮ－γ又はＩＦＮ－αで２４時間処理し、ウエスタンブロット分析用に全細胞溶解物及び核抽出物を使用してＳＴＡＴ３及びｐＳＴＡＴ３をそれぞれ検出した。ｎＮＯＳの特異的阻害剤ＭＡＣ－３－１９０（３μＭ）は、Ａ３７５細胞中でＩＦＮ－γにより誘導されるＢ）ＳＴＡＴ３及びＣ）ＳＴＡＴ１の活性化を抑制した。Ａ３７５転移性メラノーマ細胞を、ＭＡＣ－３－１９０がある場合とない場合においてＩＦＮ－γで４８時間処理した。Ａ）黒色腫中のＳＴＡＴ３及びリン酸化ＳＴＡＴ３発現レベルに対するＩＦＮ－γの効果。Ａ３７５細胞を１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ及び２５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＩＦＮ－γ又はＩＦＮ－αで２４時間処理し、ウエスタンブロット分析用に全細胞溶解物及び核抽出物を使用してＳＴＡＴ３及びｐＳＴＡＴ３をそれぞれ検出した。ｎＮＯＳの特異的阻害剤ＭＡＣ－３－１９０（３μＭ）は、Ａ３７５細胞中でＩＦＮ－γにより誘導されるＢ）ＳＴＡＴ３及びＣ）ＳＴＡＴ１の活性化を抑制した。Ａ３７５転移性メラノーマ細胞を、ＭＡＣ－３－１９０がある場合とない場合においてＩＦＮ－γで４８時間処理した。 Ａ）３種類のヒトメラノーマ細胞株（ＷＭ１１５、Ｓｋ－ｍｅｌ－２８及びＡ３７５）中のタンパク質発現レベルに対するＩＦＮ－α及びＩＦＮ－γの異なる効果を示す逆相タンパクアレイ（ＲＰＰＡ）のヒートマップ。３種類のメラノーマ細胞株を、２５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬのインターフェロン類で４８時間処理した。全細胞溶解物を集めてＲＰＰＡアッセイにかけた。３０２種類のタンパク質と鍵となるシグナル分子のリン酸化から、ＩＦＮ－γにより増加した上位１０種類のタンパク質を選定した。赤は高発現で、緑は低発現を表す。データポイントは全てタンパク質ローディング用に正規化され、線形値に変形した。Ｂ）ＰＤ－Ｌ１，ｃ－Ｍｙｃ及びＨＩＦ１αは、ＩＦＮ－γにより著しく誘導された。ＲＰＰＡにより検出された３種類の細胞株の平均変化率を図に示した。＊コントロール及びＩＦＮ－αと比較してｐ＜０．０５。Ｃ～Ｅ）ＩＦＮ－γによるＰＤ－Ｌ１の誘導量は、ｎＮＯＳ阻害剤の同時処置により減少した。ｎＮＯＳ阻害剤ＭＡＣ－３－１９０又はＨＨ０４４（３μＭ）がある場合とない場合においてＡ３７５メラノーマ細胞をＩＦＮ－α又ＩＦＮ－γに７２時間暴露した。ＰＤ－Ｌ１の細胞表面での発現をフローサイトメトリーにより検出した。２回の独立した反復実験の代表的なヒストグラムを示す。Ｃ）はＩＦＮ－α又ＩＦＮ－γ（１００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）であり、Ｄ～Ｅ）は、ＩＦＮ－α又はＩＦＮ－γ（２５０Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）である。Ａ）３種類のヒトメラノーマ細胞株（ＷＭ１１５、Ｓｋ－ｍｅｌ－２８及びＡ３７５）中のタンパク質発現レベルに対するＩＦＮ－α及びＩＦＮ－γの異なる効果を示す逆相タンパクアレイ（ＲＰＰＡ）のヒートマップ。３種類のメラノーマ細胞株を、２５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬのインターフェロン類で４８時間処理した。全細胞溶解物を集めてＲＰＰＡアッセイにかけた。３０２種類のタンパク質と鍵となるシグナル分子のリン酸化から、ＩＦＮ－γにより増加した上位１０種類のタンパク質を選定した。赤は高発現で、緑は低発現を表す。データポイントは全てタンパク質ローディング用に正規化され、線形値に変形した。Ｂ）ＰＤ－Ｌ１，ｃ－Ｍｙｃ及びＨＩＦ１αは、ＩＦＮ－γにより著しく誘導された。ＲＰＰＡにより検出された３種類の細胞株の平均変化率を図に示した。＊コントロール及びＩＦＮ－αと比較してｐ＜０．０５。Ｃ～Ｅ）ＩＦＮ－γによるＰＤ－Ｌ１の誘導量は、ｎＮＯＳ阻害剤の同時処置により減少した。ｎＮＯＳ阻害剤ＭＡＣ－３－１９０又はＨＨ０４４（３μＭ）がある場合とない場合においてＡ３７５メラノーマ細胞をＩＦＮ－α又ＩＦＮ－γに７２時間暴露した。ＰＤ－Ｌ１の細胞表面での発現をフローサイトメトリーにより検出した。２回の独立した反復実験の代表的なヒストグラムを示す。Ｃ）はＩＦＮ－α又ＩＦＮ－γ（１００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）であり、Ｄ～Ｅ）は、ＩＦＮ－α又はＩＦＮ－γ（２５０Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）である。Ａ）３種類のヒトメラノーマ細胞株（ＷＭ１１５、Ｓｋ－ｍｅｌ－２８及びＡ３７５）中のタンパク質発現レベルに対するＩＦＮ－α及びＩＦＮ－γの異なる効果を示す逆相タンパクアレイ（ＲＰＰＡ）のヒートマップ。３種類のメラノーマ細胞株を、２５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬのインターフェロン類で４８時間処理した。全細胞溶解物を集めてＲＰＰＡアッセイにかけた。３０２種類のタンパク質と鍵となるシグナル分子のリン酸化から、ＩＦＮ－γにより増加した上位１０種類のタンパク質を選定した。赤は高発現で、緑は低発現を表す。データポイントは全てタンパク質ローディング用に正規化され、線形値に変形した。Ｂ）ＰＤ－Ｌ１，ｃ－Ｍｙｃ及びＨＩＦ１αは、ＩＦＮ－γにより著しく誘導された。ＲＰＰＡにより検出された３種類の細胞株の平均変化率を図に示した。＊コントロール及びＩＦＮ－αと比較してｐ＜０．０５。Ｃ～Ｅ）ＩＦＮ－γによるＰＤ－Ｌ１の誘導量は、ｎＮＯＳ阻害剤の同時処置により減少した。ｎＮＯＳ阻害剤ＭＡＣ－３－１９０又はＨＨ０４４（３μＭ）がある場合とない場合においてＡ３７５メラノーマ細胞をＩＦＮ－α又ＩＦＮ－γに７２時間暴露した。ＰＤ－Ｌ１の細胞表面での発現をフローサイトメトリーにより検出した。２回の独立した反復実験の代表的なヒストグラムを示す。Ｃ）はＩＦＮ－α又ＩＦＮ－γ（１００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）であり、Ｄ～Ｅ）は、ＩＦＮ－α又はＩＦＮ－γ（２５０Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）である。Ａ）３種類のヒトメラノーマ細胞株（ＷＭ１１５、Ｓｋ－ｍｅｌ－２８及びＡ３７５）中のタンパク質発現レベルに対するＩＦＮ－α及びＩＦＮ－γの異なる効果を示す逆相タンパクアレイ（ＲＰＰＡ）のヒートマップ。３種類のメラノーマ細胞株を、２５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬのインターフェロン類で４８時間処理した。全細胞溶解物を集めてＲＰＰＡアッセイにかけた。３０２種類のタンパク質と鍵となるシグナル分子のリン酸化から、ＩＦＮ－γにより増加した上位１０種類のタンパク質を選定した。赤は高発現で、緑は低発現を表す。データポイントは全てタンパク質ローディング用に正規化され、線形値に変形した。Ｂ）ＰＤ－Ｌ１，ｃ－Ｍｙｃ及びＨＩＦ１αは、ＩＦＮ－γにより著しく誘導された。ＲＰＰＡにより検出された３種類の細胞株の平均変化率を図に示した。＊コントロール及びＩＦＮ－αと比較してｐ＜０．０５。Ｃ～Ｅ）ＩＦＮ－γによるＰＤ－Ｌ１の誘導量は、ｎＮＯＳ阻害剤の同時処置により減少した。ｎＮＯＳ阻害剤ＭＡＣ－３－１９０又はＨＨ０４４（３μＭ）がある場合とない場合においてＡ３７５メラノーマ細胞をＩＦＮ－α又ＩＦＮ－γに７２時間暴露した。ＰＤ－Ｌ１の細胞表面での発現をフローサイトメトリーにより検出した。２回の独立した反復実験の代表的なヒストグラムを示す。Ｃ）はＩＦＮ－α又ＩＦＮ－γ（１００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）であり、Ｄ～Ｅ）は、ＩＦＮ－α又はＩＦＮ－γ（２５０Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）である。Ａ）３種類のヒトメラノーマ細胞株（ＷＭ１１５、Ｓｋ－ｍｅｌ－２８及びＡ３７５）中のタンパク質発現レベルに対するＩＦＮ－α及びＩＦＮ－γの異なる効果を示す逆相タンパクアレイ（ＲＰＰＡ）のヒートマップ。３種類のメラノーマ細胞株を、２５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬのインターフェロン類で４８時間処理した。全細胞溶解物を集めてＲＰＰＡアッセイにかけた。３０２種類のタンパク質と鍵となるシグナル分子のリン酸化から、ＩＦＮ－γにより増加した上位１０種類のタンパク質を選定した。赤は高発現で、緑は低発現を表す。データポイントは全てタンパク質ローディング用に正規化され、線形値に変形した。Ｂ）ＰＤ－Ｌ１，ｃ－Ｍｙｃ及びＨＩＦ１αは、ＩＦＮ－γにより著しく誘導された。ＲＰＰＡにより検出された３種類の細胞株の平均変化率を図に示した。＊コントロール及びＩＦＮ－αと比較してｐ＜０．０５。Ｃ～Ｅ）ＩＦＮ－γによるＰＤ－Ｌ１の誘導量は、ｎＮＯＳ阻害剤の同時処置により減少した。ｎＮＯＳ阻害剤ＭＡＣ－３－１９０又はＨＨ０４４（３μＭ）がある場合とない場合においてＡ３７５メラノーマ細胞をＩＦＮ－α又ＩＦＮ－γに７２時間暴露した。ＰＤ－Ｌ１の細胞表面での発現をフローサイトメトリーにより検出した。２回の独立した反復実験の代表的なヒストグラムを示す。Ｃ）はＩＦＮ－α又ＩＦＮ－γ（１００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）であり、Ｄ～Ｅ）は、ＩＦＮ－α又はＩＦＮ－γ（２５０Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）である。 免疫蛍光染色により検出されたＡ３７５転移性メラノーマ細胞中のＰＤ－Ｌ１の発現。Ａ３７５をカバーガラス上に蒔き、一晩７５％コンフルエンスまで接着させ、次いでＭＡＣ－３－１９０（３μＭ）がある場合とない場合においてＩＦＮ－α又はＩＦＮ－γ（２５０Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）で７２時間処理した。その後細胞を固定し、４％ホルムアルデヒド及びメタノールで透過処理した。５％ウマ血清を含有するブロッキングバッファー中で１時間試料をブロッキングした。スライドを１：５０ＰＤ－Ｌ１抗体希釈中で４℃で一晩インキュベートさせ、ＤＡＰＩ試薬で１時間インキュベートさせた。ＰＤ－Ｌ１抗体（緑）及びＤＡＰＩ（青蛍光）で染色した代表画像を示す（最初の倍率は、１００倍である）。２回の反復実験の代表画像を示す。 新規ｎＮＯＳ阻害剤の有望な抗黒色腫活性。Ａ～Ｂ）ｎＮＯＳ阻害剤ＭＡＣ－３－１９０（５ｍｇ／ｋｇ、毎日腹腔内投与）は、ＩＦＮ－γ（１０００ｕｎｉｔｓ、毎日腹腔内投与）により刺激された腫瘍増殖を減少させた。＊コントロールと比較してｐ＜０．０５。＃ＩＦＮ－γ処理と比較してｐ＜０．０５。Ｂ）ｎＮＯＳ阻害剤ＨＨ０４４（１０ｍｇ／ｋｇ、毎日腹腔内投与）は、コントロールと比較してインビボでのヒト黒色腫の腫瘍増殖を著しく抑制した。 Ｃ）ＨＨ０４４は、肺及び体の重量を著しく変化させることなく異種移植腫瘍の最終的な重量を有意に減少させた。＊コントロールと比較してｐ＜０．０５。Ｄ）ＨＨ０４４で処理した腫瘍のＰＤ－Ｌ１発現量は、フローサイトメトリーにより検出すると有意に低減した。＊コントロールと比較してｐ＜０．０５。Ａ３７５転移性メラノーマ細胞をヌードマウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍増殖を毎日測定し、腫瘍体積を式腫瘍体積（ｍｍ^３）＝［長さ×（幅^２）］／２を使用することによりデジタルノギス（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ）を用いて決定した。データは、平均±ＳＤを表す。Ｅ）収集した腫瘍の単細胞懸濁液をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８結合ＰＤ－Ｌ１抗体で染色し、フローサイトメトリーによりＰＤ－Ｌ１発現量を測定した。新規ｎＮＯＳ阻害剤の有望な抗黒色腫活性。Ａ～Ｂ）ｎＮＯＳ阻害剤ＭＡＣ－３－１９０（５ｍｇ／ｋｇ、毎日腹腔内投与）は、ＩＦＮ－γ（１０００ｕｎｉｔｓ、毎日腹腔内投与）により刺激された腫瘍増殖を減少させた。＊コントロールと比較してｐ＜０．０５。＃ＩＦＮ－γ処理と比較してｐ＜０．０５。Ｂ）ｎＮＯＳ阻害剤ＨＨ０４４（１０ｍｇ／ｋｇ、毎日腹腔内投与）は、コントロールと比較してインビボでのヒト黒色腫の腫瘍増殖を著しく抑制した。 異種移植腫瘍中のＰＤ－Ｌ１発現。被験者から得られた試料にＮＯＳ阻害剤を投与し、免疫組織化学染色により検出された試験をさらに投与した。倍率１００×（Ａ）及び２０×（Ｂ）での標本のＰＤ－Ｌ１染色（茶）を表す。ＭＡＣ－３－１９０で処理した又は処理していない腫瘍のコントロール及びＩＦＮ－γについてＣＤ８陰性領域の画像を撮影した。２倍の倍率で撮影されたＰＤ－Ｌ１（Ｃ）及びＣＤ８（Ｄ）染色標本を表す。標本を１０％ホルマリン溶液中に固定し、ベンタナベンチマークＵＬＴＲＡマシンを使用して自動処理用にパラフィンワックスに包埋した。 ｎＮＯＳは、インターフェロン－γ媒介黒色腫進行において中心的な役割を果たす。日焼け量でＵＶ照射すると特に、皮膚に損傷を与え、ＩＦＮ－γ産生を刺激する。ＩＦＮ－γは、遺伝子導入マウスモデル（９０）及び黒色腫患者（５８）の両方で炎症、黒色腫発生及び疾患進行を促進することが分かっている。我々の研究から、ＩＦＮ－γは、核転写因子ＳＴＡＴ３活性化に関連するｎＮＯＳ－ＮＯシグナル伝達カスケード活性化の引き金となることが示された。ＮＯレベルが異常に高いと、黒色腫増殖をあおり、がん細胞に対するＴ細胞応答をネガティブに制御するＰＤ－Ｌ１発現を誘導することによりがん細胞が免疫監視から回避するのを促進する。ｎＮＯＳ阻害剤は、ＮＯ産生を効果的に低減するだけでなく、ＩＦＮ－γで刺激されたＰＤ－Ｌ１発現及びＳＴＡＴ１／３シグナル伝達活性化も抑制する。インビトロ及びインビボ試験の両方では、小分子阻害剤を使用してｎＮＯＳ－ＮＯを標的とすることは、黒色腫治療の有望な戦略であることが実証された。 新規なｎＮＯＳ阻害剤ＨＨ０４４の有望な抗黒色腫活性。Ａ３７５転移性メラノーマ細胞をヌードマウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍増殖を毎日測定し、腫瘍体積を式（長さ／２）×（幅）^２を使用してデジタルノギスにより決定した。ｎＮＯＳ阻害剤ＨＨ０４４（２０ｍｇ／ｋｇ）は、インビボでヒト黒色腫の腫瘍増殖を抑制した。試験の終わりまでに、腫瘍（ｇ）、肺、腎臓、肝臓（ｍｇ／ｇ体重）、及び体重を測定し、記録した。データは、平均±ＳＤを表す（ｎ＝５）。 Ｂ）及びＣ）：ＨＨ０４４で処理すると、インビボでのＰＤ－Ｌ１発現量が著しく減少した。２１日間の処理後、異種移植した腫瘍を集め、解離させて単細胞懸濁液を作成した。次いで固定した細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８結合ＰＤ－Ｌ１抗体により染色し、相対ＰＤ－Ｌ１発現レベルをフローサイトメトリーにより決定した（ｎ＝４、１つの腫瘍試料は小さすぎて単細胞懸濁液に集められなかった）。＊コントロールと比較してｐ＜０．０５。 Ｂ）及びＣ）：ＨＨ０４４で処理すると、インビボでのＰＤ－Ｌ１発現量が著しく減少した。２１日間の処理後、異種移植した腫瘍を集め、解離させて単細胞懸濁液を作成した。次いで固定した細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８結合ＰＤ－Ｌ１抗体により染色し、相対ＰＤ－Ｌ１発現レベルをフローサイトメトリーにより決定した（ｎ＝４、１つの腫瘍試料は小さすぎて単細胞懸濁液に集められなかった）。＊コントロールと比較してｐ＜０．０５。 黒色腫異種移植マウスモデルにおけるＨＨ０４４のインビボ分布。Ａ）インビボイメージング及び追跡のために、ＨＨ０４４にβ―アラニンリンカーを介してＶｉｖｏＴａｇ６８０ＸＬを結合した。ＩＶＩＳイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標））により検出した、ＨＨ０４４－ＶｉｖｏＴａｇ複合体投与後の化合物分布の異なる時点でのＢ）エクスビボ及びＣ）インビボイメージング。（Ｄ及びＥ）液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）を使用して（Ｄ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析法を使用して（Ｅ）、投与後２４時間で腫瘍異種移植片から検出されたＨＨ０４４。薬剤試料は、前述したように調整した［２］。腫瘍組織を均質化し、ホモジネートに薬剤抽出用にクロロホルムとイソプロパノールの混合物（比率１：１）を加えた。乾燥させた試料をメタノールに再溶解し、ＬＣＭＳ又はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析にそれぞれかけた。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ－ＭＳ ２０２０システム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＭＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｊａｐａｎ）を使用するＳｈｉｍａｄｚｕ ＰｒｅｍｉｅｒＣ１８カラム（３．０μｍ，４．６×１００ｍｍ）でクロマトグラフィー分離を実施した。陽イオンモードで動作するＥＳＩインターフェースを備えたＳｈｉｍａｄｚｕ２０２０質量分析計で、質量分析を実行した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析については、異なる組織（肝臓、腎臓及び腫瘍異種移植片）から集めた乾燥させた試料をメタノールに再溶解し、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｌｅｘ Ｓｐｅｅｄ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦシステムを使用して分析にかけた。 黒色腫異種移植マウスモデルにおけるＨＨ０４４のインビボ分布。Ａ）インビボイメージング及び追跡のために、ＨＨ０４４にβ―アラニンリンカーを介してＶｉｖｏＴａｇ６８０ＸＬを結合した。ＩＶＩＳイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標））により検出した、ＨＨ０４４－ＶｉｖｏＴａｇ複合体投与後の化合物分布の異なる時点でのＢ）エクスビボ及びＣ）インビボイメージング。（Ｄ及びＥ）液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）を使用して（Ｄ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析法を使用して（Ｅ）、投与後２４時間で腫瘍異種移植片から検出されたＨＨ０４４。薬剤試料は、前述したように調整した［２］。腫瘍組織を均質化し、ホモジネートに薬剤抽出用にクロロホルムとイソプロパノールの混合物（比率１：１）を加えた。乾燥させた試料をメタノールに再溶解し、ＬＣＭＳ又はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析にそれぞれかけた。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ－ＭＳ ２０２０システム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＭＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｊａｐａｎ）を使用するＳｈｉｍａｄｚｕ ＰｒｅｍｉｅｒＣ１８カラム（３．０μｍ，４．６×１００ｍｍ）でクロマトグラフィー分離を実施した。陽イオンモードで動作するＥＳＩインターフェースを備えたＳｈｉｍａｄｚｕ２０２０質量分析計で、質量分析を実行した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析については、異なる組織（肝臓、腎臓及び腫瘍異種移植片）から集めた乾燥させた試料をメタノールに再溶解し、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｌｅｘ Ｓｐｅｅｄ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦシステムを使用して分析にかけた。 黒色腫異種移植マウスモデルにおけるＨＨ０４４のインビボ分布。Ａ）インビボイメージング及び追跡のために、ＨＨ０４４にβ―アラニンリンカーを介してＶｉｖｏＴａｇ６８０ＸＬを結合した。ＩＶＩＳイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標））により検出した、ＨＨ０４４－ＶｉｖｏＴａｇ複合体投与後の化合物分布の異なる時点でのＢ）エクスビボ及びＣ）インビボイメージング。（Ｄ及びＥ）液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）を使用して（Ｄ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析法を使用して（Ｅ）、投与後２４時間で腫瘍異種移植片から検出されたＨＨ０４４。薬剤試料は、前述したように調整した［２］。腫瘍組織を均質化し、ホモジネートに薬剤抽出用にクロロホルムとイソプロパノールの混合物（比率１：１）を加えた。乾燥させた試料をメタノールに再溶解し、ＬＣＭＳ又はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析にそれぞれかけた。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ－ＭＳ ２０２０システム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＭＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｊａｐａｎ）を使用するＳｈｉｍａｄｚｕ ＰｒｅｍｉｅｒＣ１８カラム（３．０μｍ，４．６×１００ｍｍ）でクロマトグラフィー分離を実施した。陽イオンモードで動作するＥＳＩインターフェースを備えたＳｈｉｍａｄｚｕ２０２０質量分析計で、質量分析を実行した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析については、異なる組織（肝臓、腎臓及び腫瘍異種移植片）から集めた乾燥させた試料をメタノールに再溶解し、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｌｅｘ Ｓｐｅｅｄ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦシステムを使用して分析にかけた。 黒色腫異種移植マウスモデルにおけるＨＨ０４４のインビボ分布。Ａ）インビボイメージング及び追跡のために、ＨＨ０４４にβ―アラニンリンカーを介してＶｉｖｏＴａｇ６８０ＸＬを結合した。ＩＶＩＳイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標））により検出した、ＨＨ０４４－ＶｉｖｏＴａｇ複合体投与後の化合物分布の異なる時点でのＢ）エクスビボ及びＣ）インビボイメージング。（Ｄ及びＥ）液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）を使用して（Ｄ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析法を使用して（Ｅ）、投与後２４時間で腫瘍異種移植片から検出されたＨＨ０４４。薬剤試料は、前述したように調整した［２］。腫瘍組織を均質化し、ホモジネートに薬剤抽出用にクロロホルムとイソプロパノールの混合物（比率１：１）を加えた。乾燥させた試料をメタノールに再溶解し、ＬＣＭＳ又はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析にそれぞれかけた。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ－ＭＳ ２０２０システム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＭＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｊａｐａｎ）を使用するＳｈｉｍａｄｚｕ ＰｒｅｍｉｅｒＣ１８カラム（３．０μｍ，４．６×１００ｍｍ）でクロマトグラフィー分離を実施した。陽イオンモードで動作するＥＳＩインターフェースを備えたＳｈｉｍａｄｚｕ２０２０質量分析計で、質量分析を実行した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析については、異なる組織（肝臓、腎臓及び腫瘍異種移植片）から集めた乾燥させた試料をメタノールに再溶解し、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｌｅｘ Ｓｐｅｅｄ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦシステムを使用して分析にかけた。 黒色腫異種移植マウスモデルにおけるＨＨ０４４のインビボ分布。Ａ）インビボイメージング及び追跡のために、ＨＨ０４４にβ―アラニンリンカーを介してＶｉｖｏＴａｇ６８０ＸＬを結合した。ＩＶＩＳイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標））により検出した、ＨＨ０４４－ＶｉｖｏＴａｇ複合体投与後の化合物分布の異なる時点でのＢ）エクスビボ及びＣ）インビボイメージング。（Ｄ及びＥ）液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）を使用して（Ｄ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析法を使用して（Ｅ）、投与後２４時間で腫瘍異種移植片から検出されたＨＨ０４４。薬剤試料は、前述したように調整した［２］。腫瘍組織を均質化し、ホモジネートに薬剤抽出用にクロロホルムとイソプロパノールの混合物（比率１：１）を加えた。乾燥させた試料をメタノールに再溶解し、ＬＣＭＳ又はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析にそれぞれかけた。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ－ＭＳ ２０２０システム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＭＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｊａｐａｎ）を使用するＳｈｉｍａｄｚｕ ＰｒｅｍｉｅｒＣ１８カラム（３．０μｍ，４．６×１００ｍｍ）でクロマトグラフィー分離を実施した。陽イオンモードで動作するＥＳＩインターフェースを備えたＳｈｉｍａｄｚｕ２０２０質量分析計で、質量分析を実行した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析については、異なる組織（肝臓、腎臓及び腫瘍異種移植片）から集めた乾燥させた試料をメタノールに再溶解し、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｌｅｘ Ｓｐｅｅｄ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦシステムを使用して分析にかけた。

本発明を、以下に説明するような、いくつかの定義を使用して本明細書中で説明し、出願全体を通じて説明する。

定義

文脈により特に定めや指示がない限り、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「この（ｔｈｅ）」は、「１つ又は複数の」を意味するものとする。例えば、「１つの化合物」又は「１つの阻害剤」は、それぞれ「１つ又は複数の化合物」及び「１つ又は複数の阻害剤」を意味する。

本明細書中で使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」、「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」、「かなり（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」及び「著しく（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ）」は、当該技術分野における当業者によって理解されるものとし、使用される文脈である程度変わるものとする。これらの用語が、使用される文脈を考慮すると当業者にとって明確でなく使用される場合、「約」及び「およそ」は、特別な用語のプラスマイナス１０％以下を表すものとし、「かなり」及び「著しく」は、特別な用語のプラスマイナス１０％以上を表すものとする。

本明細書中で使用される場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」には、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」がこれらの移行用語に続いて列挙される構成要素にのみ請求項を限定しない「オープン」な移行用語であるという点でこれらの後者の用語と同様の意味を有する。用語「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」に含まれるものであるが、請求項をこの移行用語に続いて列挙される構成要素にのみ限定する「クローズ」な移行用語として解釈すべきである。用語「基本的にから成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」に含まれるものであるが、この移行用語に続く追加の構成要素を許容する「部分的にクローズ」な移行用語として解釈すべきものであるが、これらの追加の構成要素は請求項の基本的で新規な特性に実質的に影響を及ぼさない場合にのみ許容されると解釈すべきものである。

開示される方法は、必要とする被験者を治療する方法に関する。特に、開示される方法は、必要とする被験者に免疫療法を施す方法に関する。

本明細書中で使用される場合、「被験者」は、「患者」又は「個人」と互換性があってもよく、例えば、神経型一酸化窒素合成酵素の阻害剤（すなわちｎＮＯＳ阻害剤）を投与することを含む治療である、治療を必要とする、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。

「治療を必要とする被験者」は、がんなどの、細胞増殖性疾患、障害又は健康状態を有する被験者を含んでもよい。がんには、腺がん、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌腫並びに副腎、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頸部、胆のう、神経節、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、前立腺、皮膚、精巣、胸腺、及び子宮の個別のがんであってもよい。

「治療を必要とする被験者」は特に、黒色腫を有する又は黒色腫を発生する危険がある被験者を含んでよい。「治療を必要とする被験者」はより具体的には、ステージＩ黒色腫、ステージＩＩ黒色腫、ステージＩＩＩ黒色腫、又はステージＩＶ黒色腫を有する又は発生する危険がある被験者を含んでよい。

「治療を必要とする被験者」は特に、黒色腫を有し、ＩＦＮ－γ刺激による黒色腫進行の発症を示している又は発症する危険がある被験者を含んでよい。「治療を必要とする被験者」は特に、黒色腫を有し、ｎＮＯＳ発現レベルの上昇（任意にｎＮＯＳ発現レベルの上昇はＩＦＮ－γにより誘導される）によって特徴づけられる黒色腫の発症を示している又は発症する危険がある被験者を含んでよい。「治療を必要とする被験者」は特に、黒色腫を有し、シグナル伝達性転写因子１及び３（ＳＴＡＴ１／３）発現レベルの上昇（任意にＳＴＡＴ１／３発現レベルの上昇はＩＦＮ－γにより誘導される）によって特徴づけられる黒色腫の発症を示している又は発症する危険がある被験者を含んでよい。「治療を必要とする被験者」は特に、黒色腫を有し、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）発現レベルの上昇（任意に（ＰＤ－Ｌ１発現レベルの上昇はＩＦＮ－γにより誘導される）によって特徴づけられる黒色腫の発症を示している又は発症する危険がある被験者を含んでよい。

がん患者に対する免疫治療のための神経型一酸化窒素合成酵素阻害剤の使用

開示される主題は、必要とする被験者に免疫治療を施す方法に関するものである。この方法は典型的には、免疫治療応答を誘導するために有効量の神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）の阻害剤を被験者に投与することを含む。

開示される方法のいくつかの実施形態においては、この被験者は、本明細書中に開示されるように、かつ当該技術分野において公知のように、細胞増殖性疾患又は障害を有してもよく、あるいは細胞増殖性疾患又は障害を発症する危険があってもよい。特に、この被験者は、黒色腫を有してもよく、又は黒色腫進行を発症する危険があってもよい（例えば、ステージＩ黒色腫、ステージＩＩ黒色腫、ステージＩＩＩ黒色腫、又はステージＩＶ黒色腫など）。

開示される方法のいくつかの実施形態においては、被験者は、黒色腫を有してもよく、ＩＦＮ－γ刺激による黒色腫進行の発症を示しているまたは発症する危険があってもよい。開示される方法のさらなる実施形態においては、被験者は、黒色腫を有してもよく、ｎＮＯＳ発現レベルの上昇（ＩＦＮ－γによって誘発されるｎＮＯＳ発現レベルの上昇など）によって特徴づけられる黒色腫の発症を示している又は発症する危険がある。開示される方法のさらなる実施形態においては、被験者は、黒色腫を有してもよく、シグナル伝達性転写因子１及び３（ＳＴＡＴ１／３）発現レベルの上昇（ＩＦＮ－γによって誘発されるＳＴＡＴ１／３発現レベルの上昇など）によって特徴づけられる黒色腫の発症を示している又は発症する危険がある。開示される方法の他のさらなる実施形態においては、被験者は、黒色腫を有してもよく、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）発現レベルの上昇（ＩＦＮ－γによって誘発されるＰＤ－Ｌ１発現レベルの上昇など）によって特徴づけられる黒色腫の発症を示している又は発症する危険がある。

開示される方法においては、この方法の被験者は典型的に、神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）の阻害剤を投与される。ｎＮＯＳ阻害剤を含むｎＮＯＳ薬学的組成物の阻害剤及び治療法としてｎＮＯＳの阻害剤を投与する方法が本明細書中に開示され、当該技術分野において公知である（米国特許出願公開第２０１７０２９８０２１号明細書「２－Ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ－ｂａｓｅｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、第２０１７０２７５２７８号「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、第２０１７０２６０１６５号「２－Ｉｍｉｄａｚｏｌｙｌ－Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ」、第２０１６０３６８８７７号「２－Ａｍｉｎｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－Ｂａｓｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ」、第２０１６０３４７７１３号「２－Ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ－ｂａｓｅｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、第２０１６０１５２５９０号「Ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ－２－ｃａｒｂｏｘｉｍｉｄａｍｉｄｅ Ｂａｓｅｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、第２０１６０１２２３０２号「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、第２０１６００９６８２１号「Ｃｈｉｒａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ Ｃｏｒｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｅｎ ｒｏｕｔｅ ｔｏ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、第２０１６００９６８０６号「２－Ａｍｉｎｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－Ｂａｓｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｓ」、第２０１６０００９６９０号「２－Ｉｍｉｄａｚｏｌｙｌ－Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ」、第２０１５０３６８２０１号「２－Ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ－ｂａｓｅｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、第２０１５０２５２０２０号「Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ－Ｂｏｎｄｅｄ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、第２０１５０２１０６４４号「２－Ａｍｉｎｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－ｂａｓｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ」、第２０１４０２５６９５８号「Ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ－２－ｃａｒｂｏｘｉｍｉｄａｍｉｄｅ Ｂａｓｅｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、第２０１４０２５６０１６号「２－Ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ－ｂａｓｅｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、第２０１４０２２８５７８号「Ｃｈｉｒａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ Ｃｏｒｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｅｎ ｒｏｕｔｅ ｔｏ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、第２０１４０１６３０１６号「Ｂｅｎｚｏｘａｚｉｎｅｓ， Ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｉｎｅｓ，ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｈａｖｉｎｇ ＮＯＳ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」、第２０１４０１４７９２０号「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎＮＯＳ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ」、第２０１４００６６６３５号「Ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ－２－ｃａｒｂｏｘｉｍｉｄａｍｉｄｅ Ｂａｓｅｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、第２０１３００４０３５９号「Ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ ｄｉｍｅｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ， ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ」、第２０１２０２５８５１３号「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、第２０１２０２３８０１６号「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎＮＯＳ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ」、第２０１２０１２２８５５号「Ｂｅｎｚｏｘａｚｉｎｅｓ， Ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｉｎｅｓ， ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｈａｖｉｎｇ ＮＯＳ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」、第２０１２００８８７９８号「Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ－Ｂｏｎｄｅｄ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、第２０１２０００４４１５号「Ｃｈｉｒａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ Ｃｏｒｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｅｎ ｒｏｕｔｅ ｔｏ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、第２０１００２９２４８４号「Ｃｈｉｒａｌ Ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ Ｃｏｒｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｅｎ ｒｏｕｔｅ ｔｏ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ」、第２０１００２０３６１３号「Ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ Ｄｉｍｅｒ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ」、第２０１００１９０２３０号「Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ」、第２０１００００９９７５号「Ｂｅｎｚｏｘａｚｉｎｅｓ，Ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｉｎｅｓ，ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｈａｖｉｎｇ ＮＯＳ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」、第２００９０１０４６７７号「Ｈｅｔｅｒｏａｒｏｍａｔｉｃ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ」、第２００８０２３４２３７号「Ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ ａｎｄ Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｈａｖｉｎｇ ＮＯＳ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」、第２００８０１７６９０７号「ＮＯＳ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｏｆ Ｍｏｔｏｒ Ｄｅｆｉｃｉｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、第２００８０１０８８１４号「Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｅｔｅｒｏａｒｏｍａｔｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ」、第２００５０１５９３６３号「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、第２００５０１０７３６９号「Ｈｅｔｅｒｏａｒｏｍａｔｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ」、第２００３０１１９７５１号「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」等を参照することとし、その内容は全体を参照により本明細書に援用される。

開示される方法のうちいくつかの実施形態においては、投与されるｎＮＯＳ阻害剤は、式を有する化合物ＭＡＣ－３－１９０、

又はその適切な薬学的な塩、溶媒和物あるいは水和物である。化合物ＭＡＣ－３－１９０は、米国特許出願公開第２０１６０３６８８７７号中明細書「化合物１４」として開示されるものである（その内容は全体を参照により本明細書に援用される）。

前述した請求項のうちいずれかに記載の方法においては、ｎＮＯＳ阻害剤は、式を有する化合物ＨＨ０４４、

又はその適切な薬学的な塩、溶媒和物あるいは水和物である。化合物ＨＨ０４４は、米国特許出願公開第２０１６０１５２５９０号明細書中「化合物７」として開示されるものである（その内容は全体を参照により本明細書に援用される）。

開示される方法においては、被験者には典型的には、免疫治療応答を誘導するためにＮＯＳ阻害剤を投与する。開示される方法のうちいくつかの実施形態においては、被験者には、ＰＤ－Ｌ１発現量の減少を誘導することを含む免疫治療応答を誘導するＮＯＳ阻害剤を投与する。例えば、被験者が黒色腫を有する開示される方法のうちのいくつかの実施形態において、被験者には、黒色腫中のＰＤ－Ｌ１発現量の減少を含む免疫治療応答を誘導するＮＯＳ阻害剤を投与する。

開示される方法においては、被験者には典型的には、免疫治療応答を誘導するためにＮＯＳ阻害剤を投与する。開示される方法のうちいくつかの実施形態においては、被験者には、追加の治療薬を投与してもよい。例えば、開示される方法のうちいくつかの実施形態においては、被験者にＮＯＳ阻害剤を投与し、さらにＩＦＮ－αを含む医薬組成物を投与する。ＩＦＮ－αを含む医薬組成物は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｒｏｆｅｒｏｎ（登録商標）Ａ商標インターフェロンα２ａ、Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）Ａ／Ｅｒｌｉｆｅｒｏｎ（登録商標）／Ｕｎｉｆｅｒｏｎ（登録商標）商標インターフェロンα２ｂ、及びＭｕｌｔｉｆｅｒｏｎ（登録商標）商標ヒト白血球インターフェロンα（ＨｕＩＦＮ－ａｌｐｈａ－Ｌｅ）を参照すること）。

開示される方法のうちさらなる実施形態においては、被験者にはＮＯＳ阻害剤を投与し、さらにＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／又はＰＤ－１阻害剤を含む医薬組成物を投与する。ＰＤ－Ｌ１阻害剤を含む医薬組成物は、当該技術分野において公知である（例えば、アテゾリズマブ（テセントリク（商標））（ロシュジェネンテック）、アベルマブ（バベンチオ（商標））（メルクセローノ）、デュルバルマブ（イミフィンジ（商標））（アストラゼネカ）、ＢＭＳ－９３６５５９（ブリストル・マイヤーズスクイブ）、及びＣＫ－３０１（チェックポイント・セラピューティックス）を参照すること）。ＰＤ－１阻害剤を含む医薬組成物もやはり、当該技術分野において公知である（例えば、（ペムブロリズマブ（キイトルーダ（商標））（メルク）及びニボルマブ（オプジーボ（商標））（ブリストル・マイヤーズスクイブ）を参照すること）。

開示される方法のうちいくつかの実施形態においては、被験者にはＮＯＳ阻害剤を投与し、さらに黒色腫治療用の化学療法薬を含む医薬組成物を投与する。開示される方法のうちいくつかの実施形態においては、被験者にはＮＯＳ阻害剤を投与し、さらにダカルバジンを投与する。開示される方法の他の実施形態においては、被験者にはＮＯＳ阻害剤を投与し、さらにテモゾロミドをこの患者に投与する。

説明的実施形態
以下の実施形態は説明的なものであり、主張される主題の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。

実施形態１。必要とする被験者に対して免疫治療を施す方法及び／又は必要とする被験者を治療する方法であって、この方法は、免疫治療応答を誘導するために有効量の神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）阻害剤及び／又は有効量のものを被験者に投与することを含む。

実施形態２。この被験者は、細胞増殖性疾患又は障害を有する、実施形態１に記載の方法。

実施形態３。この被験者は、黒色腫を有する、実施形態１又は実施形態２に記載の方法。

実施形態４。この被験者は、ステージＩ黒色腫、ステージＩＩ黒色腫、ステージＩＩＩ黒色腫、又はステージＩＶ黒色腫を有している又は発症する危険がある、前述した実施形態のうちいずれか１つに記載の方法。

実施形態５。この被験者は、黒色腫を有しており、ＩＦＮ－γ刺激による黒色腫進行の発症を示しているまたは発症する危険がある、前述した実施形態のうちいずれか１つに記載の方法。

実施形態６。この被験者は、黒色腫を有しており、ｎＮＯＳ発現レベルの上昇によって特徴づけられる黒色腫の発症を示している又は発症する危険がある、前述した実施形態のうちいずれか１つに記載の方法。

実施形態７。この被験者は、黒色腫を有しており、ＩＦＮ－γによって誘発されるｎＮＯＳ発現レベルの上昇によって特徴づけられる黒色腫の発症を示している又は発症する危険がある、前述した実施形態のうちいずれか１つに記載の方法。

実施形態８。この被験者は、黒色腫を有しており、シグナル伝達性転写因子１及び３（ＳＴＡＴ１／３）発現レベルの上昇によって特徴づけられる黒色腫の発症を示している又は発症する危険がある、前述した実施形態のうちいずれか１つに記載の方法。

実施形態９。この被験者は、黒色腫を有しており、ＩＦＮ－γによって誘発されるＳＴＡＴ１／３発現レベルの上昇によって特徴づけられる黒色腫の発症を示している又は発症する危険がある、前述した実施形態のうちいずれか１つに記載の方法。

実施形態１０。この被験者は、黒色腫を有しており、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）発現レベルの上昇によって特徴づけられる黒色腫の発症を示している又は発症する危険がある、前述した実施形態のうちいずれか１つに記載の方法。

実施形態１１。この被験者は、黒色腫を有しており、ＩＦＮ－γによって誘発されるＰＤ－Ｌ１発現レベルの上昇によって特徴づけられる黒色腫の発症を示している又は発症する危険がある、前述した実施形態のうちいずれか１つに記載の方法。

実施形態１２。ｎＮＯＳ阻害剤は、式を有する化合物ＭＡＣ－３－１９０、

又はその適切な薬学的な塩、溶媒和物あるいは水和物である、前述した実施形態のうちいずれか１つに記載の方法。

実施形態１３。ｎＮＯＳ阻害剤は、式を有する化合物ＨＨ０４４、

又はその適切な薬学的な塩、溶媒和物あるいは水和物である、前述した実施形態のうちいずれか１つに記載の方法。

実施形態１４。免疫治療応答には、ＰＤ－Ｌ１発現量の減少が含まれる、前述した実施形態のうちいずれか１つに記載の方法。

実施形態１５。被験者は黒色腫を有し、免疫治療応答には、ＰＤ－Ｌ１発現量の減少が含まれる、前述した実施形態のうちいずれか１つに記載の方法。

実施形態１６。さらに被験者にＩＦＮ－αを投与することを含む、前述した実施形態のうちいずれか１つに記載の方法。

実施形態１７。ＰＤ－Ｌ１阻害剤（アテゾリズマブなど）又はＰＤ－１阻害剤（ペムブロリズマブ又はニボルマブなど）を被験者に投与することをさらに含む、前述した実施形態のうちいずれか１つに記載の方法。

実施形態１８。被験者に化学療法を施すことをさらに含む、前述した実施形態のうちいずれか１つに記載の方法。

実施形態１９。被験者にダカルバジンを投与することをさらに含む、前述した実施形態のうちいずれか１つに記載の方法。

実施形態２０。被験者にテモゾロミドを投与することをさらに含む、前述した実施形態のうちいずれか１つに記載の方法。

以下の実施形態は説明的なものであり、主張される主題の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。

表題：インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）誘導黒色腫進行における神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）の役割

本出願の申請後に審査及び出版用に提出予定の原稿である、Ｆｏｎｇ，Ｓ．，Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．，ａｎｄ Ｙａｎｇ，Ｓ、「Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ（ｎＮＯＳ）ｉｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－Ｇａｍｍａ（ＩＦＮ－γ）－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ」を参照するものとする。

要約

背景：ヒト免疫細胞が産生するインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）は、黒色腫の発症及び進行にある役割を果たすことが分かっている。しかしながら、根底にあるメカニズムは完全には理解されていない。

目的：したがって、インビトロとインビボの両方でＩＦＮ－γで刺激された黒色腫進行における神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）媒介シグナル経路の役割を調べ、医薬品阻害剤を使用してｎＮＯＳ―一酸化窒素（ＮＯ）シグナル伝達を遮断することによってＩＦＮ－γによるこのような刺激が阻害されるかを明らかにした。

結果：我々の研究から、ＩＦＮ－γは黒色腫細胞のｎＮＯＳ発現レベルを著しく誘導することが分かったが、このような誘導は、黒色腫のＦＤＡ承認補助療法である、ＩＦＮ―アルファ（ＩＦＮ－α）を用いた治療法にはないものである。ＩＦＮ－γ曝露後には、矛盾なく、細胞内ＮＯレベルも増加した。ＳＴＡＴ１及び３は、黒色腫細胞のＩＦＮ－γ治療によって、リン酸化ＳＴＡＴ１／３レベルの上昇に相関して、活性化された。新規なｎＮＯＳ阻害剤は、ＩＦＮ－γにより活性化されたＳＴＡＴ１／３を低濃度（３μＭ）で効果的に軽減する。逆相タンパクアレイ（ＲＰＰＡ）分析によりさらに、ＨＩＦ１α、ｃ－Ｍｙｃ、及びプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）などの、黒色腫の増殖、浸潤、及び免疫抑制に関連する遺伝子の発現がＩＦＮ－γにより誘導されることが実証されたが、このような変化はＩＦＮ－α曝露後には観察されなかった。注目すべきことには、ＰＤ－Ｌ１発現レベルはコントロールの１．８倍まで上昇したが、これはＩＦＮ－α治療法にはないものである。ＩＦＮ－γによりＰＤ－Ｌ１が誘導されることはまた、フローサイトメトリー及び蛍光免疫染色によって確認できる。特異的阻害剤を使用してｎＮＯＳ媒介シグナル経路を遮断すると、黒色腫細胞中のＩＦＮ－γ誘導型ＰＤ－Ｌ１を効果的に減少させることが分かった。さらに、異種移植黒色腫モデルを使用すると、インビボ動物試験からＩＦＮ－γはコントロールと比較して腫瘍増殖を増加させ、これはｎＮＯＳ阻害剤である、ＭＡＣ－３－１９０を同時投与（５ｍｇ／ｋｇ／日）することにより戻ることが明らかとなった。別のｎＮＯＳ阻害剤である、ＨＨ０４４は、異種移植黒色腫腫瘍中のＰＤ－Ｌ１発現レベルの減少に相関して、インビボで腫瘍増殖を効果的に阻害することが分かった。

技術革新：我々の研究により、ＩＦＮ－γで刺激された黒色腫進行におけるｎＮＯＳ媒介一酸化窒素シグナル経路の重要な役割が初めて実証された。

結論：選択性の高い医薬品阻害剤を使用してｎＮＯＳを標的とすることは、黒色腫の治療を改善する独特で効果的な戦略である。

緒言

ヒト皮膚黒色腫（ＣＭ）の発症率は、最近の数十年間で上昇し続けており、この疾患に対する公衆衛生上の懸念が高まっている。黒色腫の症例数は皮膚がんの全症例数の１％未満を占めるにすぎないが、皮膚がん死亡者数の圧倒的多数を占める。ゲノムの変異率が高く（４３）、遠隔転移患者の５年生存率が１５～２０％と皮膚がんのなかで最も致命的で最も悪性度の高い形態である（１）。外科的切除と合わせて早期発見できると患者の予後が最も良好となる。疾患が利用する多種多様な抵抗メカニズムにより、伝統的な細胞障害性化学療法の効率は非常に限定的であり、作用メカニズムに特異性がないので重度の毒性にも関連する。

腫瘍の微小環境（ＴＭＥ）は、癌細胞を免疫応答から保護することができ、これにより癌細胞は有効な免疫監視機構を回避できるとみなされている。免疫療法は、がんの病態生理学と免疫系の役割の理解が進んだことにより、黒色腫治療に有望な新しい手法として現れた。近年、黒色腫の免疫学の理解がかなり進展し、この理解を確固とした治療方針に応用している。結果として、がんの治療法は現在、古典的な細胞傷害性薬物から、腫瘍が関連する免疫寛容を外すよう免疫系を回復及び／又は活性化できる同定された薬剤（ｍＡｂ及び小分子）へとパラダイムシフトを受けている。免疫療法は、特異的なバイオマーカーを標的とすることにより患者自身の免疫系を利用しており、腫瘍科医は患者の疾患各々に特有の複雑さに基づいて治療を調整することができる（２１，６１）。刺激的な発展にも関わらず、この革命的な免疫療法は主に、切除不能又は転移性黒色腫及び他の治療時又は治療後に疾患が進行した患者に対して必要性が示されている（２７）。さらに、黒色腫患者のうち多くの人々が治療に応答するか迅速に抵抗性を獲得できなかったので、免疫チェックポイント阻害剤の欠点も明らかになってきた。残念なことに、免疫療法から長期的な恩恵を被るであろう患者を識別できるバイオマーカーはまだ特定されていない。さらに、重度の免疫関連有害事象の発症率が高いならば、無憎悪生存期間（ＰＦＳ）が長いという利益を受ける可能性があるにも関わらず、患者の生活の質は最適とはならない（１３）。このように、悪性黒色腫の発生及び進行期への疾患進行を阻止するために新規な治療的介入を開発することは、影響と重要度が高いものとなる。

紫外線照射（ＵＶＲ）は、黒色腫発生の主要な環境要因と示されてきた。発がん性物質のように、ＵＶＲはピリミジン二量体及び８－オキソ－７，８－ジヒドロ－２－デオキシグアノシン（８－ｏｘｏ－ｄＧ）などの酸化的なＤＮＡ塩基損傷を形成することができ、ゲノム変異を引き起こす。Ｂ－ｒａｆ癌原遺伝子（ＢＲＡＦ）は、黒色腫患者によく見られる変異遺伝子である（５３，８８）。しかしながら、研究から、ＢＲＡＦ変異黒色腫は、累積ＵＶ線量が低い初期に生じることが分かった（１０）。変異ＢＲＡＦはまた、メラニン細胞の良性の異形成母斑にも存在し、黒色腫の開始にはさらなる因子が必要であることが示唆されている（１６）。多くの疫学的研究からＵＶＲと悪性皮膚黒色腫のリスク間の強い関連性が分かっているので、ＵＶＲは黒色腫発生及び疾患進行に関与する重要な要因となってもよい（３４，６３）。

ＵＶＲがヒト皮膚中の一酸化窒素（ΝΟ）を著しく増加させることは、文書により十分裏付けられている。ＮＯは、血管拡張、色素沈着、及びマクロファージ細胞毒性などの多くの生理学的、そして病理学的機能に関与する重要なシグナル分子である。研究からはまた、ΝΟが免疫応答の制御及びＴ細胞の増殖に関与する重要なメディエーターであることも示される（５）。

近年、ますます多くの研究により、腫瘍形成及び進行におけるＮＯの役割が明らかになった。ＮＯは、鍵となる修復タンパク質をニトロシル化することによりＤＮＡ修復を阻害することが分かっており、これにより異常細胞の生存が促進される（３５）。ＤＮＡ損傷に応答して腫瘍抑制因子ｐ５３を活性化することにより、ＮＯは、黒色腫細胞をシスプラチンの細胞障害性から保護する（７５）。ＮＯはまた、強力な血管拡張因子として働くことにより悪性細胞の血管新生及び転移にも役割を果たすことができる（３６）。さらに、ＮＯ及び他の活性窒素種（ＲＮＳ）と共に、ＵＶＲもヒト皮膚中のスーパーオキシドなどの、大量の活性酸素種（ＲＯＳ）を産生する。ＮＯ／ＲＮＳとＲＯＳが相互作用すると、ペルオキシナイトライトなどの有毒な副生物を生成することとなり、この有毒な副生物は遺伝毒性であり、ＤＮＡ損傷及びタンパク質修飾を生じ、さらには黒色腫の進行を促進することにより細胞機能に干渉する（３１）。

一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）は、Ｌ－アルギニンからＮＯを産生し、誘導型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）、内皮ＮＯＳ（ｅＮＯＳ）、及び神経型ＮＯＳ（ｎＮＯＳ）で構成される。ｉＮＯＳは高レベルのＮＯを生成し、非特異的免疫防御などの過程を制御する。ｅＮＯＳ及びｎＮＯＳは共に、低レベルのＮＯを生成するが、ｅＮＯＳは血管拡張などの欠陥機能に関与する一方、主に神経組織で発現するｎＮＯＳは、中枢神経系（ＣＮＳ）の活動に関与する。メラニン細胞は神経堤に起源を持ち、神経細胞と同様の多くの遺伝子発現特性を有しているので（２２）、ｎＮＯＳはメラニン細胞中のＮＯレベルを制御する際の中心的な役割を果たす（３）。患者生検に対する我々の研究からはまた、正常な皮膚と比較して、試験した悪性黒色腫の全てで著しく高いｎＮＯＳの発現レベルが示されたが、これは病期と有意に相関する（８６）。Ｌｉｕらによって報告された最近の研究においては（２０１４）、ヒト黒色腫組織におけるｎＮＯＳ発現量の増加は、免疫抑制をもたらす循環Ｔリンパ球の免疫機能不全と関連づけられた（４６）。研究からはさらに、ＮＯスカベンジャーが細胞を細胞障害機構から保護する抗酸化効果を示すことも分かった（２６，５１）。さらなる機構の研究が保証されているが、この調査観察研究から、特にヒト黒色腫についての免疫応答の制御におけるｎＮＯＳ媒介ＮＯシグナル伝達の重要な役割が明らかになった（４６）。蓄積された証拠から、ｎＮＯＳシグナル伝達を標的とすることにより黒色腫細胞の腫瘍免疫応答と潜在的に干渉できることが示唆される。

前臨床試験から、ＩＦＮ－γ曝露により腫瘍転移能力が強化されることが分かったが、このことは黒色腫を含む、前述したいくつかの異なるモデル系において一致している（２４，５０）。新生児の肝細胞増殖因子／散乱因子（ＨＧＦ／ＳＦ）へのＵＶ照射に由来するＵＶＢ－ＨＧＦ／ＳＦ遺伝子導入マウス黒色腫モデルにおける研究では（６２）、アポトーシスの阻害により黒色腫の増殖を促進する際に、マクロファージが産生したＩＦＮ－γが直接的に関与することが実証された（９０）。ＩＦＮ－αではなく、ＩＦＮ－γを遮断する特異抗体は、ＵＶＢによって誘導されたメラニン細胞の活性化を消失させた。微小環境要因の状況により、ＩＦＮ－γの役割が免疫監視から免疫編集に切り替わることができることも提唱されている（９２）。実際に、１９９０年になされた米国南西部臨床試験グループ（ＳＷＯＧ）による初期の臨床治験では、ＩＦＮ－γ治療を行うと、初期黒色腫患者の５０％が再発又は息を吐き、疾患進行を刺激することが分かった。Ｂ１６マウス黒色腫における研究ではＩＦＮ－γが転移を阻止して腫瘍発生を低減する有益な効果が示唆されたけれども（２５，３８）、このマウスモデルのヒト疾患に対する関連性はかなり弱い。我々の研究は、特異的な合成ｎＮＯＳ阻害剤を使用してＩＦＮ－γ刺激による黒色腫進行に対するｎＮＯＳ－ＮＯの効果を調べることにより、黒色腫進行を理解することに寄与する。

シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）１及び３は、ＩＦＮ－γ下流の文書により十分裏付けられた標的である。ＳＴＡＴ１とＳＴＡＴ３は共に黒色腫のシグナル経路に寄与する多くの遺伝子の制御に関与することが分かっており（４０）、多くの型のがんの癌遺伝子とみなされている（８，５７）。本研究においては、ＳＴＡＴ１／３の活性化はＮＯシグナル経路の活性化と関連するかを議論することとする。

プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）は、乳がん、黒色腫を含む多くの型のがん細胞で発現する膜貫通タンパク質であり、プログラム死受容体－１（ＰＤ－１）に結合し、アポトーシス又はＴリンパ球の不活性化を引き起こすことにより免疫系の抑制に重要な役割を果たす（９４）。ＰＤ－１は概して、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）及びエフェクターＴ細胞などの免疫細胞で発現し、ＩＬ－２分泌によりＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の活性化を介して増加する。エフェクターＴ細胞における恒常的なＰＤ－１発現は自己免疫反応を制限するが、ＴｒｅｇｓにおけるＰＤ－１発現は過剰炎症を防止し、免疫の恒常性を促進する（７１）。ＰＤ－Ｌ１は、黒色腫がＴ細胞応答を阻害し、免疫応答を回避する能力に関連づけられてきた（３７）。ＰＤ－Ｌ１の発現は疾患の悪性度の上昇と関連していることが観察されてきた（７）。ＵＣＬＡでなされた研究から、ＳＴＡＴ１／３結合部位がＰＤ－Ｌ１プロモーター上に存在することが分かった（２８）。患者の腫瘍にＩＦＮ－γを分泌するＣＤ８^＋腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）が存在することは、ＰＤ－Ｌ１の発現と強く相関する（３９）。チェックポイント阻害剤と呼ばれる、革命的な新規抗がん剤は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達を標的とし、ＰＤ－１がＰＤ－Ｌ１に結合するのを防ぐことができ、これにより患者の免疫系の能力を解放し、Ｔ細胞ががん細胞を除去する能力を強化する。近年では、研究からＩＦＮ－γがヒト黒色腫細胞中のＰＤ－Ｌ１発現をＮＦ－ｋＢ依存的様式で誘発することが実証された（２９）。別の研究からはさらに、ＩＦＮ－γを腫瘍内に注射すると抗腫瘍免疫遺伝子の痕跡を誘導しないことが分かった（５５）。

遺伝子導入マウス黒色腫モデルにおいては、研究によりＰＤ－Ｌ１の誘導は、ＩＦＮ－γが黒色腫進行を刺激する構成要素の１つであってもよいことが分かった（３０，９１）。若齢期に日焼け量のＵＶＲに断続的に暴露すると、メラニン細胞に変異が生じ、変異を保有する細胞が免疫監視を持続的に回避できる場合、黒色腫が発症する。Ｔリンパ球のＮＯを阻害的に制御するとヒトのＵＶＲ誘導免疫抑制に寄与することもできる（３２，６６）。このことを考慮すると、ＮＯはＩＦＮ－γとＰＤ－Ｌ１－媒介免疫チェックポイントとの間のメッセンジャーとなることができるのは当然のことである。

今まで、ＩＦＮ－γ媒介腫瘍発生促進の根底にある分子メカニズムは詳細に明らかにされてこなかった。蓄積された証拠から、ＩＦＮ－γは黒色腫細胞の免疫微小環境をｎＮＯＳ／ＮＯ経路により直接的に、又はＰＤ－Ｌ１媒介免疫抑制の可能性を持たせることにより間接的に変化させることができることが示されている。我々の研究では、ＩＦＮ－γで刺激された黒色腫進行の根底にあるメカニズムを立証し、黒色腫予防及び治療のためのＩＦＮ－γ－媒介シグナル経路を標的とする新規な医薬品阻害剤を開発することに焦点を合わせる。我々の研究が完了すると、黒色腫の原因についての基礎知識が増強するだけでなく、ＦＤＡ承認チェックポイント阻害剤を用いる既存の免疫療法を補完する薬理学的治療の開発にもつながるだろう。

結果

ＩＦＮ－γは、ｎＮＯＳ－ＮＯシグナル伝達の活性化により黒色腫進行を刺激する。転移性黒色腫Ａ３７５細胞を使用して、黒色腫浸潤能力に対するＩＦＮ－γの効果を決定した。図１Ａに示すように、ＩＦＮ－γは、コントロールと比較して黒色腫浸潤能力を有意に増強した（ｐ＜０．０５）。黒色腫細胞の線維芽細胞に対する接着力もまた、ＩＦＮ－γにより有意に増強し（図１Ｂ）、転移能力を獲得したことが示される（５６）。

図２Ａに示すように、ＩＦＮ－γは、初代黒色腫ＷＭ３２１１細胞のｎＮＯＳ発現レベルを著しく促し、これは９６時間後でさえ持続していた。対照的に、４時間以内にＩＦＮ－αで処理した後はｎＮＯＳの発現量は検出不能なレベルまで急速に低下し、２４時間までに回復した（図２Ｂ）。異なる細胞株Ａ３７５細胞においても、ＩＦＮ－α及びＩＦＮ－γに曝露すると、同様のパターンが明らかになった（図２Ｃ）。初代黒色腫ＷＭ３２１１細胞は、転移性Ａ３７５細胞と比較してＩＦＮ－γ治療に対する感受性が高く、ｎＮＯＳの誘導が１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬの低濃度で観察された。ｎＮＯＳ発現量の増加と並行して、ＩＦＮ－γ曝露後にＤＡＦ－ＦＭ蛍光プローブを用いて細胞内ＮＯレベルの上昇も検出した。しかしながら、ＩＦＮ－αで処置した黒色腫細胞においては、ＮＯ産生が著しく減少し（図２Ｄ）、このことはＩＦＮ－α処置後にｎＮＯＳ発現量が低減したことと一致する（図２Ｂ及び図２Ｃ）。ｓｈＲＮＡ－ｎＮＯＳによりｎＮＯＳをノックダウンすると、２４時間Ａ３７５細胞をＩＦＮ－γ処置したことによるｎＮＯＳ誘導を著しく抑制した（図２Ｅ）。

ＩＦＮ－γの下流の標的かつＰＤ－Ｌ１発現の重要な転写因子として（５４）、ＳＴＡＴ３の発現レベルは、細胞をＩＦＮ－γに曝露すると、コントロールの１．６倍に増加した。ホスホ－ＳＴＡＴ３のレベルもやはり、コントロールの１．９倍まで促され、ＩＦＮ－γ処置がＳＴＡＴ３媒介シグナル伝達の活性化と関連することが示唆された（図３Ａ）。興味深いことに、ｎＮＯＳ阻害剤である、ＭＡＣ－３－１９０及びＨＨ０４４は、ＩＦＮ－γ誘導型ｎＮＯＳを阻害しなかったが、ＭＡＣ－３－１９０は３μＭで、細胞をＩＦＮ－γで同時処置すると活性化されるＳＴＡＴ３発現の誘導を効果的に減少させた（図３Ｂ）。ＩＦＮ－αではＳＴＡＴ１発現の増加が観察されたが、ＩＦＮ－γは、ＳＴＡＴ１誘導量の増加を示し、ｎＮＯＳ阻害剤で同時処置するとやはり効果的に減少した（図３Ｃ）。

ＩＦＮ－γによるＰＤ－Ｌ１発現の誘導は、ｎＮＯＳ阻害剤処置により減少した。我々の研究においては、３種類のヒト黒色腫細胞株における主要な増殖及び生存シグナル分子に対するＩＦＮ－α及びＩＦＮ－γの効果を評価するために、ＲＰＰＡも使用した（図４Ａ）。近年の研究と一致して（２９）、ＩＦＮ－γ処置を行うとコントロールと比較してＰＤ－Ｌ１発現量が著しく増加した。ＩＦＮ－γ処置後にはｃ－Ｍｙｃ及びＨＩＦ－１α発現レベルの増加も明らかとなり（図４Ｂ）、黒色腫患者の腫瘍転移及び予後不良と関連している（３３，４５）。

ＩＦＮ－γによるＰＤ－Ｌ１の増加量は、フローサイトメトリーを用いて確認した（図４Ｃ）。我々のデータから、フローサイトメトリーにより調べられた３種類の細胞株の全てにおいてＩＦＮ－γは、ＰＤ－Ｌ１の細胞表面での発現を増加させたことが分かったが、同濃度のＩＦＮ－αはＰＤ－Ｌ１発現量を減少させた。注目すべきことには、ｎＮＯＳ阻害剤ＭＡＣ－３－１９０は、７２時間の処置後にＩＦＮ－γによるＰＤ－Ｌ１の誘導を著しく反転させ（図４Ｄ）、フローサイトメトリーにより得られたＰＤ－Ｌ１染色のＭＦＩをコントロールの３．３倍からコントロールの１．９倍まで減少させた（図４Ｅ）。

免疫蛍光顕微鏡により得られた画像においては、コントロールとＩＦＮ－α処置細胞は、ＰＤ－Ｌ１の低い基本的発現を示した。しかしながら、ＩＦＮ－γ処置後には、高強度緑色蛍光染色によって示されるように、黒色腫細胞中のＰＤ－Ｌ１細胞外発現が著しく誘導された。３μＭのＭＡＣ－３－１９０で同時処置するとＩＦＮ－γ誘導型のＰＤ－Ｌ１発現量は著しく減少したが、ＭＡＣ－３－１９０のみで処置してもＰＤ－Ｌ１の基本レベルはコントロールの基本レベルと比較して変化しなかった（図５）。

まとめると、これらの結果は、ＩＦＮ－γは、ｎＮＯＳ－ＮＯシグナル伝達の活性化を介して黒色腫細胞のうちより悪性度の高い表現型を持続させ、新規なｎＮＯＳ阻害剤を用いるとＳＴＡＴ１／３の活性化及びＩＦＮ－γ処置によるＰＤ－Ｌ１発現の誘導を効果的に抑制するという我々の仮説と一致した。

ｎＮＯＳ阻害剤は、異種移植マウスモデルにおいてＩＦＮ－γ存在下の腫瘍増殖を抑制した。我々の研究では、新規に開発したｎＮＯＳ阻害剤は、インビトロ（表１）及びインビボ（図６）の両 者で強力な抗黒色腫活性を示した。表１に列挙したように、候補化合物全てのＩＣ_５０は１０μＭ未満であり、化学療法薬シスプラチンのＩＣ_５０（Ａ３７５細胞及びＳｋ－ｍｅｌ－２８細胞でそれぞれ４．２μＭ及び１４．３μＭ）と同等かずっと強力である。注目すべきことに、ｎＮＯＳ阻害剤による阻害は、初期のＷＭ３２１１初代細胞と比較して転移性黒色腫Ａ３７５細胞において優勢であり、ｎＮＯＳ／ＮＯシグナル伝達は開始相よりも黒色腫進行時に重要であるという我々の仮説を支持する。

表１．強力で選択性の高い新規なｎＮＯＳ阻害剤。使用したＮＯＳアイソザイムは全て大腸菌で過剰発現した組換え酵素だった。Ｋｉ値は、文献に既知の方法を用いて直接計算し、共同主任研究員であるＲ． Ｓｉｌｖｅｒｍａｎが発表した原稿に詳述している（１７，１８，６４，８５）。ヒト黒色腫におけるｎＮＯＳ阻害剤の細胞障害性効果をＭＴＴ比色分析法により分析した（８５）。ＩＣ_５０値は、少なくとも２個のヒト黒色腫細胞株の平均値である。

黒色腫異種移植腫瘍モデルを用いると、動物試験から、ＩＦＮ－γ処置（１０００ユニット／日）によりインビボでの腫瘍増殖が著しく刺激されることが分かった（図６Ａ）。図６Ｂに示すように、水溶性の強力なｎＮＯＳ阻害剤であるＭＡＣ－３－１９０で同時処置すると、試験の終わりまでに腫瘍体積の誘導が効果的に減少した（ＩＦＮ－γ処置と比較してｐ＜０．０５）。ＭＡＣ－３－１９０の有効用量は、毎日皮下注射で５ｍｇ／ｋｇの低濃度だった。

ｎＮＯＳ阻害剤ＨＨ０４４の腫瘍増殖におけるインビボ効果をさらに決定した。ＨＨ０４４で処置すると（２１日間１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）、みかけ上の全身毒性が観察されずに、腫瘍増殖を有意に減少させた（図６Ｃ）。図６Ｄに示されるように、試験の終わりにはＨＨ０４４で処置した腫瘍の重量は、肺の重量と体重に有意な変化を生じずに減少したことも分かった（コントロールの重量と比較してｐ＜０．０５）。異種移植腫瘍から得られた単細胞懸濁液を分析すると、コントロール群と比較してＨＨ０４４処置マウスにおいてＰＤ－Ｌ１発現レベルの有意な減少が見られた（図６Ｅ、ｐ＜０．０５）。

ＩＦＮ－γで処置するとＣＤ８陰性黒色腫腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１発現が上昇した。図７に示すように、コントロールＡ３７５異種移植腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１の陽性染色率は１０％を超え、ＩＦＮ－γで２１日処置した後は２０％を超えるまでに上昇した（毎日マウスあたり１０００ユニット腹腔内投与）。ＭＡＣ－３－１９０で同時処置するとＰＤ－Ｌ１陽性染色率は１５％を超えるまでに減少し、ｎＮＯＳ活性がインビボＰＤ－Ｌ１発現を制御する役割が示唆された（図７Ａ及び図７Ｂ）。２倍の拡大率では、ＣＤ８＋染色で陽性の領域（図７Ｄ）はまた、明らかにＰＤ－Ｌ１についても強く要請に染色されていた（図７Ｃ）。ＩＦＮ－γでの処置後は、ＣＤ８陰性組織でも明らかにＰＤ－Ｌ１陽性染色され、ＰＤ－Ｌ１の誘導は腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）の有無とは独立であり、ＩＦＮ－γが直接刺激できることが示唆される。この効果は、ＭＡＣ－３－１９０を同時投与する（５ｍｇ／ｋｇ／日）ことで効果的に遮断されるようである。

考察

我々の研究により、インビトロとインビボの両方でＩＦＮ－γで刺激された黒色腫進行におけるｎＮＯＳ媒介ＮＯシグナル伝達の決定的な役割が初めて実証された（図８）。新規な小分子阻害剤を使用してｎＮＯＳを阻害することにより、ＩＦＮ－γ処置により刺激された黒色腫転移能力及びＰＤ－Ｌ１の誘導を首尾よく阻害した。データからはまた、ｎＮＯＳ阻害剤で同時処置するとＩＦＮ－γ曝露後のＮＯ産生及びＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３シグナル伝達の活性化を効果的に軽減することが示された。インビボ研究では一貫して、黒色腫異種移植マウスモデルにおいてｎＮＯＳ阻害剤ＭＡＣ－３－１９０を使用するとＩＦＮ－γで刺激された黒色腫腫瘍増殖が効果的に抑制されることを実証した。我々の研究を蓄積された証拠と併せると、小分子阻害剤を使用してｎＮＯＳ媒介ＮＯシグナル伝達を標的とすることは、新規で効果的な黒色腫の治療方針とすることができることが示される。

ＩＦＮ－γとは異なり、ＩＦＮ－αは外科的切除後の再発リスクが高いとみなされる黒色腫患者に対する補助療法として臨床において広範に利用されている。ＩＦＮ－αは、免疫調節を含む様々なメカニズムを介して抗腫瘍効果を発揮し、宿主免疫をＴｈ２優位応答からＴｈ１応答に変え（２）、無病生存期間を改善させる（２０，２３）。遺伝子改変した黒色腫マウスモデルにおいては、ＰＤ－１の遮断と併せてＩＦＮ－αを標的活性化すると生存期間が著しく延長することが分かった（９）。我々の研究から、ＩＦＮ－αは４～６時間の治療でｎＮＯＳ発現量を検出不能なレベルへ減少させるが、発現量は２４時間で回復することが示される。治療期間を延長する場合、９６時間でのｎＮＯＳ発現レベルはコントロールと比較して減少する。このことから、治療が継続する間はＩＦＮ－αの阻害効果は持続するけれども、ｎＮＯＳ発現量を回復する適応メカニズムが機能できることが示唆される。

ＩＦＮ－γは、抗原特異的免疫が発達する前に自然応答の一部としてナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞で主に産生されるが、免疫応答にとって重大なものである（６８）。分泌されたＩＦＮ－γは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の機能を媒介し、Ｔｈ２細胞の発生を阻害し、ＩＦＮ－γ分泌量をさらに増加させるＴｈ１細胞の分化を促進する（７７）。健常者に対する研究から、ＵＶ照射に曝露する場合、血清ＩＦＮ－γレベルは著しく上昇し、数週間は上昇した状態を維持することが分かった（４７）。報告されたところによると、肝細胞がんにおいては、血清中のＩＦＮ－γレベルが低いことは、疾患再発の予測因子となる（４４）。しかしながら近年では、ますます多くの研究によりヒト黒色腫におけるＩＦＮ－γの異なる腫瘍化促進活性が明らかになった。

日焼けの場合においては、マクロファージがその領域に補充され、ＩＦＮ－γを分泌し、これによりがん細胞の微小環境を変えることができる（７０）。ＵＶＢ－ＨＧＦ／ＳＦ遺伝子導入マウスモデルにおいては、ＩＦＮ－γを遮断するとマクロファージによって増強される黒色腫増殖及び生存が効果的に消失する（９０）。マクロファージによるＩＦＮ－γ媒介ＮＯ産生は病原性微生物に対する防御免疫の中心的役割を果たすけれども（５２）、初期のマウス試験からＴ細胞に由来するＩＦＮ－γは、マクロファージの活性化サイクルを開始することによりＴ細胞の増殖を抑制するＮＯ産生を活性化する（４，８１）ことが分かった。他の研究でも矛盾なく、ＮＯの増加は免疫抑制と関連することが示され（７９）、少なくとも部分的にはＵＶ誘導局所免疫抑制に寄与することができ（６５）、その後細胞増殖の刺激及びがんで観察される浸潤能力を促進する（３１，８５）ことができる。

Ｌｏｌｌｉｎｉのグループにより、ＩＦＮ－γ処置を行うと、インビトロでは細胞増殖が９９％阻害されたにも関わらず、マウス黒色腫では抗増殖効果とは独立して肺転移数がおよそ２０倍増加して腫瘍転移数が著しく増加することが示された（４９）。我々の研究でもやはり、ＩＦＮ－γにより黒色腫細胞の浸潤及び転移能力が著しく増加することが観察された（図１）。近年の別の研究も矛盾なく、ＩＦＮ－γにより、主要な組織適合性複合体クラスＩＩに関連するインバリアント鎖として知られるＣＤ７４の発現量が増加することが分かり、これはリガンドと相互作用し、それにより黒色腫中のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路が活性化され、腫瘍生存及び増殖につながる（７４）。ヒト黒色腫におけるＩＦＮ－γのこの注目すべき腫瘍化促進活性はまた、第ＩＩＩ相臨床試験においても観察され、ＩＦＮ－γを毎日皮下注射する補助療法を行っても治療意図をもって切除した高リスクのＣＭ患者の無病生存期間又は全生存期間は改善されないことが分かり、臨床的に有益な応用に対する強力な根拠を構成する（５９）。しかしながら、ＩＦＮ－γ媒介腫瘍化促進効果の分子メカニズムは、まだ完全には理解されていない。他の腫瘍と比較して異なる黒色腫におけるＩＦＮ－γの応答から、ＩＦＮ－γは特有のシグナル経路を活性化し、疾患の進行を促進できることが示唆される。

我々の研究で示されるように、ＩＦＮ－γ処置により黒色腫初代細胞のｎＮＯＳ発現が優位に誘導されるが、同量のＩＦＮ－αではｎＮＯＳレベルが著しく減少することが分かった。検出された細胞内ＮＯレベルは矛盾することなく、ｎＮＯＳ発現レベルと相関し、ＩＦＮ－γ．曝露後は増加した。ｎＮＯＳ－ＮＯシグナル伝達の制御に対するＩＦＮ－α及びＩＦＮ－γの効果は、黒色腫患者における２種類のＩＦＮアイソタイプの異なる臨床応答を説明することに役立てることができ、ＩＦＮ－γで刺激された黒色腫進行の原因への新しい洞察も提供する。さらに、ヒト黒色腫のＰＤ－Ｌ１媒介免疫抑制におけるｎＮＯＳ－ＮＯシグナル伝達の新規メカニズムを明らかにした。ｎＮＯＳ阻害剤は、黒色腫細胞中のＩＦＮ－γによりＰＤ－Ｌ１の誘導を効果的に戻した。さらに、我々のインビボ研究から、ｎＮＯＳ阻害剤ＭＡＣ－３－１９０は、異種移植腫瘍中のＰＤ－Ｌ１発現を１０ｍｇ／ｋｇ／日の低用量であっても有意に低減することが分かった。ＩＦＮ－γで刺激された黒色腫進行及びＰＤ－Ｌ１媒介免疫抑制におけるｎＮＯＳ－ＮＯシグナル伝達の重要な役割から、ＩＦＮ－γ－ｎＮＯＳ－ＮＯ－ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達系を標的とすることによる黒色腫の補助療法のための特有の戦略がもたらされる（図８）。

アプリン／アピリミジンエンドヌクレアーゼ－１／酸化還元因子－１（ＡＰＥ／Ｒｅｆ－１）は、初めはＤＮＡエンドヌクレアーゼとして認識された多機能タンパク質であり、酸化還元依存的方式と酸化還元非依存的方式の両方で各種核転写因子活性を制御することが分かっている（８２）。以前の研究から、ヒト黒色腫においては、過剰に活性化されたＡＰＥ／Ｒｅｆ－１は酸化還元の不平衡に感受性があり、ＤＮＡ修復活性及び酸化還元制御活性を持つことにより疾患進行及び薬剤耐性の発生に重要な役割を果たすことが実証された（８２，８３）。ＲＯＳに加えて、ＮＯはＡＰＥ／Ｒｅｆ－１をフィードフォワード方式で活性化し、黒色腫細胞中のＡＰＥ／Ｒｅｆ－１が恒常的に過剰発現する（８７）。初期の膵がん研究において、研究者らはＳＴＡＴ３の転写活性がＡＰＥ／Ｒｅｆ－１の活性により直接制御され（１４）、そのことは誘導型複合体により生じることができることを実証した（６７）。

下流の標的として、転写因子ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３は、ＩＦＮ－γにより制御されることがよく知られている。ＩＦＮ－γがＪＡＫ１受容体及びＪＡＫ２受容体に結合すると、これらのＳＴＡＴはリン酸化により続いて活性化され、それによりＳＴＡＴ二量体は核内に移動し、ガンマ活性化シーケンス（ＧＡＳ）に結合する。活性化された遺伝子のパターンが異なるので、細胞内のシグナルを再度向けることができ、その後腫瘍発生などの生物学的変化が生じる（８）。ＳＴＡＴ１は概して、腫瘍抑制因子とみなされていたが（８）、過剰に活性化されたＳＴＡＴ１は腫瘍プロモーターとしても働くことができるという増えつつある証拠がある（１２）。黒色腫のＳＴＡＴ１をノックダウンすると、インビトロとインビボの両方で遊走能力及び浸潤能力が遅くなることが分かった（６９）。反対に、免疫細胞中のＳＴＡＴ１が活性化すると黒色腫に対する免疫応答を活性化する（７２）。

ＳＴＡＴ３は、黒色腫を含む各種型のがんにおいて広範に研究され、黒色腫の生存及び増殖におけるシグナル経路に寄与する各種遺伝子の制御に関連づけられた（８，４０）。ヒト腫瘍における活性化されたＳＴＡＴシグナル伝達は文書により十分に裏付けられ、近年では、研究者らは治療介入のためにＳＴＡＴ３シグナル伝達を標的とする分子的薬理学的戦略を開発しつつある。

我々の研究から、ＳＴＡＴ１／３の発現レベルと活性の両方がＩＦＮ－γ処置後に上昇し、ＭＡＣ－３－１９０及びＨＨ０４４での同時処置により消失することが分かった。我々のデータから、ｎＮＯＳ－ＮＯシグナル伝達はＩＦＮ－γで活性化されたＳＴＡＴ１／３シグナル伝達において重要な役割を果たせることが示唆される。ｎＮＯＳを標的とすると、黒色腫増殖及び転移に関与するＩＦＮ－γで活性化されたＳＴＡＴ１／３系を阻害することにより腫瘍進行を効果的に遮断することができる。

我々のＲＰＰＡの結果から、ＩＦＮ－γ処置を施すと黒色腫患者において予後不良及び疾患進行と関連するＰＤ－Ｌ１、ｃ－Ｍｙｃ、及びＨＩＦ１αなどの遺伝子の発現が誘導される（１５，４１，４５，４８）。注目すべきことに、我々のデータから、ＩＦＮ－γによるＰＤ－Ｌ１の誘導は用量依存的であり、直接制御メカニズムが関与できることを示す。近年では、蓄積された証拠からＩＦＮ－γががん細胞の微小環境を変えられることが示され、これによりがん細胞は免疫応答から回避することができる。この効果は部分的には、ＮＯによるＴリンパ球増殖の抑制が媒介することができる（５，３２，６６，８１）。

がん細胞の表面に発現したＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞上のＰＤ－１と結合し、その後Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の下流の抑制性シグナル伝達の引き金となる（２９，７８）。近年では、ますます多くの研究によりＰＤ－Ｌ１発現の増加を介して免疫抑制微小環境を育成する、黒色腫免疫におけるＩＦＮ－γの決定的な役割が立証されている（２８，６０）。ＵＣＬＡのＲｉｂａｓのグループでは、ＰＤ－Ｌ１発現の制御はＪＡＫ１／２－ＳＴＡＴ１／３－ＩＲＦ１系を経由することを見出した（２８）。ＰＤ－Ｌ１発現の主要な誘導因子として（２９，７４）、ＩＦＮ－γはＰＤ－Ｌ１^＋腫瘍と腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）の境界面で検出され、腫瘍ＰＤ－Ｌ１発現を駆動するＩＦＮ－γなどのサイトカインを分泌することによりＴＩＬが自身の抑制の引き金となることが示唆される（７６）。近年の研究から、老年の黒色腫患者は、若い患者と比較して細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に対する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の個体数が多いので抗ＰＤ－１免疫療法に対する奏効率が良好であることを見出した（４２）。このことは、抗増殖特性及び抗炎症特性を有するＴｒｅｇの個体数が多いとＣＤ８^＋ＣＴＬの活性と増殖を抑制できることを示唆する（７１）。ＩＦＮ－γはＣＴＬ細胞障害性機能と運動性を増加させるＣＴＬ化学誘引物質であることが分かっているが（１１）、黒色腫細胞はＰＤ－Ｌ１を増加させるようＩＦＮ－γシグナル経路を乗っ取る能力を獲得し、したがって免疫応答を回避できる。ＣＤ８及びＰＤ－Ｌ１で染色した異種移植腫瘍試料からは矛盾なく、黒色腫細胞ではＣＤ８＋－ＴＩＬが多く存在している領域のＰＤ－Ｌ１発現レベルが高いことが示された。ＣＤ８^＋染色で陰性の腫瘍領域におけるＰＤ－Ｌ１発現量はまた、ＩＦＮ－γ処置により上昇した。我々の研究からはやはり、ＭＡＣ－３－１９０で同時処理すると異種移植腫瘍中のＩＦＮ－γ誘導型ＰＤ－Ｌ１の発現量が減少することが分かった。我々の研究における制限は、ＣＤ８^＋ＣＴＬに対するＴｒｅｇの割合を決定するためのフォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）染色が欠如していることであるが、現在進行中である。

近年のメカニズム研究から、ヒト黒色腫細胞においては、ＰＤ－Ｌ１発現は主にＩＦＮ－γで活性化されたＪＡＫ１／ＪＡＫ２－ＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ２／ＳＴＡＴ３－ＩＲＦ１系により制御されることが分かった（２８）。同様のメカニズムはまた、頭頸部がん研究においても明らかにされた（１９）。このようなＩＦＮ－γに応答してのＰＤ－Ｌ１の適応誘導は、がん細胞が自身を免疫―細胞媒介死滅から保護しようと試みる新しいメカニズムを説明する（７８）。さらに新しい研究では、ＩＦＮが関連するＪＡＫシグナル伝達の機能損失変異によりＩＦＮ－γによって誘導されたＰＤ－Ｌ１に対する応答が欠如したＰＤ－Ｌ１遮断の獲得耐性を生じる（６，２８，９３）。したがって、ＰＤ－Ｌ１の誘導を制御するシグナル経路の詳細な理解は、がんの免疫療法の改良に役立てることができる。

がん患者の免疫応答を救出するために小分子を開発することは利点が多いので、がん研究者の中ではますます注意を引き付けている。生物製剤とは異なって、小分子は安定で、経口投与することができ、大きさが小さいので腫瘍微小環境に細胞内曝露することも期待できる。生産、調製、及び生物製剤による治療を受けた患者に観察される免疫に関連する重度の有害事象に関連するコストも低い（８０）。インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ１）は、トリプトファンをキヌレニンに酸化する原因となる酵素であり、黒色腫を含む多くの悪性腫瘍で過剰発現することが分かっている。ＩＤＯ１を遮断すると現位置でのＴ細胞の直接的な再活性化をもたらすＩＬ－２産生を効果的に回復する（７３）。ＩＤＯ１をがん免疫療法の新規な治療標的とみなして、研究者らは多くの非常に強力で選択性の高いＩＤＯ１阻害剤を開発した。それらの中では、ＩＤＯ１の経口投与可能な医薬品阻害剤である、エパカドスタットは、インビトロとインビボの両方で潜在的な免疫調節活性及び抗悪性腫瘍活性を示す（８９）。驚くべきことに、抗ＰＤ－１抗体であるキイトルーダをエパカドスタットと併用した転移性黒色腫についての注視した第ＩＩＩ相治験は、無憎悪生存期間の有意な改善がなく、失敗し、合剤が全生存期間を延長することもなさそうだった。

我々の研究から、ｎＮＯＳ阻害剤を用いるとインビトロとインビボの両方でＩＦＮ－γ誘導型ＰＤ－Ｌ１を効果的に阻害することが初めて実証された。これらの知見は、黒色腫患者のＰＤ－Ｌ１媒介免疫抑制を救出するためにｎＮＯＳを標的とする医薬品阻害剤を使用することに光を当てた。蓄積された証拠と併せて、我々の研究から、ＩＦＮ－γ曝露時のＰＤ－Ｌ１適応発現におけるｎＮＯＳ媒介ＮＯシグナル伝達の重要な役割が示され、ヒト黒色腫のｎＮＯＳ－ＮＯシグナル伝達を標的とすることにより有効なＰＤ－Ｌ１遮断療法を開発する新規戦略をもたらす。インビトロの知見と一致して、低用量のＭＡＣ－３－１９０（５ｍｇ／ｋｇ）を用いて治療するとＩＦＮ－γによる腫瘍増殖の誘導が効果的に減少した。注目すべきことに、新規に合成されたｎＮＯＳ阻害剤である、ＨＨ０４４単独でも有望なインビボ抗黒色腫活性が示された。

まとめると、我々の研究では、新規な作用メカニズムを仮定すれば、小分子阻害剤を使用してｎＮＯＳ－ＮＯシグナル伝達を標的とすることは、ＮＯの産生量を減少させることによりｎＮＯＳで刺激された黒色腫進行を抑制するだけでなく、ＩＦＮ－γで活性化されたＳＴＡＴ１／３及びＰＤ－Ｌ１も抑制し、黒色腫治療の有効な戦略とすることができることを実証した。これらの選択性が高く、生体利用可能で、強力な阻害剤を備えると、ｎＮＯＳ－ＮＯを標的とする我々の革新的な手法は、次の数年以内に臨床状況に移るときに大きな影響を与えることになる。

技術革新

我々の研究から、ＩＦＮ－γで刺激された黒色腫進行におけるインビトロとインビボの両方でのｎＮＯＳの重要な役割が実証され、黒色腫治療を改良するための革新的手法としてｎＮＯＳを標的とする医薬品阻害剤を使用することに光が当たった。我々の研究はまた、ＩＦＮ－γ誘導型ＰＤ－Ｌ１の制御におけるｎＮＯＳの重要な役割も実証し、これによりｎＮＯＳを標的とすることは合成小分子を使用する黒色腫患者の効果的な免疫療法を開発する新規戦略として役立つことが示される。

材料と方法

細胞株、化学物質及び試薬。ヒト黒色腫細胞株Ａ３７５、ＷＭ１１５、及びＳｋ－ｍｅｌ－２８は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得られ、ＷＭ３２１１はＲｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（Ｌｉｍｅｒｉｃｋ，ＰＡ）から得られた。細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；＃２６１４００７９；Ｇｉｂｃｏ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を加えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；＃１１９９５０７３；Ｇｉｂｃｏ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）（Ａ３７５）あるいはイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）（ＷＭ１１５，Ｓｋ－ｍｅｌ－２８）、又は２％ＦＢＳを加えた腫瘍専門培地（ＷＭ３２１１）で培養した。ＩＦＮ－γは、インビトロジェン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入し、ＩＦＮ－αは、ＰＢＬ Ａｓｓａｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に発注した。

抗体。マウスモノクローナル抗ヒトＮＯＳ１、ＳＴＡＴ３、ｐ－ＳＴＡＴ３、ラミンＡ／Ｃ（ｓｃ－１７８２５；ｓｃ－８０１９；ｓｃ－８０５９；ｓｃ－３９８９２７；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）及びマウスモノクローナル抗ヒトβ－アクチン（８Ｈ１０Ｄ１０；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）抗体を一次抗体として使用し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウス（１：５，０００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を二次抗体として使用した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８に結合されたウサギモノクローナルＰＤ－Ｌ１（２５０４８，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）をフローサイトメトリー及び免疫蛍光法による細胞外発現解析用に使用した。

タンパク質単離とウエスタンブロット法。他に断らない限り全ての試料を４℃に維持した。１％プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩＣ）を含む１倍溶解バッファー（９８０３Ｓ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）中で細胞懸濁液を１５分間インキュベートし、次いで１５秒間オンで１５秒間オフの１分間４０％の振幅で超音波処理により溶解することにより全細胞溶解物を集めた。４℃、１４，０００ｇ^－１で１０分間遠心分離を使用してタンパク質試料を単離した。

核及び細胞質のタンパク質抽出法は、他で説明する（８４）。細胞を遠心分離により集めて１％ＰＩＣを含むバッファーＡ（１０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．９，１０ｍＭＫＣｌ，０．１５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．５ｍＭＤＴＴ，０．２ｍＭＰＭＳＦ）に再懸濁し、１０分間膨張させた。１０％ＮＰ－４０を添加し、ボルテックスして細胞を溶解した。試料を１４，０００ｇ^－１で３０秒間遠心沈殿して細胞質画分を分離した。ペレット状の核を１％ＰＩＣを含むバッファーＣ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ，２０％グリセロール，０．４２ＭＮａＣｌ，０．１５ｍＭＭｇＣｌ_２，０．２ｍＭＥＤＴＡ，０．５ｍＭＤＴＴ、及び０．２ｍＭＰＭＳＦ）中に再懸濁し、インキュベートし、次いで１４，０００ｇ^－１で３０分間遠心沈殿して細胞片を除去した。次いでバッファーＤ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ，２０％グリセロール，５０ｍＭＫＣｌ，０．５ｍＭＥＤＴＡ，０．５ｍＭＤＴＴ、及び０．２ｍＭＰＭＳＦ）を加えて核試料を希釈した。

Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙにより検出された、等量のタンパク質を７．５％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルにロードし、分解させ、次いでイモビロン－Ｐ^ＳＱポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ＩＳＥＱ０００１０；Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にトランスファーした。製造業者の推奨のとおり、膜を１０％ノンファットミルク（ＮＯＳ１，ＳＴＡＴ１／２，アクチン、ラミンＡ／Ｃ）又は５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；ＳＨ３０５７４０２；Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）（ｐ－ＳＴＡＴ１／３）を用いてブロックし、次いで室温で１時間又は４℃で一晩、一次抗体でインキュベートし、その後室温で１時間、二次抗体でインキュベートした。各抗体インキュベーション後にＴＢＳ－Ｔでブロットを広範に洗浄した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ西洋ワサビペルオキシダーゼ化学発光試薬（１８５９６７４；１８５９６７５；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して標識バンドを検出し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ^＋システムを使用して画像を撮影し、解析した。

逆相タンパクアレイ。培養皿に蒔いた細胞を２５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＩＦＮ－α又はＩＦＮ－γで７２時間処理した。１倍ＰＢＳで洗浄後、溶解バッファー（１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，５０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭＮａＣｌ，１．５ｍＭＭｇＣｌ_２，１ｍＭＥＧＴＡ，１００ｍＭＮａＦ，１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭＮａ_３ＶＯ_４，１０％グリセロール及び１％ＰＩＣ）をプレートに加え、その後氷上で２０分間時々振動を加えながらインキュベートした。次いで削り取りにより試料を集め、４℃、１４，０００ｇ^－１で１０分間遠心沈殿した。ブラッドフォード法によりタンパク質濃度を定量化し、溶解バッファーで１．５μｇ／μＬに調整した。細胞溶解物を次いで４×ＳＤＳサンプルバッファー（４０％グリセロール，８％ＳＤＳ，０．２５ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ６．８、１０％ＢＭＥ含有）と混合した。極微量の連続希釈タンパク質試料をニトロセルロースで被覆したスライド上に少量載せ、検証済みの一次抗体とビオチン結合二次抗体で探索した。ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社で触媒されたシステム（Ｄａｋｏ）を用いて信号を増幅し、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）比色反応により可視化した。Ｓｕｐｅｒｃｕｒｖｅ Ｆｉｔｔｉｎｇ及びタンパク質ローディング用に正規化したタンパク質発現により希釈曲線をフィットさせた。

フローサイトメトリーにより検出されたＰＤ－Ｌ１発現レベル。培養皿に蒔いた細胞を３μＭのｎＮＯＳ阻害剤がある場合とない場合においてＩＦＮ－α又はＩＦＮ－γで７２時間処理した。処理済みの細胞を遠心分離により集め、３７℃で１０分間４％ホルムアルデヒドの１×ＰＢＳ溶液を用いて固定した。次いでこの細胞をインキュベーションバッファー（０．５％ＢＳＡの１×ＰＢＳ溶液）で洗浄し、その後室温で２時間暗闇の中でＰＤ－Ｌ１抗体でインキュベートした（１：１００希釈）。解析用に平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定し、記録した。

免疫蛍光法により検出されたＰＤ－Ｌ１発現レベル。Ａ３７５細胞をカバーガラス上に蒔き、３μＭのｎＮＯＳ阻害剤存在下又は非存在下で２５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＩＦＮ－α又はＩＦＮ－γで７２時間インキュベートした。処理後、カバーガラス上の細胞を室温で１５分間４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、その後氷冷１００％メタノールで－２０℃で１０分間インキュベートした。次いで試料をブロッキングバッファー（１×ＰＢＳ，５％ウマ血清、０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）中で６０分間インキュベートし、次いで希釈バッファー（１×ＰＢＳ，１％ＢＳＡ，０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）の１：５０ＰＤ－Ｌ１抗体希釈中で４℃で一晩インキュベートした。染色試料をＰＢＳですすぎ、次いでＤＡＰＩ蛍光染色試薬により暗闇の中で１時間硬化させた。ＢＺ－Ｘ７００顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ，Ｉｔａｓｃａ，ＩＬ）を使用してスライドを可視化し、記録した。

細胞内一酸化窒素レベルの検出。９６穴プレートで培養した細胞を１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＩＦＮ－α又はＩＦＮ－γで４８時間処理した。インキュベーション時間が終了すると、培地を除去し、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に交換した。１μＭの４－アミノ－５－メチルアミノ－２’，７’－ジフルオロフルオレセイン（ＤＡＦ－ＦＭ）プローブを各条件に加え、励起波長及び発光波長がそれぞれ４８５ｎｍ及び５３８ｎｍである蛍光マイクロプレートリーダーを用いてＤＡＦ－ＦＭにより生じる蛍光レベルを検出した。

ｎＮＯＳ ｓｈＲＮＡノックダウン。コントロールＧＩＰＺと共にレンチウイルスｎＮＯＳ ｓｈＲＮＡｍｉｒ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）を使用して、ｎＮＯＳのノックダウンを達成した。このｓｈＲＮＡを、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて細胞内に導入した。７日間以上ピューロマイシンをインキュベーションすることにより、ｎＮＯＳが欠損した安定発現細胞を選択し、ｎＮＯＳ発現のノックダウンは、ウエスタンブロットにより確認した。

インビボ異種移植黒色腫。動物処置法は全てチャップマン大学の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）により認可された。ヌードマウス（Ｎｕ／Ｎｕ）をチャールスリバー（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入し、チャップマン大学の飼育器に無菌条件で収容し、養った。ヒトＡ３７５転移性黒色腫細胞を冷却したマトリゲル（３５４２４８；Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に懸濁し、腫瘍が定着するようマウスの側腹部に皮下注射した（マウスあたり１×１０^６細胞）。このマウスを、ＭＡＣ－３－１９０（５ｍｇ／ｋｇ／日）がある場合とない場合において普通の生理食塩水又はＩＦＮ－γ（１０００ユニット／マウス）の腹腔内投与で２１日間処置した。腫瘍増殖を週に３回監視し、デジタルノギスを用いて測定した。腫瘍増殖は、腫瘍体積（ｍｍ^３）＝［長さ×（幅^２）］／２として算出した。２１日後にマウスを殺し、腫瘍異種移植片及び肺を除去し、秤量した。腫瘍異種移植片のうち半分は１０％ホルマリン溶液中に固定し、他の半分をフローサイトメトリー用に処理した。固定した試料を次いで、薄片作成用にパラフィンワックスにさらに包埋し、ＰＤ－Ｌ１（７９０－４９０５；Ｖｅｎｔａｎａ，Ｏｒｏ Ｖａｌｌｅｙ，ＡＺ）及びＣＤ８^＋Ｔ細胞（１０８Ｍ－９８；Ｃｅｌｌ Ｍａｒｑｕｅ，Ｒｏｃｋｌｉｎ，ＣＡ）の発現を可視化するためにベンタナベンチマークＵＬＴＲＡマシンを使用して特異抗体で染色した。ＰＤ－Ｌ１が染色された陽性細胞の割合を、ＩｍａｇｅＪ（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を使用して計数した。フローサイトメトリー用の異種移植腫瘍試料を、軟部腫瘍用の標準プロトコルにしたがってＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（１３０－０９５－９２９； Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）のｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを使用して単細胞懸濁液に解離した。単細胞懸濁液は、次いで固定し、上述したようにＰＤ－Ｌ１抗体で染色した。

統計解析。実験は全て、少なくとも２種類の異なるヒト黒色腫細胞株で実行した。示したデータは、少なくとも２回の独立した実験の代表値の平均±ＳＤである。統計解析は、スチューデントｔ検定を用いることにより実行し、ｐ値が０．０５のものを統計的に有意であるとみなした。

略語

参照

１． ２０１７． Ｋｅｙ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｓｋｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ． ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｍｅｌａｎｏｍａ－ｓｋｉｎ－ｃａｎｃｅｒ／ａｂｏｕｔ／ｋｅｙ－ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．ｈｔｍｌ ２０１７ Ａｐｒｉｌ １７．

２． Ａｃｈｋａｒ Ｔ， Ｔａｒｈｉｎｉ ＡＡ． Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ １０： ８８， ２０１７．

３． Ａｈｍｅｄ Ｂ， Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｏｏｒｄ ＪＪ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｉｓｏｆｏｒｍ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ （ｎＮＯＳ） ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ， ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｎＮＯＳ， ｉｎ ｐｉｇｍｅｎｔ ｃｅｌｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｋｉｎ． Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １４１： １２－９， １９９９．

４． Ａｌｂｉｎａ ＪＥ， Ａｂａｔｅ ＪＡ， Ｈｅｎｒｙ ＷＬ． Ｎｉｔｒｉｃ－Ｏｘｉｄｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｍｕｒｉｎｅ Ｒｅｓｉｄｅｎｔ Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ－Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｔｏ Ｓｕｐｐｒｅｓｓ Ｍｉｔｏｇｅｎ－Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ － Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｉｆｎ－Ｇａｍｍａ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４７： １４４－１４８， １９９１．

５． Ａｌｂｉｎａ ＪＥ， Ａｂａｔｅ ＪＡ， Ｈｅｎｒｙ ＷＬ， Ｊｒ． Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｍｕｒｉｎｅ ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｔｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｍｉｔｏｇｅｎ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７： １４４－８， １９９１．

６． Ａｌｍｕｒｉｅｋｈｉ Ｍ， Ｓｈｉｎｔａｎｉ Ｔ， Ｆａｈｉｍｉｎｉｙａ Ｓ， Ｆｕｊｉｋａｗａ Ａ， Ｋｕｂｏｙａｍａ Ｋ， Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｙ， Ｎａｗａｚ Ｚ， Ｎａｄａｆ Ｊ， Ｋａｍｅｌ Ｈ， Ｋｉｔａｍ ＡＫ， Ｓａｍｉｈａ Ｚ， Ｍａｈｍｏｕｄ Ｌ， Ｂｅｎ－Ｏｍｒａｎ Ｔ， Ｍａｊｅｗｓｋｉ Ｊ， Ｎｏｄａ Ｍ． Ｌｏｓｓ－ｏｆ－Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ＡＰＣ２ Ｃａｕｓｅｓ Ｓｏｔｏｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｆｅａｔｕｒｅｓ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ， ２０１５．

７． Ａｕｄｒｉｔｏ Ｖ， Ｓｅｒｒａ Ｓ， Ｓｔｉｎｇｉ Ａ， Ｏｒｓｏ Ｆ， Ｇａｕｄｉｎｏ Ｆ， Ｂｏｌｏｇｎａ Ｃ， Ｎｅｒｉ Ｆ， Ｇａｒａｆｆｏ Ｇ， Ｎａｓｓｉｎｉ Ｒ， Ｂａｒｏｎｉ Ｇ， Ｒｕｌｌｉ Ｅ， Ｍａｓｓｉ Ｄ， Ｏｌｉｖｉｅｒｏ Ｓ， Ｐｉｖａ Ｒ， Ｔａｖｅｒｎａ Ｄ， Ｍａｎｄａｌａ Ｍ， Ｄｅａｇｌｉｏ Ｓ． ＰＤ－Ｌ１ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｓｓ ａｎｄ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｉＲ－１７－５ｐ． Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ８： １５８９４－１５９１１， ２０１７．

８． Ａｖａｌｌｅ Ｌ， Ｐｅｎｓａ Ｓ， Ｒｅｇｉｓ Ｇ， Ｎｏｖｅｌｌｉ Ｆ， Ｐｏｌｉ Ｖ． ＳＴＡＴ１ ａｎｄ ＳＴＡＴ３ ｉｎ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ： Ａ ｍａｔｔｅｒ ｏｆ ｂａｌａｎｃｅ． ＪＡＫＳＴＡＴ １： ６５－７２， ２０１２．

９． Ｂａｌｄ Ｔ， Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ Ｊ， Ｌｏｐｅｚ－Ｒａｍｏｓ Ｄ， Ｒｅｎｎ Ｍ， Ｇｌｏｄｄｅ Ｎ， Ｊａｎｓｅｎ Ｐ， Ｇａｆｆａｌ Ｅ， Ｓｔｅｉｔｚ Ｊ， Ｔｏｌｂａ Ｒ， Ｋａｌｉｎｋｅ Ｕ， Ｌｉｍｍｅｒ Ａ， Ｊｏｎｓｓｏｎ Ｇ， Ｈｏｌｚｅｌ Ｍ， Ｔｕｔｉｎｇ Ｔ． Ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ－ｐｏｏｒ ｍｅｌａｎｏｍａｓ ｂｅｎｅｆｉｔ ｆｒｏｍ ＰＤ－１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ａｆｔｅｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｙｐｅ Ｉ ＩＦＮ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ４： ６７４－８７， ２０１４．

１０． Ｂａｕｅｒ Ｊ， Ｂｕｔｔｎｅｒ Ｐ， Ｍｕｒａｌｉ Ｒ， Ｏｋａｍｏｔｏ Ｉ， Ｋｏｌａｉｔｉｓ ＮＡ， Ｌａｎｄｉ ＭＴ， Ｓｃｏｌｙｅｒ ＲＡ， Ｂａｓｔｉａｎ ＢＣ． ＢＲＡＦ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｒｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｇｅ， ａｎａｔｏｍｉｃ ｓｉｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ， ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｓｏｌａｒ ｅｌａｓｔｏｓｉｓ ａｔ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｓｉｔｅ． Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ ２４： ３４５－５１， ２０１１．

１１． Ｂｈａｔ Ｐ， Ｌｅｇｇａｔｔ Ｇ， Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ Ｎ， Ｆｒａｚｅｒ ＩＨ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅｉｒ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ ８： ｅ２８３６， ２０１７．

１２． Ｂｕｅｔｔｎｅｒ Ｒ， Ｍｏｒａ ＬＢ， Ｊｏｖｅ Ｒ． Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＳＴＡＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｓ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｎｏｖｅｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８： ９４５－５４， ２００２．

１３． Ｂｙｒｎｅ ＥＨ， Ｆｉｓｈｅｒ ＤＥ． Ｉｍｍｕｎｅ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ． Ｃａｎｃｅｒ １２３： ２１４３－２１５３， ２０１７．

１４． Ｃａｒｄｏｓｏ ＡＡ， Ｊｉａｎｇ Ｙ， Ｌｕｏ Ｍ， Ｒｅｅｄ ＡＭ， Ｓｈａｈｄａ Ｓ， Ｈｅ Ｙ， Ｍａｉｔｒａ Ａ， Ｋｅｌｌｅｙ ＭＲ， Ｆｉｓｈｅｌ ＭＬ． ＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＳＴＡＴ３ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１－ＳＴＡＴ３ ｄｕａｌ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７： ｅ４７４６２， ２０１２．

１５． Ｃｈｅｎ Ｙ， Ｚｈａｎｇ Ｚ， Ｌｕｏ Ｃ， Ｃｈｅｎ Ｚ， Ｚｈｏｕ Ｊ． ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１８ｂ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ ｖｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＦ－１ａｌｐｈａ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ． Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ ３６： ４７１－９， ２０１６．

１６． Ｃｈｅｎｇ Ｌ， Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｌｔｒａｎ Ａ， Ｍａｓｓａｒｉ Ｆ， ＭａｃＬｅｎｎａｎ ＧＴ， Ｍｏｎｔｉｒｏｎｉ Ｒ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ＢＲＡＦ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｉｎｆｏｒｍ ｍｅｌａｎｏｍａ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ： ａ ｍｏｖｅ ｔｏｗａｒｄ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ． Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ ３１： ２４－３８， ２０１８．

１７． Ｃｉｎｅｌｌｉ ＭＡ， Ｌｉ Ｈ， Ｃｈｒｅｉｆｉ Ｇ， Ｐｏｕｌｏｓ ＴＬ， Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ＲＢ． Ｎｉｔｒｉｌｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｏｌｅ： Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ａ Ｓｍａｌｌ Ａｕｘｉｌｉａｒｙ Ｐｏｃｋｅｔ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ２－Ａｍｉｎｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ６０： ３９５８－３９７８， ２０１７．

１８． Ｃｉｎｅｌｌｉ ＭＡ， Ｌｉ Ｈ， Ｐｅｎｓａ ＡＶ， Ｋａｎｇ Ｓ， Ｒｏｍａｎ ＬＪ， Ｍａｒｔａｓｅｋ Ｐ， Ｐｏｕｌｏｓ ＴＬ， Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ＲＢ． Ｐｈｅｎｙｌ Ｅｔｈｅｒ－ ａｎｄ Ａｎｉｌｉｎｅ－Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２－Ａｍｉｎｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ． Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５８： ８６９４－７１２， ２０１５．

１９． Ｃｏｎｃｈａ－Ｂｅｎａｖｅｎｔｅ Ｆ， Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ＲＭ， Ｔｒｉｖｅｄｉ Ｓ， Ｌｅｉ Ｙ， Ｃｈａｎｄｒａｎ Ｕ， Ｓｅｅｔｈａｌａ ＲＲ， Ｆｒｅｅｍａｎ ＧＪ， Ｆｅｒｒｉｓ ＲＬ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ－Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｎｄ －Ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ Ｐａｔｈｗａｙｓ Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ ＥＧＦＲ ａｎｄ ＩＦＮｇａｍｍａ Ｔｈａｔ Ｉｎｄｕｃｅ ＰＤ－Ｌ１ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｈｅａｄ ａｎｄ Ｎｅｃｋ Ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７６： １０３１－４３， ２０１６．

２０． Ｃｒｅａｇａｎ ＥＴ， Ａｈｍａｎｎ ＤＬ， Ｌｏｎｇ ＨＪ， Ｆｒｙｔａｋ Ｓ， Ｓｈｅｒｗｉｎ ＳＡ， Ｃｈａｎｇ ＭＮ． Ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｐ ７１： ８４３－４， １９８７．

２１． Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ Ｂ， Ｌｏｐｅｓ ＪＭ， Ｓｏａｒｅｓ Ｐ， Ｐｏｐｕｌｏ Ｈ． Ｍｅｌａｎｏｍａ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｒｅｖｉｅｗ． Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｓ Ｔｈｅｒ ７： ３５－４９， ２０１８．

２２． Ｄｕｐｉｎ Ｅ， Ｌｅ Ｄｏｕａｒｉｎ ＮＭ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２： ３０１６－２３， ２００３．

２３． Ｅｒｎｓｔｏｆｆ ＭＳ， Ｔｒａｕｔｍａｎ Ｔ， Ｄａｖｉｓ ＣＡ， Ｒｅｉｃｈ ＳＤ， Ｗｉｔｍａｎ Ｐ， Ｂａｌｓｅｒ Ｊ， Ｒｕｄｎｉｃｋ Ｓ， Ｋｉｒｋｗｏｏｄ ＪＭ． Ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｖｅｒｓｕｓ ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ５： １８０４－１０， １９８７．

２４． Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ Ｍ， Ｇｉｏｖａｒｅｌｌｉ Ｍ， Ｍｏｄｅｓｔｉ Ａ， Ｍｕｓｉａｎｉ Ｐ， Ｍｏｄｉｃａ Ａ， Ｖｅｎｄｉｔｔｉ Ｍ， Ｐｅｒｅｔｔｉ Ｅ， Ｌｏｌｌｉｎｉ ＰＬ， Ｎａｎｎｉ Ｐ， Ｆｏｒｎｉ Ｇ， ｅｔ ａｌ． ＩＦＮ－ａｌｐｈａ １ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｔｏ ａ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｕｒｉｎｅ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ （ＴＳ／Ａ） ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ＴＳ／Ａ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５３： ４６０４－１５， １９９４．

２５． Ｆｅｒｒｅｒ Ｐ， Ａｓｅｎｓｉ Ｍ， Ｐｒｉｅｇｏ Ｓ， Ｂｅｎｌｌｏｃｈ Ｍ， Ｍｅｎａ Ｓ， Ｏｒｔｅｇａ Ａ， Ｏｂｒａｄｏｒ Ｅ， Ｅｓｔｅｖｅ ＪＭ， Ｅｓｔｒｅｌａ ＪＭ． Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｎａｔｕｒａｌ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ－ｉｎｄｕｃｅｄ Ｂｃｌ－２ ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｂ１６ ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２： ２８８０－９０， ２００７．

２６． Ｆｏｔｉｏｕ Ｓ， Ｆｏｔｉｏｕ Ｄ， Ｄｅｌｉｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｓ Ｇ． Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍｅ－ｉｒｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ （ＮＯ） ａｎｄ ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ （ＯＮＯＯ－） ａｆｔｅｒ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ ｒａｔ ｓｋｉｎ． Ｉｎ Ｖｉｖｏ ２３： ２８１－６， ２００９

２７． Ｇａｒｂｅ Ｃ， Ｅｉｇｅｎｔｌｅｒ ＴＫ， Ｋｅｉｌｈｏｌｚ Ｕ， Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ Ａ， Ｋｉｒｋｗｏｏｄ ＪＭ． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ． Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ １６： ５－２４， ２０１１．

２８． Ｇａｒｃｉａ－Ｄｉａｚ Ａ， Ｓｈｉｎ ＤＳ， Ｍｏｒｅｎｏ ＢＨ， Ｓａｃｏ Ｊ， Ｅｓｃｕｉｎ－Ｏｒｄｉｎａｓ Ｈ， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＧＡ， Ｚａｒｅｔｓｋｙ ＪＭ， Ｓｕｎ Ｌ， Ｈｕｇｏ Ｗ， Ｗａｎｇ Ｘ， Ｐａｒｉｓｉ Ｇ， Ｓａｕｓ ＣＰ， Ｔｏｒｒｅｊｏｎ ＤＹ， Ｇｒａｅｂｅｒ ＴＧ， Ｃｏｍｉｎ－Ａｎｄｕｉｘ Ｂ， Ｈｕ－Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ Ｓ， Ｄａｍｏｉｓｅａｕｘ Ｒ， Ｌｏ ＲＳ， Ｒｉｂａｓ Ａ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙｓ Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ＰＤ－Ｌ１ ａｎｄ ＰＤ－Ｌ２ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １９： １１８９－１２０１， ２０１７．

２９． Ｇｏｗｒｉｓｈａｎｋａｒ Ｋ， Ｇｕｎａｔｉｌａｋｅ Ｄ， Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ＳＪ， Ｔｉｆｆｅｎ Ｊ， Ｒｉｚｏｓ Ｈ， Ｈｅｒｓｅｙ Ｐ． Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｂｕｔ ｎｏｔ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＤ－Ｌ１ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０： ｅ０１２３４１０， ２０１５．

３０． Ｇｏｗｒｉｓｈａｎｋａｒ Ｋ， Ｇｕｎａｔｉｌａｋｅ Ｄ， Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ＳＪ， Ｔｉｆｆｅｎ Ｊ， Ｒｉｚｏｓ Ｈ， Ｈｅｒｓｅｙ Ｐ． Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｂｕｔ Ｎｏｔ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＤ－Ｌ１ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｃｅｌｌｓ Ｉｓ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ－？Ｂ． Ｉｎ： ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃｈｅｒｉｙａｔｈ Ｖ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ ＵＳＡ； ２０１５．

３１． Ｈａｌｌｉｄａｙ ＧＭ． Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ， ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｏｔｏｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＵＶＲ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｄａｍａｇｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｐｈｏｔｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ５７１： １０７－２０， ２００５．

３２． Ｈａｌｌｉｄａｙ ＧＭ， Ｂｙｒｎｅ ＳＮ， Ｋｕｃｈｅｌ ＪＭ， Ｐｏｏｎ ＴＳ， Ｂａｒｎｅｔｓｏｎ ＲＳ． Ｔｈｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｒａｄｉａｔｉｏｎ： ＵＶＡ， ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ａｎｄ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ． Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ Ｓｃｉ ３： ７３６－４０， ２００４．

３３． Ｈａｎｎａ ＳＣ， Ｋｒｉｓｈｎａｎ Ｂ， Ｂａｉｌｅｙ ＳＴ， Ｍｏｓｃｈｏｓ ＳＪ， Ｋｕａｎ ＰＦ， Ｓｈｉｍａｍｕｒａ Ｔ， Ｏｓｂｏｒｎｅ ＬＤ， Ｓｉｅｇｅｌ ＭＢ， Ｄｕｎｃａｎ ＬＭ， Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ＥＴ， Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ Ｒ， Ｍｉｌｌｅｒ ＣＲ， Ｓｉｍｏｎ ＭＣ， Ｗｏｎｇ ＫＫ， Ｋｉｍ ＷＹ． ＨＩＦ１ ａｌｐｈａ ａｎｄ ＨＩＦ２ ａｌｐｈａ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅ ＳＲＣ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｍｅｌａｎｏｍａ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １２３： ２０７８－２０９３， ２０１３．

３４． Ｈｏｌｌｙ ＥＡ， Ａｓｔｏｎ ＤＡ， Ｃｒｅｓｓ ＲＤ， Ａｈｎ ＤＫ， Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ ＪＪ． Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｎ ｗｏｍｅｎ． Ｉ． Ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｓｕｎｌｉｇｈｔ， ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｔａｎ， ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｌｉｇｈｔ． Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ １４１： ９２３－３３， １９９５．

３５． Ｊａｉｓｗａｌ Ｍ， ＬａＲｕｓｓｏ ＮＦ， Ｂｕｒｇａｒｔ ＬＪ， Ｇｏｒｅｓ ＧＪ． Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０： １８４－９０， ２０００．

３６． Ｊｏｓｈｉ Ｍ， Ｓｔｒａｎｄｈｏｙ Ｊ， Ｗｈｉｔｅ ＷＬ． Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ： ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ ６： １２１－６， １９９６．

３７． Ｊｕｎｅｊａ ＶＲ， ＭｃＧｕｉｒｅ ＫＡ， Ｍａｎｇｕｓｏ ＲＴ， ＬａＦｌｅｕｒ ＭＷ， Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｎ， Ｈａｉｎｉｎｇ ＷＮ， Ｆｒｅｅｍａｎ ＧＪ， Ｓｈａｒｐｅ ＡＨ． ＰＤ－Ｌ１ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｅｖａｓｉｏｎ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ， ２０１７．

３８． Ｋａｋｕｔａ Ｓ， Ｔａｇａｗａ Ｙ， Ｓｈｉｂａｔａ Ｓ， Ｎａｎｎｏ Ｍ， Ｉｗａｋｕｒａ Ｙ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ１６ ｍｅｌａｎｏｍａ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｂｙ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ ｈｏｓｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０５： ９２－１００， ２００２．

３９． Ｋａｕｎｉｔｚ ＧＪ， Ｃｏｔｔｒｅｌｌ ＴＲ， Ｌｉｌｏ Ｍ， Ｍｕｔｈａｐｐａｎ Ｖ， Ｅｓａｎｄｒｉｏ Ｊ， Ｂｅｒｒｙ Ｓ， Ｘｕ Ｈ， Ｏｇｕｒｔｓｏｖａ Ａ， Ａｎｄｅｒｓ ＲＡ， Ｆｉｓｃｈｅｒ ＡＨ， Ｋｒａｆｔ Ｓ， Ｇｅｒｓｔｅｎｂｌｉｔｈ ＭＲ， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＣＬ， Ｈｏｎｄａ Ｋ， Ｃｕｄａ ＪＤ， Ｅｂｅｒｈａｒｔ ＣＧ， Ｈａｎｄａ ＪＴ， Ｌｉｐｓｏｎ ＥＪ， Ｔａｕｂｅ ＪＭ． Ｍｅｌａｎｏｍａ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＰＤ－Ｌ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ． Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ９７： １０６３－１０７１， ２０１７．

４０． Ｋｏｒｔｙｌｅｗｓｋｉ Ｍ， Ｊｏｖｅ Ｒ， Ｙｕ Ｈ． Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＳＴＡＴ３ ａｆｆｅｃｔｓ ｍｅｌａｎｏｍａ ｏｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｒｏｎｔｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ ２４： ３１５－２７， ２００５．

４１． Ｋｒａｅｈｎ ＧＭ， Ｕｔｉｋａｌ Ｊ， Ｕｄａｒｔ Ｍ， Ｇｒｅｕｌｉｃｈ ＫＭ， Ｂｅｚｏｌｄ Ｇ， Ｋａｓｋｅｌ Ｐ， Ｌｅｉｔｅｒ Ｕ， Ｐｅｔｅｒ ＲＵ． Ｅｘｔｒａ ｃ－ｍｙｃ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｃｏｐｉｅｓ ｉｎ ｈｉｇｈ ｒｉｓｋ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｄ ｍｅｌａｎｏｍａ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ． Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８４： ７２－９， ２００１．

４２． Ｋｕｇｅｌ ＣＨ， ３ｒｄ， Ｄｏｕｇｌａｓｓ ＳＭ， Ｗｅｂｓｔｅｒ ＭＲ， Ｋａｕｒ Ａ， Ｌｉｕ Ｑ， Ｙｉｎ Ｘ， Ｗｅｉｓｓ ＳＡ， Ｄａｒｖｉｓｈｉａｎ Ｆ， Ａｌ－Ｒｏｈｉｌ ＲＮ， Ｎｄｏｙｅ Ａ， Ｂｅｈｅｒａ Ｒ， Ａｌｉｃｅａ ＧＭ， Ｅｃｋｅｒ ＢＬ， Ｆａｎｅ Ｍ， Ａｌｌｅｇｒｅｚｚａ ＭＪ， Ｓｖｏｒｏｎｏｓ Ｎ， Ｋｕｍａｒ Ｖ， Ｗａｎｇ ＤＹ， Ｓｏｍａｓｕｎｄａｒａｍ Ｒ， Ｈｕ－Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ Ｓ， Ｏｚｇｕｎ Ａ， Ｈｅｒｌｙｎ Ｍ， Ｃｏｎｅｊｏ－Ｇａｒｃｉａ ＪＲ， Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ Ｄ， Ｓｔｏｎｅ ＥＬ， Ｎｏｗｉｃｋｉ ＴＳ， Ｓｏｓｍａｎ Ｊ， Ｒａｉ Ｒ， Ｃａｒｌｉｎｏ ＭＳ， Ｌｏｎｇ ＧＶ， Ｍａｒａｉｓ Ｒ， Ｒｉｂａｓ Ａ， Ｅｒｏｇｌｕ Ｚ， Ｄａｖｉｅｓ ＭＡ， Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ Ｂ， Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆ Ｄ， Ｘｕ Ｗ， Ａｍａｒａｖａｄｉ ＲＫ， Ｍｅｎｚｉｅｓ ＡＭ， ＭｃＱｕａｄｅ ＪＬ， Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＢ， Ｏｓｍａｎ Ｉ， Ｗｅｅｒａｒａｔｎａ ＡＴ． Ａｇｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ａｎｔｉ－ＰＤ１， Ｒｅｆｌｅｃｔｉｎｇ Ａｇｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２０１８．

４３． Ｌａｗｒｅｎｃｅ ＭＳ， Ｓｔｏｊａｎｏｖ Ｐ， Ｐｏｌａｋ Ｐ， Ｋｒｙｕｋｏｖ ＧＶ， Ｃｉｂｕｌｓｋｉｓ Ｋ， Ｓｉｖａｃｈｅｎｋｏ Ａ， Ｃａｒｔｅｒ ＳＬ， Ｓｔｅｗａｒｔ Ｃ， Ｍｅｒｍｅｌ ＣＨ， Ｒｏｂｅｒｔｓ ＳＡ， Ｋｉｅｚｕｎ Ａ， Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＰＳ， ＭｃＫｅｎｎａ Ａ， Ｄｒｉｅｒ Ｙ， Ｚｏｕ Ｌ， Ｒａｍｏｓ ＡＨ， Ｐｕｇｈ ＴＪ， Ｓｔｒａｎｓｋｙ Ｎ， Ｈｅｌｍａｎ Ｅ， Ｋｉｍ Ｊ， Ｓｏｕｇｎｅｚ Ｃ， Ａｍｂｒｏｇｉｏ Ｌ， Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ Ｅ， Ｓｈｅｆｌｅｒ Ｅ， Ｃｏｒｔｅｓ ＭＬ， Ａｕｃｌａｉｒ Ｄ， Ｓａｋｓｅｎａ Ｇ， Ｖｏｅｔ Ｄ， Ｎｏｂｌｅ Ｍ， ＤｉＣａｒａ Ｄ， Ｌｉｎ Ｐ， Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ Ｌ， Ｈｅｉｍａｎ ＤＩ， Ｆｅｎｎｅｌｌ Ｔ， Ｉｍｉｅｌｉｎｓｋｉ Ｍ， Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ Ｂ， Ｈｏｄｉｓ Ｅ， Ｂａｃａ Ｓ， Ｄｕｌａｋ ＡＭ， Ｌｏｈｒ Ｊ， Ｌａｎｄａｕ ＤＡ， Ｗｕ ＣＪ， Ｍｅｌｅｎｄｅｚ－Ｚａｊｇｌａ Ｊ， Ｈｉｄａｌｇｏ－Ｍｉｒａｎｄａ Ａ， Ｋｏｒｅｎ Ａ， ＭｃＣａｒｒｏｌｌ ＳＡ， Ｍｏｒａ Ｊ， Ｃｒｏｍｐｔｏｎ Ｂ， Ｏｎｏｆｒｉｏ Ｒ， Ｐａｒｋｉｎ Ｍ， Ｗｉｎｃｋｌｅｒ Ｗ， Ａｒｄｌｉｅ Ｋ， Ｇａｂｒｉｅｌ ＳＢ， Ｒｏｂｅｒｔｓ ＣＷＭ， Ｂｉｅｇｅｌ ＪＡ， Ｓｔｅｇｍａｉｅｒ Ｋ， Ｂａｓｓ ＡＪ， Ｇａｒｒａｗａｙ ＬＡ， Ｍｅｙｅｒｓｏｎ Ｍ， Ｇｏｌｕｂ ＴＲ， Ｇｏｒｄｅｎｉｎ ＤＡ， Ｓｕｎｙａｅｖ Ｓ， Ｌａｎｄｅｒ ＥＳ， Ｇｅｔｚ Ｇ． Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｎｅｗ ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４９９： ２１４－２１８， ２０１３．

４４． Ｌｅｅ ＩＣ， Ｈｕａｎｇ ＹＨ， Ｃｈａｕ ＧＹ， Ｈｕｏ ＴＩ， Ｓｕ ＣＷ， Ｗｕ ＪＣ， Ｌｉｎ ＨＣ． Ｓｅｒｕｍ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ ｌｅｖｅｌ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｆｔｅｒ ｃｕｒａｔｉｖｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １３３： ２８９５－９０２， ２０１３．

４５． Ｌｉｎ Ｘ， Ｓｕｎ Ｒ， Ｚｈａｏ ＸＬ， Ｚｈｕ ＤＷ， Ｚｈａｏ ＸＭ， Ｇｕ Ｑ， Ｄｏｎｇ ＸＹ， Ｚｈａｎｇ ＤＦ， Ｚｈａｎｇ ＹＨ， Ｌｉ ＹＬ， Ｓｕｎ ＢＣ． Ｃ－ｍｙｃ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｒｉｖｅｓ ｍｅｌａｎｏｍａ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｂｙ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｉｃ ｍｉｍｉｃｒｙ ｖｉａ ｃ－ｍｙｃ／ｓｎａｉｌ／Ｂａｘ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ－Ｊｍｍ ９５： ５３－６７， ２０１７．

４６． Ｌｉｕ Ｑ， Ｔｏｍｅｉ Ｓ， Ａｓｃｉｅｒｔｏ ＭＬ， Ｄｅ Ｇｉｏｒｇｉ Ｖ， Ｂｅｄｏｇｎｅｔｔｉ Ｄ， Ｄａｉ Ｃ， Ｕｃｃｅｌｌｉｎｉ Ｌ， Ｓｐｉｖｅｙ Ｔ， Ｐｏｓ Ｚ， Ｔｈｏｍａｓ Ｊ， Ｒｅｉｎｂｏｔｈ Ｊ， Ｍｕｒｔａｓ Ｄ， Ｚｈａｎｇ Ｑ， Ｃｈｏｕｃｈａｎｅ Ｌ， Ｗｅｉｓｓ ＧＲ， Ｓｌｉｎｇｌｕｆｆ ＣＬ， Ｊｒ．， Ｌｅｅ ＰＰ， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ， Ａｌｔｅｒ Ｈ， Ｙａｏ Ｋ， Ｗａｎｇ Ｅ， Ｍａｒｉｎｃｏｌａ ＦＭ． Ｍｅｌａｎｏｍａ ＮＯＳ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＩＦＮ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２４： ２１４７－５９， ２０１４．

４７． Ｌｉｖｄｅｎ ＪＫ， Ｂｊｅｒｋｅ ＪＲ， Ｄｅｇｒｅ Ｍ， Ｍａｔｒｅ Ｒ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＵＶ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｏｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ， ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｆｒｏｍ ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ． Ｐｈｏｔｏｄｅｒｍａｔｏｌ ４： ２９６－３０１， １９８７．

４８． Ｌｏｆｔｕｓ ＳＫ， Ｂａｘｔｅｒ ＬＬ， Ｃｒｏｎｉｎ ＪＣ， Ｆｕｆａ ＴＤ， Ｐｒｏｇｒａｍ ＮＣＳ， Ｐａｖａｎ ＷＪ． Ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＨＩＦ１ａｌｐｈａ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ ｒｅｖｅａｌ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｆｉｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｏｒ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ． Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ ３０： ３３９－３５２， ２０１７．

４９． Ｌｏｌｌｉｎｉ ＰＬ， Ｄｅ Ｇｉｏｖａｎｎｉ Ｃ， Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ Ｇ， Ｂｏｎｔａｄｉｎｉ Ａ， Ｔａｚｚａｒｉ ＰＬ， Ｌａｎｄｕｚｚｉ Ｌ， Ｓｃｏｔｌａｎｄｉ Ｋ， Ｎａｎｎｉ Ｐ． Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ａｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ ａｌｏｎｅ ｏｒ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ． Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ８： ２１５－２４， １９９０．

５０． Ｌｏｌｌｉｎｉ ＰＬ， Ｎａｎｎｉ Ｐ， ｄｅ Ｇｉｏｖａｎｎｉ Ｃ， Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ Ｇ， Ｌａｎｄｕｚｚｉ Ｌ． Ｒｅ：Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ａｄｊｕｖａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ ｖｅｒｓｕｓ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｇｈ－ｒｉｓｋ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｍｅｌａｎｏｍａ： ａ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ ｓｔｕｄｙ． Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８８： ９２６－７， １９９６．

５１． Ｌｏｒｅｎｚ Ｐ， Ｒｏｙｃｈｏｗｄｈｕｒｙ Ｓ， Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ Ｍ， Ｗｏｌｆ Ｇ， Ｈｏｒｎ ＴＦ． Ｏｘｙｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ａｎｄ ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ａｒｅ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ａｎｄ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｅｒｓ： ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｎｉｔｒｏｓａｔｉｖｅ ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ ９： ６４－７６， ２００３．

５２． ＭａｃＭｉｃｋｉｎｇ Ｊ， Ｘｉｅ ＱＷ， Ｎａｔｈａｎ Ｃ． Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ａｎｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５： ３２３－５０， １９９７．

５３． Ｍａｌｄｏｎａｄｏ ＪＬ， Ｆｒｉｄｌｙａｎｄ Ｊ， Ｐａｔｅｌ Ｈ， Ｊａｉｎ ＡＮ， Ｂｕｓａｍ Ｋ， Ｋａｇｅｓｈｉｔａ Ｔ， Ｏｎｏ Ｔ， Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ ＤＧ， Ｐｉｎｋｅｌ Ｄ， Ｂａｓｔｉａｎ ＢＣ． Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ＢＲＡＦ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｍｅｌａｎｏｍａｓ． Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９５： １８７８－９０， ２００３．

５４． Ｍａｒｚｅｃ Ｍ， Ｚｈａｎｇ Ｑ， Ｇｏｒａｄｉａ Ａ， Ｒａｇｈｕｎａｔｈ ＰＮ， Ｌｉｕ Ｘ， Ｐａｅｓｓｌｅｒ Ｍ， Ｗａｎｇ ＨＹ， Ｗｙｓｏｃｋａ Ｍ， Ｃｈｅｎｇ Ｍ， Ｒｕｇｇｅｒｉ ＢＡ， Ｗａｓｉｋ ＭＡ． Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｋｉｎａｓｅ ＮＰＭ／ＡＬＫ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＳＴＡＴ３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＤ２７４ （ＰＤ－Ｌ１， Ｂ７－Ｈ１）． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０５： ２０８５２－７， ２００８．

５５． Ｍａｕｌｄｉｎ ＩＳ， Ｗａｇｅｓ ＮＡ， Ｓｔｏｗｍａｎ ＡＭ， Ｗａｎｇ Ｅ， Ｓｍｏｌｋｉｎ ＭＥ， Ｏｌｓｏｎ ＷＣ， Ｄｅａｃｏｎ ＤＨ， Ｓｍｉｔｈ ＫＴ， Ｇａｌｅａｓｓｉ ＮＶ， Ｃｈｉａｎｅｓｅ－Ｂｕｌｌｏｃｋ ＫＡ， Ｄｅｎｇｅｌ ＬＴ， Ｍａｒｉｎｃｏｌａ ＦＭ， Ｐｅｔｒｏｎｉ ＧＲ， Ｍｕｌｌｉｎｓ ＤＷ， Ｓｌｉｎｇｌｕｆｆ ＣＬ， Ｊｒ． Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｕｔ ｆａｉｌｓ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ６５： １１８９－９９， ２０１６．

５６． ＭｃＧａｒｙ ＥＣ， Ｌｅｖ ＤＣ， Ｂａｒ－Ｅｌｉ Ｍ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １： ４５９－６５， ２００２．

５７． Ｍｅｉｓｓｌ Ｋ， Ｍａｃｈｏ－Ｍａｓｃｈｌｅｒ Ｓ， Ｍｕｌｌｅｒ Ｍ， Ｓｔｒｏｂｌ Ｂ． Ｔｈｅ ｇｏｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｂａｄ ｆａｃｅｓ ｏｆ ＳＴＡＴ１ ｉｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｕｒｓ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８９： １２－２０， ２０１７．

５８． Ｍｅｙｓｋｅｎｓ ＦＬ， Ｊｒ．， Ｋｏｐｅｃｋｙ Ｋ， Ｓａｍｓｏｎ Ｍ， Ｈｅｒｓｈ Ｅ， Ｍａｃｄｏｎａｌｄ Ｊ， Ｊａｆｆｅ Ｈ， Ｃｒｏｗｌｅｙ Ｊ， Ｃｏｌｔｍａｎ Ｃ． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ： ａｄｖｅｒｓｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｈｉｇｈ－ｒｉｓｋ ｓｔａｇｅ Ｉ ａｎｄ ＩＩ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８２： １０７１， １９９０．

５９． Ｍｅｙｓｋｅｎｓ ＦＬ， Ｊｒ．， Ｋｏｐｅｃｋｙ ＫＪ， Ｔａｙｌｏｒ ＣＷ， Ｎｏｙｅｓ ＲＤ， Ｔｕｔｈｉｌｌ ＲＪ， Ｈｅｒｓｈ ＥＭ， Ｆｅｕｎ ＬＧ， Ｄｏｒｏｓｈｏｗ ＪＨ， Ｆｌａｈｅｒｔｙ ＬＥ， Ｓｏｎｄａｋ ＶＫ． Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ａｄｊｕｖａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ ｖｅｒｓｕｓ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｇｈ－ｒｉｓｋ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｍｅｌａｎｏｍａ： ａ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ ｓｔｕｄｙ． Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８７： １７１０－３， １９９５．

６０． Ｍｉｍｕｒａ Ｋ， Ｔｅｈ ＪＬ， Ｏｋａｙａｍａ Ｈ， Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ Ｋ， Ｋｕａ ＬＦ， Ｋｏｈ Ｖ， Ｓｍｏｏｔ ＤＴ， Ａｓｈｋｔｏｒａｂ Ｈ， Ｏｉｋｅ Ｔ， Ｓｕｚｕｋｉ Ｙ， Ｆａｚｒｅｅｎ Ｚ， Ａｓｕｎｃｉｏｎ ＢＲ， Ｓｈａｂｂｉｒ Ａ， Ｙｏｎｇ ＷＰ， Ｓｏ Ｊ， Ｓｏｏｎｇ Ｒ， Ｋｏｎｏ Ｋ． ＰＤ－Ｌ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｍａｉｎｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＪＡＫ－ＳＴＡＴ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ １０９： ４３－５３， ２０１８．

６１． Ｍｏｓｃｏｗ ＪＡ， Ｆｏｊｏ Ｔ， Ｓｃｈｉｌｓｋｙ ＲＬ． Ｔｈｅ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １５： １８３－１９２， ２０１８．

６２． Ｎｏｏｎａｎ ＦＰ， Ｄｕｄｅｋ Ｊ， Ｍｅｒｌｉｎｏ Ｇ， Ｄｅ Ｆａｂｏ ＥＣ． Ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ： ａｎ ＨＧＦ／ＳＦ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｍａｙ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｃｃｅｓｓ ｔｏ ＵＶ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｅｖｅｎｔｓ． Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １６： １６－２５， ２００３．

６３． Ｏｓｔｅｒｌｉｎｄ Ａ， Ｔｕｃｋｅｒ ＭＡ， Ｓｔｏｎｅ ＢＪ， Ｊｅｎｓｅｎ ＯＭ． Ｔｈｅ Ｄａｎｉｓｈ ｃａｓｅ－ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ． ＩＩ． Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ＵＶ－ｌｉｇｈｔ ｅｘｐｏｓｕｒｅ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４２： ３１９－２４， １９８８．

６４． Ｐｅｎｓａ ＡＶ， Ｃｉｎｅｌｌｉ ＭＡ， Ｌｉ Ｈ， Ｃｈｒｅｉｆｉ Ｇ， Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｐ， Ｒｏｍａｎ ＬＪ， Ｍａｒｔａｓｅｋ Ｐ， Ｐｏｕｌｏｓ ＴＬ， Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ＲＢ． Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ， Ｐｏｔｅｎｔ， ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ７－Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ２－Ａｍｉｎｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓ ａｓ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ６０： ７１４６－７１６５， ２０１７．

６５． Ｐｏｎｓｏｎｂｙ ＡＬ， ＭｃＭｉｃｈａｅｌ Ａ， ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｉ Ｉ． Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ： ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｒｏｍ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ １８１－１８２： ７１－８， ２００２．

６６． Ｐｒａｓａｄ Ｒ， Ｋａｔｉｙａｒ ＳＫ． Ｃｒｏｓｓｔａｌｋ Ａｍｏｎｇ ＵＶ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ， ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ ａｎｄ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ， ２０１６．

６７． Ｒａｙ Ｓ， Ｌｅｅ Ｃ， Ｈｏｕ Ｔ， Ｂｈａｋａｔ ＫＫ， Ｂｒａｓｉｅｒ ＡＲ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ３ ｅｎｈａｎｃｅｏｓｏｍｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ １ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｃ ａｃｕｔｅ ｐｈａｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２４： ３９１－４０１， ２０１０．

６８． Ｓｃｈｏｅｎｂｏｒｎ ＪＲ， Ｗｉｌｓｏｎ ＣＢ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９６： ４１－１０１， ２００７．

６９． Ｓｃｈｕｌｔｚ Ｊ， Ｋｏｃｚａｎ Ｄ， Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｕ， Ｉｂｒａｈｉｍ ＳＭ， Ｐｉｌｃｈ Ｄ， Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ Ｊ， Ｋｕｎｚ Ｍ． Ｔｕｍｏｒ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ （Ｓｔａｔ）１ ｉｎ ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｍｅｌａｎｏｍａ ｇｒｏｗｔｈ． Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ２７： １３３－４０， ２０１０．

７０． Ｓｈｅｎ Ｊ， Ｂａｏ Ｓ， Ｒｅｅｖｅ ＶＥ． Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ－１０， ＩＬ－１２， ａｎｄ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ ｉｎ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ｏｆ ｈａｉｒｌｅｓｓ ｍｉｃｅ ｂｙ ＵＶＡ （３２０－４００ｎｍ） ａｎｄ ＵＶＢ （２８０－３２０ｎｍ） ｒａｄｉａｔｉｏｎ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １１３： １０５９－６４， １９９９．

７１． Ｓｉｍｏｎ Ｓ， Ｌａｂａｒｒｉｅｒｅ Ｎ． ＰＤ－１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ： Ｆｒｉｅｎｄ ｏｒ ｆｏｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ？ Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７： ｅ１３６４８２８， ２０１７．

７２． Ｓｉｍｏｎｓ ＤＬ， Ｌｅｅ Ｇ， Ｋｉｒｋｗｏｏｄ ＪＭ， Ｌｅｅ ＰＰ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｍａｙ ｐｒｅｄｉｃｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ａｆｔｅｒ ｈｉｇｈ－ｄｏｓｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９： ５２， ２０１１．

７３． Ｓｐｒａｎｇｅｒ Ｓ， Ｋｏｂｌｉｓｈ ＨＫ， Ｈｏｒｔｏｎ Ｂ， Ｓｃｈｅｒｌｅ ＰＡ， Ｎｅｗｔｏｎ Ｒ， Ｇａｊｅｗｓｋｉ ＴＦ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｏｕｂｌｅｔｓ ｏｆ ＣＴＬＡ－４， ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１， ｏｒ ＩＤＯ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｒｅｓｔｏｒｅｄ ＩＬ－２ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８（＋） Ｔ ｃｅｌｌｓ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ２： ３， ２０１４．

７４． Ｔａｎｅｓｅ Ｋ， Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｙ， Ｂｅｒｋｏｖａ Ｚ， Ｗａｎｇ Ｙ， Ｓａｍａｎｉｅｇｏ Ｆ， Ｌｅｅ ＪＥ， Ｅｋｍｅｋｃｉｏｇｌｕ Ｓ， Ｇｒｉｍｍ ＥＡ． Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ ＣＤ７４－ＭＩＦ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｄｒｉｖｅ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １３５： ２７７５－８４， ２０１５．

７５． Ｔａｎｇ ＣＨ， Ｇｒｉｍｍ ＥＡ． Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ａ ｐ５３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９： ２８８－９８， ２００４．

７６． Ｔａｕｂｅ ＪＭ， Ａｎｄｅｒｓ ＲＡ， Ｙｏｕｎｇ ＧＤ， Ｘｕ Ｈ， Ｓｈａｒｍａ Ｒ， ＭｃＭｉｌｌｅｒ ＴＬ， Ｃｈｅｎ Ｓ， Ｋｌｅｉｎ ＡＰ， Ｐａｒｄｏｌｌ ＤＭ， Ｔｏｐａｌｉａｎ ＳＬ， Ｃｈｅｎ Ｌ． Ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｗｉｔｈ Ｂ７－ｈ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｃｙｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ａｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｅｓｃａｐｅ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ４： １２７ｒａ３７， ２０１２．

７７． Ｔｅｉｘｅｉｒａ ＬＫ， Ｆｏｎｓｅｃａ ＢＰ， Ｂａｒｂｏｚａ ＢＡ， Ｖｉｏｌａ ＪＰ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ ｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ａｎｄ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｍｅｍ Ｉｎｓｔ Ｏｓｗａｌｄｏ Ｃｒｕｚ １００ Ｓｕｐｐｌ １： １３７－４４， ２００５．

７８． Ｔｕｍｅｈ ＰＣ， Ｈａｒｖｉｅｗ ＣＬ， Ｙｅａｒｌｅｙ ＪＨ， Ｓｈｉｎｔａｋｕ ＩＰ， Ｔａｙｌｏｒ ＥＪ， Ｒｏｂｅｒｔ Ｌ， Ｃｈｍｉｅｌｏｗｓｋｉ Ｂ， Ｓｐａｓｉｃ Ｍ， Ｈｅｎｒｙ Ｇ， Ｃｉｏｂａｎｕ Ｖ， Ｗｅｓｔ ＡＮ， Ｃａｒｍｏｎａ Ｍ， Ｋｉｖｏｒｋ Ｃ， Ｓｅｊａ Ｅ， Ｃｈｅｒｒｙ Ｇ， Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ ＡＪ， Ｇｒｏｇａｎ ＴＲ， Ｍａｔｅｕｓ Ｃ， Ｔｏｍａｓｉｃ Ｇ， Ｇｌａｓｐｙ ＪＡ， Ｅｍｅｒｓｏｎ ＲＯ， Ｒｏｂｉｎｓ Ｈ， Ｐｉｅｒｃｅ ＲＨ， Ｅｌａｓｈｏｆｆ ＤＡ， Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ， Ｒｉｂａｓ Ａ． ＰＤ－１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５１５： ５６８－７１， ２０１４．

７９． Ｖａｎｎｉｎｉ Ｆ， Ｋａｓｈｆｉ Ｋ， Ｎａｔｈ Ｎ． Ｔｈｅ ｄｕａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉＮＯＳ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｒｅｄｏｘ Ｂｉｏｌ ６： ３３４－４３， ２０１５．

８０． Ｗｅｉｎｍａｎｎ Ｈ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ： Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ Ｓｍａｌｌ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ． ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ １１： ４５０－６６， ２０１６．

８１． Ｙａｍａｚａｋｉ Ｔ， Ａｋｉｂａ Ｈ， Ｋｏｙａｎａｇｉ Ａ， Ａｚｕｍａ Ｍ， Ｙａｇｉｔａ Ｈ， Ｏｋｕｍｕｒａ Ｋ． Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ Ｂ７－Ｈ１ ｏｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ａｕｇｍｅｎｔｉｎｇ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７５： １５８６－９２， ２００５．

８２． Ｙａｎｇ Ｓ， Ｉｒａｎｉ Ｋ， Ｈｅｆｆｒｏｎ ＳＥ， Ｊｕｒｎａｋ Ｆ， Ｍｅｙｓｋｅｎｓ ＦＬ， Ｊｒ． Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ－１／ｒｅｄｏｘ ｆａｃｔｏｒ－１ （ＡＰＥ／Ｒｅｆ－１） ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ａｓ ａｎ ＡＰＥ／Ｒｅｆ－１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ． Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ４： １９２３－３５， ２００５．

８３． Ｙａｎｇ Ｓ， Ｍｅｙｓｋｅｎｓ ＦＬ． Ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ／ｒｅｄｏｘ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆａｃｔｏｒ－１（ＡＰＥ／Ｒｅｆ－１）： ａ ｕｎｉｑｕｅ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ． Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ １１： ６３９－５０， ２００９．

８４． Ｙａｎｇ Ｓ， Ｍｅｙｓｋｅｎｓ ＦＬ， Ｊｒ． Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ６７： ２９８－３０８， ２００５．

８５． Ｙａｎｇ Ｚ， Ｍｉｓｎｅｒ Ｂ， Ｊｉ Ｈ， Ｐｏｕｌｏｓ ＴＬ， Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ＲＢ， Ｍｅｙｓｋｅｎｓ ＦＬ， Ｙａｎｇ Ｓ． Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｗｉｔｈ ｎＮＯＳ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ． Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ １９： ４３３－４７， ２０１３．

８６． Ｙａｎｇ Ｚ， Ｍｉｓｎｅｒ Ｂ， Ｊｉ Ｈ， Ｐｏｕｌｏｓ ＴＬ， Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ＲＢ， Ｍｅｙｓｋｅｎｓ ＦＬ， Ｙａｎｇ Ｓ． Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｗｉｔｈ ｎＮＯＳ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ａｓ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ． Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ， ２０１３．

８７． Ｙａｎｇ Ｚ， Ｙａｎｇ Ｓ， Ｍｉｓｎｅｒ ＢＪ， Ｃｈｉｕ Ｒ， Ｌｉｕ Ｆ， Ｍｅｙｓｋｅｎｓ ＦＬ， Ｊｒ． Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｉｎｉｔｉａｔｅｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｖｉａ ａ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ－１／ｒｅｄｏｘ ｆａｃｔｏｒ－１， ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ． Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ７： ３７５１－６０， ２００８．

８８． Ｙａｚｄｉ ＡＳ， Ｐａｌｍｅｄｏ Ｇ， Ｆｌａｉｇ ＭＪ， Ｐｕｃｈｔａ Ｕ， Ｒｅｃｋｗｅｒｔｈ Ａ， Ｒｕｔｔｅｎ Ａ， Ｍｅｎｔｚｅｌ Ｔ， Ｈｕｇｅｌ Ｈ， Ｈａｎｔｓｃｈｋｅ Ｍ， Ｓｃｈｍｉｄ－Ｗｅｎｄｔｎｅｒ ＭＨ， Ｋｕｔｚｎｅｒ Ｈ， Ｓａｎｄｅｒ ＣＡ． Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＢＲＡＦ ｇｅｎｅ ｉｎ ｂｅｎｉｇｎ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｃｙｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２１： １１６０－２， ２００３．

８９． Ｙｕｅ ＥＷ， Ｓｐａｒｋｓ Ｒ， Ｐｏｌａｍ Ｐ， Ｍｏｄｉ Ｄ， Ｄｏｕｔｙ Ｂ， Ｗａｙｌａｎｄ Ｂ， Ｇｌａｓｓ Ｂ， Ｔａｋｖｏｒｉａｎ Ａ， Ｇｌｅｎｎ Ｊ， Ｚｈｕ Ｗ， Ｂｏｗｅｒ Ｍ， Ｌｉｕ Ｘ， Ｌｅｆｆｅｔ Ｌ， Ｗａｎｇ Ｑ， Ｂｏｗｍａｎ ＫＪ， Ｈａｎｓｂｕｒｙ ＭＪ， Ｗｅｉ Ｍ， Ｌｉ Ｙ， Ｗｙｎｎ Ｒ， Ｂｕｒｎ ＴＣ， Ｋｏｂｌｉｓｈ ＨＫ， Ｆｒｉｄｍａｎ ＪＳ， Ｅｍｍ Ｔ， Ｓｃｈｅｒｌｅ ＰＡ， Ｍｅｔｃａｌｆ Ｂ， Ｃｏｍｂｓ ＡＰ． ＩＮＣＢ２４３６０ （Ｅｐａｃａｄｏｓｔａｔ）， ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ－２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ １ （ＩＤＯ１） Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏ－ｏｎｃｏｌｏｇｙ． ＡＣＳ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ８： ４８６－４９１， ２０１７．

９０． Ｚａｉｄｉ ＭＲ， Ｄａｖｉｓ Ｓ， Ｎｏｏｎａｎ ＦＰ， Ｇｒａｆｆ－Ｃｈｅｒｒｙ Ｃ， Ｈａｗｌｅｙ ＴＳ， Ｗａｌｋｅｒ ＲＬ， Ｆｅｉｇｅｎｂａｕｍ Ｌ， Ｆｕｃｈｓ Ｅ， Ｌｙａｋｈ Ｌ， Ｙｏｕｎｇ ＨＡ， Ｈｏｒｎｙａｋ ＴＪ， Ａｒｎｈｅｉｔｅｒ Ｈ， Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ Ｇ， Ｍｅｌｔｚｅｒ ＰＳ， Ｄｅ Ｆａｂｏ ＥＣ， Ｍｅｒｌｉｎｏ Ｇ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ ｌｉｎｋｓ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｏ ｍｅｌａｎｏｍａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｎａｔｕｒｅ ４６９： ５４８－５３， ２０１１．

９１． Ｚａｉｄｉ ＭＲ， Ｄａｖｉｓ Ｓ， Ｎｏｏｎａｎ ＦＰ， Ｇｒａｆｆ－Ｃｈｅｒｒｙ Ｃ， Ｈａｗｌｅｙ ＴＳ， Ｗａｌｋｅｒ ＲＬ， Ｆｅｉｇｅｎｂａｕｍ Ｌ， Ｆｕｃｈｓ Ｅ， Ｌｙａｋｈ Ｌ， Ｙｏｕｎｇ ＨＡ， Ｈｏｒｎｙａｋ ＴＪ， Ａｒｎｈｅｉｔｅｒ Ｈ， Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ Ｇ， Ｍｅｌｔｚｅｒ ＰＳ， Ｄｅ Ｆａｂｏ ＥＣ， Ｍｅｒｌｉｎｏ Ｇ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－？ ｌｉｎｋｓ ＵＶ ｔｏ ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍｅｌａｎｏｍａｇｅｎｅｓｉｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４６９： ５４８－５３， ２０１１．

９２． Ｚａｉｄｉ ＭＲ， Ｄｅ Ｆａｂｏ ＥＣ， Ｎｏｏｎａｎ ＦＰ， Ｍｅｒｌｉｎｏ Ｇ． Ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｌｉｇｈｔ ｏｎ ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７２： １５９１－５， ２０１２．

９３． Ｚａｒｅｔｓｋｙ ＪＭ， Ｇａｒｃｉａ－Ｄｉａｚ Ａ， Ｓｈｉｎ ＤＳ， Ｅｓｃｕｉｎ－Ｏｒｄｉｎａｓ Ｈ， Ｈｕｇｏ Ｗ， Ｈｕ－Ｌｉｅｓｋｏｖａｎ Ｓ， Ｔｏｒｒｅｊｏｎ ＤＹ， Ａｂｒｉｌ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｇ， Ｓａｎｄｏｖａｌ Ｓ， Ｂａｒｔｈｌｙ Ｌ， Ｓａｃｏ Ｊ， Ｈｏｍｅｔ Ｍｏｒｅｎｏ Ｂ， Ｍｅｚｚａｄｒａ Ｒ， Ｃｈｍｉｅｌｏｗｓｋｉ Ｂ， Ｒｕｃｈａｌｓｋｉ Ｋ， Ｓｈｉｎｔａｋｕ ＩＰ， Ｓａｎｃｈｅｚ ＰＪ， Ｐｕｉｇ－Ｓａｕｓ Ｃ， Ｃｈｅｒｒｙ Ｇ， Ｓｅｊａ Ｅ， Ｋｏｎｇ Ｘ， Ｐａｎｇ Ｊ， Ｂｅｒｅｎｔ－Ｍａｏｚ Ｂ， Ｃｏｍｉｎ－Ａｎｄｕｉｘ Ｂ， Ｇｒａｅｂｅｒ ＴＧ， Ｔｕｍｅｈ ＰＣ， Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ＴＮ， Ｌｏ ＲＳ， Ｒｉｂａｓ Ａ． Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ＰＤ－１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７５： ８１９－２９， ２０１６．

９４． Ｚｉｔｖｏｇｅｌ Ｌ， Ｋｒｏｅｍｅｒ Ｇ． Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １： １２２３－１２２５， ２０１２．

実施例２―ＨＨ０４４：抗黒色腫活性並びにインビボ薬剤体内分布の検出及びイメージング

方法

ＨＨ０４４のインビボ抗黒色腫活性

１）腫瘍増殖及びＨＨ０４４処理：メスの胸腺欠損ヌードマウス（４～６週齢、Ｎｕ／Ｎｕ０８８ホモ接合）をチャールスリバー（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）から購入した。この動物試験は、チャップマン大学（Ｉｒｖｉｎｅ， ＣＡ）の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）からの認可のもとで実施した。マウスに、１×１０^６Ａ３７５ヒト黒色腫細胞の５０％マトリゲル基底膜マトリクス（ＣＢ３５４２４８， Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ）２００μＬ溶液を皮下注射した。３日後、マウスを異なる実験処置グループに無作為に割り当てた。溶媒処置コントロールと比較して、ｎＮＯＳ阻害剤ＨＨ０４４を２１日間一日一回腹腔内投与した（２０ｍｇ／ｋｇ）。体重および腫瘍サイズを試験の終わりまで毎週２回測定した。

２）Ａ３７５黒色腫異種移植片中のＰＤ－Ｌ１発現レベル。試験の終わりまで、異種移植片腫瘍サンプルの一部を軟部腫瘍用の標準プロトコルにしたがってＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（１３０－０９５－９２９； Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）のＧｅｎｔｌｅ ＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを使用して単細胞懸濁液に解離することにより、フローサイトメトリー用に処理した。次いで単細胞懸濁液を集め、１×ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドを３７℃で１０分間使用して固定した。この細胞をその後、インキュベーションバッファー（１×ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ）で洗浄し、続いて室温で２時間暗闇の中でＰＤ－Ｌ１抗体でインキュベートした（１：１００希釈）。解析用に平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定し、記録した。

インビボ体内分布の検出

１）組織試料からの化合物の単離：２０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量の生理食塩水又はＨＨ０４４を、４週間腹腔内投与（各グループにつきｎ＝６）により投与した。次いで腫瘍及び臓器を集め、秤量した。組織１００ｍｇ毎にＭｉｌｌｉ－Ｑ水を３００μＬ加え、その後手動で均質化した。ホモジネートを同量のアセトニトリルとボルテックスで混合し、その後４℃、２５００ｇ^－１で４分間遠心分離した。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水１ｍＬを集めた上清に加え、次いでクロロホルムとイソプロパノールの混合物（割合１：１）６ｍＬを抽出用に加えた。この混合物をボルテックスにより混合し、４℃、２５００ｇ^－１で５分間遠心分離した。Ｓｐｅｅｄｖａｃを使用して集めた有機層をさらに遠心分離して溶媒を蒸発させた。乾燥させた試料をメタノールに再溶解し、化合物の有無をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦを使用して決定した。

２）液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）：ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによりＨＨ０４４を含有すると決定された試料を、ＬＣ－ＭＳによりさらに分析した。濃度が１μＭと既知である内部標準を使用してＨＨ０４４の濃度を決定した。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ－ＭＳ２０２０システム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＭＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｊａｐａｎ）を使用するＳｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｃ１８カラム（３．０μｍ，４．６×１００ｍｍ）でクロマトグラフィー分離を実施した。０．０５％ギ酸水溶液及びアセトニトリルから成る移動相を用いて、各試料２０μＬを流速０．４ｍＬ／ｍｉｎで溶出した。移動相中のアセトニトリルの割合を以下の、０～３分では１５％、３～１５分では５５％、１５～１８分では１００％、１８～２３分では５％のように最適化した。陽イオンモードで動作するＥＳＩインターフェースを備えたＳｈｉｍａｄｚｕ２０２０質量分析計で、質量分析を実行した。決定された組織中のＨＨ０４４濃度は、試料の重量に対して標準化した［１］。

インビボ薬剤分布のイメージング試験

ａ）ＶｉｖｏＴａｇ６８０ＸＬ標識ＨＨ０４４の合成：合成スキームに示すように（図１０）、初めに一次アミンとのリンカーとしてβ－アラニンをＨＨ０４４に結合させた（１）。β－アラニン（１．２ｍｇ、０．００６５ｍｍｏｌｅ、１．２当量）とＨＡＴＵ（２．４８ｍｇ、０．００６５ｍｍｏｌｅ、１．２当量）の混合物を無水ＤＭＦ２００μｌに溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（５．６μｌ、０．０３３ｍｍｏｌｅ、６当量）を、無水ＤＭＦ２００μｌに溶解した後のＨＨ０４４（１）（２．５ｍｇ，０．００５４４ｍｍｏｌｅ）溶液に加えた。反応混合物を室温で２時間攪拌した。次いでこの反応混合物にジエチルエーテル１５ｍＬを加えて生成物を沈殿させた。沈殿した生成物をＨ_２Ｏ／アセトニトリルに溶解し、水／アセトニトリルをグラジエント溶媒として使用してＨＰＬＣにより精製した。末端ＮＨ_２をＢｏｃで保護したＨＨ０４４－β－アラニンを、保持時間４７分で溶出した。Ｂｏｃ保護基は、３ＭＨＣｌメタノール溶液を２時間攪拌しながら使用してβ－アラニンリンカーから除去した。次いでこの溶媒を蒸発させ、化合物をメタノール５０μＬに再溶解し、その後冷却した無水ジエチルエーテル１５ｍＬを加えて化合物２を沈殿させた。分子式が［Ｃ_２８Ｈ_３０Ｎ_６ＯＳ_２］で、５３０．１９２３と計算された化合物２（ＨＨ０４４－β－アラニン）に対してＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（ｍ／ｚ）すると、質量は５３１．１４３８［Ｍ＋Ｈ］となった。

次に、インビボ蛍光タグＶｉｖｏＴａｇ ６８０ＸＬをＨＨ０４４－β－アラニンに結合した。遊離β―アミノ基を有するＨＨ０４４－β－アラニン（２）（７１μｇ，０．１３５μｍｏｌｅ）を、ＤＩＰＥＡ５μＬを塩基触媒として含有する無水ＤＭＦ１００μＬに溶解した。次いで、無水ＤＭＦ１００μＬに溶解したＶｉｖｏＴａｇ ６８０ＸＬの溶液（２５０μｇ，０．０．１３５μｍｏｌｅ）を化合物２の溶液に加えた。混合物を室温で２時間攪拌した。反応が終了した後、冷却したジエチルエーテルを加えてＶｉｖｏＴａｇ－標識ＨＨ０４４－β－アラニン（化合物３）を沈殿させ、これを冷却したジエチルエーテルで３回洗浄し、さらなるイメージング試験のために真空乾燥した。

ｂ）インビボ及びエクスビボイメージング：Ｖｉｖｏｔａｇ６８０標識ＨＨ０４４ ４μｇを尾静脈を介してマウスに注射した。次いでこの動物をＩＶＩＳスペクトルイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）を使用して各種時間間隔でスキャンした。Ｖｉｖｏｔａｇ６８０－標識ＨＨ０４４から生じたインビボ蛍光をスキャンするために、マウスを中間ビニング及び視野絞り２の自動タイミングで、励起波長及び発光波長がそれぞれ６７５及び７２０ｎｍで撮影した。

静脈内投与後の既定された時間間隔（０、２、及び４時間）でのエクスビボ蛍光イメージングについては、動物を安楽死させ、異種移植腫瘍、脳、肝臓、肺、腎臓、脾臓、及び心臓を切除し、通常の生理食塩水で手短に洗浄した。集めた臓器を次いで、ＩＶＩＳスペクトルイメージングシステムを使用して中間ビニング及び視野絞り２の自動タイミングで、励起波長及び発光波長がそれぞれ６７５及び７２０ｎｍで撮影した。

結果

処置の終わりに、体、腫瘍、及び主要な臓器（肺、肝臓及び腎臓）を秤量した。２１日間、２０ｍｇ／ｋｇ／日のＨＨ０４４で処置したマウスにおいては、最終腫瘍重量は、肺、肝臓及び腎臓の重量に著しい変化はなく、コントロールの最終腫瘍重量の６１％まで減少した（図９Ａ～Ｂ）。標本の大きさが小さい予備試験（ｎ＝５）を考慮すると、処置グループとコントロールグループ間の腫瘍重量の差は、統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．０５４）。試験期間全体の間に、著しい全身毒性は観察されなかった。ＨＨ０４４処置を受けたマウスにおいては体重のわずかな減少が観察されたが（２２．６ｇ対コントロールグループの２３．９ｇ）、この減少量は１０％未満であり、統計的に有意でなかった（ｐ＞０．０５）。

図９Ｃに示すように、Ａ３７５黒色腫異種移植片から集められた細胞懸濁液を分析すると、ＨＨ０４４処置後の腫瘍中のＰＤ－Ｌ１発現レベルは、コントロールグループの７６％まで有意に低減したことが実証された（ｐ＜０．０５，ｎ＝５）。

ＨＨ０４４のインビボ分布をさらに決定するために、腫瘍異種移植片、肝臓、脳、及び腎臓を含む各種臓器から試料を集めた。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析を実施し、これにより腫瘍（図１０Ｅ）、肝臓、及び腎臓（データ示さず）中でＨＨ０４４の存在が確認された。これらの試料をＬＣ－ＭＳを用いてさらに分析した。内部標準（１μＭ）によって算出された推定ＨＨ０４４レベル及び曲線下の面積から、ＨＨ０４４濃度は腫瘍異種移植片中０．８８μＭに達し、ｎＮＯＳ阻害のＫｉ値（０．００５μＭ）の１７０倍を超えることが分かった（図１０Ｄ）。これらのデータから、ＨＨ０４４はインビボでのｎＮＯＳ阻害を効果的に阻害するのに十分な腫瘍中レベルに達することができることが示される。ＬＣ－ＭＳ分析でもまた、この化合物は腹腔内投与後２４時間で肝臓、腎臓中でそれぞれ３．９５μＭ及び６．００μＭの濃度で見られることが分かり、ＨＨ０４４が肝臓又は腎臓経路を介して代謝され、排出されてもよいことが示される。

図１０Ｂ及び１０Ｃに示すように、Ａ３７５黒色腫腫瘍を異種移植した生きたＮｕ／Ｎｕマウス中のインビボＨＨ０４４分布も、ＩＶＩＳイメージングシステムを使用して調べた。結果から、標識ＨＨ０４４は、１０分以内に異種移植腫瘍まで急速に分布し、ＩＶ投与後４時間まで可視化されたままだったことが分かった。腫瘍及び臓器の切除後のエクスビボイメージングでも同様のパターンを確認した。投与後２時間で、この化合物は主に腫瘍内に局在化し、腎臓及び肝臓でも見られたが、範囲は狭かった。４時間たっても、この化合物は腫瘍及び肝臓中に観察できたが、腎臓中で優位に観察できた。肝臓と腎臓で一貫して薬剤の存在量が増加したことから、薬剤の代謝と排出は主にこれら２個の臓器により処理されることが示される。注目すべきことに、インビボイメージング試験とエクスビボイメージング試験の両方で、脳をいくら調べても薬剤を観察できないことが分かり、血液脳関門を透過しないことが示される。

前の記述から、本発明の範囲と精神から逸脱することなく、さまざまな修正及び変更を本明細書中に開示された発明に対してなされてもよいことが、当業者にとっては容易に明らかとなるであろう。本明細書中に例示的に記述した発明は、本明細書中に具体的に開示されていないいかなる要素、制限もなく適切に実行することができる。利用されている用語及び表現は、記述的用語として使用され、限定的用語としては使用されず、このような用語及び表現の使用は、示され説明された特徴又はその部分のいかなる同等のものを排除することを意図するものではないが、本発明の範囲内ではさまざまな変更が可能であると理解されたい。したがって、本発明は、特定の実施形態及び任意の特徴により説明されているが、当業者は本明細書中に開示された概念の変更及び／又は変形に頼ってもよく、このような変更及び変形は本発明の範囲内であるとみなされることを理解すべきである。

本明細書においては多くの特許及び非特許文献に対する引用がなされている。引用した参考文献は、その全体を参照により本明細書に援用される。引用した参考文献中の用語の定義と比較して明細書中の用語の定義に矛盾がある場合には、明細書中の定義に基づいて用語を解釈すべきである。

Claims (20)

1. 必要とする被験者における細胞増殖性疾患又は障害を治療する方法であって、前記方法は、前記細胞増殖性疾患又は障害を治療するための有効量の神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）阻害剤を前記被験者に投与することを含む、方法。
2. 前記有効量の神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）の前記阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１発現量の減少を含む前記被験者の免疫治療応答を誘導するのに有効である、請求項１に記載の方法。
3. 前記被験者は黒色腫を有する、請求項１に記載の方法。
4. 前記被験者は黒色腫を有し、ＩＦＮ－γ刺激による黒色腫進行の発症を示しているまたは発症する危険がある、請求項１に記載の方法。
5. 前記被験者は黒色腫を有し、ｎＮＯＳ発現レベルの上昇によって特徴づけられる黒色腫の発症を示している又は発症する危険がある、請求項１に記載の方法。
6. 前記被験者は黒色腫を有し、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）発現レベルの上昇によって特徴づけられる黒色腫の発症を示している又は発症する危険がある、請求項１に記載の方法。
7. ｎＮＯＳの前記阻害剤は、式を有する化合物ＭＡＣ－３－１９０、又はその適切な薬学的な塩、溶媒和物あるいは水和物である、請求項１に記載の方法。
   

   
8. ｎＮＯＳの前記阻害剤は、式を有する化合物ＨＨ０４４、又はその適切な薬学的な塩、溶媒和物あるいは水和物である、請求項１に記載の方法。
   

   
9. 前記被験者にＩＦＮ－αを投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. ＰＤ－Ｌ１阻害剤又はプログラム死受容体―１（ＰＤ－１）阻害剤を前記被験者に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記被験者にダカルバジンを投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
12. 前記被験者にテモゾロミドを投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
13. 必要とする被験者に対して免疫治療を施す方法であって、前記方法は、前記被験者の免疫治療応答を誘導するために有効量の神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）阻害剤を前記被験者に投与することを含む、方法。
14. 前記免疫治療応答には、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）発現量の減少が含まれる、請求項１３に記載の方法。
15. 前記被験者は、ｎＮＯＳ発現レベルの上昇によって特徴づけられる疾患又は障害を有する、請求項１３に記載の方法。
16. 前記被験者は、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）発現レベルの上昇によって特徴づけられる疾患又は障害を有する、請求項１３に記載の方法。
17. ｎＮＯＳの前記阻害剤は、式を有する化合物ＭＡＣ－３－１９０、又はその適切な薬学的な塩、溶媒和物あるいは水和物である、請求項１３に記載の方法。
    

    
18. ｎＮＯＳの前記阻害剤は、式を有する化合物ＨＨ０４４、又はその適切な薬学的な塩、溶媒和物あるいは水和物である、請求項１３に記載の方法。
    

    
19. 前記被験者にＩＦＮ－αを投与することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
20. ＰＤ－Ｌ１阻害剤又はＰＤ－１阻害剤を前記被験者に投与することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。

Images