KR101697437B1 - 중간엽줄기세포의 심근유사세포 분화유도용 아피시딘 함유 조성물 - Google Patents

중간엽줄기세포의 심근유사세포 분화유도용 아피시딘 함유 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 중간엽줄기세포를 심근유사세포로 분화유도하기 위한 아피시딘 조성물 및 이를 이용한 심근유사세포 분화유도방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 아피시딘을 24시간이라는 매우 짧은 시간만 처리하여도, 중간엽 줄기세포를 심근유사세포 특이적으로 분화유도할 수 있는 바, 종래 중간엽줄기세포의 극히 낮은 심근분화 효율, 고비용, 장시간의 문제를 해결할 수 있기 때문에, 심질환 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

중간엽줄기세포의 심근유사세포 분화유도용 아피시딘 함유 조성물{Composition comprising apicidin for differentiating mesenchymal stem cell to cardiac committed cell}
본 발명은, 중간엽줄기세포를 심근유사세포로 분화유도하기 위한 아피시딘 조성물 및 이를 이용한 심근유사세포 분화유도방법에 관한 것이다.
중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC)는 지방세포, 연골세포, 근육세포, 뼈세포 등 여러 가지 세포형태로 분화가 가능하고, 체외에서 손쉽게 증식시킬 수 있기 때문에, 유전자 치료와 세포치료에 있어서 유용한 tool로 이용되고 있다. 줄기세포의 작용 기전은 파라크라인(paracrine) 인자들을 분비하여 주변 세포를 세포사로부터 보호하고 염증반응을 억제하며 새로운 혈관을 생성하는 것으로 알려져 있다. 이에 따라 지난 수년간 중간엽 줄기세포 연구의 방향 또한 분화 및 미세환경을 조절하는 연구들에 촛점이 맞춰져 있으며, 실제 뼈/연골질환, 심장질환, 위장관 질환, 면역질환을 포함하는 다양한 질환에 대하여 세포치료제로서 임상시험이 활발히 진행되고 있다.
그러나, 줄기세포를 이용한 심장질환 치료와 관련하여, 줄기세포의 병변심근 생착률이 매우 낮을 뿐만 아니라 수일내에 생존능을 상실하는 문제가 있는 바, 이를 극복하기 위하여 다양한 전처리(priming) 또는 물리전기적 자극에 대한 연구가활발하다. 특히, 소실된 심근세포의 재생은 아직까지도 매우 제한적인 연구 결과를 보이고 있는데, 주로 배아줄기세포 또는 역분화줄기세포를 심근세포 또는 심근-유사세포로 분화시키는 연구결과가 보고되었으나, 이 역시 낮은 분화율과 안전성 문제로 임상적용에 큰 걸림돌이 되고 있다.
이에, 5-azacytidine이 중간엽줄기세포를 심근유사 세포로 분화유도시킬 수 있음이 최초로 보고된 이래로, 성체줄기세포의 심근분화 효율을 높이기 위하여 다양한 노력이 집중되고 있다. 예를 들면, FGF-2, activin A, insulin, transferrin 등의 물질 처리, 유전자 도입, 배지조성 변화, 칵테일 요법(5-azacytidine ＋ salvianolic acid B ＋ 심근세포 lysis 배지(CLM)) 등을 통해 성체줄기세포의 심근분화를 유도하기 위한 시도가 계속되고 있다.
그러나, 여전히 변종암이 발생하는 등의 부작용이 있으며, 현재 임상연구에 사용되고 있는 cardiogenic 배지의 조성은 여러가지 재조합 단백질이 필요하고 5일 이상의 세포배양기간을 요하며 매우 고가라는 문제가 있다. 따라서, 상기의 노력에도 불구하고, 아직까지 기존의 인자들에 비하여 부작용이 적으면서 효율적인 심근유사세포로의 분화 유도방법은 거의 밝혀지지 않은 실정이다.
한편, 히스톤 탈아세틸화효소(HDAC, Histone deacetylase)는 히스톤의 아세틸화를 억제하여 세포증식 억제인자의 발현을 저해함으로써, 세포증식을 촉진시키고 세포의 종양화 및 분화를 조절하는 것으로 알려져 있으며, 암이나 염증질환을 비롯한 다양한 질병 치료를 위한 표적으로 많은 주목을 받아 왔다.
또한, HDAC 억제제로서 트리코스타틴 A, 발프론산이 중간엽줄기세포를 골분화 또는 신경분화 유도하는 것으로 보고된 바 있으나(한국특허공개 제2006-0079772호), 아직까지 심근유사세포(cardiac committed cell) 분화와의 상관관계에 대하여는 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 HDAC 억제제중 아피시딘이 중간엽줄기세포를 고효율로 심근 분화촉진함을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 아피시딘을 함유하는 중간엽줄기세포의 심근유사세포 분화촉진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용한 심질환 세포치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 세포치료제를 이용한 심질환 치료방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은, 하기 화학식 1의 아피시딘 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 중간엽줄기세포의 심근유사세포 분화유도용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112015098380110-pat00001
또한, 본 발명은, 상기 조성물에 의해 분화유도된 심근유사세포를 유효성분으로 함유하는 심질환 치료용 세포치료제, 이를 이용한 심질환 치료방법/용도를 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 조성물을 분리된 중간엽줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, in vitro에서 중간엽줄기세포를 심근유사세포로 분화유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 골수, 지방조직, 제대혈 또는 말초혈액에서 유래된 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 아피시딘은 1 내지 3uM의 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 심질환은 심근경색, 협심증, 동맥경화증, 또는 부정맥인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의하면, 아피시딘을 24시간이라는 매우 짧은 시간만 처리하여도, 중간엽 줄기세포를 심근유사세포 특이적으로 분화유도할 수 있는 바, 종래 중간엽줄기세포의 극히 낮은 심근분화 효율, 고비용, 장시간의 문제를 해결할 수 있기 때문에, 심질환 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면, 완전한 심근세포로의 분화가 아닌 심근유사세포(cardiac committed cell)로의 분화를 유도하는 것이기 때문에, 심근 이식후 생착한 다음 심근 미세환경내에서 심근분화가 유도되도록 함으로써, 줄기세포의 생존율과 생착율을 높이고 심근경색 기능을 효과적으로 개선시킬 수 있다.
도 1은 중간엽줄기세포에 HDAC 억제제들(TSA, VPA, AC)을 처리한 후 심근특이 마커(GATA4, Nkx2.5, cTnI) 유전자의 mRNA 발현 정도를 real-time PCR로 비교측정한 결과이다.
도 2는 중간엽줄기세포에 아피시딘을 처리시 심근특이 마커(GATA4, Nkx2.5, cTnI) 단백질의 발현이 증가됨을 면역세포화학염색법(Immunocytochemistry)으로 확인한 결과이다.
도 3은 중간엽줄기세포에 아피시딘을 처리시 줄기세포능/미분화능 유지 마커(nanog, sox2, oct4) 유전자의 mRNA 발현이 저해됨을 real-time PCR로 확인한 결과이다.
도 4는 중간엽줄기세포에 아피시딘을 처리시 골세포 분화마커(Runx2) 및 지방세포 분화마커(PPAR-γ) 유전자의 mRNA 발현이 저해됨을 real-time PCR로 확인한 결과이다.
도 5는 아피시딘을 전처리한 중간엽줄기세포를 심근경색 마우스모델에 이식시, 심근내에서 심근분화가 현저하게 증가됨을 면역세포화학염색법(Immunocytochemistry)으로 확인한 결과이다.
본 발명은, 하기 화학식 1의 아피시딘 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 중간엽줄기세포의 심근유사세포 분화유도용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112015098380110-pat00002
상기 아피시딘(cyclo-(N-O-methyl-L-tryptophanyl-L-isoleucinyl-D-pipecolinyl-L-2-amino-8-oxodecanoyl)은 곰팡이 대사체에서 분리된 물질로서, 종래 p21WAF1/Cip1 경로를 통하여 암세포 증식을 억제하는 HDAC 억제제로 알려져 있다. 본 발명은 이러한 아피시딘 화합물 뿐만 아니라, 생체 또는 시험관내에서 HDAC 억제효능을 나타내는 그 유도체를 포함한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 아피시딘 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용가능한 염 및 이의 용매화물로 제조될 수 있다. '약학적으로 허용가능한 염'은, 특별히 언급되지 않는 한, 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 석시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 아피시딘은 1-100 uM 농도, 바람직하게는 1-10 uM 농도, 더욱 바람직하게는 1-3 uM 농도로 함유되어 있다. 농도가 너무 낮으면 효과를 나타내지 않으며, 농도가 너무 높으면 독성을 가지게 되므로 세포의 종류에 따라 적정한 농도를 확인해야 한다.
본 발명에 있어서 '심근유사세포(cardiac committed cell)'란, 중간엽줄기세포로부터 심근세포로의 분화 과정중에 있는 세포를 모두 포함하는 의미이다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 분리된 중간엽줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 생체외(in vitro)에서 중간엽줄기세포를 심근유사세포로 분화유도하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서 심근유사세포로의 분화유도를 위해 사용되는 중간엽줄기세포의 종류에는 특별한 제한이 없다. 중간엽줄기세포는 공지의 공급원, 예를 들어 골수, 지방조직, 제대혈, 말초혈액 등으로부터 얻을 수 있으며, 특히 골수인 것이 바람직하다. 또한, 골수, 지방조직 등의 채취 대상 동물은 포유동물일 수 있으며, 상기 동물이 인간일 경우 골수, 조직 등은 본 발명의 조성물의 처리에 의해 분화가 유도된 중간엽줄기세포를 세포치료제로서 투여하게 될 환자 자신의 것이나 타인 유래의 것일 수 있다. 이러한 공지의 중간엽 줄기세포 공급원으로부터 중간엽 줄기세포를 수득하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 분화유도를 위한 배지는 당업계에서 통상 사용되는 배지일 수 있으나, 바람직하게는 MEM-α(Minimum Essential Medium alpha), MSCGM(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물에 의해 분화유도된 심근유사세포를 유효성분으로 함유하는, 심질환 치료용 세포치료제를 제공한다.
본 발명에서 심질환에 특별한 제한은 없으나, 심근경색, 협심증, 동맥경화증, 부정맥 등의 심혈관질환인 것이 바람직하다. 또한, 심질환의 치료란, 심질환의 경감, 완화 및 증상의 개선을 포함하며, 또한 심질환이 걸릴 가능성을 낮추는 것을 포함하는 의미이다.
본 발명의 세포치료제는 기존 치료 활성 성분, 기타 보조제, 약제학적으로 허용가능한 담체 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명에서 '개체'란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
또한, 본 발명에서 '약학적 유효량'은 투여되는 질환 종류 및 중증도, 환자의 연령 및 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정되며 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로써 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 본 발명의 치료용 물질의 양을 의미한다. 비제한적 예로서, 본 발명에 의한 세포치료제의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들면 1×104 내지 1×108 세포/㎏일 수 있다.
본 발명의 세포치료제의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥 내, 피하, 복강 내, 흡입, 피부도포 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다.
본 발명에서는, 중간엽줄기세포에 HDAC 억제제들(TSA, VPA, AC)을 처리한 후 심근특이 마커(GATA4, Nkx2.5, cTnI)의 발현 정도를 비교평가한 결과, AC(아피시딘)이 상기 마커들의 mRNA/단백질 발현 모두를 가장 현저히 증가시킴을 확인하였는 바, 아피시딘이 다른 HDAC 억제제들에 비하여 심근분화 유도에 있어서 매우 효과적임을 알 수 있었다(실시예 2 및 3).
또한, 본 발명에서는, 중간엽줄기세포에 아피시딘을 처리시 줄기세포능/미분화능 유지 마커로 알려진 nanog, sox2, oct4 유전자의 발현을 저해함을 확인하였는 바, 아피시딘이 줄기세포로서의 미분화상태 유지를 저해하고, 특정 세포로의 분화를 개시하려는 세포내 신호전달체계를 유도함을 알 수 있었다(실시예 4).
또한, 본 발명에서는, 중간엽줄기세포에 아피시딘을 처리시 골세포 분화마커(Runx2) 및 지방세포 분화마커(PPAR-γ) 유전자의 발현을 저해함을 확인하였는 바, 아피시딘이 골세포나 지방세포가 아닌 심근세포 특이적으로 분화유도한다는 것을 알 수 있었다(실시예 5).
또한, 본 발명에서는, 아피시딘을 전처리한 중간엽줄기세포를 심근경색 마우스모델에 이식시, 심근내에서 심근분화가 현저하게 증가됨을 확인하였는 바, 아피시딘 처리 중간엽줄기세포가 심근유사세포(cardiac committed cell)로 분화 유도되어, 심근 이식 후 생착한 다음 심근 미세환경내에서 심근세포로 분화됨을 알 수 있었다(실시예 6).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 인간 골수유래 중간엽줄기세포의 분리 및 배양
인간에게서 채취한 골수를 PBS(phosphate buffered saline)와 1:1 부피비로 혼합하여 희석한 후, 피콜-하이팩 용액(Ficoll-Hypaque, 밀도 1.077 g/mL, Sigma)에 중첩시켰다. 이때, 피콜-하이팩 용액은 사용 전에 실온이 되도록 하였고, 희석된 골수의 부피가 피콜-하이팩 용액 부피의 3배가 넘지 않도록 하였다. 이를 2,000 rpm의 속도로 상온에서 30분간 원심분리하여 적혈구층과, 단핵구층 및 혈청층을 분리하였다. 파스퇴르 피펫(pasteur pipette)을 이용하여 단핵구층만을 새로운 튜브로 옮기고 PBS로 세척하여 단핵구층 채취 시 혼입된 피콜-하이팩 용액이나 오염된 혈소판을 제거하였다. 이 상태는 '단핵구 (mononuclear cell)'이며, 이로부터 중간엽줄기세포를 분리 및 증폭배양하기 위해, 10% FBS(fetal bovine serum), 100 units/mL 페니실린(Invitrogen-Gibco), 100 μM/mL 스테렙토마이신(Invitrogen-Gibco)이 포함된 low glucose DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) (Invitrogen-Gibco) 세포배양 배지에 1 ~ 2 x105 세포/cm2 농도로 접종하였다. 2-3일 후 비부착세포를 제거하고 2-3주간 단층 배양하여 중간엽줄기세포를 분리 배양하였다.
이후, 상기 분리배양된 인간 골수유래 중간엽줄기세포에 인간 telomerase 유전자를 렌티바이러스에 도입하여 감염시킨 후 telomerase 유전자를 안정적으로 계속 발현하는 세포주를 선별하여 세포주를 구축하였다. 일차배양(primary culture) 세포의 경우, 세포의 수명이 한정되어 있고, 계대배양이 지속될수록 세포 성장능 및 고유의 특성이 변화되므로, telomerase 유전자를 도입하여 분화능 등의 고유 특성은 유지한 채 세포의 수명을 지속시켜 불멸화된 인간 골수유래 중간엽줄기세포를 확립하였다.
실시예 2: HDAC 억제제들에 의한 심근특이 마커 유전자의 발현 비교
본 발명의 아피시딘(AC)이 종래 HDAC 억제제로 널리 사용되고 있는 trichostatin A (TSA), valproic acid (VPA)에 비하여 중간엽줄기세포에서 심근특이 마커 유전자(GATA4, Nkx2.5, cTnI (cardiac tropponin I))의 발현을 현저히 유도하는지 비교평가하기 위하여 real-time PCR을 실시하였다.
우선, 실시예 1에서 준비한 중간엽줄기세포를 6웰 배양접시에서 HIGH glucose/DMEM (4mM L-glutamine, 4500mg/L glucose, sodium pyruvate, 10% FBS, 100U/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin) 배지로 하루동안 배양한 후, TSA 0.5μM, VPA 3mM, AC 1μM, 3μM의 농도로 24시간 동안 처리하였다. 그 다음, 각각의 샘플에서 세포배양액을 제거하고 PBS로 1회 세척한 후 Trizol을 넣어 10분 동안 상온에서 균질화시킨 후 클로로포름을 가하여 원심분리하였다. 원심분리 결과 얻어진 상청액을 회수하여 total RNA를 정제한 후, 역전사 효소(MMLV)를 이용하여 cDNA를 합성하고, 이를 template로 하여 QuantiTect SYBR Green PCR kit로 Real-time PCR을 수행함으로써, 심근특이 마커 유전자(GATA4, Nkx2.5, cTnI)의 발현정도를 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, VPA는 심근특이 마커들 중 GATA4와 cTnI의 mRNA 발현을 촉진시켰으나 AC 만큼 현저하지 못했고, TSA는 cTnI의 mRNA 발현에만 유의성이 있었고 다른 심근특이 마커들에서는 별다른 효과를 확인할 수 없었다(대조군: vehicle, Veh). 반면, AC에 의한 심근특이 마커들의 발현이 가장 현저하였으며, 특히 AC가 3μM의 농도일 경우(AC3) 그 효과가 가장 우수하였다. 따라서, HDAC 억제제중에서 아피시딘이 다른 억제제들에 비하여 심근분화 유도에 있어서 매우 효과적임을 알 수 있다.
실시예 3: 아피시딘에 의한 심근특이 마커 단백질 발현 유도
상기 실시예 2를 통하여, 아피시딘(3μM)을 처리한 경우가 심근분화 유도 효과가 가장 우수함을 확인하였기 때문에, 아피시딘(3μM)에 의한 심근분화 마커들의 단백질 발현을 더욱 분석하기 위하여 면역세포화학염색법(Immunocytochemistry)을 실시하였다.
우선, 중간엽줄기세포를 12웰 배양접시에서 HIGH glucose/DMEM 배지로 하루동안 배양한 후, AC 3μM의 농도로 24시간 동안 처리하였다. 그 다음, 샘플에서 세포배양액을 제거하고 PBS로 1회 세척한 후 3.7% 마스크폼에 15분간 고정시켜 0.1% triton X-100으로 10분간 침투시켰다. Normal goat serum으로 1시간 동안 블록킹시킨 다음, 항-GATA4, Nkx2.5, cTnI 1차 항체로 4℃에서 밤새 배양하고, 형광염료(Alexa 488, Alexa 594)로 표지된 2차 항체를 1시간동안 처리한 후, 형광 stain인 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 핵염색 후 마운팅하여 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 2의 결과와 마찬가지로, 3가지의 심근특이 마커들(GATA4, Nkx2.5, cTnI)의 세포내 단백질 발현 또한 현저히 증가하였음을 확인하였다.
실시예 4: 아피시딘에 의한 줄기세포 미분화 특성 상실효과
줄기세포능/미분화능을 유지하는데 nanog, sox2, oct4와 같은 전사인자가 중요하다고 알려져 있기 때문에, 아피시딘(3μM)을 처리할 경우 이들 전사인자의 mRNA 발현에 어떠한 변화가 일어나는지 확인하기 위하여 real-time PCR을 실시하였다.
우선, 중간엽줄기세포를 12웰 배양접시에서 HIGH glucose/DMEM 배지로 하루동안 배양한 후, AC 3μM의 농도로 24시간 동안 처리하였다. 그 다음, 샘플에서 세포배양액을 제거하고 PBS로 1회 세척한 후 Trizol을 넣어 10분 동안 상온에서 균질화시킨 후 클로로포름을 가하여 원심분리하였다. 원심분리 결과 얻어진 상청액을 회수하여 total RNA를 정제한 후, 역전사 효소(MMLV)를 이용하여 cDNA를 합성하고, 이를 template로 하여 QuantiTect SYBR Green PCR kit로 Real-time PCR을 수행함으로써, 전사인자(nanog, sox2, oct4)의 발현정도를 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 줄기세포의 미분화 특성을 유지하는데 중요한 3가지 인자인 nanog, sox2, oct4의 발현이 AC 3μM 처리에 의하여 현저하게 감소하였음을 알 수 있었다. 이러한 결과는, 아피시딘이 줄기세포로서의 미분화상태 유지를 저해하고, 특정 세포로의 분화를 개시하려는 세포내 신호전달체계를 유도한다는 것을 의미하는 것이다.
실시예 5: 아피시딘에 의한 골세포( Runx2 ) 및 지방세포( PPAR -γ)로의 분화 억제
중간엽줄기세포는 골세포나 지방세포로도 분화가능하며, 이때 Runx2는 골세포로 분화시 발현되며 조골세포 유전자 발현조절 전사인자이고, PPAR-γ는 지방세포로 분화시 발현되며 지방세포 유전자 발현조절 전사인자로 알려져 있다. 따라서, 아피시딘(3μM)을 처리할 경우 이들 전사인자의 mRNA 발현에 어떠한 변화가 일어나는지 확인하기 위하여 real-time PCR을 실시하였다.
우선, 중간엽줄기세포를 12웰 배양접시에서 HIGH glucose/DMEM 배지로 하루동안 배양한 후, AC 3μM의 농도로 24시간 동안 처리하였다. 그 다음, 샘플에서 세포배양액을 제거하고 PBS로 1회 세척한 후 Trizol을 넣어 10분 동안 상온에서 균질화시킨 후 클로로포름을 가하여 원심분리하였다. 원심분리 결과 얻어진 상청액을 회수하여 total RNA를 정제한 후, 역전사 효소(MMLV)를 이용하여 cDNA를 합성하고, 이를 template로 하여 QuantiTect SYBR Green PCR kit로 Real-time PCR을 수행함으로써, 골세포 분화마커(Runx2) 및 지방세포 분화마커(PPAR-γ)의 발현정도를 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 중간엽줄기세포는 AC 3μM 처리에 의하여 골세포 분화마커(Runx2)나 지방세포 분화마커(PPAR-γ)의 발현이 현저히 저하되었음을 확인하였다. 이러한 결과는, 아피시딘이 줄기세포로서의 미분화상태 유지를 저해할 뿐만 아니라, 골세포나 지방세포가 아닌 심근세포 특이적으로 분화유도한다는 것을 의미하는 것이다.
실시예 6: in vivo 심근경색 동물모델에서 아피시딘에 의한 심근분화 유도
상기 실시예의 in vitro 데이터에 더하여, in vivo 심근경색 동물모델에서도 아피시딘을 전처리한 중간엽줄기세포를 이식하였을 경우 심근내에서 심근분화가 유도되는지 확인하였다. 동물 연구에 대한 모든 실험 과정은 전남대학교 의과대학 실험동물운영위원회에 의해 승인을 받았으며, 동물 보호에 대한 위원회의 가이드라인과 조정에 따라 수행되었다.
우선, 심근 경색증 동물모델은 선천성 면역결핍 마우스인 SCID mouse(BALB/c-nude 수컷 마우스, 8주령)을 사용하였으며, 좌전하방(left anterior descending, LAD) 관상동맥 폐색 수술로 심근경색증을 야기시켰다. 케타민(50 mg/kg)과 자일라진(5 mg/kg)으로 마취 후, 산소호흡기를 이용하여 95% O2 및 5% CO2로 마우스를 산소호흡시켰다. 3번째와 4번째 갈비뼈 사이에 리트렉터로 고정시킨 후 흉부를 열고, 좌심방 부속물 아래의 왼쪽 관상동맥의 근위 부분을 7-0 실크 봉합사로 감싸도록 묶고, 5-0 실크 봉합사로 피부를 봉합한 후 봉합부위를 소독하였다.
심근경색 유발 7일 후에 세포 이식을 위해, 3개의 그룹(① PBS, ② 미처리 중간엽줄기세포, ③ AC 처리 중간엽줄기세포)으로 나누고, 미처리 중간엽줄기세포(MSC)와 AC 처리 중간엽줄기세포(AC/MSC)를 DAPI로 표지하였다. 이를 위해 우선, 멸균 DAPI 용액을 50㎍/ml의 최종 농도로 세포배양 배지에 가하고 PBS로 4회 세척한 후, 이식을 위해 각 세포들은 30㎕의 PBS에 현탁시키고(3×105 cells), 30-게이지의 바늘을 이용하여 심근경색 영역에서부터 변연부까지 주입하였다. PBS 그룹은 심근경색 유발 마우스에 동일한 양의 PBS만을 주입하였다. 세포 주입 2주 후에 마우스를 희생시켜 심장을 적출하고, 액체 질소에 냉동시킨 후 O.C.T. compound로 동결포매한 다음, 심장조직을 10 ㎛의 두께로 슬라이드 절편화하여 면역조직화학염색을 실시하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, AC을 전처리한 중간엽줄기세포(AC/MSC)를 이식하였을 경우, 미처리 중간엽줄기세포(MSC)를 이식하였을 때보다 심근특이 구조 단백질인 Cadiac troponin I(cTnl)의 발현이 현저하게 증가하였다. 이러한 결과는, 이식한 AC 처리 중간엽줄기세포가 cardiac committed 세포(심근유사세포)로 분화 유도되어, 심근 이식 후 생착한 다음 심근 미세환경내에서 심근세포로 분화됨을 의미하는 것이다.

Claims (7)

  1. 하기 화학식 1의 아피시딘 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 중간엽줄기세포의 심근유사세포 분화유도용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112015098380110-pat00003
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 골수, 지방조직, 제대혈 또는 말초혈액에서 유래된 것임을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 아피시딘은 1 내지 3uM의 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 분리된 중간엽줄기세포에 제 1 항의 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 시험관내(in vitro)에서 중간엽줄기세포를 심근유사세포로 분화유도하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 조성물은 아피시딘이 1 내지 3uM의 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
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