KR102404092B1 - Bicd1 발현 증가를 통해 허혈적응능력과 치료기능이 향상된 줄기세포와 그 제조방법, 및 이를 포함하는 세포치료제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 BICD1 (Bicaudal D homolog 1)발현 증가를 통해 허혈적응능력과 치료기능이 향상된 줄기세포; 상기 줄기세포 또는 상기 중간엽 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 함유하는, 허혈성 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물; 및 BICD1의 발현을 증가시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 저산소 상태에서 치료기능이 향상된 줄기세포의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명은 BICD1을 매개로한 HIF1α 핵이동 조절기전과 조절 물질을 규명하여 허혈적응 조절에 관한 새로운 접근 방법을 제시하였다는 점에서 의의가 있으며, 중간엽 줄기세포의 치료적 적용에 있어서 그 효율성을 현저히 증대시킬 수 있는바, 의학, 제약학, 수의학 등 분야에 있어서 널리 활용될 수 있다.

Description

BICD1 발현 증가를 통해 허혈적응능력과 치료기능이 향상된 줄기세포와 그 제조방법, 및 이를 포함하는 세포치료제 조성물 {Stem cell having improved hypoxia adaptation and therapeutic potential by induction of BICD1 expression and method for preparing the same, and cell therapeutic composition comprising the same}

본 발명은 BICD1 발현 증가를 통해 허혈적응능력과 치료기능이 향상된 줄기세포와 그 제조방법, 및 이를 포함하는 세포치료제 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 BICD1의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는, 저산소 상태에서 치료기능이 향상된 줄기세포; 상기 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 함유하는, 허혈성 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물; 및 BICD1의 발현을 증가시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 저산소 상태에서 치료기능이 향상된 줄기세포의 제조방법에 관한 것이다.

중간엽 줄기세포는 배아줄기세포와 달리 성장한 신체에서 분리된 세포로 그 유래에 따라 골수, 제대혈, 지방 등의 중간엽 줄기세포로 분류된다. 따라서 윤리적 문제에 대한 논쟁의 여지가 적으나, 중간엽 줄기세포의 증식력 및 분화능의 한계로 인하여, 그 치료적 효과의 일관성 유지와 효율성 증진이 매우 중요하다.

이식된 줄기세포의 생착은 줄기세포를 이용한 치료의 성공여부를 좌우하는 매우 중요한 요소이다. 체내에 이식된 줄기세포는 주변 혈관 분포로 인해 극심한 저산소 환경에 노출되게 되고, 이 때 줄기세포에서는 저산소 환경에서 생존하기 위해 허혈적응이라는 생리학적 대사전환이 일어나게 된다(McInyre A et al., EMBO molecular medicine, 7(4):368-379, 2015). 허혈적응은 산소 환경에서 세포사멸을 유도하는 세포내 활성산소종 생성을 저해하여 줄기세포 기능을 유지시키고 생존율을 증가시킨다(Chen J. et al., Exp Hematol., 44(9):866-873 e4, 2016; Cheloni G. et al., Stem cells international., 2017:4979474, 2017). 그러나 허혈적응에 실패한 줄기세포는 사멸되며, 그에 따라 줄기세포 이식 치료 효과가 저해되는바, 허혈적응능력을 개선시킬 수 있는 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.

저산소 상태에서의 줄기세포의 대사 변화는 산소 신호에 의해 활성화된 줄기세포 기능을 조절하기 위한 전제 조건이다(K. Ito et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 15:243-256, 2014; J. M. Ryu et al., Int. J. Stem Cells, 8:24-35, 2015). 재생의학에 있어서, 저산소 상태에서의 줄기세포 조절은 정상산소 상태와 비교할 때, 줄기세포 기능 조절에 있어서 많은 장점을 가진다는 것이 보고된바 있다(H. Adollahi et al., J. Surg. Res.,165:112-117, 2011; A. Lavrentieva et al., Cell Commun. Signal., 8:18, 2010). 그러나, 저산소 상태에 의한 줄기세포의 기능 조절을 향상시키고 지속시키는 본질적인 대사 인자는 완전히 설명된 적이 없다. 저산소 상태에서 대사와 줄기세포 생리 사이의 관계를 밝히기 위한 연구는 재생의학에 있어서 임상적 적용을 위한 줄기세포-기반 치료법을 최적화할 필요성이 있다.

최근에는 줄기세포 이식 시 발생하는 산화적 스트레스, 이식생착률 저하 및 이식 치료 효과 저하 현상을 개선할 수 있는 방안으로 허혈적응 능력을 조절하는 방법이 주목되고 있다. 줄기 세포의 기능과 이식생착률을 증가시키기 위해, 허혈유도인자를 과발현시키거나 허혈전처리법을 적용하는 것 등이다.

BICD1(Bicaudal D homolog 1)은 세포 내 생체트럭을 구성하는 주요 구성요소로서 미세소관을 타고 세포소기관, 단백질, 바이러스 등 다양한 물질을 운송하는 역할이 알려져 있다. 특히, BICD1은 주로 생체트럭 단백질인 Dynein과 결합한 후 특정 방향의 물질 운송을 조절하는 것으로 알려져 있다.

이러한 BICD1은 허혈유도인자인 HIF1α와 상호작용하여 작동하는데, HIF1α는 전사, 번역, 안정화, 번역후수정과 같은 다양한 경로를 통해서 활성이 조절되는 것으로 밝혀졌으나, 허혈환경에서 HIF1α의 자세한 작용 기작에 대해서는 상세하게 알려진 바는 없다. 따라서 줄기세포의 효과적인 허혈적응유도와 산화적 스트레스 제어, 줄기세포의 치료 효능 증진을 위해 HIF1α의 핵 내 이동 조절기전이 명확히 규명될 필요가 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 예의 노력한 결과, 미세소관 운동단백질인 BICD1이 줄기세포에서 HIF1α 핵 내 이동을 조절하는데 중요한 역할을 하고 있으며, 이를 조절할 수 있는 물질의 신규한 용도를 최초로 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은, BICD1 (Bicaudal D homolog 1)의 발현 증가를 통해 허혈적응능력과 치료기능이 향상된 줄기세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은, 상기 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 함유하는, 허혈성 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은, BICD1 (Bicaudal D homolog 1)의 발현을 증가시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 저산소 상태에서 치료기능이 향상된 줄기세포의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 BICD1 (Bicaudal D homolog 1)의 발현 증가를 통해 허혈적응능력과 치료기능이 향상된 줄기세포를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 함유하는, 허혈성 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, BICD1 (Bicaudal D homolog 1)의 발현을 증가시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 저산소 상태에서 치료기능이 향상된 줄기세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 BICD1이 미세소관을 매개로 한 HIF1α의 핵 내 수송을 중개하는 역할을 통해 허혈 적응 조절에 대한 새로운 접근 전략을 제시하였고, BICD1의 발현을 조절 가능한 물질을 신규하게 규명함 것에 핵심적인 의의가 있으며, BICD1 조절을 통해 줄기세포 치료제의 효능 증진 기술 개발에 활용 가능하므로, 본 발명은 의학, 제약학, 수의학 등 다양한 산업 분야에 있어서 널리 활용될 수 있다.

도 1 내지 도 8은 저산소증 하에서 미토콘드리아 ROS 축적 및 UCB-MSC의 아폽토시스에 대한 cP1P의 효과에 관한 것이다.
도 9 내지 도 13은 UCB-MSC에서 포도당 대사에 대한 cP1P의 효과에 관한 것이다.
도 14 내지 도 23은 UCB-MSC의 아폽토시스 및 치료 효능에 관한, cP1P-유도된 HIF1α의 효과에 대한 것이다.
도 24 내지 도 31은 cP1P-유도된 HIF1α 번역에서 S1PR1의 역할에 관한 것이다.
도 32 내지 도 40은 cP1P-유도된 HIF1α 발현에서 칼슘-의존적 PKCα/mTOR 경로의 관여에 관한 것이다.
도 41 내지 도 46은 cP1P-유도된 HIF1α 발현에서 BICD1의 역할에 관한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 허혈적응에 필요한 인자인 HIF1의 수송에 중요한 역할을 담당하는 단백질로 BICD1을 발굴하였으며, BICD1에 의한 HIF1 핵 내 수송 기전에 대한 연구를 통하여 AKT/GSK3β의 활성이 중요하고, 이를 조절하여 줄기세포의 치료효능을 증진시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명은 일 관점에서, BICD1 (Bicaudal D homolog 1)의 발현 증가를 통해 허혈적응능력과 치료기능이 향상된 줄기세포에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 함유하는, 허혈성 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, BICD1의 발현을 증가시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 저산소 상태에서 허혈적응능력과 치료기능이 향상된 줄기세포의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, BICD1의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는, 허혈적응능력과 치료기능이 향상된 줄기세포를 지질대사질환 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환의 치료방법에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, BICD1의 발현을 증가시켜 줄기세포의 치료기능을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, "줄기세포"란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 가지는 세포를 의미한다.

본 발명에 있어서, "세포치료제"란 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로, 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

본 발명에 있어서, "저산소 상태(hypoxia)"는 혈액에 의한 조직의 적절한 관류에도 불구하고 조직으로의 산소공급이 생리 수준 미만으로 감소한 상태를 의미한다. 본 발명의 "저산소 상태"는 세포에 공급되는 세포의 양이 대기에서 약 20% O2에 비하여 현저하게 적은 상태, 예를 들면 1% O2를 의미한다.

본 발명에 있어서, BICD1의 발현이 증가된 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 HIF-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha), 및 AKT/GSK3β의 활성화를 통해 BICD1의 발현이 증가된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, BICD1 발현 조절을 통해 줄기세포의 허혈적응능력이 개선된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 더욱 바람직하게는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, "중간엽 줄기세포"란 골, 연골, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등으로 분화될 수 있는 미분화된 줄기세포를 의미하는데, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대혈, 말초혈액, 기타 조직 등에도 존재하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 줄기세포에 P1P (phytosphingosine-1-phosphate), cP1P (O-cyclic phytosphingosine-1-phosphate) 및/또는 S1P (sphingosine-1-phosphate)이 전처리된 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로 cP1P(O-cyclic phytosphingosine-1-phosphate)이 전처리된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 허혈성 질환은 구체적으로 허혈성 피부 병변, 동맥 경화로 인한 허혈성 심장 질환, 허혈성 뇌졸증, 허혈성 급성 신부전증 또는 허혈성 하지질환(족부궤양)일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 허혈성 심장 질환은 협심증 또는 심근경색증 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 세포치료제 조성물은 총 중량에 대하여 상기 줄기세포를 바람직하게는 0.01 내지 99.9중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포치료제 조성물은 세포치료제 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 세포치료제 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

상기 세포치료제 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 적어도 면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 상기 약학적 조성물의 경구투여를 위한, 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포치료제 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 조성물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.

상기 세포치료제 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 통상의 방법에 의할 수 있고, 일 예로 경구 및 직장 또는 정맥등의 방법을 통하여 투여 할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 실험 재료 및 방법

1-1: 실험 재료

서울대학교 생명윤리심의위원회의 승인에 따라 UCB-MSC에 대한 실험이 진행되었다 (SNUIRB No E1707/002-003). UCB-MSC는 서술된 문헌(Yang, S. E. et al. Mesenchymal stem/progenitor cells developed in cultures from UC blood. Cytotherapy 6, 476-486 (2004))에 따라 분리 및 배양하였고, 표면 항원 프로파일 분석을 실시하였다.

P1P (phytosphingosine-1-phosphate) 및 cP1P (O-cyclic phytosphingosine-1-phosphate)를 Axceso에서 획득하였으며, cP1P는 0.01N NaOH 용액에 용해시켜 준비하였다. 0.01 N NaOH 용액은 cP1P 처리에 대한 대조군으로 준비하였다. S1P (sphingosine-1-phosphate), 4', 6-diamidino-2-phenylindol, cycloheximide, JTE013, VPC23019, BAPTA-AM, Rapamycin, A23187, PF4708671 외 기타 재료를 준비하였다.

1-2: UCB-MSCs 및 SK-N-MCs의 배양

UCB-MSC를 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 α-최소 필수 배지(α-MEM)를 포함하는 기본 배양 배지에서 배양하였다. UCB-MSC는 37℃및 5% CO₂로 유지된 배양기 내의 6- 및 12-웰 배양 접시와 60, 또는 100 mm 직경의 배양 접시에 플레이팅하였다. 실험 전 24시간 전에, 배양 배지는 serum free-α-MEM으로 교체하였다. 배양 후, PBS로 세포를 2번 세척한 후 세포를 배양하였다. 허혈 환경은 UCB-MSC를 모듈식 저산소 배양 챔버(Billups-Rothenberg, Del Mar, CA, USA)에서 배양함으로써 구성하였고, 저산소 가스는 0.5% O₂, 5% CO₂, 및 94.5% N₂로서 15분 동안 5L/min의 유속으로 주입하였다. SK-N-MC 세포는 10% FBS, 및 1% penicillin-streptomycin이 포함된 DMEM 배지에서 배양하여 준비하였다.

1-3: 세포 내 ROS, 미토콘드리아 ROS 및 미토콘드리아 막 전위의 측정

세포 내 ROS, 미토콘드리아 ROS 및 미토콘드리아 막 전위를 측정하기 위해 DCFDA (Thermo Fisher Scientific, # C6821), MitoSOX Red (Thermo Fisher Scientific, # M36008) 및 테트라메틸로다민 에틸 에스테르 퍼클로레이트 (TMRE, Sigma-Aldrich, # 87917)를 사용하였다. DCFDA, MitoSOX 및 TMRE의 형광 강도를 유세포 분석기에서 측정하였다. 염색되지 않은 세포 데이터는 단일 플루오로크롬 염색의 fluorescence-minus-one (FMO) 대조군으로서 제시되었다. 유세포 분석 데이터의 양성 부분을 결정하기 위해 FMO 대조군 샘플을 적용하였다.

1-4: 젖산 탈수소 효소 (LDH) 세포 독성 분석

LDH 농도 측정 전에, UCB-MSC 세포 농도는 LDH 방출 분석에 의해 제공된 프로토콜에 따라 최적화되었다 (EZ-LDH, DoGenBio, Seoul, Korea, #DG-LDH500). UCB-MSC (1Х10⁴ 세포/웰)를 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 90% 합류에서 성장시키고, 배지를 무혈청 α-MEM으로 교환 하였다. 실험 설계에 따라 72 시간 동안 처리 한 후, 플레이트를 600 x g에서 5 분 동안 원심분리 하였다. 배양 상청액 (10 μL)을 수집하고 LDH 반응 혼합물(100 μL)과 혼합 하였다. 실온에서 30분 배양 후, 마이크로 플레이트 분광 광도계 (Epoch 2; BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 450 nm에서 광학 밀도를 측정하였다.

1-5: 아넥신(Annexin) V/PI 아폽토시스 분석-FACS

UCB-MSC의 아폽토시스를 평가하기 위해, 플루오레세인 이소티오시아 네이트-접합된 아넥신 V (annexinV-FITC) 및 프로피디움 요오다이드(PI)-더블 염색 분석을 아넥신 V-FITC 아폽토시스 검출 키트 (# 556547, BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 공급 업체의 지침에 따라 수행하였다. 처리 후, 시판 키트가 제공된 결합 완충액에 세포 (1Х10⁵)를 현탁시켰다. 아넥신 V-FITC (5μL) 및 PI (5μL)를 모두 세포 현탁액 용액에 첨가한 다음, 실온에서 15분 동안 배양 하였다. UCB-MSC 아폽토시스는 유세포 분석법 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)을 사용하여 측정하였다. similar side- 및 forward-scatter Levels을 나타내는 셀 (3 Х 10³)은 flowing software2 (Perttu Terho 개발)를 사용하여 측정하였다. AnnexinV 음성 및 PI 음성 (Q3) 세포는 생존 가능한 것으로 간주되었다. AnnexinV 음성 및 PI 양성 (Q1), annexinV 양성 및 PI 양성 (Q2) 및 annexinV 양성 및 PI 음성 (Q4)은 각각 후기 apoptotic/necrotic, apoptotic 및 초기 apoptotic 세포로 간주하였다. 총 아폽토시스 세포의 백분율은 하기 식에 기초하여 결정하였다: 아폽토시스 세포 = Q2 + Q4.

1-6: WST-1 증식 분석

UCB-MSC의 증식 및 생존력은 제조사의 지시에 따라 WST-1 세포 생존력 분석 키트 (EZ-Cytox; Daeil Labservice, Seoul, Korea, # EZ-1000)를 사용하여 결정하였다. 간략하게, 96-웰 플레이트에서 배양된 UCB-MSC를 48 시간 동안 cP1P, S1P 및 P1P로 처리하였다. 세포를 5 % CO₂와 함께 37℃에서 30분 동안 100 μL의 배지의 10 μL의 EZ-Cytox 용액에서 배양하였다. 이어서 흡광도를 마이크로 플레이트 분광 광도계 (Epoch 2; Bio Vek Instruments, Winooski, VT, USA)를 사용하여 측정하였다.

1-7: Oris migration 분석

세포 (1 x 10⁴)를 Oris 이동분석 플레이트 (Platypus Technologies, WI, USA, # CMACC1.101)의 각 웰에 플레이팅 하였다. 스토퍼를 부드럽게 제거하고 cP1P, P1P 및 S1P로 처리 하였다. 제조된 플레이트를 24 시간 동안 배양 하였다. 세포를 5 μM의 칼세인(calcein) AM (Thermo Fisher Scientific, # C1430)으로 30분 동안 염색 하였다. 무세포 구역으로 이동하는 세포는 excitation/emission = 485/535 nm에서 microplate reader(Victor3; PerkinElmer, Norwalk, CT)를 사용하여 검출하였다.

1-8: Tri-lineage differentiation of UCB-MSCs

기능적 특성 분석을 위해 UCB-MSC를 12-웰 플레이트에 플레이팅하고 특정 분화 배지 (StemPro Osteogenesis Differentiation Kit (# A1007201, Gibco), StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit (# A1007101, Gibco), 및 StemPro Adipogenesis Differentiation Kit (# A1007001, Gibco)를 사용하여 조골 세포, 연골 세포 및 지방 세포로 분화시켰다. 14-21 일 후, 세포를 10 % 동안 4% 파라포름알데히드 (PFA; 서울, Lugen Sci, #LGB-1175)로 고정시키고 PBS로 세척 하였다. 골 형성, 연골 형성 및 지방 생성 분화를 평가하기 위해, 세포를 각각 알칼리 포스파타제 (ALP) 염색, 사 프라닌-O 용액 및 오일 레드 O로 30 내지 60 분 동안 염색하고 현미경을 사용하여 가시화하였다. MSC의 지방 세포 분화 잠재력을 비교하기 위해, 오일 레드 O-염색된 세포를 100% 이소프로필 알코올에서 용리시켰다. 분광 광도계를 사용하여 500 nm에서의 흡광도를 측정하였다. UCB-MSC에서의 조골 세포 분화 수준은 제조사의 지시에 따라 알칼리성 포스파타제, 디에탄올 아민 검출 키트 (Sigma-Aldrich, # AP0100)로 평가하였다. UCB-MSC를 골 형성 분화 배지 (Gibco) 또는 정상 성장 배지에서 14 일 동안 인큐베이션 하였다. 분화된 세포 (1 Х 10⁵)를 PBS 중 1 % 트리톤 X-100으로 용해시키고 4℃ 15,000 rpm에서 5분 동안 원심 분리 하였다. 상청액을 반응 완충액에서 포스파타제 기질 (p-니트로페닐포스페이트)과 혼합 하였다. ALP 활성을 405 nm, 37 ℃에서 20 분 동안 분광 광도계로 측정 하였다. ALP 활성은 최대 선형 속도 (△A405 nm / min)의 비교에 의해 계산하였다.

1-9: RT2 포도당 대사 PCR 분석

포도당 대사 RT2 프로파일러 PCR 어레이 (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 제조사의 지시에 따라, 24시간 동안 cP1P로 처리한 세포에서 포도당 대사 관련 유전자 발현을 분석하는데 사용하였다. 본 어레이에서, 일련의 최적화된 프라이머 분석법은 Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Germany)에 의해 로터 유전자 스타일 튜브에서 84개의 유전자 및 5개의 housekeeping 유전자에 대한 mRNA 전사체 검출이 가능하다. Qiagen 웹사이트의 GeneGlobe Data Analysis Center를 사용하여 PCR 어레이 데이터를 분석하였다. 2 초과의 배수 변화 및 0.05 미만의 p-값을 갖는 상향 조절된 당분해 및 하향 조절된 TCA 사이클 유전자를 선택하였다.

1-10: 헥소키나제 활성 및 젖산 생산 측정

hexokinase colorimetric (Biovision, Mountain View, CA, USA, # K789) 및 lactate colorimetric assay kits (Biovision, # K607)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 UCB-MSC 헥소키나제 활성 및 젖산 생산을 측정 하였다. UCB-MSC 헥소키나제 활성 및 세포 락테이트 수준을 각각 450 nm 및 570 nm에서 마이크로 플레이트 판독기로 측정하였다.

1-11: 미토콘드리아 및 해당(glycolysis) 스트레스 테스트

미토콘드리아 스트레스 테스트 검정 하의 산소 소비율 (OCR) 및 당분 해 스트레스 테스트 검정 하의 세포외 산성화 속도 (ECAR)는 Seahorse XF24 세포 외 플럭스 분석기 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. XF 세포 미토 스트레스 테스트 키트 (Agilent Technologies, # 103015 100) 및 XF 당분 해 스트레스 테스트 키트 (Agilent Technologies, # 103020-100)를 각각 사용하여 미토콘드리아 및 당분 해 스트레스 테스트 분석을 제조사의 지시에 따라 수행하였다. UCB-MSC (1 Х 10⁴ 세포/웰)를 XF24 세포 배양 마이크로 플레이트 (Agilent Technologies, # 100777-004)에서 배양 하였다. 미토콘드리아 스트레스 테스트 분석을 위해, 올리고 마이신 (1μM), 카보닐 시아나이드-4-(트리플루오로메 톡시) 페닐하이드라존 (FCCP, 0.5μM) 및 안티마이신 A 및 로테논 혼합물 (0.5μM)을 세포 배양 플레이트로 처리하여 기초 호흡, 최대 호흡 및 여분의 호흡 능력을 포함한 미토콘드리아 호흡을 측정하였다. 해당 분해 스트레스 테스트 분석을 위해, D-글루코스 (10mM), 올리고마이신 (1μM) 및 2-데옥시-D-글루코스 (50mM)를 세포 배양 플레이트로 처리하여 해당 분해, 해당 과정을 포함한 해당 분해 흐름을 측정하였다.

1-12: 실시간 정량 PCR

UCB-MSC를 cP1P 또는 비히클로 처리한 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고 완충액 -RL 첨가된 50X DTT 용액으로 용해시켰다. 제조업체의 지침에 따라 RNA 추출 키트 (일본 도쿄, 타카라, # 9767)를 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. 역전사 PCR (RT-PCR)을 Maxime RT 프리믹스 키트 (iNtRON, Sungnam, Korea, # 25081)와 함께 1㎍의 총 RNA로 수행하였다. cDNA는 MyGenie 96 (Bioneer, Daejeon, Korea)과 함께 Maxime PCR PreMix Kit (iNtRON, # 25165)를 사용하여 증폭되었다. TB 유전자 프리믹스 Ex Taq (TaKaRa, # RR420A)와 함께 Rotor-Gene 6000 장치 (Corbett Research, Cambridge, UK)를 사용하여 표적 유전자의 상대 mRNA 발현 수준을 분석하였다. 실시간 정량적 PCR을 위한 PCR 프라이머의 특이성, 효율성 및 정확도는 PCR 산물을 확인하고 용융 곡선 분석을 통해 검증하였다. SLC2A1, LDHA, PDK1 및 NHE1의 상대 mRNA 발현 수준을 델타-델타 Ct 방법을 사용하여 분석하였다. 18S rRNA 유전자를 표준화 기준 유전자로 사용하였다.

1-12: 세포 내 pH 측정

세포 내 pH 지시약인 BCECF-AM (Thermo Fisher Scientific, # B1150)으로 UCB-MSC를 염색하여 세포 내 pH를 측정하였다. cP1P를 24 시간 동안 처리 한 후, 세포를 PBS로 2 회 세척하고, 세포를 PBS 중 2μM의 BCECF-AM에서 배양하고 37℃에서 10분 동안 유지시켰다. 이어서 세포를 PBS로 헹구었다. BCECFAM 형광 강도는 마이크로 플레이트 리더 (Victor3)를 사용하여 여기/방출 = 485/535nm에서 측정되었다.

1-13: 작은 간섭 RNA (siRNA) 형질 감염

UCB-MSC를 항생제 없이 25nM의 표적된 siRNA 및 형질감염 시약 TurboFect (Thermo Fisher Scientific, MA, USA, USA, # R0531)와 함께 24 시간 동안 인큐베이션 하였다. 배지는 무혈청 α-MEM으로 변경하였다. 대조군 siRNA로서 NT siRNA를 사용 하였다.

1-14: 웨스턴 블롯팅 및 아세포 분획

단백질 농도는 bicinchoninic acid (BCA) 단백질 분석 키트 (Pierce, Rockford, IL, USA, # 23225)를 사용하여 결정하였다. 샘플 단백질을 SDS-PAGE로 분해하고 PVDF 막으로 옮겼으며, 이를 1차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 특정 밴드는 ChemiDoc XRS +시스템 (Bio-Rad, Richmond, CA, USA)을 사용하여 시각화하였다. 세포질 분획을 수행하여 시토졸, 막 및 핵단백질을 분리하였다. 세포를 100mm 접시에서 배양하고 지시된 시약으로 처리 하였다. 세포질, 막 및 핵분획화 샘플을 제조하기 위해 EzSubcell 세포하 분획/추출 키트 (Atto, Tokyo, Japan, # WSE-7421)를 사용 하였다. 제조사의 지시에 따라 웨스턴 블롯 분석을 위해 세포질, 막 및 핵 샘플을 제조 하였다. Pan-cadherin 및 Lamin A/C를 각각 막 및 핵 단백질 마커로 사용하였다.

1-15: HIF1 전사 활동 측정

HIF1의 전사 활성을 평가하기 위해, HIF1-반응성 dual firefly/renilla luciferase를 갖는 시그날 리포터 분석 시스템을 Qiagen (# CCS-007L)으로부터 획득하였다. HIF1 리포터 활성을 이중 루시퍼라제 리포터 분석 시스템 (Promega, Madison, WI, USA, # E1910)으로 측정하였다. 제조업체의 지침에 따라, UCB-MSC를 Lipofectamine Stem transfection reagent (Thermo Fisher Scientific, # STEM0015)로 S1PR1, S1PR3 및 NT (25 nM)에 대한 시그날 리포터 구축물 (200ng) 및 siRNA로 24 시간 동안 처리 하였다. 이중 루시퍼라제 리포터 분석은 제조사의 지시에 따라 수행되었다. firefly 및 renilla의 루시퍼라제 활성을 루미노미터 (Victor3)를 사용하여 측정 하였다.

1-16: 트립판 블루 제외 세포 생존력 분석

UCB-MSC를 HIF1A siRNA 또는 NT siRNA로 24 시간 동안 형질 감염시킨 후, 세포를 72 시간 동안 cP1P로 처리 하였다. UCB-MSC를 PBS로 2회 세척하고 단일 세포로 트립신 처리 하였다. 세포 현탁액 용액을 1,500 Х g에서 5 분 동안 원심 분리 하였다. 세포 펠렛을 PBS로 현탁시키고 PBS (1 : 1 비)에서 0.4 % 트리판 블루 (Sigma-Aldrich, # T6146)로 염색 하였다. Countess II 자동 세포 계수기 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 세포 생존력을 분석 하였다.

1-17: 마우스 스킨 플랩 모델

실험 동물을 이용한 모든 절차는 서울대학교의 동물 관리 사용위원회 (SNU-181120-4)가 승인한 프로토콜에 따라 수행되었다. 8주령 수컷 ICR 마우스를 실험실 동물 시설에서 12 시간 명/암주기 및 20 내지 25℃의 온도로 유지시켰다. 마우스를 5 가지 그룹으로 나누었다: 비히클 주사 야생형 마우스 (그룹 1, n = 6); NT siRNA 단독 (그룹 2, n = 6) 또는 NT siRNA 및 1μM cP1P (그룹 3, n = 6)로 전처리 된 UCB-MSC를 수용하는 마우스; HIF1A siRNA 및 1μM cP1P로 전처리 된 UCB-MSC를 수용하는 마우스 (그룹 4, n = 6); HIF1A siRNA로 형질 감염된 UCB-MSC를 수용하는 마우스 (그룹 5, n = 6). 모발 면도 후, 마우스의 등면에 4 Х 1 cm 피부 플랩을 만들었다. 전체 과정을 무균 조건 하에서 수행하였고, 체온과 마취를 유지하면서 피부 플랩을 30 분 동안 방치 하였다. 치료를 위해, UCB-MSC 및 함께 치료될 약물을 함유하는 100 μL의 PBS 용액을 제조하고 피부 플랩의 중심에 주사 한 다음, 원래 위치로 되돌려 봉합 하였다. 모든 피부 플랩 이미지는 디지털 카메라 시스템 (D50; 일본 도쿄, 니콘)으로 피사체로부터 동일한 거리 (30 cm)에서 촬영되었다. 주사 후 12 일에 모든 마우스를 희생시킨 후, 1.5 x 0.5 cm의 피부 플랩 샘플을 수집하였다. H&E 염색의 경우, 각 조직 샘플의 절반을 PBS (Sigma-Aldrich)에서 10 % 포르말린으로 고정시키고 조직 처리를 통해 파라핀에 포매시켰다. 10㎛ 두께의 섹션이 준비되었다. 조직의 다른 측면은 OCT 화합물 (일본 도쿄, 사쿠라파인텍, # HIO-0051)에 매립되었다. 조직학적 분석 및 스코어링은 blind 방식으로 수행하였다.

1-18: 헤마톡실린 및 에오신 염색

탈 파라핀화 된 슬라이드를 4 % PFA로 5분 동안 고정한 후 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 샘플을 70 %, 95 % 및 100 % 에탄올로 3회 세척한 후, 자일렌에서 5분 동안 배양하였다. 커버 슬립은 장착 매체 (Eco-Mount, Biocare Medical, 미국 캘리포니아 주 콩코드 # EM897L)로 장착되었다.

H&E 염색 슬라이드는 Pannoramic SCAN (헝가리 부다페스트의 3DHISTECH Ltd.)으로 자동 스캔하였다. 피부 플랩의 괴사 영역은 ImageJ 소프트웨어 (미국 베데스다 소재 미국 국립 보건원 Wayne Rasband)를 사용해 육안으로 평가되었다. 어두운 색과 딱지를 나타내는 피부 플랩 부위는 괴사로 간주되었다. 피부 플랩의 괴사 부분은 하기 식을 사용하여 계산하였다: 피부 플랩의 괴사 영역 = 플랩 영역의 괴사 영역/전체 플랩의 면적Х100

1-19: 면역 조직 화학

슬라이드상의 피부 샘플을 80 % 아세톤 용액에서 20 분 동안 고정시켰다. 슬라이드를 PBS에서 세척하고 5 % 정상 염소 혈청 (Sigma-Aldrich, # 566380)에서 30 분 동안 배양 하였다. 샘플을 2시간 동안 0.2 % 트윈-20 (PBST)을 함유하는 PBS 중의 HNA / DAPI, α-SAM / CD31 / DAPI로 면역 염색한 후, 2 시간 동안 Alexa Fluor 488 또는 555-접합된 2차 항체로 염색 하였다. 1 시간 조직 샘플의 형광 이미지를 Eclipse Ts2 형광 현미경 (일본 도쿄, 니콘)에 의해 포착하고 MetaMorph 소프트웨어 (Universal Imaging, West Chester, PA, USA)로 분석 하였다.

1-19: 면역 세포 화학

면역 세포 화학을 위해, UCB-MSC를 4 % PFA로 10 분 동안 고정시킨 다음, 0.5 % 트윈-20에서 10 분 동안 인큐베이션 하였다. 세포를 0.1 % 트윈-20을 함유하는 PBS (PBST; 1 : 100 희석)에서 1 차 항체와 함께 2 시간 동안 인큐베이션 한 다음 PBS로 3 회 세척 하였다. 이어서 세포를 1 시간 동안 PBST (1 : 100 희석)에서 Alexa Fluor 488 또는 555-접합된 이차 항체와 함께 배양 하였다. 면역 형광-염색된 샘플을 SRRF (Super-Resolution Radial Fluctuations) 이미징 시스템 (Andor Technology, Belfast, UK)을 사용하여 시각화 하였다. HIF1α / DAPI의 상대 형광 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화되었다.

1-20: 세포 내 칼슘 농도 [Ca ²⁺ ] _i 측정

DMSO에 용해된 Fluo 3-AM (Invitrogen, # F1242)을 사용하여 [Ca²⁺]_i 의 변화를 관찰 하였다. 세포를 PBS로 1 회 세척하고, 37 ℃에서 30 분 동안 5 % CO₂와 함께 FluO 3-AM (4μM)을 함유하는 PBS에서 배양 한 후 PBS로 1 회 세척하고 Eclipse Ts2 형광 현미경 (Nikon)을 사용하여 매초 스캔 하였다. 형광은 488 nm에서 여기되었고 방출된 빛은 515 nm에서 감지되었다. 검정을 확인하기 위해, A23187을 양성 대조군으로서 세포에 적용하였다. 모든 [Ca²⁺]_i 분석은 단일 세포 수준에서 처리하고 상대 형광 강도로 표현하였다.

1-21: In situ 근접 결찰 분석 (PLA)

HIF1α / BICD1 및 HIF1α / Dynein IC 상호 작용은 제조업체의 지침에 따라 Duolink II 2 차 항체 및 검출 키트 (Sigma-Aldrich, # DUO92001, # DUO92005 및 # DUO92008)를 사용하여 In situ로 검출하였다. 간략하게, PLA 프로브 및 항-HIF1α, 항-BICD1 및 항-디네인 IC에 대한 1 차 항체를 고정 세포에 적용 하였다. 이어서 듀오 링크 2 차 항체를 첨가하였다. 항체가 근접한 경우(<40 nm) Duolink 결찰 용액에 의해 폐쇄된 원을 만들기 위해 이들 2차 항체를 결찰시켰다. 폐쇄된 원의 포지티브 신호 (빨간색 점)를 증폭시키기 위해 폴리머라제 및 증폭 완충액을 첨가하고 SRRF 현미경에 의해 검출하였다. 핵은 DAPI를 사용하여 염색되었다.

1-22: 공동 면역 침강

UCB-MSC를 프로테아제 억제제 칵테일과 함께 공면역 침전 용해 완충제 (20mM Tris-HCl pH 8.0, 137mM NaCl, 1 % Nonidet P-40 및 2mM EDTA)로 용해시키고 얼음에서 30분 동안 배양 하였다. BCA 정량 분석 (Thermo Fisher Scientific, # 23225)을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. BICD1 또는 토끼 IgG 항체를 단백질 G 자기 비드 (Sure Beads, BioRad, CA, USA, # 161-4021)로 고정시켰다. 고정화된 자성 비드를 4 시간 동안 6 시간 동안 세포 용해물과 함께 인큐베이션 하였다. 세척된 비드를 5 분 동안 20mM 글리신 완충액 (pH 2.0)으로 용리시키고 1M 포스페이트 완충액으로 중화시켰다. 이어서 단백질 샘플을 100 ℃에서 5 분 동안 비등시켰다.

1-23: 통계적 분석

모든 정량적 데이터는 평균±평균의 표준 오차(S.E.M)로 제시되었다. SigmaPlot 12 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석 하였다. 동물 연구의 샘플 크기는 이전 보고서 및 SigmaPlot 12 소프트웨어에 의해 결정되었다. 두 실험군 간의 비교는 스튜던트 시험(Student's test)을 사용하여 수행되었다. 여러 실험 그룹의 평균을 일원 분산 분석을 사용하여 비교한 다음 여러 비교를 위한 Student-Newman Keuls의 테스트를 수행하였다. p <0.05의 수준은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

실시예 2: 실험 결과

2-1: 저산소증 하에서 미토콘드리아 ROS 축적 및 MSC 생존에 대한 cP1P의 효과

산화 스트레스에서 cP1P의 생물학적 특성과 MSC 생존을 확인하기 위해 저산소 상태에서 cP1P 또는 S1P 및 P1P와 같은 다른 스핑고신 대사물을 UCB-MSC로 처리했다 (도 1). 먼저, cP1P는 지방 세포, 연골 세포 및 골세포로의 분화 가능성에 대한 UCB-MSCs에 영향을 미치지 않았다 (도 2). 저산소증 하에서, cP1P 전처리는 비처리 UCB-MSC와 비교하여 DCFDA- 및 MitoSOX- 양성 세포의 백분율을 감소시켰다 (도 3, 4). TMRE-양성 세포에서의 저산소증 관련 감소는 cP1P에 의해 역전되었다 (도 5). 그러나, cP1P 또는 S1P는 Nrf2의 발현 및 SOD2의 아세틸화 및 발현을 유도하는 항산화 효소에 영향을 미치지 않았다. 저산소증 72 시간 후, cP1P는 용량-의존적 방식으로 LDH의 방출을 감소시켰다 (도 6).

저산소증-유도된 LDH 방출은 cP1P 및 S1P 둘 다에 의해 상당히 감소되었지만 P1P는 그렇지 않았다 (도 7). Annexin V / PI 분석 데이터는 저산소증 및 cP1P를 갖는 아폽토시스 UCB-MSC의 백분율이 저산소증만을 갖는 UCB-MSC의 백분율보다 낮음을 보여 주었다 (도 8). 이러한 결과는, S1P와 유사하게, cP1P가 저산소증에 노출된 UCB-MSC의 항-아폽토시스를 유도한다는 것을 나타낸다. 48 시간 동안 cP1P 또는 S1P로 처리된 UCB-MSC의 증식 속도는 비 처리 또는 P1P 처리된 UCB-MSC의 증식 속도보다 높았다. 0.1 및 1 μM의 cP1P 처리량은 72 시간 동안 정상 산소증 및 저산소증 하에서 UCB-MSC 증식을 유의하게 증가시켰다. 모든 cP1P, S1P 및 P1P는 UCB-MSC 마이그레이션을 증가 시켰다. 종합적으로, 이들 데이터를 통해, cP1P가 다중 계통 분화 가능성을 유지하면서 UCBMSC 증식, 이동 및 항-아폽토시스를 자극함을 알 수 있다.

2-2: 포도당 대사에 대한 cP1P의 조절 효과

포도당 대사에 대한 cP1P의 효과를 결정하기 위해, 본 발명자들은 정상 산소증 및 저산소증 하에서 cP1P의 유무에 관계없이 UCB-MSC에서 포도당 대사-관련 유전자 mRNA 발현, 헥소키나제 활성 및 락테이트 수준을 조사하였다. PCR 어레이 데이터는 cP1P (도 9)에 의해 유전자 (BPGM, GALM, HK2, ENO3, ALDOA, ENO1 및 PGM1)의 해당 분해 관련 발현의 상향 조절 및 유전자의 PDCA1 사이클 관련 발현 (PDHA1, MDH1, ALCY, CS 및 ACO1의 하향 조절을 나타냈다. 일관되게, cP1P는 정상 산소증 및 저산소증 하에서 UCB-MSC에서 헥소키나제 활성 및 세포 내 락테이트 수준을 증가시켰다 (도 10). OCR 데이터에 의하면 cP1P는 정상 호흡기와 저산소증 하에서 UCB-MSC에서 기저 호흡, 최대 호흡, ATP 생산 및 여분의 호흡 능력을 감소 시켰다. 저산소증은 기저 호흡, 최대 호흡 및 ATP 생성을 감소시켰지만 UCB-MSC에서 양성자 누출을 증가 시켰다 (그림 11). ECAR 데이터는 cP1P 처리와 저산소증 배양 모두가 해당 분해능과 해당 작용 능력을 자극하지만 해당 분해능을 자극하지 않음을 보여 주었다 (도 12). cP1P는 시간 의존적 방식으로 NHE1 mRNA 발현을 자극하고, 정상 산소증 및 저산소증하에 UCB-MSC에서 세포 내 알칼리화를 증가시켰다 (도 13). 종합하면, cP1P는 산소 가용성 및 산화 인산화를 감소시키고 normoxia 및 hypoxia에서 UCB-MSCs에서 glycolysis에 의해 포도당 대사를 전환하여 glycolytic 플럭스를 증가시킨다고 볼 수 있다.

2-3: MSC의 치료 잠재력에서 cP1P-유도된 HIF1α의 역할

cP1P-유도된 당분해의 대사 조절 인자를 확인하기 위해, cP1P, S1P 및 P1P를 갖는 UCB-MSC에서 HIF1α 발현 및 HIF1 활성을 분석하였다. cP1P 및 S1P는 모두 HIF1α 발현 및 HIF1 활성을 유도하지만, P1P는 HIF1 루시퍼라제 활성에 영향을 미치지 않았다 (도 14). cP1P- 전처리된 UCB-MSC에서 HIF1α의 총 및 핵발현 수준은 저산소증이 있거나 없는 비히클 전처리된 UCB-MSC보다 높았다. 다음으로, cP1P가 정상 산소증 및 저산소증하에 UCB-MSC에서 LDHA 및 PDK1과 같은 HIF1- 표적화된 당분해 유전자의 mRNA 발현을 증가시켰음을 확인 하였다 (도 15). HIF1A 침묵화는 cP1P 증가된 세포 내 락테이트 및 감소된 미토콘드리아 ROS 수준을 역전시키고 (도 16, 17), 저산소증 하에서 UCB-MSC의 cP1P 증가된 생존율을 감소시켰다 (도 18). 이러한 결과는 cP1P-자극된 HIF1α가 해당 작용을 조절하고 저산소증 하에서 UCB-MSC의 세포 자멸사를 역전시키는 핵심 인자임을 시사한다.

다음으로, 마우스 피부 플랩 모델에 이식 UCB-MSCs의 치료 잠재력에 cP1P 및 HIF1A 침묵의 효과를 조사하였다. 허혈성 피부 플랩으로의 UCB-MSC 이식 8 일 후, cP1P 이식 그룹을 갖는 HIF1A siRNA-감염된 UCB-MSC의 괴사 면적은 cP1P 이식 그룹을 갖는 NT siRNA-감염된 UCB-MSC의 것보다 더 컸다 (도 19). cP1P를 갖는 NT siRNA- 형질 감염된 UCB-MSC는 모든 그룹 중에서 가장 높은 조직학적 점수를 가졌다 (도 20). cP1P 그룹을 갖는 NT siRNA-감염된 UCB-MSC에서 이식된 UCB-MSC 양성 세포의 마커인 HNA의 백분율은 비히클 전처리를 갖는 NT siRNA- 감염된 UCB-MSC 그룹보다 유의하게 더 높았다 (도 21). 일관되게, cP1P 및 HIF1A siRNA가 있거나 또는 존재하지 않는 NT siRNA 형질 감염된 UCB-MSC를 고려할 때, 피부-플랩 조직에서 panendothelial 마커 CD31- 및 근섬유 아세포 마커 α-SMA-양성 세포의 백분율은 실험군에서 유사한 패턴을 가졌다 (도 22). 또한, cP1P 이식 그룹을 갖는 NT siRNA- 감염된 UCB-MSC에서 상처 치유 과정 및 면역 조절, 예를 들어 VEGF, EGF, IL-6 및 IDO-1과 관련된 사이토카인의 발현은 모든 실험 그룹 중에서 가장 높았다 (도 23). 그러나, cP1P는 UCB-MSC에서 VEGF, EGF, IL-6 및 IDO-1의 발현 수준에 영향을 미치지 않았다. 이는 이식된 UCB-MSC의 생존율이 상처 치유 과정 동안 피부에서 이들 사이토카인 수준의 증가 인자임을 나타낸다.

2-4: cP1P-자극된 HIF1α 번역에서 S1PR1-의존적 PKCα/mTOR 경로의 관여

다음으로, HIF1α 전사, 번역 및 프롤릴히드록실화에 대한 효과를 조사 하였다. cP1P-유도된 HIF1α 발현은 번역 억제제 시클로헥시미드로 전처리함으로써 억제되었다 (도 24). 시클로헥시미드는 핵 HIF1α의 백분율을 감소시켰다 (도 25). 그러나, HIF1α의 mRNA 발현 및 프롤릴히드록실화 (Hyp402)에 대해 대조군과 cP1P간에 통계적으로 유의한 차이가 발견되지 않았다 (도 26). VHL과 HIF1α 간의 상호 작용은 cP1P에 의해 변하지 않았다 (도 27). cP1P의 유무에 관계없이 시클로헥시미드 처리된 UCB-MSC에서 HIF1α 단백질 수준은 시간 의존적으로 감소 하였다. 이러한 결과는 cP1P가 번역을 통해 HIF1α를 유도하였으나 전사 및 프롤릴하이드록실-의존적 안정화를 통해서는 아니라는 것을 나타낸다. 또한, cP1P-유도된 HIF1α는 S1PR1 / S1PR3 억제제 VPC23019의 전처리에 의해 제거되었지만 S1PR2 억제제 JTE013은 전처리되지 않았다 (도 28). cP1P는 S1PR1- 침묵 UCB-MSC에서 HIF1 루시퍼라제 활성을 증가시키지 않았다 (도 29). S1PR1 침묵화는 총 HIF1α 발현 및 핵 HIF1α의 백분율 모두를 억제 하였다 (도 30, 31). 저산소증은 다른 S1PRs mRNA의 발현 수준에 영향을 미치지 않으면서 S1PR4 mRNA의 발현 수준을 감소시켰다 .이러한 결과는 cP1P가 S1PR1 경로를 통해 번역-의존적 방식으로 HIF1α 발현을 증가시킴을 시사한다.

다음으로, 칼슘 신호 및 PKC 활성화에 cP1P의 효과를 조사하였다. 조사 결과는 cP1P가 세포 내 칼슘 수준을 증가 시켰지만 BAPTA-AM 및 VPC23019로 전처리 된 UCB-MSC의 칼슘 수준에는 영향을 미치지는 않았다는 것을 보여 주었다 (도 32). 이들 데이터는 cP1P가 S1PR1/3 신호 전달을 통해 세포 내 칼슘 방출을 자극한다는 것을 나타낸다. 또한, cP1P는 PKC (Ser660), Akt (Thr308 및 Ser473) 및 GSK3*?* (Ser9)의 인산화를 증가시켰다 (도 33). cP1P는 BAPTA-AM에 의해 감소된 PKCα 및 PKCε의 PKCα의 막 위치를 자극 하였다 (도 34). BAPTA-AM 전처리는 cP1P-유도된 PKCα 인산화 (Ser657) 및 HIF1α 발현을 억제 하였다 (도 35, 36). 또한, cP1P-처리된 UCB-MSC에서 Akt/mTOR/S6K1 경로에서 칼슘-활성화 PKCα의 역할을 조사 하였다. BAPTA-AM 전처리는 Akt, mTOR 및 S6K1의 cP1P-유도 인산화를 억제한 반면, cP1P는 PKCA siRNA-감염된 UCB-MSC에서 Akt, mTOR 또는 S6K1의 인산화에 영향을 미치지 않았다 (도 37). Akt 억제제는 Ser2448 및 Ser2481 잔기에서 mP의 cP1P- 유도된 인산화를 억제 하였다 (도 38). mTOR 억제제 라파마이신, S6K1 억제제 PF4708671 또는 RPTOR siRNA의 전처리는 cP1P-유도된 HIF1α 발현을 억제하였다 (도 39). 이중 루시퍼라제 리포터 분석의 결과는 cP1P-활성화된 HIF1 루시퍼라제 활성이 RPTOR 침묵에 의해 억제됨을 보여 주었다 (도 40). 또한, cP1P는 RPTOR 녹아웃 SK-N-MCs 신경 모세포종 세포에서 HIF1 발현을 증가시키지 않았다. 종합하면, 이들 결과는 칼슘-활성화 PKCα / mTOR 경로가 UCB-MSC에서 cP1P-유도된 HIF1α 번역에 필수적임을 나타낸다.

2-5: HIF1α 핵 전위에서 cP1P-유도된 BICD1의 역할

추가적으로, cP1P와 S1P가 BICD1 발현을 유의하게 자극한다는 것을 확인하였다 (도 41). cP1P에 의한 BICD1 유도는 라파마이신 또는 PF4708671 전처리에 의해 억제되었으며, 이는 cP1P-활성화된 mTOR/S6K1이 잠재적으로 BICD1-매개 HIF1α 핵 전위로 이어질 수 있음을 나타낸다 (도 41). cP1P는 RPTOR-결핍 SK-N-MC에서 BICD1 발현을 유도하지 않았다. 또한, HIF1α와 BICD1 사이의 상호작용에 cP1P가 미치는 효과를 조사하였다. cP1P-처리된 UCB-MSC에서 HIF1α-BICD1 PLA 형광 강도는 228 %로 증가하였다 (도 42). 그러나, cP1P는 HIF1α 및 디네인 IC 대 BICD1의 비를 변화시키지 않았지만 HIF1α, 디네인 IC 및 BICD1의 총 발현량을 증가시켰다 (도 43). HIF1α/BICD1 복합체 형성은 사이클로헥시미드 전처리에 의해 상당히 감소되었다 (도 43). BICD1 침묵은 총 HIF1α 발현에 영향을 미치지 않았지만, HIF1α의 cP1P-유도된 핵 발현, 핵 HIF1α의 백분율 및 HIF1 루시퍼라제 활성을 감소시켰다 (도 44-46). 종합하면, 이들 결과를 통해 cP1P에 의해 유도된 BICD1 발현이 HIF1 활성화를 위한 HIF1α 핵 전위 에서 중요한 역할을 함을 알 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (12)

1. cP1P(O-cyclic phytosphingosine-1-phosphate)가 전처리되어, HIF-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha), 및 AKT/GSK3β의 활성화를 통해 세포 내 BICD1 (Bicaudal D homolog 1)의 발현 증가를 통해 허혈적응능력과 치료기능이 향상된 줄기세포.
   
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3. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포.
   
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6. 제1항 또는 제3항 중 어느 한 항의 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 함유하는, 허혈성 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 허혈성 질환은 허혈성 피부 병변, 허혈성 심장 질환, 허혈성 뇌졸증, 허혈성 급성 신부전증 또는 허혈성 하지질환인 것인, 세포치료제 조성물.
   
8. cP1P(O-cyclic phytosphingosine-1-phosphate)를 전처리하여, HIF-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha), 및 AKT/GSK3β의 활성화를 통해 세포 내 BICD1 (Bicaudal D homolog 1)의 발현을 증가시켜 허혈적응능력을 개선하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 저산소 상태에서 치료기능이 향상된 줄기세포의 제조방법.
   
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11. 제8항에 있어서, 상기 줄기세포는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 제조방법.
    
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