KR101879517B1

KR101879517B1 - 중간엽 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법

Info

Publication number: KR101879517B1
Application number: KR1020160179624A
Authority: KR
Inventors: 안영근; 김용숙; 강혜진; 조동임
Original assignee: 전남대학교병원
Priority date: 2016-12-27
Filing date: 2016-12-27
Publication date: 2018-07-17
Also published as: US20180201903A1; KR20180075808A

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 의한 중간엽 줄기세포의 심근세포로의 분화 방법을 이용하면 중간엽 줄기세포로부터 높은 효율로 심근세포를 생산할 수 있으므로, 심근 재생을 필요로 하는 심부전 등의 심장 질환에 대한 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

중간엽 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법 {METHOD FOR THE DIFFERENTIATION OF MESENCHYMAL STEM CELLS INTO CARDIOMYOCYTES}

본 발명은 중간엽 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 중간엽 줄기세포를 아피시딘 (apicidin)을 포함하는 배지에서 배양하면서 포도당 결핍 조건을 더함으로써 심근세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

줄기세포는 미분화 상태에서 일정기간 동안 자신과 동일한 세포를 지속적으로 만들어 낼 수 있는 성질과 적당한 조건하에서는 특정한 세포로 분화하는 성질을 가지고 있다.

줄기세포는 분화능과 생성시기에 따라 크게 배아 줄기세포 (embryonic stem cell)와 성체 줄기세포 (adult stem cell)로 구분될 수 있다. 인간 배아 줄기세포는 인간 생명체로 발생할 수 있는 배아로부터 만들어지기 때문에 많은 윤리적인 문제점을 가지고 있으나, 성체 줄기세포에 비하여 세포증식 및 분화 능력이 우수한 것으로 알려져 있다. 성체 줄기세포는 골수, 혈액, 뇌, 피부 등에서 얻을 수 있어 윤리적인 문제가 적으나, 배아 줄기세포에 비하여 한정된 분화능력을 가지고 있다.

대표적인 성체 줄기세포에는 조혈모세포 (hematopoietic stem cells; HSCs)와 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells; MSCs)가 있다. 조혈모세포에는 적혈구, 백혈구, 혈소판 등 주로 혈액내의 혈구세포로 분화하는 반면, 중간엽 줄기세포는 연골 세포 (chondroblast), 골세포 (osteoblast), 지방세포 (adipocyte), 근육세포 (myocyte), 신경세포 등의 중배엽성 조직의 세포로 분화하는 것으로 알려져 있다. 상기한 성체 줄기세포의 분리 및 배양 방법이 알려지면서 세포 치료제로서의 임상적 적용에도 관심이 고조되고 있으며, 줄기세포를 이용하여 파킨슨 병, 알츠하이머 병과 같은 신경퇴행성 질환이나 척추손상에 의한 사지마비, 간경화, 소아 당뇨병, 백혈병, 기타 만성질환 등과 같은 질환에 의해 파괴되어 부족한 세포를 외부로부터 공급해주는 세포 대체요법 (cell replacement therapy)이 효과적인 치료법으로 제시되면서 많은 연구가 진행되고 있다.

한편, 배아 줄기세포를 심근세포로 분화시키는 연구에서 가장 큰 문제 중의 하나는, 미분화 세포와 분화된 심근세포를 완벽하게 분리하는 과정에 있으며, 미분화 배아 줄기세포가 완벽하게 제거되지 않은 채로 체내 이식 될 경우, 이 배아 줄기세포에서 유래한 종양 생성이 치명적인 걸림돌이 된다.

미분화 세포, 증식중인 세포, 분화가 종결된 세포, 암세포 등 세포에 따라 에너지 대사의 특성은 매우 다르게 나타난다. 이에 따라, 분화/미분화 배아 줄기세포를 분리하기 위해 다양한 연구가 진행되고 있으며, 그 중 세포 내 포도당 대사의 특성을 이용한 연구 결과가 소개되었다. 미분화 상태의 배아 줄기세포는 증식 활성이 높은 상태로, 포도당을 곧바로 분해하여 ATP 외에 세포 구성 성분을 만들어내 증식에 사용하게 되는 반면, 분화된 세포는 시트르산 회로 (citric acid cycle)를 통해 포도당으로부터 훨씬 더 많은 ATP를 만들어 내게 된다.

한편, 심근세포는 증식 활성이 매우 낮아, 포도당을 시트르산 회로를 통해 대사시키게 되는데, 만약 이러한 포도당이 결손될 경우, 다양한 비포도당 탄소원이 시트르산 회로의 중간체로 전환되거나, 젖산을 탄소원으로 사용할 수 있게 된다. 이때, 미분화 상태의 증식 효율이 높은 세포는 젖산을 탄소원으로 사용할 수 없다.

많은 다양한 세포 유형들이 심장에 대한 줄기세포 치료제의 후보로서 고려되었지만, 이상적인 세포 유형은 아직까지 발견되지 않고 있다 (Segers, V.F. & Lee, R.T. Nature 451, 937-942 (2008)). 실제로, 순수한 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells, MSCs)의 심근세포로의 분화는 생체 내에서 극히 낮은 비율로 관찰되었을 뿐만 아니라, 이식된 줄기세포와 심장근육과의 전기기계적 통합 능력은 불확실하다 (Chang, M.G., et al. Circulation 113, 1832-1841 (2006)). 따라서, 보다 효율적으로 중간엽 줄기세포로부터 심근세포로 분화시키기 위한 연구가 시급한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 중간엽 줄기세포로부터 심근세포로 분화시키기는 방법을 연구하던 중, 포도당 결핍의 조건 하에서 아피시딘 (apicidin)을 병용 처리하는 경우, 심근-특이 유전자의 발현이 급속히 증가되는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 포도당-결핍 조건 하에서 아피시딘 (Apicidin)을 중간엽 줄기세포에 처리하는 것을 포함하는, 중간엽 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 포도당은 포함하지 않으면서, 아피시딘 (Apicidin)을 포함하는 중간엽 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포도당-결핍 조건 하에서 아피시딘 (Apicidin)을 중간엽 줄기세포에 처리하는 것을 포함하는, 중간엽 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 중간엽 줄기세포는 골수, 조직, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻을 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 아피시딘의 처리는 중간엽 줄기세포를 아피시딘을 포함하는 배지에서 배양함으로써 수행될 수 있으며, 상기 배지는 젖산을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 배양은 4 시간 내지 20 시간 동안 수행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 심근세포는 심근세포 특이적 마커의 발현이 중간엽 줄기세포에 비해 증가되어 있을 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 심근세포 특이적 마커는 GATA4, Nkx2.5, cTnI (cardiac troponin I), cTnT (cardiac troponin T), MLC (myosin light chain), MHC (myosin heavy chain), 또는 Cx43 (connexin 43)일 수 있다.

또한, 본 발명은 포도당은 포함하지 않으면서, 아피시딘 (Apicidin)을 포함하는 중간엽 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포를 포함하는 심혈관질환 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 심혈관질환은 협심증, 심근경색, 허혈성 심장질환, 고지혈증, 뇌졸중, 동맥경화, 고혈압, 부정맥, 뇌혈관 질환, 또는 관상동맥 질환일 수 있다.

도 1은 본 발명의 포도당 결핍 조건 실험의 방법을 개략적으로 나타내는 도이다.
도 2는 포도당 결핍, 아피시딘 (apicidin) 함유, 또는 아피시딘에 젖산 첨가의 조건을 갖는 배지에서 배양 시, 시간에 따른 중간엽 줄기세포의 생존율을 확인하는 도이다.
도 3은 포도당 결핍, 아피시딘 (apicidin) 함유, 또는 아피시딘에 젖산 첨가의 조건을 갖는 배지에서 배양 시, 심근세포-특이 유전자인 GATA4, cardiac troponin I, 또는 Nkx2.5의 발현을 확인하는 도이다.
도 4는 포도당 결핍, 아피시딘 (apicidin) 함유, 또는 아피시딘에 젖산 첨가의 조건을 갖는 배지에서 배양 시, 심근세포 전사인자인 GATA-4, 및 심근구조 단백질인 cTnI의 단백질 발현을 형광면역염색법을 통하여 확인한 도이다.
도 5는 지방분화 마커인 PPAR-gamma, 골분화 마커인 Runx2, 및 연골분화 마커인 collagen type 2a1의 발현을 확인하는 도이다.

본 발명자들은, 중간엽 줄기세포 배양 배지에 포도당 결핍의 조건 하에서 아피시딘 (apicidin)을 병용 처리하는 경우, 심근-특이 유전자의 발현이 증가되는 것에 기반하여 포도당 결핍, 아피시딘 (apicidin) 함유, 또는 아피시딘에 젖산 첨가의 조건을 갖는 배지에서 배양 시, 시간에 따른 중간엽 줄기세포의 생존율, 심근-특이 유전자의 발현 등을 구체적으로 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 포도당-결핍 조건 하에서 아피시딘 (Apicidin)을 중간엽 줄기세포에 처리하는 것을 포함하는, 중간엽 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.

본 발명에서 "아피시딘 (Apicidin)"은 하기 화학식 1로 표현되는 구조를 갖는 화합물로서, 천연물로부터 분리되거나 인공적으로 합성할 수 있으며, 인공적으로 합성하여도 동일한 효과를 갖는 것은 당업자에게 자명하다.

[화학식 1]

본 발명에 있어서 심근세포로의 분화 유도를 위해 사용되는 중간엽 줄기세포의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 중간엽 줄기세포는 공지의 중간엽 줄기세포 공급원, 예를 들어 골수, 조직, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻을 수 있다. 골수, 조직 등의 채취 대상인 동물은 포유동물일 수 있다. 상기 동물이 인간일 경우 골수, 조직 등은 본 발명의 조성물의 처리에 의해 심근세포로의 분화가 유도된 중간엽 줄기세포를 세포치료제로서 투여하게 될 환자 자신의 것이나 타인 유래의 것일 수 있다. 이러한 공지의 중간엽 줄기세포 공급원으로부터 중간엽 줄기세포를 수득하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명에서, "배지"는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외 (in vitro)에서 줄기세포 등의 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다.

당업계에는 다양한 배지가 시판되고 있으며, 인위적으로 제조하여 사용할 수도 있다. 시판 중인 배지로는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, α-MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMPM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), AmnioMax, AminoMaxⅡ complete Medium (Gibco, Newyork, USA), Chang's Medium MesemCult-XF Medium (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada) 등이 있으며, 인위적으로 제조할 수 있는 배지와 더불어 본 발명의 배지 조성물에 포함되는 기본 배지로 사용할 수 있다.

본 발명의 배지 조성물은 중간엽 줄기세포 배양에 특이적인 배지로서, 포도당 및 글루타민이 포함되지 않은 배지에 아피시딘 (Apicidin)을 첨가함으로써 달성될 수 있으며, 이에 젖산을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 포도당 및 글루타민이 포함되지 않은 배지는 A14430 (ThermoFisher Scientific)을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 중간엽 줄기세포 배양용 배지 조성물에 포함되는 아피시딘의 함량은 1-100 μM 농도, 바람직하게는 1-10 μM 농도, 더욱 바람직하게는 1-3 μM 농도로 함유되어 있다. 농도가 너무 낮으면 효과를 나타내지 않으며, 농도가 너무 높으면 독성을 가지게 되므로 세포의 종류에 따라 적정한 농도를 확인해야 한다.

중간엽 줄기세포의 분화 유도에 일반적으로 요구되는 시간을 고려할 때, 아피시딘을 포함하는 배지에서의 배양은 4 시간 내지 20 시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 중간엽 줄기세포에 대한 아피시딘의 처리 기간은 포도당이 포함되지 않거나 젖산이 추가로 포함되는 경우에 따라 달라질 수 있을 것이다.

본 발명에 있어서 "심근세포"는 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포 또는 심근세포로의 분화 과정에 있는 세포를 모두 포함한다. 본 발명에 있어서, 아피시딘의 처리에 의해 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포는 심장 특이적 마커의 발현을 나타낸다. 본 발명의 방법에 따라 수득한 심근세포는 심장 특이적 마커의 발현이 중간엽 줄기세포에 비해 증가되어 있는 것일 수 있다. 심장 특이적 마커는 이에 제한되는 것은 아니나, GATA4, Nkx2.5, cTnI (cardiac troponin I), cTnT (cardiac troponinT), MLC (myosin light chain), MHC (myosin heavy chain), 및 Cx43 (connexin 43)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

발명의 일실시예에서는, 중간엽 줄기세포를 포도당 결핍, 아피시딘 (apicidin) 함유, 또는 아피시딘에 젖산 첨가의 조건을 갖는 배지에서 배양하여 분화된 세포의 특성을 확인한 결과, 본 발명의 분화 유도 방법에 의해 분화된 세포에서 심근세포-특이 유전자가 발현되었음을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포를 심근세포로 분화하는 방법을 사용하여 심근세포가 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 아피시딘 (Apicidin)을 포함하면서 포도당은 포함하지 않는 중간엽 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.

앞서 설명한 바와 같이, 상기 조성물은 젖산을 추가로 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 방법에 의해 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포를 포함하는 유효성분으로 포함하는 심혈관질환 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "세포치료제 (cell therapy)"란, 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 살아있는 자가, 동종, 이종의 세포들을 체외에서 증식, 선별하거나 여타 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등 일련의 행위를 통하여 특정 질환의 치료, 진단, 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

본 발명에 있어서 상기 심혈관질환은 협심증, 심근경색, 허혈성 심장질환, 고지혈증, 뇌졸중, 동맥경화, 고혈압, 부정맥, 뇌혈관 질환, 또는 관상동맥 질환일 수 있으며, 바람직하게는 심근경색일 수 있다.

본 발명의 세포치료제는 기존 치료 활성 성분, 기타 보조제, 약제학적으로 허용가능한 담체 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 심장질환 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 세포치료제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 심혈관질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

나아가, 본 발명은 상기 세포치료제를 포함하는 심혈관질환의 예방 또는 치료용도를 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험 준비 및 실험 방법

1-1. 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양

인간으로부터 채취한 골수를 PBS (phosphate buffered saline)와 1:1의 부피비로 혼합하여 희석한 후, 피콜-하이팩 용액 (Ficoll-Hypaque, 밀도 1.077 g/mL, Sigma)에 중첩시켰다. 이때, 피콜-하이팩 용액은 사용 전에 실온이 되도록 하였고, 희석된 골수의 부피가 피콜-하이팩 용액 부피의 3 배가 넘지 않도록 하였다. 이를 2,000 rpm의 속도로 상온에서 30 분간 원심분리하여 적혈구층, 단핵구층 및 혈청층을 분리하였다. 파스퇴르 피펫 (pasteur pipette)을 이용하여 단핵구층만을 새로운 튜브로 옮기고 PBS로 세척하여 단핵구층 채취 시 혼입된 피콜-하이팩 용액 및 오염된 혈소판을 제거하였다.

이 상태는 ‘단핵구 (mononuclear cell)’로, 이로부터 중간엽 줄기세포를 분리 및 증폭 배양하기 위해, 10% FBS (fetal bovine serum), 100 units/mL 페니실린 (Invitrogen-Gibco), 및 100 μM/mL 스테렙토마이신 (Invitrogen-Gibco)이 포함된 low glucose DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, Invitrogen-Gibco) 세포배양 배지에 1~2 x 10⁵ 세포/cm² 농도로 접종하였다. 2-3일 후 비부착세포를 제거하고, 2-3 주간 단층 배양하여 중간엽 줄기세포를 분리 배양하였다.

이후, 상기 분리 배양된 인간 골수-유래 중간엽 줄기세포에 인간 텔로머라제 (telomerase) 유전자를 렌티바이러스에 도입하여 감염시킨 후, 텔로머라제 (telomerase) 유전자를 안정적으로 계속 발현하는 세포주를 선별하여 세포주를 구축하였다. 일차 배양 (primary culture) 세포의 경우, 세포의 수명이 한정되어 있고, 계대 배양이 지속될수록 세포 성장능 및 고유의 특성이 변화되므로, 텔로머라제 (telomerase) 유전자를 도입하여 분화능 등의 고유 특성은 유지한 채 세포의 수명을 지속시켜 불멸화된 인간 골수-유래 중간엽 줄기세포를 확립하였다.

1-2. 세포 생존능 확인

포도당-결핍 조건에서의 중간엽 줄기세포의 상태 변화를 확인하기 위하여, 포도당-결핍 배지를 교환한 후, 일정 시간에 세포를 관찰하였다. 이때, 포도당 또는 젖산을 첨가한 세포군 (포도당 결핍 배지만 처리한 경우, 포도당 결핍 배지에 젖산만 추가한 경우, 포도당 결핍 배지에 아피시딘만 추가한 경우, 또는 포도당 결핍배지에 젖산 및 아피시딘을 추가한 경우)에 대하여 관찰하였으며, 이는 도 1에 나타내었다.

우선, 중간엽 줄기세포를 6-웰 플레이트에서 HIGH glucose/DMEM (4 mM L-글루타민, 4500 mg/L 글루코스, 소듐 피루베이트, 10 % FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신) 배지로 하루 동안 배양한 후, 멸균 인산-식염수 완충 용액으로 2 회 세척한 후, 포도당 결핍 배지로 교환하였다. 이때, 포도당 결핍 배지만 처리한 경우, 포도당 결핍 배지에 아피시딘 3 μM을 첨가한 경우, 또는 포도당 결핍 배지에 아피시딘 및 젖산 12 mM을 첨가한 경우를 각각 veh, AC, 또는 AC/Lac12로 표시하였으며, 이로부터 4 시간, 7 시간, 20 시간, 27 시간 째에 세포의 형태를 현미경으로 관찰하여 사진을 촬영하였다.

1-3. 정량적 실시간 중합효소연쇄반응 (Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction; qRT -PCR)

포도당-결핍 조건에서 아피시딘 및 젖산의 첨가에 의한 중간엽 줄기세포의 심근 분화 정도를 판단하기 위하여, 세포 내 심근-특이 유전자의 발현을 정량하였다. 보다 자세하게는, 상기 실시예 1-2와 같이, 중간엽 줄기세포를 4 시간 또는 20 시간 처리한 후, 각각의 샘플에서 세포 배양액을 제거하고, PBS로 1 회 세척한 후 트리졸 (Trizol)을 넣어 10 분 동안 상온에서 균질화시킨 후 클로로포름을 가하여 원심분리하였다. 원심분리 결과 얻어진 상청액을 회수하여 총 RNA를 정제한 후, 역전사 효소 (MMLV)를 이용하여 cDNA를 합성하고, 이를 주된 가닥 (template)으로 하여 QuantiTect SYBR Green PCR kit로 Real-time PCR을 수행함으로써, 심근-특이 마커 유전자 (GATA4, Nkx2.5, cTnI)의 발현정도를 확인하였다.

1-4. 형광면역염색 분석 (Immunohistochemistry Analysis)

심근 분화 마커 단백질 발현을 확인하기 위하여, 면역세포화학염색법 (Immunocytochemistry)을 실시하였다. 우선, 중간엽 줄기세포를 12-웰 플레이트에서 HIGH glucose/DMEM 배지로 하루 동안 배양한 후, 각각 포도당 결핍 배지만 처리 (veh), 포도당 결핍 배지에 아피시딘 첨가 (AC), 및 포도당 결핍 배지에 아피시딘 및 젖산 첨가 (AC/Lac) 조건으로 4 시간 배양하였다. 그 다음, 샘플에서 세포 배양액을 제거하고 PBS로 1 회 세척한 후 3.7 % 마스크폼에 15 분간 고정시켜 0.1 % triton X-100으로 10 분간 침투시켰다. Normal goat serum으로 1 시간 동안 고정시킨 다음, 항-GATA4, cTnI 또는 alpha-sarcomeric actin (a-SA) 1차 항체로 4 ℃에서 밤새 배양하고, 형광염료 (Alexa 488, Alexa 594)로 표지된 2차 항체를 1 시간 동안 처리한 후, 형광 염색제인 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)로 핵 염색 후 마운팅하여 형광 현미경으로 관찰하였다.

1-5. ( in vivo ) 동물 모델

동물 연구에 대한 모든 실험 과정은 전남대학교 의과대학 실험동물운영위원회에 의해 승인을 받았으며, 동물 보호에 대한 위원회의 가이드라인과 조정에 따라 수행되었다.

우선, 심근 경색증 동물모델은 면역결핍 마우스인 nude mouse (8 주령, 수컷)을 사용하였으며, 좌전하방 (left anterior descending, LAD) 관상동맥 폐색 수술로 심근경색증을 야기시켰다. 케타민 (50 mg/kg)과 자일라진 (5 mg/kg)으로 마취 후, 산소호흡기를 이용하여 95 % O₂ 및 5 % CO₂로 마우스를 산소호흡시켰다. 3 번째와 4 번째 갈비뼈 사이에 리트렉터로 고정시킨 후 흉부를 열고, 좌심방 부속물 아래의 왼쪽 관상동맥의 근위 부분을 7-0 실크 봉합사로 감싸도록 묶고, 5-0 실크 봉합사로 피부를 봉합한 후 봉합부위를 소독하였다.

심근경색 직후, 세포 이식을 위해, 미처리 중간엽줄기세포 또는 포도당-결핍/아피시딘 20시간 처리한 중간엽줄기세포를 형광 표지염료인 DAPI로 표지하였다. 이를 위해 우선, 멸균 DAPI 용액을 50 μg/ml의 최종 농도로 세포배양 배지에 가하고 PBS로 4 회 세척한 후, 이식을 위해 각 세포들은 30 μl의 PBS에 현탁시키고 (3×10⁵ cells), 30-게이지의 바늘을 이용하여 심근경색 영역에서부터 변연부까지 주입하였다. 세포 주입 2주 후에 마우스를 희생시켜 심장을 적출하고, 액체 질소에 냉동시킨 후 O.C.T. compound로 동결포매한 다음, 심장조직을 10 μm의 두께로 슬라이드 절편화하여 면역조직화학염색을 실시하여 공초점형광현미경으로 800배율의 이미지를 관찰하였다.

실시예 2: 포도당-결핍 조건에서 아피시딘 및 젖산의 중간엽 줄기세포 보호 효과

중간엽 줄기세포가 심근세포로 분화하는데 배양 배지가 미치는 영향을 평가하기 위해, 상기 실시예 1-2에 기재한 바와 같이, 중간엽 줄기세포를 포도당 결핍 배지만 처리한 경우, 포도당 결핍 배지에 아피시딘을 첨가한 경우, 또는 포도당 결핍 배지에 아피시딘 및 젖산을 첨가한 경우의 세포 생존율을 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, Veh 군 (포도당 결핍 배지만 처리)의 중간엽 줄기세포는 7 시간 째부터 일부 세포들의 사멸이 관찰되었으나, AC 군 (포도당 결핍 배지에 아피시딘을 첨가) 및 AC/Lac12 군 (포도당 결핍 배지에 아피시딘 및 젖산을 첨가)의 세포는 전혀 변화가 없음을 확인하였다. 또한, 20 시간 째에 Veh 군의 중간엽 줄기세포는 대부분 사멸되었으나, AC 군 및 AC/Lac12의 세포는 일부 사멸된 세포들이 관찰되었으며, 특히 AC/Lac12 군의 세포 생존이 더 우수하였다. 27 시간 째에는 AC 군 및 AC/Lac12 군의 세포도 사멸된 세포들이 상당히 관찰되었으나, AC/Lac12 군의 세포 생존이 더 우수함을 알 수 있었다.

실시예 3: 포도당-결핍 조건에서 아피시딘 및 젖산에 의한 중간엽 줄기세포의 심근 분화

3-1. 심근마커 유전자 발현의 증가

포도당결핍 조건에서 아피시딘 또는 아피시딘과 젖산의 첨가에 의한 심근특이 유전자 발현의 변화를 상기 실시예 1-3의 방법에 따라 RT-PCR 방법으로 정량하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 3 가지의 심근-특이 마커들 (GATA4, Nkx2.5, 또는 cTnI)의 세포 내 유전자 발현이 현저히 증가함을 확인하였으며, 특히 처리 20 시간 째의 유전자 발현양이 눈에 띠게 폭증하였는데, 아피시딘만 첨가된 경우보다 아피시딘 및 젖산이 함께 첨가된 경우에 그 증폭이 더 크게 나타남을 확인할 수 있었다.

3-2. 심근마커 단백질 발현의 증가

나아가, 심근특이 마커의 단백질 발현증가를 확인하기 위하여 상기 실시예 1-4의 방법에 따라 면역형광염색을 수행하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 포도당-결핍 조건에서 아피시딘이 첨가된 경우와 아피시딘 및 젖산이 첨가된 경우에 심근-특이 단백질인 GATA4 및 cTnI의 발현이 증가되었는데, 특히 아피시딘 및 젖산이 함께 첨가된 경우의 단백질 발현이 좀 더 높았으며, 이는 상기 실시예 3-1의 결과와 동일하였다. 즉, 포도당-결핍 조건에서 아피시딘을 병합 처리하는 경우, 매우 짧은 시간 내에 심근 분화 마커의 단백질 발현이 두드러지게 증가함을 알 수 있다.

실시예 4: 지방분화 마커, 골분화 마커, 및 연골분화 마커의 발현 확인

상기 실시예에 따라 확인된 바와 같이, 분화된 세포가 심근세포로의 특성을 가지는지 확인하기 위하여, 추가적으로 분화된 세포에 대하여 상기 실시예 1-3의 방법에 따라 qRT-PCR을 수행하여 지방분화 마커 PPAR-gamma, 골분화 마커 Runx2, 및 연골분화 마커 collagen type 2a1의 mRNA 발현수준을 비교분석하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 지방분화 마커인 PPAR-gamma, 골분화 마커인 Runx2, 및 연골분화 마커인 collagen type 2a1 모두 발현 증가폭이 상대적으로 크게 차이가 없거나 작게 나타남을 알 수 있었다.

따라서, 중간엽 줄기세포에 포도당-결핍 조건과 아피시딘 (apcidin)을 병합 처리하는 경우 매우 짧은 시간 내에 특이적으로 심근 분화를 유도할 수 있으며, 특히 젖산을 더 첨가하는 경우, 상기 분화 속도를 더욱 향상시킬 수 있는 바, 이를 심근세포를 이용한 치료에 응용할 수 있음을 시사하고 있다.

실시예 5: ( in vivo ) 심근경색-동물 모델의 심장조직에 이식한 중간엽줄기세포의 심근분화 확인

상기 실시예 결과를 바탕으로, 심근분화를 유도한 중간엽 줄기세포가 경색 심근에서도 분화가 유도되는지 확인하기 위하여, 심근경색-마우스 동물 모델을 이용하여 세포실험에서 확인한 중간엽 줄기세포의 심근분화를 실험동물의 심근조직에서도 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 포도당-결핍/아피시딘 처리 중간엽 줄기세포(Glc(-)/AC-MSC)를 이식한 심장조직에서 심근특이 구조 단백질인 alpha-sarcomeric actin (aSA)의 발현이 현저하게 증가함을 알 수 있었다.

이러한 결과는, 이식한 포도당-결핍/아피시딘 처리 중간엽 줄기세포가 심근유사세포 (cardiac committed cell)로 분화 유도되어, 심근 이식 후 생착한 다음 심근 미세환경내에서 심근세포로 분화됨을 의미한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

포도당-결핍 조건 하에서 아피시딘 (Apicidin) 및 젖산을 포함하는 배지에서 성체 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 성체 중간엽 줄기세포의 심근세포로의 분화 효율 증진 방법.
제1항에 있어서,
상기 성체 중간엽 줄기세포는 골수, 조직, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻은 것을 특징으로 하는, 방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 배양은 4 시간 내지 20 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 심근세포는 심근세포 특이적 마커의 발현이 성체 중간엽 줄기세포에 비해 증가되어 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
제6항에 있어서,
상기 심근세포 특이적 마커는 GATA4, Nkx2.5, cTnI (cardiac troponin I), cTnT (cardiac troponin T), MLC (myosin light chain), MHC (myosin heavy chain) 및 Cx43 (connexin 43)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
아피시딘 (Apicidin) 및 젖산을 포함하면서 포도당은 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 성체 중간엽 줄기세포의 심근세포로의 분화 효율 증진용 조성물.