JP4613069B2 - 支持細胞非含有、異種非含有のヒト胚性幹細胞の調製方法およびこれらを使用して調製された幹細胞培養物 - Google Patents
支持細胞非含有、異種非含有のヒト胚性幹細胞の調製方法およびこれらを使用して調製された幹細胞培養物 Download PDFInfo
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Description
マウス支持細胞層−ES細胞を培養するための最も一般的な方法は、ES細胞の増殖および多能性を助ける、血清または白血病阻害因子(LIF)を含有する組織培養培地が補充された支持細胞層としてのマウス胚性繊維芽細胞(MEF)に基づいている[Thomson JA、Itskovitz−Eldor J、Shapiro SS、Waknitz MA、Swiergiel JJ、Marshall VS、Jones JM(1998)、ヒト胚盤胞に由来する胚性幹細胞株、Science、282:1145〜7;Reubinoff BE、Pera MF、Fong C,Trounson A、Bongso A(2000)、ヒト胚盤胞由来の胚性幹細胞株:インビトロでの体細胞分化、Nat.Biotechnol.、18:399〜404]。MEF細胞は、ウシ胎児血清が補充された培地における12日齢〜13日齢のマウス胚から得られる。これらの条件のもとで、マウスES細胞は、その表現型および機能的特徴を持続させながら、多能性幹細胞として培養状態で維持することができる。しかしながら、マウスES細胞とは異なり、外部から添加されたLIFの存在下では、ヒトES細胞の分化は妨げられない(Thomson他、1998、Science、282:1145〜7;Reubinoff他、2000、Nat.Biotechnol.、18:399〜404)。さらに、支持細胞の使用は製造費用を実質的に増大させ、ヒトES細胞培養の規模拡大を実施不可能にする。また、支持細胞は、支持細胞が幹細胞を成長させないために代謝的に不活性化されており、従って、ヒトES培養のそれぞれの分割のために新鮮な支持細胞を有することが必要である。現在、大量培養で調製された胚細胞からの支持細胞成分の分離は効率的に達成することができないので、支持細胞層で調製されたES培養物はヒト治療には適していない。
幹細胞は、培養培地の存在下、細胞外マトリックス(例えば、MatrigelRTMまたはラミニン)などの固体表面において成長させることができる。支持細胞および幹細胞の同時成長が要求され、また、混合された細胞集団をもたらし得る支持細胞型培養とは異なり、支持細胞非含有システムで成長した幹細胞は表面から容易に分離される。幹細胞を成長させるために使用される培養培地は、分化を効果的に阻害し、その成長を促進させる因子(例えば、MEF馴化培地およびbFGFなど)を含有する。しかしながら、一般に使用されている支持細胞非含有培養システムでは、マウス血清もしくはウシ血清またはMEF馴化培地が補充された動物系マトリックス(例えば、MatrigelRTM)が利用されており[Xu C他(2001)、未分化ヒト胚性幹細胞の支持細胞非含有成長、Nat Biotechnol、19:971〜4]、これらは、ヒトES細胞に対する動物病原体の交差転移の危険性をもたらし、従って、将来の臨床的適用を危うくする。
本発明は、例としてだけであるが、添付されている図面を参照して、本明細書中に記載される。次に図面を詳しく具体的に参照して、示されている細目は、例としてであり、また、本発明の好ましい実施形態の例示的な議論のためのものであり、従って、本発明の原理および概念的態様の最も有用かつ容易に理解された記述であると考えられるものを提供するために示されていることが強調される。これに関して、記述を図面と一緒に理解することにより、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具体化され得るかが当業者には明らかになるので、発明の構造的詳細を、発明の基本的な理解のために必要であるよりも詳細に示すことは試みられていない。
図1a〜図1dは、支持細胞非含有システムでウシ由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したES細胞コロニーおよび単一ES細胞を例示する顕微鏡写真である。血清代替物および様々な組合せの増殖因子の存在下でフィブロネクチン上で成長した様々なES細胞株の明視野像が示される。図1a−31回の継代培養にわたってTGFβ1、LIFおよびbFGF(TLF)の存在下で成長したI−6ES細胞株(サイズバーは100μMを表す);図1b−21回の継代培養にわたってTLFにおいて成長したI−3ES細胞株(サイズバーは50μMを表す);図1c−31回の継代培養にわたってTLFにおいて成長したI−6ES細胞株(サイズバーは50μMを表す);図1d−20回の継代培養にわたってTGFβ1およびbFGF(TF)において成長したI−3ES細胞株(サイズバーは38μMを表す)。細胞間の間隔(図1a〜図1c)およびヒトES細胞に典型的な大きい核対細胞質比率(図1d)に留意すること。図1e〜図1hは、支持細胞非含有システムでウシ由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したヒトI−3ES細胞株およびI−6ES細胞株における未分化細胞に典型的な表面マーカーの発現を例示する免疫組織化学顕微鏡写真である。17回の継代培養にわたってTFの存在下で成長し、抗SSEA4抗体で標識されたヒトES細胞(系統I−3)の蛍光像(図1e、サイズバーは50μMを表す);38回の継代培養にわたってTLFの存在下で成長し、抗SSEA4抗体で標識されたI−3ES細胞の蛍光像(図1f、サイズバーは6μMを表す);30回の継代培養にわたってTLFの存在下で成長し、抗TRA−60抗体で標識されたI−6ES細胞の蛍光像(図1g、サイズバーは6μMを表す);21回の継代培養にわたってTFの存在下で成長し、抗TRA−81抗体で標識されたI−3ES細胞の蛍光像(図1h、サイズバーは6μMを表す)が示される。蛍光像は、倒立型蛍光顕微鏡(図1e)または共焦点顕微鏡(図1f〜図1h)のいずれかを使用して記録された。
図2a〜図2cは、支持細胞非含有システムでウシ由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したhES細胞のインビトロ分化を例示する。支持細胞非含有システムで成長した細胞に由来するEBの組織学的断面が示される。図2a−TFにおいて28回の継代培養にわたって成長した後のI−3細胞株に由来する24時間経た純然たるEB(サイズバーは100μMを表す);図2b−TFにおいて28回の継代培養にわたって成長したI−3細胞株に由来する14日齢のEB(サイズバーは50μMを表す);図2c−TLFにおいて30回の継代培養にわたって成長した細胞株I−3に由来する14日齢のEB(サイズバーは25μMを表す)。EBの外側の保護的上皮(図2b、矢印)、および間葉組織によって取り囲まれる柱状上皮からなるボール様構造(図2c)に留意すること。図2d〜図2fは、本発明の支持細胞非含有システムでウシ由来のフィブロネクチンマトリックスにおける様々な培地において成長したES細胞から形成された14日齢のEBに由来する細胞における中胚葉および外胚葉の代表的なマーカーの発現を例示する。様々なES細胞株に由来するEB細胞が様々な抗体プローブで蛍光免疫染色された。図2d−22回の継代培養にわたってTLFにおいて成長し、神経特異的チューブリンに対する抗体を使用して免疫染色されたI−6細胞株(サイズバーは6μMを表す)。図2e−30回の継代培養にわたってTLFにおいて成長し、平滑筋アクチンに対する抗体を使用して免疫染色されたI−3細胞株(サイズバーは6μMを表す)。図2f−28回の継代培養にわたってTFにおいて成長し、CD31に対する抗体を使用して免疫染色されたI−3細胞株(サイズバーは6μMを表す)。
図3は支持細胞非含有システムでウシ由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したI−3ES細胞またはI−6ES細胞の分化段階およびそれらに由来する胚様体(EB)の分化段階のRT−PCR決定を例示する。RT−PCR反応が、I−3ES細胞、I−6ES細胞、またはそれらに由来するEBから抽出されたRNAサンプルに対して行われた。レーン1−19回の継代培養にわたってTFにおいて成長したI−3ES細胞;レーン2−20回の継代培養にわたってTLFにおいて成長したI−3ES細胞;レーン3−23回の継代培養にわたってTLFにおいて成長したI−3ES細胞に由来する14日齢のEB;レーン4−28回の継代培養にわたってTFにおいて成長したI−3ES細胞に由来する14日齢のEB;レーン5−30回の継代培養にわたってTLFにおいて成長したI−3ES細胞に由来する14日齢のEB;レーン6−29回の継代培養にわたってTLFにおいて成長したI−3ES細胞に由来する14日齢のEB;レーン7−22回の継代培養にわたってTLFにおいて成長したI−6ES細胞に由来する14日齢のEB。反応の特異性がRNAの非存在下で確認された(図3、レーン8)。レーン3〜6のEBサンプルは1−3ES細胞の4つの異なるバッチに由来したことに留意すること。
図4a〜図4cは、支持細胞非含有システムでウシ由来のフィブロネクチンマトリックスでのTLFにおいてそれぞれ26回および19回の継代培養にわたって成長したI−3ES細胞株およびI−6ES細胞株に由来する奇形腫の組織学的断面を例示する。奇形腫の断面には、有髄神経(図4a)、ヒアリン軟骨の細部(図4b)、および、杯細胞が多い分泌上皮(図4c)が含まれる。サイズバーは25μMを表す。
図5a〜図5cは、支持細胞非含有システムでヒト由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したES細胞コロニーを例示する形態学顕微鏡写真である。血清代替物および増殖因子のTF組合せの存在下で22回の継代培養にわたってヒト細胞フィブロネクチンにおいて成長したI−3ES細胞株の明視野像が示される。図5d〜図5fは、支持細胞非含有システムでヒト由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したヒトI−3ES細胞株およびヒトH−9ES細胞株における未分化細胞に典型的な表面マーカーの発現を例示する免疫組織化学顕微鏡写真である。16回の継代培養にわたってTFの存在下でヒト細胞フィブロネクチンにおいて培養され、抗TRA−1−60抗体(図5d)または抗TRA−1−81抗体(図5e)で標識されたヒトI−3ES細胞株の明視野像、ならびに、10回の継代培養にわたってTLFの存在下でヒト血漿フィブロネクチンにおいて培養され、抗SSEA4抗体で標識されたヒトH−9ES細胞株の明視野像(図5f)が示される。
図6a〜図6cは、異種非含有かつ支持細胞非含有の状態のもとでヒトフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したhES細胞のインビトロ分化を例示する。様々な培養条件のもとで成長したI−3ES細胞に由来する14日齢のEBの像が示される。図6a−17回の継代培養にわたるTLF増殖因子の存在下におけるヒト細胞フィブロネクチンマトリックス;図6b−17回の継代培養にわたるTF増殖因子の存在下におけるヒト細胞フィブロネクチンマトリックス;図6c−16回の継代培養にわたるTLF増殖因子の存在下におけるヒト血漿フィブロネクチンマトリックス。
図7は支持細胞非含有システムでヒト由来のフィブロネクチンマトリックスにおいて成長したI−3細胞の分化段階およびそれに由来する胚様体(EB)の分化段階のRT−PCR決定を例示する。RT−PCR反応が、I−3ES細胞またはそれに由来するEBから抽出されたRNAサンプルに対して行われた。レーン1−22回の継代培養にわたってTFにおいて成長したI−3ES細胞;レーン2−18回の継代培養にわたってTLFにおいて成長したI−3ES細胞;レーン3−17回の継代培養にわたってTLFにおいて成長したI−3ES細胞;レーン4−17回の継代培養にわたってTFにおいて成長したI−3ES細胞に由来する14日齢のEB;レーン5−17回の継代培養にわたってTLFにおいて成長したI−3ES細胞に由来する14日齢のEB;レーン6−16回の継代培養にわたってTLFにおいて成長したI−3ES細胞に由来する14日齢のEB。反応の特異性がRNAの非存在下で確認された(図7、レーン7)。
図8a〜図8cは、様々な培養条件のもとでのI−3hES細胞株の成長速度(図8a)、I−6hES細胞株の成長速度(図8b)およびH−9hES細胞株の成長速度(図8c)を例示する。ウシフィブロネクチンマトリックスにおいて、増殖因子のTLF組合せの存在下で培養されたときの、I−3hES細胞株、I−6hES細胞株およびH−9hES細胞株の成長速度(ぞれぞれ、図8a、図8bおよび図8c、ピンク色曲線)、またはTF組合せの存在下で培養されたときのそれらの成長速度(ぞれぞれ、図8a、図8bおよび図8c、黒色曲線)、あるいは、ヒトフィブロネクチンマトリックスにおいて、増殖因子のTF組合せの存在下で培養されたときのそれらの成長速度(ぞれぞれ、図8a、図8bおよび図8c、明青色曲線)、またはMEF支持細胞上で培養されたときのそれらの成長速度(ぞれぞれ、図8a、図8bおよび図8c、暗青色の曲線)が示される。図8dは、未分化hES細胞の成長を助ける様々な培養条件の能力を例示する棒グラフである。ヒトES細胞が下記の培養条件のもとで培養された:マウス胚性繊維芽細胞(MEF)、TGFβ、LIFおよびbFGFの存在下でのウシフィブロネクチン(TLF BF)、TGFβ、LIFおよびbFGFの存在下でのヒトフィブロネクチン(TLF HF)、TGFβおよびbFGFの存在下でのウシフィブロネクチン(TF BF)、TGFβおよびbFGFの存在下でのヒトフィブロネクチン(TF HF)、LIFおよびTGFβの存在下でのウシフィブロネクチン(LT)、LIFおよびbFGFの存在下でのウシフィブロネクチン(LF)、TGFβだけの存在下でのウシフィブロネクチン(T)、ならびに、bFGFだけの存在下でのウシフィブロネクチン(F)。未分化細胞の百分率が2日ずつ延ばして測定された。
図9a〜図9fは、様々な条件のもとでの支持細胞非含有システムで成長したヒトES細胞およびヒトES細胞コロニーを例示する。支持細胞非含有システムで成長した様々なES細胞株の明視野像が示される。図9a−5回の継代培養にわたってTLFの存在下で包皮マトリックスにおいて成長したI−6細胞株(サイズバーは75μMを表す);図9b−MEF馴化培地の存在下で12回の継代培養にわたってMatrigelRTMにおいて成長したI−3.2細胞株(サイズバーは50μMを表す);図9c−数回の継代培養にわたってTLFの存在下でMEFマトリックスにおいて成長したI−6細胞株(サイズバーは75μMを表す);図9d−TFの存在下で21回の継代培養にわたってフィブロネクチンにおいて成長したI−3細胞株(サイズバーは50μMを表す);図9e−TLFの存在下で12回の継代培養にわたってMatrigelRTMにおいて成長したI−6細胞株(サイズバーは75μMを表す);図9f−20回の継代培養にわたってフィブロネクチンにおいて成長したI−3細胞株(サイズバーは38μMを表す)。
図10a〜図10fは、フィブロネクチン(図10aおよび図10b)、MEFマトリックス(図10c、図10eおよび図10f)またはMatrigelRTM(図10d)において成長したI−6ES細胞株およびI−3ES細胞株に由来するSCIDベージュマウスにおける奇形腫の組織学的断面を例示する。奇形腫の断面はヘマトキシリン&エオシンで染色され、断面には、杯細胞を含む腸様上皮(図10a)、成熟した軟骨組織(図10bおよび図10c)、胚筋管(図10d)、層状上皮(図10e)および有髄神経(図10f)が含まれる。サイズバーは40μMを表す。
異種非含有培地が補充された支持細胞非含有培養システムはES細胞株を成長させるために好適である
ヒトES細胞を、支持細胞非含有の十分に規定された環境をES細胞培養物に提供するために、血清代替物および選択された増殖因子の存在下でのフィブロネクチンに基づく細胞システムに移した。
ES細胞培養物:ヒトES細胞株のI−6、I−3[Amit,M.&Itskovitz−Eldor,J.、ヒト胚性幹細胞の誘導および自然分化、J Anat.、200、225〜232(2002)]およびH−9[Thomson,J.A.他、ヒト胚盤胞に由来する胚性幹細胞株、Science、282、1145〜7(1998)]が、15%の血清代替物(SR)が補充された85%のKo−DMEM、2mMのL−グルタミン、0.1mMのβ−メルカプトエタノール、1%の非必須アミノ酸ストック液、および4ng/mlのbFGFからなる培養培地(これらはすべてが、Gibco Invitrogen corporation products(米国)から得られる)で、46回、39回および25回の継代培養にわたってそれぞれ、マウス胚性繊維芽細胞(MEF)とともに培養された。ES細胞は、その後、20%のSR、80%の培養培地、および増殖因子の下記組合せの1つの存在下でのウシ由来フィブロネクチン被覆プレート(50μg/10cm2、Biological Industries(Beth Haemek、イスラエル))に移された:「T」−0.12ng/mlのTGFβ1(R&D Systems Inc.(Minneapolis、MN、米国));「TF」−0.12ng/mlのTGFβ1および4ng/mlのbFGF(Gibco Invitrogen corporation products(米国));「LF」−1000u/mlの白血病阻害剤因子(LIF、CHEMICON International,Inc.(Temecula、CA、米国))および4ng/mlのbFGF;または「TLF」−0.12ng/mlのTGFβ1、1000u/mlのLIFおよび4ng/mlのbFGF。付着性細胞が、1mg/mlのIV型コラゲナーゼ(Gibco Invitrogen corporation products(米国))を30分間使用して4日毎〜6日毎に分けられ、新鮮な培地を含有するフラスコに再び置床された。凍結プロトコルに従って、細胞を、10%のDMSO(Sigma(St.Louis、MO、米国))、10%のヒト血清(CHEMICON International,Inc.(Temecula、CA、米国))または15%のSR、および80%のKo−DMEM(Gibco Invitrogen corporation products(米国))からなる凍結液を使用して液体窒素で凍結した。
支持細胞非含有培養システムにおけるhES細胞の増殖能力−I−3、I−6およびH−9の系統に由来するES細胞を、本明細書中上記の方法に詳しく記載されるように、選択された増殖因子が補充された血清代替物の存在下でのフィブロネクチン被覆プレートに移した。培養培地に、bFGFだけが補充されたとき、または、LIFおよびbFGFが補充されたとき(LF)、細胞は数回の継代培養にわたって増殖し続け、その後、分化に変わった。また、ES培養培地にTGFβだけが補充されたとき、ES細胞は、10回を越える継代培養にわたって未分化状態で維持されたが、増殖が悪く、15回目の継代培養までにゆっくり消失していった。他方で、ES培養培地に、TGFβ1およびbFGFが補充されたとき(TF)、または、TGFβ1、LIFおよびbFGFが補充されたとき(TLF)、細胞は増殖し続け、MEFにおいて成長したhES細胞と同様に、hES細胞の正常な特徴を維持していた。しかしながら、TFの組合せで成長した細胞は、それぞれの継代培養の期間中、1枚のプレートに分けられたが、TLFの組合せで成長した細胞は、MEFにおいて成長したES細胞と同様に、2枚〜3枚のプレートに分けられた。このことは、増殖速度がTLFの組合せの存在下では大きいことを明らかにしている。従って、TLF組合せの増殖因子が補充された支持細胞非含有培養システムは、MEFにおいて成長したES細胞の倍加時間と同様な少なくとも25時間の倍加時間を伴ってhES細胞の正常な成長を助けることができた。
異種非含有培地が補充された支持細胞非含有培養システムは、表現型が一致するES細胞の成長を助ける
異種非含有培地が補充された支持細胞非含有培養システムで成長したhES細胞の表現型特徴が、未分化細胞に典型的な細胞表面マーカーを使用して評価された。
核型分析−ES細胞の有糸分裂中期が、コルセミド(KaryoMaxコルセミド溶液、Invitrogen(Grand island、NY、米国))を使用して阻止され、核膜が、標準的なプロトコル(ヒト細胞遺伝学命名法に関する国際システム、ISCN)による低張溶液において溶解された。染色体のGバンド形成が、製造者(Giemsa、Merck)の説明書に従って行われた。サンプルあたり少なくとも20個の細胞の核型がISCNに従って分析および報告された。
異種非含有培地が補充されたフィブロネクチン型支持細胞非含有培養システムは他の支持細胞型プロトコルのような一致した核型を有するES細胞をもたらす−核型分析が、異種非含有培地が補充されたフィブロネクチン型支持細胞非含有培養システムでの連続培養の後のhES細胞に対して行われた。核型分析は、2つの培地条件(TFおよびTLF)、および、支持細胞非含有培養システムでの6回〜32回の継代培養の異なる段階における3つのhES細胞株(I−3、I−6およびH−9)を表す9個の別個の培養物に対して行われた。この分析により、正常な核型が、TH培地で培養されたときの30回目の継代培養、およびTLF培地で培養されたときの32回目の継代培養において調べられた140個の細胞のうちの136個の細胞において明らかにされた。同じ群の4つの細胞において、47の異常な核型(すなわち、XXX)が見出された。これら4つの細胞は、ほぼ1年間にわたって培養されており、TLFが補充された支持細胞非含有培養システムにおいてそのうちの20回の継代培養が行われた誘導後71回目の継代培養においてであった。以前に報告されているように[Amit,M.、クローン誘導されたヒト胚性幹細胞株は多能性および増殖能力を長期間の培養にわたって維持する、Dev.Biol.、227:271〜8(2000)]、染色体の不安定性が、MEFにおいて8ヶ月間にわたって培養されたとき、ES細胞において生じ得る。まとめると、これらの結果から、本発明の支持細胞非含有培養システムはhES細胞の正常かつ安定な核型を助けていることが示唆される。
異種非含有培地が補充された支持細胞非含有培養システムは機能的なES細胞の成長を助ける
血清代替物および異種非含有増殖因子が補充されたフィブロネクチン型支持細胞非含有の培養システムで成長したヒトES細胞が、インビトロで胚様体を形成し、かつインビボで奇形腫を形成するその能力について調べられた。
ヒトES細胞からの胚様体(EB)の形成−支持細胞非含有培養システムで成長したヒトES細胞をIV型コラゲナーゼ(1mg/ml)によって6ウエルプレート(40cm2〜60cm2)培養物から取り出し、1000μlのGilsonピペットチップを使用して小さい塊にさらに解離させた。その後、解離した細胞を、20%の規定されたウシ胎児血清(FBSd、HyClone(Utah、米国))が補充された80%のKo−DMEM、1mMのL−グルタミン、0.1mMのβ−メルカプトエタノール、および1%の非必須アミノ酸ストック液からなる培地で58mmペトリディッシュ(Greiner、ドイツ)において培養した。別途記されない限り、すべてがGibco Invitrogen corporation(米国)から購入された。EBの形成が懸濁状態で14日後に調べられた。
ES細胞は、支持細胞非含有培養システムから取り出された後、インビトロで胚の胚葉細胞タイプに自然分化する−フィブロネクチンに基づく支持細胞非含有の培養システムで培養されたヒトES細胞が、支持細胞に基づくプロトコルによって得られるヒトES細胞と、表現型だけでなく、機能的に一致することを確認するために、ES細胞を、TLFにおける22回〜30回の継代培養の後、およびTFにおける28回の継代培養の後の支持細胞非含有培養から取り出して、懸濁状態で成長させた。結果として、hES細胞は、MEFにおいて成長したES細胞によって生じた胚様体(EB)と類似する胚様体を形成した(図2a〜図2c)。単離されたEBの機能性が、様々な胎児性細胞マーカーを使用するIHCによってさらに調べられた。図2d〜図2fにさらに示されるように、EBは、外胚葉起源に由来する神経特異的チューブリン、平滑筋アクチン、および中胚葉起源のCD−31マーカーを発現した。
完全な異種非含有かつ支持細胞非含有の培養システムは、表現型が一致するヒトES細胞を成長させるために好適である
動物非存在の環境はヒトES細胞の何らかの将来の臨床的使用のためには非常に重要であるので、完全な異種非含有かつ支持細胞非含有の培養システムが、hES細胞を培養するためのマトリックスとしてヒト起源のフィブロネクチン、ならびに、異種非含有の補充された培地、および増殖因子を使用して開発された。
異種非含有かつ支持細胞非含有の培養システムはヒトES細胞の成長を助ける−hES細胞培養のための完全な動物非存在の十分に規定された環境を得るために、ヒト起源のフィブロネクチンが支持細胞非含有培養システムとして使用された。培養培地には、本明細書中上記の実施例1における材料および実験方法で記載されるように、T、LF、TFおよびTLFの増殖因子組合せが補充された血清代替物(15%)が含まれた。ヒト血漿フィブロネクチン(ヒト血漿から得られるフィブロネクチン(Sigma、St.Louis、MO、米国))および細胞フィブロネクチン(ヒト包皮繊維芽細胞から得られる細胞フィブロネクチン(Sigma、St.Louis、MO、米国))はともに、TFおよびTLFの両方の増殖因子組合せの存在下で少なくとも38回の継代培養(約110回の倍加)にわたってhES細胞の未分化成長を助けることが見出された。また、本発明のフィブロネクチン−支持細胞非含有システムでの継代培養から4日目において、hES細胞培養物は、MEFにおいて成長したhES細胞の倍加時間と一致する30時間〜35時間の倍加時間を有する、85%〜90%の未分化細胞からなった。このことは、hES細胞の正常な成長を伝えるこれらの異種非含有培養システムの能力を明らかにしている。
完全な異種非含有かつ支持細胞非含の培養システムで成長したヒトES細胞は、他の培養システムで成長したES細胞と機能的に区別することができない
血清代替物および異種非含有増殖因子が補充されたヒトフィブロネクチン型支持細胞非含有培養システムで成長したヒトES細胞が、インビボで胚様体を形成するその能力について調べられた。
支持細胞非含有培養システムは未分化のヒト胚性幹細胞の正常な成長速度および大きい割合を支える
ヒト胚性幹細胞を増殖する支持細胞非含有培養システムの能力をさらに特徴づけるために、未分化幹細胞の成長速度および割合が、様々な培養条件のもとでのhES細胞において明らかにされた。
TLF組合せおよびTF組合せの増殖因子は他の支持細胞非含有培養システムでES細胞を維持するために好適である
他の支持細胞非含有システムを補うTLF組合せおよびTF組合せの増殖因子の能力をさらに立証するために、さらなるマトリックスが使用されている。
最初にMEFにおいて培養されたヒトES細胞を下記の支持細胞非含有培養システムに移した:MatrigelRTM、自家製のMEFマトリックス、および自家製の包皮繊維芽細胞マトリックス、これらはすべて、血清代替物および選択された組合せの増殖因子が補充された。TLF組合せまたはTF組合せの増殖因子を使用したとき、hES細胞は、MatrigelRTM、MEFマトリックスおよび包皮繊維芽細胞マトリックスにおいて問題なく成長した(図9a〜図9f)。MatrigelRTMマトリックスまたはMEFマトリックスのいずれかが利用されたとき、細胞は(120日を越える)未分化状態で30回の継代培養を越え、EBを生じさせ、奇形腫を形成した(図10c〜図10f)。しかしながら、これらのマトリックスは動物非存在でもなく、また、十分に規定されたものでもなく、このため、フィブロネクチンには好都合な選択肢が残っている。
Claims (28)
- 多能性かつ増殖性の未分化状態で維持することができる支持細胞非含有のヒト胚性幹細胞株を確立する方法であって、
支持細胞を含まず、マトリックスと、トランスフォーミング増殖因子β1(TGFβ1)および塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)が補充された組織培養培地とを含む培養条件のもとでヒト胚性幹細胞を培養し、それにより、支持細胞非含有のヒト胚性幹細胞株を得る工程;
を含む方法。 - 前記培養条件のもとでヒト胚性幹細胞株から細胞をクローン化する工程をさらに含む請求項1に記載の方法。
- 支持細胞を含まない培養条件のもとで、多能性かつ増殖性の未分化状態でヒト胚性幹細胞株を拡大する方法であって、ヒト胚性幹細胞株の細胞を、マトリックスと、TGFβ1およびbFGFが補充された組織培養培地とに基づいて培養し、それにより、ヒト胚性幹細胞株の細胞を多能性かつ増殖性の未分化状態で維持する工程を含む方法。
- 多能性かつ増殖性の未分化状態で維持することができる特定の種の異種非含有かつ支持細胞非含有の胚性幹細胞株を確立する方法であって、
支持細胞および異種混入物を含まず、特定の種由来のマトリックスと、TGFβ1およびbFGFを含む組織培養培地とを含む培養条件のもとで胚性幹細胞を培養し、それにより、異種非含有かつ支持細胞非含有の、特定の種の胚性幹細胞株を得る工程;
を含む方法。 - 支持細胞および異種混入物を含まない培養条件のもとで、多能性かつ増殖性の未分化状態で特定の種の胚性幹細胞株を拡大する方法であって、特定の種の胚性幹細胞株の細胞を、特定の種由来のマトリックスと、TGFβ1およびbFGFを含む組織培養培地とに基づいて培養し、それにより、特定の種の胚性幹細胞株の細胞を多能性かつ増殖性の未分化状態で維持する工程を含む方法。
- 支持細胞を含まない培養条件のもとで、ヒト胚性幹細胞を多能性かつ増殖性の未分化状態で維持する方法であって、マトリックスと、少なくとも25時間の倍加時間を伴って少なくとも56回の継代培養にわたって前記幹細胞を維持することができる選択された濃度範囲で提供されるTGFβ1およびbFGFを含む組織培養培地とを含む培養条件のもとでヒト胚性幹細胞を培養する工程を含む方法。
- 前記マトリックスが、ヒト由来フィブロネクチン、ヒト由来ラミニン、包皮繊維芽細胞マトリックス、およびMEFマトリックスからなる群から選択される請求項6に記載の方法。
- 前記マトリックスがフィブロネクチンマトリックスである請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フィブロネクチンが、ウシフィブロネクチン、組換えウシフィブロネクチン、ヒトフィブロネクチン、組換えヒトフィブロネクチン、マウスフィブロネクチン、組換えマウスフィブロネクチン、および合成フィブロネクチンからなる群から選択される請求項8に記載の方法。
- 前記培養条件が異種混入物を含まず、前記マトリックスが、ヒト血漿フィブロネクチンマトリックス、組換えヒト血漿フィブロネクチンマトリックス、ヒト細胞フィブロネクチンマトリックス、組換えヒト細胞フィブロネクチンマトリックス、および合成フィブロネクチンからなる群から選択される請求項1,2,3または6に記載の方法。
- ヒト胚性幹細胞株が少なくとも85%の未分化ヒト胚性幹細胞を含む請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト胚性幹細胞株の細胞が少なくとも25時間の倍加時間を維持する請求項1,2または3に記載の方法。
- 前記組織培養培地が血清および/または血清代替物をさらに含む請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血清および/または前記血清代替物が少なくとも10%の濃度で提供される請求項13に記載の方法。
- 前記TGFβ1が少なくとも0.06ng/mlの濃度で提供される請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記bFGFが少なくとも2ng/mlの濃度で提供される請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培地が白血病阻害剤因子(LIF)をさらに補充されている請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記LIFが少なくとも500u/mlの濃度で提供される請求項17に記載の方法。
- 前記組織培養培地が特定の種由来の血清および/または血清代替物を含む請求項4または5に記載の方法。
- 未分化で、多能性かつ増殖性のヒト胚性幹細胞を培養培地に含む細胞培養物であって、前記培養培地がTGFβ1およびbFGFを含み、前記細胞培養物が異種混入物および/または支持細胞の混入物を含まない細胞培養物。
- 培養培地が血清代替物を含む請求項20に記載の細胞培養物。
- 前記培養培地がLIFをさらに含む請求項20または21に記載の細胞培養物。
- マトリックスおよび組織培養培地を含む異種非含有かつ支持細胞非含有の培養システムであって、前記組織培養培地がTGFβ1およびbFGFを含み、前記培養システムが、この培養システムで培養されたヒト胚性幹細胞を増殖性かつ多能性の未分化状態で維持することができるように選択される異種非含有かつ支持細胞非含有の培養システム。
- 前記マトリックスがヒト由来のフィブロネクチンである請求項23に記載の培養システム。
- 前記組織培養培地が血清代替物を含む請求項23または24に記載の培養システム。
- 前記培養培地がLIFをさらに含む請求項23〜25のいずれか一項に記載の培養システム。
- 細胞置換および/または組織再生用医薬品の製造のための、異種混入物および支持細胞を含まないヒト胚性幹細胞調製物の使用であって、前記ヒト胚性幹細胞調製物が、支持細胞および異種混入物を含まず、ヒト由来のフィブロネクチンマトリックスと、TGFβ1およびbFGFが補充された組織培養培地とを含む培養条件のもとでヒト胚性幹細胞を培養することによって調製される使用。
- 前記培養条件が、15%の濃度の血清代替物、0.12ng/mlの濃度のTGFβ1、1000u/mlの濃度のLIF、および4ng/mlの濃度のbFGFを含む請求項6に記載の方法。
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