RU2668798C2 - Способы in vitro пошаговой дифференцировки полюрипотентных клеток - Google Patents
Способы in vitro пошаговой дифференцировки полюрипотентных клеток Download PDFInfo
- Publication number
- RU2668798C2 RU2668798C2 RU2014130042A RU2014130042A RU2668798C2 RU 2668798 C2 RU2668798 C2 RU 2668798C2 RU 2014130042 A RU2014130042 A RU 2014130042A RU 2014130042 A RU2014130042 A RU 2014130042A RU 2668798 C2 RU2668798 C2 RU 2668798C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- stage
- medium
- pancreatic
- inhibitor
- Prior art date
Links
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 84
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 76
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 491
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 106
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 claims abstract description 104
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 claims abstract description 103
- 102100041030 Pancreas/duodenum homeobox protein 1 Human genes 0.000 claims abstract description 101
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 100
- 102100028096 Homeobox protein Nkx-6.2 Human genes 0.000 claims abstract description 92
- 101000578254 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-6.1 Proteins 0.000 claims abstract description 92
- 101000578258 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-6.2 Proteins 0.000 claims abstract description 92
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 claims abstract description 90
- 101710144033 Pancreas/duodenum homeobox protein 1 Proteins 0.000 claims abstract description 85
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 80
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 71
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 26
- 150000004492 retinoid derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 20
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 145
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 110
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 78
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 64
- CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 4-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]-3-pyrazolo[1,5-a]pyrimidinyl]quinoline Chemical compound C1CNCCN1C1=CC=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C3=CC=CC=C3N=CC=2)C=C1 CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 45
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 45
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 45
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims description 44
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 44
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 40
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 claims description 39
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 38
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 38
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 claims description 37
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 claims description 35
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 31
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 29
- 102100039939 Growth/differentiation factor 8 Human genes 0.000 claims description 28
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 28
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 claims description 23
- FOORCIAZMIWALX-ULJHMMPZSA-N (z)-n-(4-benzylpiperazin-1-yl)-1-(3,5-dimethyl-1-phenylpyrazol-4-yl)methanimine Chemical compound CC1=NN(C=2C=CC=CC=2)C(C)=C1\C=N/N(CC1)CCN1CC1=CC=CC=C1 FOORCIAZMIWALX-ULJHMMPZSA-N 0.000 claims description 22
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 17
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 17
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 14
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 claims description 14
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 claims description 10
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 claims description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 102000019058 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Human genes 0.000 claims 4
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 claims 2
- 108010056852 Myostatin Proteins 0.000 claims 2
- PTFNNDHASFGWFI-UHFFFAOYSA-N 2,4,5-trichlorobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl PTFNNDHASFGWFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 205
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 98
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 76
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 68
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 68
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 68
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 68
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 65
- 108010083123 CDX2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 60
- 102000006277 CDX2 Transcription Factor Human genes 0.000 description 60
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 51
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 46
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 46
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 46
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 41
- 102000007345 Chromogranins Human genes 0.000 description 33
- 108010007718 Chromogranins Proteins 0.000 description 33
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 33
- 230000009996 pancreatic endocrine effect Effects 0.000 description 31
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 28
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 description 27
- 101000886562 Homo sapiens Growth/differentiation factor 8 Proteins 0.000 description 26
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 24
- 102100032063 Neurogenic differentiation factor 1 Human genes 0.000 description 23
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 23
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 23
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 22
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 22
- 101000603702 Homo sapiens Neurogenin-3 Proteins 0.000 description 21
- 108050000588 Neurogenic differentiation factor 1 Proteins 0.000 description 21
- 102100038553 Neurogenin-3 Human genes 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 17
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 17
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 17
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 17
- 101710183548 Pyridoxal 5'-phosphate synthase subunit PdxS Proteins 0.000 description 15
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 15
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 15
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 15
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 12
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 11
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 11
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 11
- 210000002438 upper gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 11
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102100038104 Glycogen synthase kinase-3 beta Human genes 0.000 description 10
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 10
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 10
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 10
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 10
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 9
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 9
- 102000007354 PAX6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 9
- 101150081664 PAX6 gene Proteins 0.000 description 9
- 101150075928 Pax4 gene Proteins 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 9
- 101100518002 Danio rerio nkx2.2a gene Proteins 0.000 description 8
- 108700014808 Homeobox Protein Nkx-2.2 Proteins 0.000 description 8
- 102100027886 Homeobox protein Nkx-2.2 Human genes 0.000 description 8
- 101100460496 Homo sapiens NKX2-2 gene Proteins 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 7
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 7
- -1 C-Kit Proteins 0.000 description 6
- 101000652324 Homo sapiens Transcription factor SOX-17 Proteins 0.000 description 6
- 102100030243 Transcription factor SOX-17 Human genes 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 6
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 6
- 101001069749 Homo sapiens Prospero homeobox protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 101150111110 NKX2-1 gene Proteins 0.000 description 5
- 102100033880 Prospero homeobox protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 5
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 description 5
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- 108010040422 Bone Morphogenetic Protein Receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000001893 Bone Morphogenetic Protein Receptors Human genes 0.000 description 4
- 102100029284 Hepatocyte nuclear factor 3-beta Human genes 0.000 description 4
- 102100022054 Hepatocyte nuclear factor 4-alpha Human genes 0.000 description 4
- 101001062347 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 3-beta Proteins 0.000 description 4
- 101001045740 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 4-alpha Proteins 0.000 description 4
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102100039282 Cytochrome P450 26A1 Human genes 0.000 description 3
- 102100037042 Forkhead box protein E1 Human genes 0.000 description 3
- 101150097704 HHEX gene Proteins 0.000 description 3
- 102100029087 Hepatocyte nuclear factor 6 Human genes 0.000 description 3
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 3
- 101000745891 Homo sapiens Cytochrome P450 26A1 Proteins 0.000 description 3
- 101001029304 Homo sapiens Forkhead box protein E1 Proteins 0.000 description 3
- 101000988619 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 6 Proteins 0.000 description 3
- 101000598781 Homo sapiens Oxidative stress-responsive serine-rich protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000613717 Homo sapiens Protein odd-skipped-related 1 Proteins 0.000 description 3
- 101001098464 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase OSR1 Proteins 0.000 description 3
- 101000819074 Homo sapiens Transcription factor GATA-4 Proteins 0.000 description 3
- 101000976622 Homo sapiens Zinc finger protein 42 homolog Proteins 0.000 description 3
- 102100024392 Insulin gene enhancer protein ISL-1 Human genes 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 102000052651 Pancreatic hormone Human genes 0.000 description 3
- 102100040551 Protein odd-skipped-related 1 Human genes 0.000 description 3
- 102100021380 Transcription factor GATA-4 Human genes 0.000 description 3
- 102100023550 Zinc finger protein 42 homolog Human genes 0.000 description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 3
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 3
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 3
- 230000007045 gastrulation Effects 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000004025 pancreas hormone Substances 0.000 description 3
- 229940032957 pancreatic hormone Drugs 0.000 description 3
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 75976-10-2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)N)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 0.000 description 2
- RYVZYACBVYKUHD-UHFFFAOYSA-N Alk5 Natural products CC#CC#CCCCCC=CC(=O)NCC(C)C RYVZYACBVYKUHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000024905 CD99 Human genes 0.000 description 2
- 108060001253 CD99 Proteins 0.000 description 2
- 101100257359 Caenorhabditis elegans sox-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100025745 Cerberus Human genes 0.000 description 2
- 101000923091 Danio rerio Aristaless-related homeobox protein Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100028072 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 description 2
- 102100037060 Forkhead box protein D3 Human genes 0.000 description 2
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 description 2
- 102100031470 Homeobox protein ARX Human genes 0.000 description 2
- 102100024208 Homeobox protein MIXL1 Human genes 0.000 description 2
- 101001060274 Homo sapiens Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 2
- 101001029308 Homo sapiens Forkhead box protein D3 Proteins 0.000 description 2
- 101001045751 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000923090 Homo sapiens Homeobox protein ARX Proteins 0.000 description 2
- 101001052462 Homo sapiens Homeobox protein MIXL1 Proteins 0.000 description 2
- 101001053263 Homo sapiens Insulin gene enhancer protein ISL-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000576323 Homo sapiens Motor neuron and pancreas homeobox protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000613495 Homo sapiens Paired box protein Pax-4 Proteins 0.000 description 2
- 101000612089 Homo sapiens Pancreas/duodenum homeobox protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000777245 Homo sapiens Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000976653 Homo sapiens Zinc finger protein ZIC 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 description 2
- 108010090306 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 2
- 102000013013 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 description 2
- 102100025170 Motor neuron and pancreas homeobox protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 101100257363 Mus musculus Sox2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150079937 NEUROD1 gene Proteins 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010032788 PAX6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100040909 Paired box protein Pax-4 Human genes 0.000 description 2
- 102100037506 Paired box protein Pax-6 Human genes 0.000 description 2
- 102000018886 Pancreatic Polypeptide Human genes 0.000 description 2
- 101800001268 Pancreatic hormone Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 101000983124 Sus scrofa Pancreatic prohormone precursor Proteins 0.000 description 2
- 102100031278 Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100023497 Zinc finger protein ZIC 1 Human genes 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000003750 lower gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000003577 pancreatic endocrine progenitor Anatomy 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 230000002311 subsequent effect Effects 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 1
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 1
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- 0 CC(*(C)CC(C)(C)C1)*1(C)S Chemical compound CC(*(C)CC(C)(C)C1)*1(C)S 0.000 description 1
- 102100036008 CD48 antigen Human genes 0.000 description 1
- 101150096994 Cdx1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000202252 Cerberus Species 0.000 description 1
- 101710010675 Cerberus Proteins 0.000 description 1
- 102100031192 Chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010069241 Connexin 43 Proteins 0.000 description 1
- 102000001045 Connexin 43 Human genes 0.000 description 1
- 102100037986 Dickkopf-related protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 102100028412 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 description 1
- 108090001047 Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 description 1
- 102100035308 Fibroblast growth factor 17 Human genes 0.000 description 1
- 102100037680 Fibroblast growth factor 8 Human genes 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 101100180045 Gallus gallus ISL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100039290 Gap junction gamma-1 protein Human genes 0.000 description 1
- 102000012004 Ghrelin Human genes 0.000 description 1
- 101800001586 Ghrelin Proteins 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 108091052347 Glucose transporter family Proteins 0.000 description 1
- 102000042092 Glucose transporter family Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108700031316 Goosecoid Proteins 0.000 description 1
- 102000050057 Goosecoid Human genes 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 108090000031 Hedgehog Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700005087 Homeobox Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100030634 Homeobox protein OTX2 Human genes 0.000 description 1
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000716130 Homo sapiens CD48 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101100220368 Homo sapiens CSGALNACT1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000914195 Homo sapiens Cerberus Proteins 0.000 description 1
- 101000951340 Homo sapiens Dickkopf-related protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000878124 Homo sapiens Fibroblast growth factor 17 Proteins 0.000 description 1
- 101001027382 Homo sapiens Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000584400 Homo sapiens Homeobox protein OTX2 Proteins 0.000 description 1
- 101000971533 Homo sapiens Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000835745 Homo sapiens Teratocarcinoma-derived growth factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000979205 Homo sapiens Transcription factor MafA Proteins 0.000 description 1
- 102100021457 Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100369076 Mus musculus Tdgf1 gene Proteins 0.000 description 1
- SNFYYXUGUBUECJ-UHFFFAOYSA-N N-{4-[2-ethyl-1-(1,2,4-triazol-1-yl)butyl]phenyl}-1,3-benzothiazol-2-amine Chemical compound C=1C=C(NC=2SC3=CC=CC=C3N=2)C=CC=1C(C(CC)CC)N1C=NC=N1 SNFYYXUGUBUECJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150088305 OSR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150092239 OTX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150111723 PDX1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700020479 Pancreatic hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004874 Synaptophysin Human genes 0.000 description 1
- 108090001076 Synaptophysin Proteins 0.000 description 1
- 102100026404 Teratocarcinoma-derived growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108010006886 Vitrogen Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 1
- 210000001874 anterior cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000001815 ascending colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 210000003445 biliary tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000003715 calcium chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 108010015426 connexin 45 Proteins 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 210000001731 descending colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000000646 extraembryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N ghrelin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)COC(=O)CCCCCCC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- OGQSCIYDJSNCMY-UHFFFAOYSA-H iron(3+);methyl-dioxido-oxo-$l^{5}-arsane Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].C[As]([O-])([O-])=O.C[As]([O-])([O-])=O.C[As]([O-])([O-])=O OGQSCIYDJSNCMY-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 230000015031 pancreas development Effects 0.000 description 1
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000007261 regionalization Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 210000001599 sigmoid colon Anatomy 0.000 description 1
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000920 spermatogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000005944 tissue migration Effects 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 210000003384 transverse colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/34—Sugars
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/19—Growth and differentiation factors [GDF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, в частности к пошаговой дифференцировки in vitro плюрипотентных клеток в популяцию клеток линии панкреатической энтодермы, которые экспрессируют PDX-1, более высокий уровень NKX6.1 и более низкий уровень SOX2 по сравнению с панкреатическими клетками передней кишки, а также к дифференцировке в панкреатические бета-клетки. Способ включает обработку плюрипотентных клеток, выбранных из группы, состоящей из клеток линии эмбриональных стволовых клеток человека линии Н1, клеток линии эмбриональных стволовых клеток человека линии Н9, перепрограммированных плюрипотентных клеток, индуцибельных плюрипотентных клеток или плюрипотентных стволовых клеток неэмбрионального происхождения, на каждой стадии дифференцировки глюкозой в количестве от 5 до 20 мМ. Также способ включает дополнительную обработку панкреатических клеток передней кишки ингибитором shh, ингибитором TGF-B и ретиноидом. Изобретение позволяет успешно производить пошаговую дифференцировку. 2 н. и 38 з.п. ф-лы, 180 ил., 8 табл., 13 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СМЕЖНУЮ ЗАЯВКУ
Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной патентной заявки США, серийный номер 61/579351, поданной 22 декабря 2011 г., которая включена в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области дифференцировки клеток. Более конкретно, настоящее изобретение относится к одногормональным инсулинпродуцирующим клеткам, дифференцированным из плюрипотентных стволовых клеток с использованием определенных условий на каждой стадии поэтапной дифференцировки. Более 10% дифференцированных инсулинпродуцирующих клеток из группы экспрессируют маркеры, характерные для одногормональных бета-клеток поджелудочной железы.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1-го типа и нехватка островков Лангерганса для трансплантации заставили обратить внимание на разработку источников инсулинпродуцирующих клеток, или β-клеток, подходящих для трансплантации. Одним из подходов является формирование функциональных β-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.
При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентные клетки дают начало группе клеток, содержащих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и эндодерму), в ходе процесса, именуемого гаструляцией. Ткани, такие как ткань щитовидной железы, вилочковой железы, поджелудочной железы, кишечника и печени, будут развиваться из энтодермы через промежуточную стадию. Промежуточной стадией в этом процессе является формирование дефинитивной энтодермы. Дефинитивные клетки энтодермы экспрессируют ряд маркеров, таких как HNF3beta, GATA4, MIXL1, CXCR4 и SOX17.
К концу гаструляции энтодерма разделяется на передний и задний отделы, которые могут быть распознаны по экспрессии целого ряда факторов, однозначно выделяющих переднюю, среднюю и заднюю области энтодермы. Например, Hhex и Sox2 идентифицируют переднюю область, в то время как Cdx1, 2 и 4 идентифицируют заднюю половину энтодермы.
Миграция ткани энтодермы приближает энтодерму как можно ближе к различным мезодермальным тканям, которые способствуют регионализации кишечной трубки. Это достигается за счет целого ряда секретируемых факторов, таких как FGFs, Wnts, TGF-Bs, ретиноевой кислоты (RA), лигандов BMP и их антагонистов. Например, FGF4 и BMP способствуют экспрессии Cdx2 в предполагаемой энтодерме задней кишки и подавляют экспрессию передних генов Hhex и SOX2 (Development 2000, 127: 1563-1567). Было продемонстрировано, что сигнализация WNT также действует параллельно с сигнализацией FGF, способствуя развитию задней кишки и препятствуя зачаткам передней кишки (Development 2007, 134: 2207-2217). Наконец, ретиноевая кислота, секретируемая мезенхимой, регулирует границу между передней и задней кишкой (Curr Biol 2002, 12: 1215-1220).
Уровень экспрессии специфических факторов транскрипции может использоваться для определения типа ткани. Во время преобразования дефинитивной энтодермы в примитивную кишечную трубку кишечная трубка становится разделенной на широкие отделы, которые можно наблюдать на молекулярном уровне с помощью ограниченных паттернов экспрессии генов. Например, регионализованный отдел поджелудочной железы в кишечной трубке демонстрирует очень высокую экспрессию PDX-1 и очень низкую экспрессию CDX2 и SOX2. Аналогично, наличие высоких уровней Foxel свидетельствует о ткани пищевода; в легочной ткани высок уровень экспрессии NKX2.1; в ткани желудка высок уровень экспрессии SOX2/Odd1 (OSR1); уровень экспрессии PROX1/Hhex/AFP высок в ткани печени; SOX17 имеет высокий уровень экспрессии в тканях желчного тракта; высок уровень экспрессии PDX1, NKX6.1/PTf1a и NKX2.2 в ткани поджелудочной железы; а уровень экспрессии CDX2 высок в ткани кишечника. Сводка, приведенная выше, взята из Dev Dyn 2009, 238: 29-42 и Annu Rev Cell Dev Biol 2009, 25: 221-251.
Формирование поджелудочной железы происходит в результате дифференцировки дефинитивной энтодермы в энтодерму поджелудочной железы (Annu Rev Cell Dev Biol 2009, 25: 221-251; Dev Dyn 2009, 238: 29-42). Дорсальный и вентральный отделы поджелудочной железы формируются из эпителия передней кишки. Передняя кишка также дает начало формирования пищевода, трахеи, легких, щитовидной железы, желудка, печени, поджелудочной железы и системы желчных протоков.
Клетки энтодермы поджелудочной железы экспрессируют панкрео-дуоденальный, содержащий гомеобокс ген PDX1. При отсутствии Pdx1 развитие поджелудочной железы не идет дальше формирования вентрального и дорсального зачатков. Таким образом, экспрессия PDX1 характеризует критическую стадию органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит, помимо других типов клеток, экзокринную ткань и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются при дифференцировке панкреатической эндодермы.
D'Amour и др. описывает производство обогащенных культур дефинитивной энтодермы, полученной из эмбриональных стволовых клеток человека в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnol 2005, 23: 1534-1541; патент США №7704738). Трансплантация этих клеток под капсулу почки у мышей приводила к дифференцировке в более зрелые клетки с характеристиками ткани энтодермы (патент США №7704738). Клетки дефинитивной энтодермы, полученные из эмбриональных стволовых клеток человека, могут быть далее дифференцированы в PDX1-позитивные клетки после добавления FGF-10 и ретиноевой кислоты (патентная публикация США №2005/0266554 А1). Последующая трансплантация этих клеток-предшественников поджелудочной железы под капсулу почки у мышей с иммунодефицитом приводила к формированию функциональных эндокринных клеток поджелудочной железы после этапа созревания в течение 3-4 месяцев (патент США №7993920 и 7534608).
Fisk и др. сообщают о системе получения клеток панкреатических островков из эмбриональных стволовых клеток человека (патент США №7033831). В данном случае процесс дифференцировки был разделен на три стадии. Эмбриональные стволовые клетки человека сначала были дифференцированы в энтодерму при помощи сочетания бутирата натрия и активина А (патент США №7326572). Затем клетки культивировали с антагонистами BMP, такими как Noggin, в сочетании с EGF или бета-целлюлином для генерирования PDX1-позитивных клеток. Окончательная дифференцировка запускалась никотинамидом.
Ингибиторы в виде небольших молекул также использовались для индуцирования предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы. Например, ингибиторы в виде небольших молекул рецепторов TGF-B и рецепторов BMP (Development 2011, 138: 861-871; Diabetes 2011, 60: 239-247) использовались для значительного увеличения количества получаемых эндокринных клеток поджелудочной железы. Кроме того, активирующие молекулы небольших размеров также использовались для генерирования клеток дефинитивной энтодермы или клеток-предшественников поджелудочной железы (Curr Opin Cell Biol 2009, 21: 727-732; Nature Chem Biol 2009, 5: 258-265).
Предыдущие попытки индуцирования предшественников клеток поджелудочной железы из эмбриональных стволовых клеток человека выявили важность совместной экспрессии PDX-1 и NKX6.1 для корректной идентификации энтодермы поджелудочной железы. Тем не менее, хотя исследования в данной области определили, что в группе клеток с положительной экспрессией PDX-1 и NKX6.1 экспрессия CDX2 невелика или отсутствует, предыдущие отчеты не смогли дать ответ на вопрос о наличии маркеров непосредственно перед развивающейся поджелудочной железой. SOX2, который является маркером передней энтодермы, не экспрессируется во взрослых островках и экспрессируется на очень низком уровне в развивающейся поджелудочной железе (Diabetes 2005, 54: 3402-4309). Напротив, некоторые из примеров в данной заявке описывают группы клеток, в которых по меньшей мере 30% клеток энтодермы поджелудочной железы, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека, положительны по экспрессии PDX-1 и NKX6.1 и отрицательны по экспрессии CDX2 и SOX2.
Все предыдущие попытки создания функциональных бета-клеток поджелудочной железы не привели к генерированию клеток с характеристиками зрелых бета-клеток. Отличительные особенности зрелых бета-клеток включают в себя экспрессию гормона инсулина, корректную переработку проинсулина в инсулин и С-пептид, сильную экспрессию PDX-1 и NKX6.1, соответствующее выделение инсулина в ответ на глюкозу, экспрессию транспортеров глюкозы и сильную экспрессию глюкокиназы. Все предшествующие отчеты сообщали об эндокринных клетках, которые производят два или более гормона поджелудочной железы. Например, D'Amour и др. (Nature Biotech 2006, 24: 1392-1401) сообщают о получении группы клеток, содержащих -10% инсулинположительных клеток и -20% эндокринных клеток по измерению синаптофизином. Подобные сообщения других (Cell Res 2009, 19: 429-438; Stem Cells 2007, 25: 1940-1953; Diabetes Obes Metab 2008, 10: 186-194) также продемонстрировали дифференцировку плюрипотентных клеток в нефункциональные инсулинположительные клетки. Действительно, недавние исследования определенно установили, что трансплантация полигормональных клеток у мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (ТКИД) не привела к образованию функциональных бета-клеток (Diabetes 2011, 60: 239-247; Nature Biotech 2011, 29: 750-756). В то время как в поджелудочной железе плода человека часть (-10-20%) эндокринных клеток является полигормональными клетками, полигормональные клетки исчезают и отсутствуют в поджелудочной железе взрослого человека (Histochem Cell Biol 1999, 112: 147-153; J Histochem Cytochem 2009, 57: 811-824).
По мере совершенствования растущей отрасли регенеративной медицины способ получения окончательно дифференцированных и надлежащим образом регулируемых эндокринных клеток поджелудочной железы становится весьма востребованным. Мы демонстрируем в настоящем документе, что при соответствующем и определенном воздействии на условия развития культуры клеток и точных сроках добавления активаторов/ингибиторов различных путей развития эмбриональные стволовые клетки человека могут быть дифференцированы in vitro в функционирующие бета-клетки поджелудочной железы. В частности, точный момент ингибирования BMP с использованием градиента ретиноевой кислоты наряду с использованием витамина С подтвердил свою эффективность при получении одногормональных эндокринных клеток поджелудочной железы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение обеспечивает создание группы клеток линии дифференцировки энтодермы поджелудочной железы, полученной in vitro путем поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток. Среда, используемая на каждой стадии дифференцировки, дополняется глюкозой. В некоторых вариантах осуществления на каждой стадии дифференцировки клетки культивируются в среде, содержащей от 5 до 2 0 мМ глюкозы.
В некоторых вариантах осуществления дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток генерирует группы клеток энтодермы поджелудочной железы, где больше 10% клеток в дифференцированной группе экспрессируют маркеры, характерные для одногормональных бета-клеток поджелудочной железы.
В некоторых вариантах осуществления дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток генерирует группу клеток энтодермы поджелудочной железы, где более 30% дифференцированной группы положительны по экспрессии PDX-1 и NKX6.1, но в то же время отрицательны по экспрессии CDX2 и SOX2.
В некоторых вариантах осуществления поэтапная дифференцировка содержит культивирование недифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека в среде, дополненной лигандом TGF-B. В некоторых вариантах осуществления поэтапная дифференцировка содержит культивирование недифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека в среде, дополненной активатором WNT. В некоторых вариантах осуществления поэтапная дифференцировка содержит культивирование дефинитивных клеток энтодермы в среде, далее дополненной лигандом FGF. В некоторых вариантах осуществления поэтапная дифференцировка содержит культивирование клеток кишечной трубки в среде, далее дополненной ингибитором shh, лигандом FGF, активатором РКС, лигандом TGF-B, ретиноидом и градиентом ингибитора BMP. В некоторых вариантах осуществления поэтапная дифференцировка содержит культивирование задних клеток переднего кишечника в среде, далее дополненной активатором РКС, ингибитором shh, ретиноидом и ингибитором BMP. В некоторых вариантах осуществления поэтапная дифференцировка содержит культивирование клеток в среде, далее дополненной аскорбиновой кислотой.
В варианте осуществления изобретение обеспечивает способ in vitro для поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток в группу линии дифференцировки клеток энтодермы поджелудочной железы, которая содержит культивирование клеток на каждой стадии дифференцировки в среде, содержащей от 5 до 20 мМ глюкозы. В некоторых вариантах осуществления способ in vitro для поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток дополнительно содержит дифференцировку плюрипотентных клеток в клетки дефинитивной энтодермы (DE) путем культивирования плюрипотентных клеток в среде, дополненной лигандом TGF-B и активатором WNT. В некоторых вариантах осуществления способ in vitro поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток дополнительно содержит дифференцировку клеток DE в клетки кишечной трубки путем культивирования клеток DE в среде, дополненной лигандом FGF. В некоторых вариантах осуществления способ in vitro поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток дополнительно содержит дифференцировку клеток кишечной трубки в задние клетки энтодермы передней кишки путем культивирования клеток кишечной трубки в среде, дополненной ингибитором shh, лигандом FGF, активатором РКС, лигандом TGF-B, ретиноидом и ингибитором BMP. В некоторых вариантах осуществления способ in vitro поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток дополнительно содержит дифференцировку клеток кишечной трубки в задние клетки энтодермы передней кишки путем культивирования клеток кишечной трубки в среде, дополненной ингибитором shh, лигандом FGF, активатором РКС, лигандом TGF-B, ретиноидом и ингибитором BMP. В некоторых вариантах осуществления способ in vitro поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток дополнительно содержит дифференцировку задних клеток энтодермы передней кишки в клетки поджелудочной железы передней кишки путем культивирования задних клеток энтодермы передней кишки в среде, дополненной активатором РКС, ингибитором shh, ретиноидом и ингибитором BMP. В некоторых вариантах осуществления способ in vitro поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток дополнительно содержит дифференцировку клеток поджелудочной железы передней кишки в клетки энтодермы поджелудочной железы путем культивирования поджелудочной железы передней кишки в среде, дополненной ингибитором shh, ингибитором TGF-B и ретиноидом. В некоторых вариантах осуществления способ in vitro поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток дополнительно содержит дифференцировку клеток энтодермы поджелудочной железы в группу бета-клеток поджелудочной железы.
В варианте осуществления по меньшей мере на одной стадии способа in vitro поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток среда далее дополняется аскорбиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления более 10% клеток в дифференцированной группе являются одногормональными инсулинположительными клетками. В некоторых вариантах осуществления более 30% клеток энтодермы поджелудочной железы в культуре, полученной способами данного изобретения, являются PDX-1+, NKX6.1+, SOX2- и CDX2-.
В варианте осуществления изобретение относится к способу in vitro дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека в бета-клетки поджелудочной железы и содержит: а) культивирование недифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека в среде, дополненной глюкозой, лигандом TGF-B и активатором WNT, для генерирования группы клеток дефинитивной энтодермы (DE); b) культивирование клеток DE в среде, дополненной глюкозой и лигандом FGF, для генерирования группы клеток кишечной трубки; с) культивирование клеток кишечной трубки в среде, дополненной глюкозой, ингибитором shh, лигандом FGF, активатором РКС, лигандом TGF-B, ретиноидом и градиентом ингибитора BMP, для генерирования группы задних клеток энтодермы передней кишки, экспрессирующих PDX-1 и SOX2; d) культивирование клеток передней кишки в среде, дополненной глюкозой, активатором РКС, ингибитором shh, ретиноидом и ингибитором BMP, для генерирования группы клеток передней кишки поджелудочной железы, экспрессирующих PDX-1 и NKX6.1 и экспрессирующих более низкий уровень SOX2 по сравнению с задними клетками передней кишки; е) культивирование клеток поджелудочной железы передней кишки в среде, дополненной глюкозой, ингибитором shh, ингибитором TGF-B и ретиноидом, для получения группы клеток энтодермы поджелудочной железы, экспрессирующих PDX-1, более высокий уровень NKX6.1 и более низкий уровень SOX2 по сравнению с клетками поджелудочной железы передней кишки; f) дифференцировка клеток энтодермы поджелудочной железы в группу бета-клеток поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления группа бета-клеток поджелудочной железы, полученная способами данного изобретения, является PDX-1+, NKX6.1+, SOX2- и CDX2-. В некоторых вариантах осуществления среда по меньшей мере в одном этапе способа поэтапной дифференцировки далее дополняется аскорбиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления бета-клетки поджелудочной железы, полученные способами данного изобретения, являются одногормональными инсулинпродуцирующими клетками, у которых также NKX6.1+ и PDX-1+.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1A-1G содержат гистограмму профилей экспрессии FACS следующих маркеров в S3, день 2 для клеток, дифференцирующихся согласно примеру 1. Фиг. 1А: изотипный контроль; фиг. 1В: хромогранин; фиг. 1С: KI-67; фиг. 1D: NKX6.1; фиг. 1E: SOX2; фиг. 1F: CDX2; фиг. 1G: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
На фиг. 2A-2G показаны профили экспрессии гистограммы FACS следующих маркеров в клетках, дифференцированных согласно примеру 1 и собранных в S4, день 2. Фиг. 2А: изотипный контроль; фиг. 2В: хромогранин; фиг. 2С: KI-67; фиг. 2D: NKX6.1; фиг. 2Е: SOX2; фиг. 2F: CDX2; фиг. 2G: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
На фиг. 3A-3G показаны профили экспрессии гистограммы FACS следующих маркеров в клетках, дифференцированных согласно примеру 1 и собранных в S5, день 2. Фиг. 3А: изотипный контроль; фиг. 3В: хромогранин; фиг. 3С: KI-67; фиг. 3D: NKX6.1; фиг. 3Е: SOX2; фиг. 3F: CDX2; фиг. 3G: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
На фиг. 4A-4G показаны профили экспрессии гистограммы FACS следующих маркеров в клетках, дифференцированных согласно примеру 1 и собранных в S5, день 7. Фиг. 4А: изотипный контроль; фиг. 4В: хромогранин; фиг. 4С: KI-67; фиг. 4D: NKX6.1; фиг. 4Е: SOX2; фиг. 4F: CDX2; фиг. 4G: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
На фиг. 5А-5С изображены профили экспрессии гистограммы FACS следующих маркеров в клетках, дифференцированных согласно примеру 1 и полученных в клетках, собранных в S5, день 2. Фиг. 5А: хромогранин (ось у) и CDX2 (ось х); фиг. 5В: хромогранин (ось y) и SOX2 (ось х); фиг.5С: хромогранин (ось у) и NKX6.1 (ось х). На каждой гистограмме показан процент совместной экспрессии для каждого графика.
На фиг. 6А-6Т показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих генов в клетках эмбриональных стволовых клеток линии H1 человека, дифференцированных согласно примеру 1 и собранных в S2, S3, S4 и S5. Фиг. 6А: CDX2; фиг. 6В: CD142; фиг. 6С: FOXE1; фиг. 6D HNF4-alpha; фиг. 6Е: NKX2.1; фиг. 6F: NKX2.2; фиг. 6G: NKX6.1 фиг. 6Н: OSR1; фиг. 6I: PDX-1; фиг. 6J: PROX1; фиг. 6K: PTF1a фиг. 6L: SOX17; фиг. 6М: SOX2; фиг. 6N: инсулин; фиг. 6O: ZIC1 фиг. 6Р: хромогранин; фиг. 6Q: глюкагон; фиг. 6R: Ngn3; фиг. 6S NeuroD; фиг. 6Т: соматостатин.
На фиг. 7A-7G показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих генов в клетках линии Hi, дифференцированных согласно примеру 2 и собранных в день 3 S2, S3 или S4. Фиг. 7А: NKX6.1; фиг. 7В: PDX-1; фиг. 7С: хромогранин; фиг. 7D: NGN3; фиг. 7Е: CDX2; фиг. 7F: альбумин; фиг. 7G: SOX2.
На фиг. 8A-8G показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих маркеров в клетках H1, дифференцированных согласно примеру 3 и собранных в S2, S3, S4 или S5. Фиг. 8А: NKX6.1; фиг. 8В: PDX-1; фиг. 8С: NGN3; фиг. 8D: NeuroD; фиг. 8E: хромогранин; фиг. 8F: CDX2; фиг. 8G: SOX2.
На фиг. 9А-9Н показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих маркеров в клетках H1, дифференцированных согласно примеру 4 и собранных в день 4 S3 и S4. Фиг. 9А: NKX6.1; фиг. 9В: PDX-1; фиг. 9С: хромогранин; фиг. 9D: NGN3; фиг. 9Е: NeuroD; фиг. 9F: CDX2; фиг. 9G: альбумин; фиг. 9Н: SOX2.
На фиг. 10А-10Н показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих генов в клетках эмбриональных стволовых клеток линии H1 человека, дифференцированных согласно примеру 5 и собранных на этапе 4. Фиг. 10А: NKX6. 1; фиг. 10В: PDX-1; фиг. 10С: хромогранин; фиг. 10D: NGN3; фиг. 10Е: NeuroD; фиг. 10F: CDX2; фиг. 10G: альбумин; фиг. 10Н: SOX2.
На фиг. 11А-11Н показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих генов в клетках эмбриональных стволовых клеток линии H1 человека, дифференцированных согласно примеру 6 и собранных в день 3 S3 или S6. Фиг. 11А: NKX6.1; фиг. 11В: PDX-1; фиг. 11С: хромогранин; фиг. 11D: NGN3; фиг. 11Е: NeuroD; фиг. 11F: CDX2; фиг. 11G: альбумин; фиг. 11Н: SOX2.
На фиг. 12A-12G показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих генов в клетках эмбриональных стволовых клеток линии H1 человека, дифференцированных согласно примеру 7 и собранных в день 3 S3, S4 или S5. Фиг. 12А: NKX6.1; фиг. 12В: PDX-1; фиг. 12С: хромогранин; фиг. 12D: NGN3; фиг. 12Е: NeuroD; фиг. 12F: CDX2; фиг. 12G: SOX2.
На фиг. 13A-13G показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих генов в клетках эмбриональных стволовых клеток линии H1 человека, дифференцированных согласно примеру 8 и собранных в S3, S4, S5 или S6. Фиг. 13А: NKX6.1; фиг. 13В: PDX-1; фиг. 13С: хромогранин; фиг. 13D: NGN3; фиг. 13Е: NeuroD; фиг. 13F: CDX2; фиг. 13G: SOX2.
Фиг. 14А-14Н содержат гистограмму профилей экспрессии FACS следующих маркеров в S3, день 4 для клеток, дифференцирующихся согласно примеру 9. Фиг. 14А: изотипный контроль; фиг. 14В: хромогранин; фиг. 14С: KI-67; фиг. 14D: NKX6.1; фиг. 14Е: SOX2; фиг. 14F: HNF3B; фиг. 14G: CDX2; фиг. 14Н: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
Фиг. 15A-15G содержат гистограмму профилей экспрессии FACS следующих маркеров в S4, день 2 для клеток, дифференцирующихся согласно примеру 9. Фиг. 15А: изотипный контроль; фиг. 15В: NKX6.1; фиг. 15С: KI-67; фиг. 15D: хромогранин; фиг. 15Е: SOX2; фиг. 15F CDX2; фиг. 15G: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
Фиг. 16A-16F содержат гистограмму профилей экспрессии FACS следующих маркеров в S4, день 4 для клеток, дифференцирующихся согласно примеру 9. Фиг. 16А: изотипный контроль; фиг. 16В: NKX6.1; фиг. 16С: хромогранин; фиг. 16D: SOX2; фиг. 16Е: CDX2; фиг. 16F: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
На фиг. 17A-17J показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих генов в клетках эмбриональных стволовых клеток линии H1 человека, дифференцированных согласно примеру 9 и собранных в S1D3, S2D3, S3D4, S4D2 и S4D4. Фиг. 17А: CDX2; фиг. 17В: ННех; фиг. 17С: FOXE1; фиг. 17D: IPF1 (PDX-1); фиг. 17Е: NKX2.1; фиг. 17F: NKX2.2; фиг. 17G: NKX6.1; фиг. 17Н: PROX1; фиг. 17I: SOX2; фиг. 17J: SOX9.
Фиг.18A-18G содержат гистограмму профилей экспрессии FACS следующих маркеров в S3, день 3 для клеток, дифференцирующихся согласно примеру 10. Фиг. 18А: изотипный контроль; фиг. 18В: NKX6.1; фиг. 18С: хромогранин; фиг. 18D: SOX2; фиг. 18Е: CDX2; фиг. 18F: KI-67; фиг. 18G: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
Фиг. 19A-19G показывают FACS-гистограмму профилей экспрессии следующих маркеров на этапе S4, день 5 у клеток, дифференцированных согласно примеру 10. Фиг. 19А: изотипный контроль; фиг. 19В: NKX6.1; фиг. 19С: хромогранин; фиг. 19D: SOX2; фиг. 19Е: CDX2; фиг. 19F: KI-67; фиг. 19G: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
На фиг. 20A-20J показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих генов в клетках эмбриональных стволовых клеток линии H1 человека, дифференцированных согласно примеру 11. Фиг. 20А: соматостатин; фиг. 20В: PDX1; фиг. 20С: Рах6; фиг. 20D: Рах4; фиг. 20Е: NKX6.1; фиг. 20F: NGN3; фиг. 20G: глюкагон; фиг. 20Н: NeuroD; фиг. 20I: инсулин; фиг. 20J: хромогранин.
На фиг. 21A-21J показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих генов в клетках эмбриональных стволовых клеток линии H1 человека, дифференцированных согласно примеру 12 и собранных в S4, день 2, S5, день 2 и S5, день 9. Фиг. 21А: соматостатин; фиг. 21В: PDX1; фиг. 21С: Рах6; фиг. 21D: Рах4; фиг. 21Е: NKX6.1; фиг. 21F: NGN3; фиг. 21G: NeuroD; фиг. 21Н: инсулин; фиг. 21I: глюкагон; фиг. 21J: хромогранин.
На фиг. 22A-22L показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих генов в клетках эмбриональных стволовых клеток линии H1, дифференцированных согласно примеру 13 и собранных на S5, день 3. Фиг. 22А: Рах4 фиг. 22В: Рах6; фиг. 22С: PDX1; фиг. 22D: PTF1a; фиг. 22Е глюкагон; фиг.22F: инсулин; фиг.22G: NeuroD; фиг. 22Н: ngn3 фиг. 22I: Zic1; фиг. 22J: CDX2; фиг. 22K: альбумин; фиг. 22L NKX6.1.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Для ясности описания, а не для ограничения изобретения подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.
Определения
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые как обладающие способностью на одноклеточном уровне к самообновлению и дифференцировке. Стволовые клетки могут производить клетки-потомки, включая самообновляющиеся прогениторные клетки, необновляющиеся прогениторные клетки и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются своей способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных линий из множества зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы). Стволовые клетки также дают начало тканям множества зародышевых листков после трансплантации и вносят значительный вклад в образование большинства, если не всех тканей после инъекции в бластоцисты.
Стволовые клетки классифицируют по потенциалу развития: (1) тотипотентные, то есть способные преобразоваться в любой из эмбриональных и внеэмбриональных типов клеток; (2) плюрипотентные, то есть способные преобразоваться во все типы эмбриональных клеток; (3) мультипотентные, то есть способные преобразоваться во множество клеточных линий, но в рамках одной ткани, органа или физиологической системы (например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) могут порождать ГСК (самообновление), олигопотентные ограниченные клетки-предшественники крови и все типы клеток и элементов (например, тромбоциты), являющиеся стандартными составляющими крови); (4) олигопотентные, то есть способные преобразоваться в более ограниченное подмножество клеточных линий, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, то есть способные преобразоваться в единственную клеточную линию (например, сперматогенные стволовые клетки).
Дифференцировка представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например нервной или мышечной клетки. Дифференцированная клетка или клетка, индуцированная дифференцировкой, представляет собой клетку, взятую на более специализированном («коммитированном») этапе линии развития клетки. Термин «коммитированный» в применении к процессу дифференцировки относится к клетке, которая прошла по пути дифференцировки до того этапа, на котором при нормальных условиях она продолжит дифференцироваться в клетку заданного типа или подмножества типов клеток и при этом не может в нормальных условиях дифференцироваться в клетку другого типа или возвращаться к клетке менее дифференцированного типа. Дедифференцировка относится к процессу, в ходе которого клетка возвращается на менее специализированный (или коммитированный) этап линии развития клетки. Используемый в настоящей заявке термин «линия дифференцировки клетки» определяет наследственность клетки, то есть определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В клеточной линии дифференцировки клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцировки. Маркером, специфичным для линии дифференцировки, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцировки, которая может использоваться для оценки дифференцировки некоммитированных клеток в клетки данной линии дифференцировки.
Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из множества известных в данной области способов.
В настоящем документе клетка «положительна по» заданному маркеру или «положительна», если заданный маркер обнаруживается в клетке. Аналогично клетка «отрицательна по» заданному маркеру или «отрицательна», если заданный маркер не обнаруживается в клетке.
В настоящем документе «этап 1» и «S1» используются взаимозаменяемо для обозначения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для дефинитивной энтодермы (DE).
«Сформированная энтодерма», как используется в настоящем документе, относится к клеткам, которые несут в себе характеристики клеток, появившиеся из эпибласта во время гаструляции, и которые формируют желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров: HNF3 beta, GATA4, SOX17, CXCR4, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 и MIXL1.
Выражение «кишечная трубка» в настоящем документе относится к клеткам, полученным из дефинитивной эндодермы, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: HNF3-beta, HNF1-beta или HNF4-alpha. Клетки кишечной трубки могут дать начало всем энтодермальным органам, таким как легкие, печень, поджелудочная железа, желудок и кишечник.
Используемые в настоящем документе взаимозаменяемые выражения «этап 2» и «S2» обозначают клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для примитивной кишечной трубки.
«Энтодерма передней кишки» относится к клеткам энтодермы, которые дают начало пищеводу, легких, желудка, печени, поджелудочной железы, желчного пузыря и части двенадцатиперстной кишки.
«Задняя часть передней кишки» относится к клеткам энтодермы, которые могут дать начало задней части желудка, поджелудочной железы, печени и части двенадцатиперстной кишки.
«Энтодерма средней кишки» относится к клеткам энтодермы, которые могут дать начало кишечнику, частям двенадцатиперстной кишки, аппендикса и восходящей ободочной кишки.
«Энтодерма задней кишки» относится к клеткам энтодермы, которые могут дать начало дистальной трети поперечной ободочной кишки, нисходящей ободочной кишки, сигмовидной кишки и прямой кишки.
Как «этап 3», так и «S3» используются взаимозаменяемо для обозначения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для энтодермы передней кишки. «Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии передней кишки», как используется в настоящем документе, относятся к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX-1, FOXA2, CDX2, SOX2 и HNF4-альфа.
Используемые в настоящем документе взаимозаменяемо «этап 4» и «S4» обозначают клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для предшественника передней кишки поджелудочной железы. Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии предшественника передней кишки поджелудочной железы, как используется в настоящем документе, относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX-1, NKX6.1, HNF6, F0XA2, PTF1a, Proxl и HNF4-альфа.
В настоящем документе выражения «этап 5» и «S5» используются взаимозаменяемо для обозначения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток энтодермы поджелудочной железы и предшественников эндокринной поджелудочной железы. Выражение «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии энтодермы поджелудочной железы» в настоящем документе относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF1 beta, PTF1 alpha, HNF6, HNF4 alpha, SOX9, НВ9 или PROX1. Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии энтодермы поджелудочной железы, не экспрессируют существенно CDX2 или SOX2.
В настоящем документе выражения «этап б» и «S6» используются взаимозаменяемо для обозначения клеток, обогащенных клетками эндокринной поджелудочной железы.
«Панкреатической эндокринной клеткой», или «клеткой, экспрессирующей гормон поджелудочной железы», или «клеткой, экспрессирующей характеристики эндокринной линии поджелудочной железы» в настоящем документе называется клетка, способная экспрессировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин, грелин и полипептид поджелудочной железы.
Выражение «клетка-предшественник эндокринной поджелудочной железы» или «прогениторная эндокринной поджелудочной железы» относится к клеткам энтодермы поджелудочной железы, обладающим возможностью стать клеткой поджелудочной железы, экспрессирующей гормон. Такая клетка может экспрессировать по меньшей мере один из следующих маркеров: NGN3, NKX2.2, NeuroD, ISL-1, Рах4, Рах6 или ARX.
Выражение «функциональная бета-клетка поджелудочной железы» в настоящем документе относится к одногормональной инсулинположительной клетке, имеющей возможность реагировать на глюкозу и положительной по PDX-1 и NKX6.1.
Используются в настоящем документе взаимозаменяемо «d1», «d1» и «день 1»; «d2», «d2» и «день 2»; «d3», «d3» и «день 3» и так далее. Эти сочетания цифр и букв указывают день инкубации на различных этапах во время поэтапного протокола дифференцировки по данной заявке.
«Аскорбиновая кислота» и «витамин С» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к важному питательному веществу для человека и других видов животных.
«Глюкоза» и «D-глюкоза» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к декстрозе, сахару, обычно встречающемуся в природе.
Клетка, «положительная» по определенному маркеру или обозначаемая как маркер «+» (т.е. PDX-1+), представляет собой клетку, в которой обнаруживается данный маркер. Клетка, «отрицательная» по определенному маркеру или обозначаемая как маркер «-» (т.е. NKX6.1-), представляет собой клетку, в которой маркер не обнаруживается способами, изложенными в данном описании.
В данной заявке «хромогранин» и «CHGN» используются взаимозаменяемо для обозначения гена, кодирующего кислотный секреторный гликопротеин хромогранин.
Используются взаимозаменяемо в настоящем документе выражения «NeuroD» и «NeuroD1», обозначающие белок, экспрессируемый в клетках-прогениторах эндокринной поджелудочной железы, и ген, кодирующий его.
Используются взаимозаменяемо в настоящем документе выражения «LDN» и «LDN-193189», обозначающие ингибитор рецептора BMP, выпускаемый Stemgent, Калифорния, США.
Выделение, размножение и культивирование полипотентных стволовых клеток
Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или более стадийно-специфичных эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые антителами, обозначенными как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282: 1145, 1998). Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к потере экспрессии SSEA-4, Tra-1-60 и Tra-1-81. Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки, как правило, имеют щелочно-фосфатазную активность, которую можно обнаружить путем обработки клеток 4%-ным параформальдегидом, а затем выращивая с Vector Red в качестве субстрата, как описано производителем (Vector Laboratories, штат Калифорния, США). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, определяемые с помощью ПЦР в реальном времени.
Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных стволовых клеток является потенциал дифференцировки в клетки всех трех зародышевых листков: в эндодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Плюрипотентность стволовых клеток может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), обработкой всех образующихся тератом 4%-ным раствором параформальдегида, а затем гистологическим исследованием на наличие типов клеток из трех зародышевых листков. В качестве альтернативы плюрипотентность можно определить по созданию эмбриоидных телец и анализа их на предмет присутствия маркеров, ассоциирующихся с тремя зародышевыми листками.
Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток могут быть кариотипированы с применением стандартного способа окрашивания с использованием красителя Гимза (G-banding) и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», т.е. эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений. Плюрипотентные клетки могут быть легко размножены в культуре путем использования различных питательных слоев или с помощью сосудов, покрытых белковой матрицей. Кроме того, химически определенные поверхности в сочетании с определенными средами, такими как среды mTesr™ 1 (StemCell Technologies, Ванкувер, Канада), могут использоваться для обычного накопления клеток. Плюрипотентные клетки могут быть легко удалены из чашек с культурой при помощи ферментативной, механической обработки или с использованием различных кальцийхелатирующих агентов, таких как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота). Кроме того, плюрипотентные клетки могут быть накоплены в суспензии в отсутствии каких-либо матричных белков или питательного слоя.
Источники плюрипотентных стволовых клеток
Среди типов плюрипотентных стволовых клеток, которые могут использоваться, могут быть устойчивые линии плюрипотентных клеток, полученных из тканей, образующихся после беременности, в том числе преэмбриональная ткань (такая как, например, бластоцист), эмбриональная ткань или ткань плода, взятая в любой момент во время беременности, как правило, но не обязательно перед сроком приблизительно от 10 до 12 недель беременности. Неограничивающими примерами являются устойчивые линии эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСК) или эмбриональные зародышевые клетки человека, такие как, например, эмбриональные стволовые клетки человека линий H1, Н7 и Н9 (WiCell Research Institute, Мэдисон, Висконсин, США). Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток. Также пригодными являются индуцибельные плюрипотентные клетки (IPS) или перепрограммированные плюрипотентные клетки, которые могут быть получены из взрослых соматических клеток с помощью принудительной экспрессии ряда факторов, относящихся к плюрипотентным транскрипционным факторам, таким как OCT4, Nanog, Sox2, KLF4 и ZFP42 (Annu Rev Genomics Hum Genet, 2011, 12:165-185). Эмбриональные стволовые клетки человека, используемые в способах данного изобретения, также могут быть подготовлены, как описано Thomson и др. (патент U.S. №5843780; Science, 1998, 282:1145; Curr. Top. Dev. Biol., 1998, 38:133; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1995: 92: 7844).
Формирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, из плюрипотентных стволовых клеток
Характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. К маркерам плюрипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или нескольких следующих маркеров: ABCG2, CRIPTO, FOXD3, Connexin43, Connexin45, 0СТ4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.
К плюрипотентным стволовым клеткам, которые могут использоваться в настоящем изобретении, относятся, например, человеческие эмбриональные стволовые клетки линии Н9 (код NIH: WA09), человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1 (код NIH: WA01), человеческие эмбриональные стволовые клетки линии Н7 (код NIH: WA07) и человеческие эмбриональные стволовые клетки линии SA002 (Cellartis, Швеция). Также для использования в рамках настоящего изобретения подходят клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN4 3, CONNEXIN4 5, ОСТ4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81.
Маркеры, характерные для сформированной линии энтодермы, выбираются из группы, содержащей SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок, FGF4, CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, С-Kit, CD99 и Otx2. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии сформированной эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку-предшественник первичной полоски. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой мезэндодермальную клетку. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку сформированной эндодермы.
Маркеры характерные для линии энтодермы поджелудочной железы, выбираются из группы, содержащей PDX1, NKX6.1, HNF1 beta, PTF1 alpha, HNF6, HNF4 alpha, SOX9, НВ9 и PR0X1. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы. В одном из аспектов данного изобретения экспрессируемые клеткой маркеры, характерные для линейки панкреатической энтодермы, представляют собой клетки панкреатической энтодермы, в которых экспрессия PDX-1 и NKX6.1 значительно превышает экспрессию CDX2 и SOX2.
Маркеры, характерные для линии эндокринной поджелудочной железы, выбираются из группы, состоящей из NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, ARX, NKX2.2 и РАХ6. В одном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка способна к экспрессии по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид. Соответствующей целям настоящего изобретения является клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. Панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, экспрессирующую гормоны. В альтернативном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, секретирующую гормоны.
В одном аспекте настоящего изобретения панкреатическая эндокринная клетка представляет собой клетку с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцировки β-клеток. Клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии β-клеток, экспрессирует PDX1 и по меньшей мере один из следующих транскрипционных факторов: NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 beta, MAFA, РАХ4 и РАХ6. В одном аспекте настоящего изобретения клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцировки β-клеток, представляет собой β-клетку.
Настоящее изобретение описывает способ in vitro и группу клеток, обладающую возможностью генерировать одногормональные инсулинположительные клетки, которые также являются PDX-1- и NKX6.1-положительными. Способ, используемый в настоящем изобретении, включает в себя ряд этапов, которые поэтапно направляют дифференцировку плюрипотентных клеток человека в одногормональные клетки при помощи следующих промежуточных этапов:
a) получение клеток дефинитивной энтодермы (DE) из недифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека, содержащее культивирование плюрипотентных клеток в среде, содержащей глюкозу, лиганд TGF-B и активатор WNT;
b) дифференцировка клеток DE в клетки кишечной трубки, содержащая культивирование клеток DE в среде, содержащей глюкозу, витамин С и лиганд FGF;
c) дифференцировка клеток кишечной трубки в клетки энтодермы задней части передней кишки, экспрессирующие PDX-1 и SOX2. Данная дифференцировка достигается путем культивирования клеток кишечной трубки в присутствии ингибитора shh, ингибитора BMP, лиганда TGF-B, лиганда FGF, ретиноевой кислоты, витамина С и активатора РКС;
d) дифференцировка клеток задней части передней кишки в клетки передней кишки поджелудочной железы, экспрессирующие PDX-1 и NKX6.1 и экспрессирующие более низкий уровень SOX2 по сравнению с клетками задней части передней кишки. Данная дифференцировка достигается путем культивирования клеток задней части передней кишки в присутствии ингибитора shh, ингибитора BMP, малой дозы ретиноевой кислоты, витамина С и активатора РКС;
e) дифференцировка клеток передней кишки поджелудочной железы в клетки энтодермы поджелудочной железы, экспрессирующие PDX-1, более высокий уровень NKX6.1 и более низкий уровень SOX2 по сравнению с клетками передней кишки поджелудочной железы. Дифференцировка достигается путем культивирования клеток передней кишки поджелудочной железы в среде, дополненной ингибитором shh, ингибитором TGF-B, малой дозы ретиноевой кислоты и витамина С;
f) дифференцировка клеток энтодермы поджелудочной железы в клетки-предшественники эндокринной поджелудочной железы и далее в одногормональные эндокринные клетки поджелудочной железы. Дифференцировка достигается путем культивирования клеток энтодермы поджелудочной железы в среде, обогащенной ингибитором shh, малой дозой ретиноевой кислоты и витамином С.
В варианте осуществления клетки на всех стадиях поэтапной дифференцировки культивируются в составе среды, содержащем менее 2 5 мМ глюкозы. В некоторых вариантах осуществления концентрация глюкозы находится в диапазоне от около 8 до около 2 0 мМ глюкозы.
В некоторых вариантах осуществления составы среды, используемой для генерирования клеток стадии кишечной трубки и всех последующих стадий, содержат аскорбиновую кислоту (также известную как витамин С). В варианте осуществления концентрация аскорбиновой кислоты составляет от около 0,01 до около 1 мМ. В варианте осуществления концентрация аскорбиновой кислоты составляет от около 0,1 до около 0,5 мМ.
Настоящее изобретение, кроме того, иллюстрируется среди прочих следующими примерами.
Пример 1
Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека из клеток линии H1 в клетки-предшественники эндокринной поджелудочной железы в отсутствии сыворотки плода коровы; модуляция BMP/TGF-B-путей дифференцировки приводит к улучшению производства группы клеток энтодермы поджелудочной железы и снижает процент содержания группы клеток SOX2+
Этот пример был приведен, чтобы показать, что культуры энтодермы поджелудочной железы могут быть получены с весьма высокими уровнями экспрессии PDX-1 и NKX6.1, которые имеют при этом низкий уровень экспрессии CDX2 и SOX2.
Клетки эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (hESC HI) были собраны после нескольких пересевов (пересевы 40-52) и были посеяны как единичные клетки при плотности 100 000 клеток/см2 на покрытых MATRIGEL™ (разведение 1:30; BD Biosciences, Нью-Джерси, США) чашках в средах mTeSR®1 (StemCell Technologies, Ванкувер, Канада), дополненных 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, номер по каталогу Y0503, SigmaAldrich, Монтана, США). Спустя 4 8 часов после посева культур были промыты и инкубированы в неполном солевом растворе PBS (фосфат-буферном солевом растворе без Mg или Са) в течение приблизительно 30 секунд. Культуры были дифференцированы в линию эндокринной поджелудочной железы следующим образом.
a. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 3 дня). Клетки были культивированы на протяжении 1 дня в среде стадии 1: среда MCDB-131 (номер по каталогу 10372-019, Invitrogen, Калифорния, США), дополненная 0,1% не содержащего жирных кислот BSA (номер по каталогу 68700, Proliant, IA, США), бикарбоната натрия 0,0012 г/мл (номер по каталогу S3187, SigmaAldrich, МО, США), IX GlutaMax™ (номер по каталогу 35050-079, Invitrogen), 5 мМ D-глюкозы (номер по каталогу G8769, SigmaAldrich, МО, США), содержащие 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems, Миннесота, США) и 1 мкМ состава МСХ (ингибитор GSK3B, 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазотерацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонен-16-он, заявка на патент США, серийный номер 12/4 94 7 8 9; включено в настоящий документ путем ссылки в полном объеме). Клетки затем культивировали на протяжении 1 дня в среде MCDB-131, обогащенной 0,1% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 5 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 100 нМ состава МСХ. Клетки затем культивировали на протяжении 1 дня в среде MCDB-131, к которой было добавлено 0,1% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 5 мМ D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 2 дня). Клетки этапа 1 обрабатывались два дня средой MCDB-131, обогащенной 0,1% не содержащего жирных кислот BSA, бикарбонатом натрия 0,0012 г/мл, IX GlutaMax ™, 5 мМ D-глюкозы и 25 нг/мл FGF7.
c. Этап 3 (передняя кишка - 2 дня). Клетки этапа 2 были культивированы на протяжении 1 дня в среде стадии 3: среда MCDB-131, дополненная разбавленным 1:200 ITS-X (Invitrogen), 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, бикарбоната натрия 0,0015 г/мл, 2% не содержащего жирных кислот BSA, 2 5 нг/мл FGF7, 10 нг/мл активина A (R&D systems), 0,25 мкМ SANT-1 (ингибитор shh, SigmaAldrich), 1 мкМ ретиноевой кислоты (RA) (SigmaAldrich) и 200 нМ ТРВ (активатора РКС; номер по каталогу 565740; EMD, Нью-Джерси, США), содержащего 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; номер по каталогу 04-0019; Stemgent, Калифорния, США). Затем клетки культивировали в течение еще одного дня в среде этапа 3 с добавлением 10 нМ LDN-193189.
d. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 2 дня). Клетки этапа 3 были культивированы в течение двух дней в среде MCDB-131, обогащенной разведенной 1:200 ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, бикарбонатом натрия 0,0015 г/мл, 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,25 мкМ SANT-1, 50 нМ RA, 200 нМ ТРВ и 50 нМ LDN-193189.
e. Этап 5 (панкреатическая энтодерма, 2-7 дней). Клетки этапа 4 были культивированы в течение 2-7 дней в среде MCDB-131, обогащенной разведенной 1:200 ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, бикарбонатом натрия 0,0015 г/мл, 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,25 мкМ SANT-1 и 50 нМ RA.
На указанных этапах образцы были собраны и проанализированы с помощью ПЦР в реальном времени, иммуногистохимически или флуоресцентно-активированной сортировкой клеток (FACS).
Для анализа FACS клетки, полученные из hESC, были выпущены в суспензию отдельных клеток путем инкубации в TrypLE Express (номер по каталогу 12604, Invitrogen) при 37°С в течение 3-5 минут. Клетки были затем промыты дважды в окрашивающем буферном растворе (PBS, содержащий 0,2% свободного от жирных кислот BSA) (номер по каталогу 554657, BD Biosciences, Нью-Джерси, США). Для окрашивания внутриклеточных антител клетки сначала инкубировали в течение 20 минут при температуре 4°С зеленым флуоресцентным красителем клеток ЖИВОЙ/МЕРТВЫЙ (Invitrogen, номер по каталогу L23101), чтобы дать возможность разделить живые/мертвые клетки во время анализа, за которым следовала одна промывка в холодном PBS. Клетки были обработаны в 250 мкл буферного раствора Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, номер по каталогу 554722) в течение 20 минут при температуре 4°С, за которой следовало две промывки в буферном растворе BD Perm/Wash (BD Biosciences, номер по каталогу 554723). Клетки были повторно взвешены до состояния суспензии в 100 мкл окрашивающего/блокирующего раствора, состоящего из буферного раствора Perm/Wash, дополненного 2% нормальной сыворотки (из соответствующих видов вторичных антител). Клетки затем инкубировали в течение 30 минут при температуре 4°С первичными антителами в эмпирически предварительно определенных разведениях, за которым следовало две промывки в буферном растворе Perm/Wash. Наконец, клетки инкубировали с соответствующими вторичными антителами в течение 30 минут при температуре 4°С, за которым следовало две промывки буферным раствором Perm/Wash перед анализами на BD FACS Canto II.
Были использованы следующие разведения первичных антител: кроличий антиинсулин (1:100; номер по каталогу С27С9; Cell Signaling, Массачусетс, США), мышиный антиинсулин (1:100; номер по каталогу ab6999, Abeam, Массачусетс, США), мышиный антиглюкагон (1:1250; номер по каталогу G2 654; Sigma-Aldrich), кроличий антисинаптофизин (1:100; номер по каталогу А0010, Dako, Калифорния, США), кроличий антихромогранин А (1:800; Dako), мышиный анти-NKX6.1 (1:50; DSHB, Университет штата Айова, Айова, США), мышиный анти-CDX2 (1:250; Invitrogen), козий анти-NeuroD (1:500; R&D Systems), мышиный анти-SOX2 (BD, Калифорния, США), мышиный анти-NKX2.2 (DSHB), мышиный анти-Рах6 (BD, Калифорния, США), мышиный анти-PDX-1 (BD, Калифорния, США). Вторичные антитела использовались в следующих разведениях: козий антимышиный Alexa 647 (1:500; Invitrogen), козий антикроличий РЕ (1:200; Invitrogen), ослиный антикозий (1:800; Invitrogen). Пробы инкубировали в течение 30 минут при 4°С после добавления вторичных антител с последующим заключительным промыванием в буферном растворе Perm/Wash. Клетки анализировали на BD FACS Canto II с использованием программного обеспечения BD FACS Diva с получением по меньшей мере 30 000 событий.
На фиг. 1A-1G изображены профили экспрессии гистограмм FACS изотипного контроля (фиг. 1А), хромогранина (фиг. 1В), клеток KI-67 (фиг. 1С), NKX6.1 (фиг. 1D), SOX2 (фиг. 1E), CDX2 (фиг. 1F), PDX-1 (фиг 1С), дифференцированных в соответствии с примером 1 и проанализированных на S3, день 2. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера. На 2-й день этапа 3 более 95% клеток были положительными по экспрессии PDX-1 (фиг. 1G) и около 60% клеток в группе были положительными по экспрессии SOX2 (фиг. 1Е), в то время как менее 10% клеток были положительными по экспрессии CDX2 (фиг. 1F) или NKX6.1 (фиг. 1D) или хромогранина (фиг. 1В). Значительный процент клеток на этапе 3 был в активном клеточном цикле, как показывает высокий процент клеток, положительных по KI-67 (фиг. 1С).
На фиг. 2A-2G изображены профили экспрессии изотипного контроля (фиг. 2А), хромогранина (фиг. 2В), клеток KI-67 (фиг. 2С), NKX6.1 (фиг. 2D), SOX2 (фиг. 2Е), CDX2 (фиг. 2F), PDX-1 (фиг. 2G) согласно определению окрашиванием FACS, клеток, дифференцированных в соответствии с примером 1 и собранных в день 2 на S4. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера. Аналогично этапу 3 более 95% клеток были положительны по экспрессии PDX-1 (фиг. 2G), в то время как около 10% клеток были положительны по экспрессии CDX2 (фиг. 2F) и около 40% клеток были положительны по экспрессии NKX6.1 (фиг. 2D). Около 45% клеток были положительны по экспрессии SOX2 (фиг. 2Е), снижение с 60% на S3. Экспрессия хромогранина была равна приблизительно 3% (фиг. 2В). Значительный процент клеток на этапе 4 был в активном клеточном цикле, как показывает высокий процент клеток, положительных по KI-67 (фиг. 2С).
Фиг. 3A-3G иллюстрируют относительные профили экспрессии, определенные анализами клеток FACS, полученных на 2-й день этапа 5 в соответствии с протоколом дифференцировки, описанным в настоящем примере. Фиг. 3А: изотипный контроль; фиг. 3В: хромогранин; фиг. 3С: KI-67; фиг. 3D: NKX6.1; фиг. 3Е: SOX2; фиг. 3F: CDX2; фиг. 3G: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера. Аналогично этапам 3 и 4 более 95% клеток были положительны по экспрессии PDX-1, в то время как около 10% клеток были положительны по экспрессии CDX2 и около 67% клеток были положительны по экспрессии NKX6.1. Экспрессия SOX2 в приблизительно 50% была ниже по сравнению с этапом 3, но аналогична его экспрессии на S4.
На фиг. 4A-4G изображена экспрессия PDX-1 (фиг. 4G), NKX6.1 (фиг. 4D), CDX2 (фиг.4F), SOX2 (фиг. 4Е), Ki-67 (маркер распространения, фиг.4С) и хромогранина (панэндокринный маркер, фиг. 4В) по измерению путем FACS-окрашивания клеток, собранных и проанализированных на 7-й день этапа 5 дифференцировки в соответствии с протоколом, описанным в настоящем примере. Как и на этапе 3 и 4, >90% клеток были положительными по экспрессии PDX-1, в то время как экспрессия CDX2 была менее 10%, а экспрессия NKX6.1 значительно возросла до >70%, при этом экспрессия SOX2 резко снизилась до около 2%.
Кроме того, большинство клеток, экспрессирующих SOX2, CDX2 и NKX6.1, были отрицательными по экспрессии хромогранина (см. фиг. 5А-5С). Таким образом, культуры S5, полученные в соответствии с протоколом, описанным в настоящем примере, позволяют получить группу клеток, в которой по меньшей мере 50% клеток экспрессируют PDX-1 и NKX6.1, проявляя при этом отрицательность по CDX-2, SOX2 и хромогранину. В таблице I дана сводка процента экспрессии различных маркеров энтодермы на этапах с S3 по S5.
На фиг. 6А-6Т изображены профили экспрессии мРНК, измеренные с помощью ПЦР в реальном времени для клеток на S2, S3, S4 и S5, дифференцированных в соответствии с протоколом, изложенным в настоящем примере, и отраженных в отчете как обладающих многократным изменением экспрессии по сравнению с недифференцированными клетками HI. На этапе 3 была очень низкая экспрессия маркеров передней части передней кишки, таких как FOXe1 (фиг. 6С) и NKX2.1 (фиг. 6Е). Тем не менее на стадии 3 SOX2 (фиг. 6М) и OSR1 (фиг. 6Н), которые являются маркерами участка желудка на кишечной трубке, значительно повысили степень своего регулирования, а их экспрессия снизилась на этапах S4-S5. Маркеры энтодермы поджелудочной железы, такие как PTF1a (фиг. 6K), NKX6.1 (фиг. 6G) и PDX-1 (фиг. 6I), достигли максимальных уровней экспрессии на этапе культуры S5, день 2. Данные ПЦР свидетельствуют, что на стадии 3 клетки выходят из группы PDX-1+SOX2+, становясь PDX-1+NKX6.1+SOX2- CDX2- на этапах S4-S5. (См. фиг. 6I, 6G, 6М и 6А.) Экспрессия эндокринных маркеров (хромогранин, инсулин, глюкагон и соматостатин) достигла максимального уровня экспрессии в конце этапа S5. Экспрессия маркеров предшественников эндокринной поджелудочной железы, NKX2.2, NeuroD и NGN3, достигла максимального уровня экспрессии на этапах S4-S5. Экспрессия маркеров других линий дифференцировки, таких как ZIC1 и SOX17, оставалась на низком уровне на этапах S4-S5.
В заключение клетки на этапе 5, день 2, которые были дифференцированы в соответствии с протоколом, изложенным в настоящем примере, экспрессируют низкие уровни CDX2 и SOX2, сохраняя высокий уровень экспрессии NKX6.1 и PDX-1. Считается, что уникальное сочетание своевременного ингибирования BMP, использование малых доз кислоты RA на этапах S4-S5, использование высокого содержания глюкозы на этапах S1-S2 позволяют получить группу клеток, описанных в примере 1.
Пример 2
Влияние ингибирования BMP и активации РКС на экспрессию SOX2 на этапах S3-S4
Протокол, изложенный в данном примере, был реализован с целью выяснить влияние ингибирования BMP, добавления FGF7 вместе с активацией РКС на экспрессию SOX2 на этапах S3-S4.
Клетки эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 были собраны после нескольких пересевов (пересевы 40-52) и были посеяны как единичные клетки при плотности 100 000 клеток/см2 на покрытых MATRIGEL™ (разведение 1:30) чашках в среде mTesr™1, обогащенной 10 мкМ Y27632. Через 48 часов после посева культуры были дифференцированы в клетки эндокринной линии поджелудочной железы следующим образом.
a. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 3 дня). Перед началом DE культуры промыли и инкубировали неполным раствором PBS (без Mg или Са) в течение 30 секунд с последующим добавлением сред этапа 1. Эмбриональные стволовые клетки человека, культивируемые в чашках, покрытых MATRIGEL™, обрабатывали средой MCDB-131, обогащенной 0,1% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™ и 2,5 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 1,5 мкМ состава МСХ (ингибитора GSK3B) в течение одного дня. Клетки затем обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% не содержащего жирных кислот BSA, бикарбонатом натрия 0,0012 г/мл, IX GlutaMax™, 2,5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8 в дни 2-3.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 3 дня). Клетки этапа 1 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% не содержащего жирных кислот BSA, бикарбонатом натрия 0,0012 г/мл, IX GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы и 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней.
c. Этап 3 (передняя кишка - 3 дня). Клетки этапа 2 обрабатывали средой MCDB131, обогащенной ITs-X в разведении 1:200, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,25 мкМ SANT-1, 20 нг/мл активина А, 2 мкМ кислоты RA в присутствии или отсутствии 50 нг/мл FGF7, 50 или 200 нМ LDN-193189 и/или 200 нМ ТРВ. Клетки инкубировали в течение трех дней в среде с использованием сочетаний, перечисленных в таблице II ниже.
d. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 3 дня). Клетки этапа 3 обрабатывали средой MCDB131, обогащенной разбавленным 1:200 ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1х GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,25 мкМ SANT-1, 200 нМ ТРВ, 400 нМ LDN-193189, 2 мкМ ингибитора ALk5 (SD-208, описанного в Molecular Pharmacology 2007, 72:152-161) и 100 нМ ингибитора CYP26A (N-{4-[2-этил-1-(1Н-1,2,4-триазол-1-ил)бутил]фенил}-1,3-бензотиазол-2-амин, Janssen, Бельгия) в течение трех дней.
мРНК была собрана на этапах S2-S4 при всех перечисленных выше условиях и проанализирована с помощью ПЦР в реальном времени. Контрольные условия на этапе S3 относятся к культурам, где FGF7, АА, SANT, RA и 200 нМ LDN-193189 были использованы в концентрациях, перечисленных на этапе свыше. Как видно по данным ПЦР, приведенным на фиг. 7A-7G, удаление LDN-193189 на этапе S3 привело к значительному снижению эндокринных маркеров, таких как NGN3 (фиг. 7D), и панэндокринного маркера, такого как хромогранин (см. фиг. 7С). Добавление активатора РКС и удаление LDN-193189 на этапе S3 еще больше понизило эндокринные маркеры при одновременном повышении экспрессии NKX6.1 (см. фиг. 7A-7G). Кроме того, добавление 50 нМ LDN-193189 было так же эффективно, как и 200 нМ LDN-193189, для индукции эндокринных маркеров (хромогранин и NGN3). Удаление LDN-19318 9 и добавление ТРВ на этапе S3 повысило экспрессию CDX2 (фиг. 7Е) и альбумина (фиг. 7F), подавляя экспрессию SOX2 (фиг. 7G). Кроме того, удаление как FGF7, так и LDN-193189 значительно усилило экспрессию SOX2 (фиг. 7G) и ослабило экспрессию альбумина (фиг. 7F) по сравнению с культурами, где LDN-193189 был удален, a FGF7 был сохранен. Эти данные показывают, что точная модуляция ингибирования BMP, активация FGF и активация РКС могут позволить получить отдел энтодермы, который богат PDX-1 и NKX6.1, но имеет низкий CDX2, SOX2 и альбумин. Наконец, устойчивое ингибирование BMP на этапах S3-S4 усилило экспрессию проэндокринных генов и повысило регулируемость экспрессии SOX2. Это указывает на то, что ингибирование BMP требуется подбирать точно, чтобы увеличить гены эндокринной поджелудочной железы, в то же время не повышая регуляции экспрессии SOX2, которая отсутствует или низка при развитии поджелудочной железы, но присутствует в органах передней части энтодермы передней кишки, таких как желудок.
Пример 3
Раннее ингибирование BMP на этапе передней кишки требуется для последующего индуцирования эндокринных маркеров
Этот пример показывает, что раннее ингибирование сигнализации BMP на этапе S3 требуется для последующего индуцирования эндокринных маркеров. В то же время устойчивое ингибирование BMP на этапе 3 также приводит к сильной экспрессии SOX2. Чтобы получить как высокую экспрессию эндокринных маркеров, так и низкую экспрессию SOX2, потребовался градиент ингибирования BMP для индуцирования пропанкреатических эндокринных маркеров при одновременной низкой экспрессии SXO2 и CDX2.
Клетки эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 различных пересевов (пересевы 40-52) были посеяны как единичные клетки при плотности 100 000 клеток/см2 на покрытых MATRIGEL™ (разведение 1:30) чашках в среде mTesr™1, обогащенной 10 мкМ Y27632. Через сорок восемь часов после посева культуры были дифференцированы в клетки линии панкреатических эндокринных клеток следующим образом.
а. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 4 дня). Перед началом DE клетки были промыты и инкубированы с помощью неполного PBS (без Mg или Са) в течение 30 секунд, после чего была проведена инкубация в среде S1. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, культивированные как отдельные клетки на чашках, покрытых средой MATRIGEL™, в течение одного дня обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8, 1,5 мкМ смеси МСХ (ингибитор GSK3B). Затем клетки в течение двух дней обрабатывались (дни 2-4) средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 2,5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 3 дня). Клетки этапа 1 обрабатывались в течение трех дней средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы и 50 нг/мл FGF7.
c. Этап 3 (передняя кишка - 3 дня). Клетки этапа 2 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,2 5 мкМ SANT-1, 20 нг/мл активина А, 2 мкМ RA, 50 нг/мл FGF7, 100 нМ LDN-193189 (только в день 1 или только в течение этапа 3) и 200 нМ ТРВ. У некоторых культур LDN-193189 был удален из этапа 3.
d. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 3 дня). Клетки этапа 3 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкМ SANT-1, 100 нМ ТРВ, 200 нМ LDN-193189, 2 мкМ ингибитора ALk5 и 100 нМ ингибитора CYP26A в течение трех дней.
e. Этап 5 (панкреатическая энтодерма/эндокрин - 4 дня). Клетки этапа 4 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 200 нМ LDN-193189 и 2 мкМ ALk5 в течение четырех дней.
Как показывают результаты ПЦР на фиг. 8A-8G, удаление LDN-193189 (ингибитора BMP) из этапа 3 отменяет экспрессию проэндокринных генов NGN3 (фиг. 8С); NeuroD (фиг. 8D); хромогранин (фиг.8Е) на этапах 4 и 5. Тем не менее экспрессия PDX-1 (фиг. 8B) и NKX6.1 (фиг. 8А) незначительно снижается по сравнению с NGN3 и NeuroD на этапах 4 и 5. Также полное удаление LDN-193189 на этапе 3 приводит к значительному увеличению экспрессии CDX2 (фиг. 7F). Добавление LDN-193189 в течение первого дня этапа 3, после чего он удаляется в день 2-3 этапа 3, значительно повышает экспрессию NGN3 и NeuroD, в то же время уменьшая экспрессию CDX2 и SOX2 на этапе 4. Культуры, в которых LDN-193189 был сохранен в течение этапа 3, показали очень высокую экспрессию SOX2 (фиг. 8G) при S3-S4. Эти данные показывают, что ингибирование BMP в день 1 этапа 3 достаточно для запуска панкреатических эндокринных маркеров, в то же время подавляя экспрессию SOX2 и CDX2.
Подводя итоги, ингибирование BMP требуется в день 1 этапа 3, чтобы вызвать образование эндокринных клеток-предшественников на этапах 4 и 5 и поддерживать экспрессию PDX-1 и NKX6.1, в то же время подавляя экспрессию SOX2. Также добавление РКС активатора на этапе 3 также повышает экспрессию PDX-1 и NKX6.1.
Пример 4
Ингибирование BMP сигнализации в день 1 этапа 3 достаточно для генерирования панкреатических клеток-предшественниц на этапе 4, тогда как ингибирование BMP-сигнализации в последний день этапа 3 приводит к значительно меньшей экспрессии эндокринных маркеров
Этот пример показывает, что раннее ингибирование BMP сигнализации на этапе 3 обеспечивает индукцию маркеров панкреатических эндокринных клеток-предшественниц, при этом ингибирование BMP сигнализации позднее на этапе 3 значительно уменьшает уровень экспрессии маркеров эндокринных клеток-предшественниц на этапе 4.
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 в различных каналах (от канала 4 0 до канала 52) были посеяны как отдельные клетки с плотностью 100 000 клеток/см2 на покрытых MATRIGEL™ (1:30 раствор) чашках в среде mTesr™1, обогащенной 10 мкМ Y27632. Через сорок восемь часов после посева культуры были дифференцированы в клетки линии панкреатических эндокринных клеток следующим образом.
a. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 4 дня). Перед началом DE культуры были промыты и инкубированы при помощи неполной PBS (без Mg или Са) в течение 30 секунд, после чего произошло добавление среды этапа 1. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, культивированные как отдельные клетки на чашках, покрытых средой MATRIGEL™, обрабатывались в течение одного дня средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 1,5 мкМ смеси МСХ (ингибитор GSK3B). Затем клетки обрабатывались в течение трех дней средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 2,5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 3 дня). Клетки этапа 1 обрабатывались в течение трех дней MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы и 50 нг/мл FGF7.
c. Этап 3 (передняя кишка - 3 дня). Клетки этапа 2 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,2 5 мкМ SANT-1, 50 нг/мл FGF7, 2 мкМ RA и сочетаниями, указанными в таблице III ниже, в течение трех дней.
d. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 3 дня). Клетки этапа 3 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкМ SANT-1, 100 нМ ТРВ, 200 нМ LDN-193189, 2 мкМ ингибитора ALk5 и 100 нМ ингибитора CYP26A в течение трех дней.
Фиг. 9А-9Н показывают профиль экспрессии генов панкреатической энтодермы, эндокринной клетки-предшественницы и маркеров энтодермы передней кишки для сочетаний условий культивирования, указанных выше. В соответствии с предыдущим примером блокирование BMP процесса в первый день этапа 3 очень важно для последующей индукции эндокринной программы, как показывают измерения экспрессии панэндокринного маркера, хромогранина. (См. фиг. 9С.) Тем не менее добавление ингибитора BMP в первый день этапа 3 запускает экспрессию эндокринных маркеров на последующих этапах. Также добавление ингибитора BMP в первый день этапа 3 уменьшает экспрессию маркера передней кишки SOX2 на этапах 3-4 (фиг. 9Н). Тем не менее добавление ингибитора BMP только в последний день этапа 3 показало значительно большую экспрессию SOX2 в конце этапа 3 по сравнению с клетками, обработанными ингибитором BMP только в первый день этапа 3. Уровни экспрессии, показанные на фиг. 9А-9Н, относятся к уровням экспрессии в недифференцированных клетках H1, которые имеют очень высокий уровень экспрессии SOX2. Кроме того, что он является маркером переднего отдела передней кишка, SOX2 - это хорошо известный фактор транскрипции, который важен для поддержания плюрипотентности клетки ES. Этот пример также поддерживает предыдущие результаты, указывающие на чувствительность культуры этапа 3 к длительности и кинетике ВМР-сигнализации и последующему влиянию на панкреатическую эндокринную индукцию и экспрессию SOX2.
Пример 5
Оптимальная доза ингибирования BMP на этапе панкреатической передней кишки (этап 4)
Предыдущий пример показал оптимальную длительность ингибирования BMP на этапе 3. Этот пример устанавливает оптимальную дозу ингибитора BMP в среде S4.
Клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека H1 от различных пересевов (пересевы 4 0-52) были посеяны как отдельные клетки с плотностью 100 000 клеток/см2 на покрытых MATRIGEL™ (1:30 раствор) чашках в среде mTesr™1 и 10 мкМ Y27 632. Через сорок восемь часов после посева культуры были дифференцированы в линию панкреатических эндокринных клеток следующим образом.
a. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 4 дня). Перед началом DE культуры были промыты и инкубированы при помощи неполной PBS (без Mg или Са) в течение 30 секунд, после чего произошло добавление среды этапа 1. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, культивированные как отдельные клетки на чашках, покрытых средой MATRIGEL™, обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 1 мкМ смеси МСХ (ингибитора GSK3B) в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 2,5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8 в течение дней 2-4.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 3 дня). Клетки этапа 1 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы и 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней.
c. Этап 3 (передняя кишка - 4 дня). Клетки этапа 2 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкМ SANT-1, 50 нг/мл FGF7A, 2 мкМ RA, 20 нг/мл активина А, 100 нМ LDN-193189 и 100 нМ ТРВ в течение 1 дня. Затем клетки были культивированы в среде MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкМ SANT-1, 50 нг/мл FGF7, 2 мкМ RA, 20 нг/мл активина А и 100 нМ ТРВ в течение трех дней.
d. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 4 дня). Клетки этапа 3 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной раствором ITS-X 1:200, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 200 нМ LDN-193189-193189, 2 мкМ ингибитора ALk5, 100 нМ ингибитора CYP26A и концентрациями LDN-193189, указанными в таблице IV (ниже) в течение дней 1-4 этапа 4.
e. Этап 5 (панкреатическая энтодерма/эндокринная клетка-предшественница - 3 дня). Клетки этапа 4 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 50 нМ LDN-193189 и 1 мкМ ингибитора ALk5 в течение трех дней.
Результаты анализов ПЦР в реальном времени для клеток, собранных после вышеуказанной обработки, показаны на фиг.10А-10Н. Эта фигура показывает, что добавление 50 или 100 нМ LDN-193189 в день 1, 2, 3 или 4 на этапе S4 может продлить экспрессию эндокринных маркеров, в то же время поддерживая низкую экспрессию SOX2 на этапах S4-S5 (см. фиг. 10А-10Н).
Пример 6
Оптимальная доза ингибирования BMP в передней кишке этапа (этап 3)
Этот пример устанавливает оптимальную дозу ингибирования BMP на этапе 3 и последующие влияния на эндокринные маркеры на этапе 6.
Клетки эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 различных пересевов (пересевы 4 0-52) были посеяны как единичные клетки при плотности 100 000 клеток/см2 на покрытых MATRIGEL™ (разведение 1:30) чашках в среде mTesr™1, обогащенной 10 мкМ Y27632. Через сорок восемь часов после посева культуры были дифференцированы в клетки линии панкреатических эндокринных клеток следующим образом.
a. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 4 дня). Перед началом DE культуры были промыты и инкубированы при помощи неполной PBS (без Mg или Са) в течение 30 секунд, после чего произошло добавление среды этапа 1. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, культивированные как отдельные клетки на чашках, покрытых средой MATRIGEL™, обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 1,5 мкМ смеси МСХ (ингибитора GSK3B) в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 2,5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8 в течение дней 2-4.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 3 дня). Клетки этапа 1 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы и 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней.
c. Этап 3 (передняя кишка - 3 дня). Клетки этапа 3 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкМ SANT-1, 50 нг/мл FGF7, 2 мкМ RA, 20 нг/мл активина А, 100 нМ ТРВ и 10-50 нМ LDN-193189 в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкМ SANT-1, 50 нг/мл FGF7, 2 мкМ RA, 20 нг/мл активина А и 100 нМ ТРВ в течение двух дней.
d. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 3 дня). Клетки этапа 3 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 20 нМ LDN-193189; 2 мкМ ингибитора ALk5; 100 нМ ингибитора CYP26 А и 100 нМ ТРВ в течение трех дней.
e. Этап 5 (панкреатическая энтодерма/эндокринная клетка-предшественница - 3 дня). Клетки этапа 4 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X; 2,5 мМ глюкозы; IX GlutaMax™; 0,0015 г/мл бикарбоната натрия; 2% BSA без жирных кислот; ±25 нМ LDN-193189 и/или 2 мкМ ингибитора ALk5 в течение трех дней.
f. Этап 6 (образование панкреатического эндокринного гормона - 3 дня). Клетки этапа 5 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X; 2,5 мМ глюкозы; IX GlutaMax™; 0,0015 г/мл бикарбоната натрия; 2% BSA без жирных кислот в течение трех дней.
Фиг. 11А-11Н показывают, что необходимо низкое либо умеренное ингибирование BMP в первый день этапа 3, чтобы запустить экспрессию эндокринных маркеров, в то же время поддерживая низкую экспрессию SOX2. Также ингибирование BMP на этапе 5 при увеличении эндокринных маркеров также привело к повышению экспрессии SOX2.
Данные в этом примере также подтверждают результаты, представленные в предыдущих примерах. Данные подтверждают, что точная модуляция BMP процесса на этапах 3-5 необходима для индукции панкреатических эндокринных маркеров, в то же время подавляет экспрессию SOX2.
Пример 7
Оптимальное окно для ингибирования BMP на этапе S3 (этап передней кишки)
Этот пример устанавливает оптимальное окно времени на этапе 3 для ингибирования BMP сигнализации, в то же время сохраняя эндокринную индукцию на последующих этапах и уменьшая экспрессию SOX2.
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 на различных этапах (пересевы 40-52) были посеяны как отдельные клетки с плотностью 100 000 клеток/см2 на покрытых MATRIGEL™ (1:30 раствор) чашках в среде mTesr™1 и 10 мкМ Y27632. Через сорок восемь часов после посева культуры были дифференцированы в линию панкреатических эндокринных клеток следующим образом.
a. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 4 дня). Перед началом DE культуры были промыты и инкубированы при помощи неполной PBS (без Mg или Са) в течение 30 секунд, после чего произошло добавление среды этапа 1. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, культивированные как отдельные клетки на чашках, покрытых средой MATRIGEL™, обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 1,5 мкМ смеси МСХ в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 2,5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8 в течение дней 2-4.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 3 дня). Клетки этапа 1 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы и 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней.
c. Этап 3 (передняя кишка - 3 дня). Клетки этапа 2 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,2 5 мкМ SANT-1, 50 нг/мл FGF7, 2 мкМ RA, 20 нг/мл активина А и 100 нМ ТРВ, содержащего 100 нМ LDN-193189, только в течение первых 2 часов, 6 часов или 24 часов этапа 3.
d. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 3 дня). Клетки этапа 3 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 25 нМ LDN-193189, 2 мкМ ингибитора ALk5, 100 нМ ингибитора CYP26 А и 100 нМ ТРВ в течение трех дней.
e. Этап 5 (панкреатическая энтодерма/эндокринная клетка-предшественница - 3 дня). Клетки этапа 4 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот и 2 мкМ ингибитора ALk5 в течение трех дней.
Фиг. 12A-12G показывают анализы ПЦР в реальном времени для данных, собранных в этом примере. Обработка на этапе 3 в течение по меньшей мере 2 часов при помощи ингибитора BMP может запустить экспрессию проэндокринных факторов транскрипции, таких как Ngn3 (фиг. 12D) и NeuroD (фиг. 12Е), в то же время поддерживая очень низкую экспрессию SOX2 (фиг. 12G), и значительно повышает экспрессию NKX6.1 (фиг. 12А) и PDX-1 (фиг. 12В) на этапах S4-S5. Тем не менее на этапе 5 в день 3 экспрессия CDX2 была выше у клеток, обработанных в течение 2-6 часов ингибитором BMP, чем у клеток, обработанных ингибитором в течение 24 часов (фиг. 12F).
Данные из этого примера указывают на то, что 24-часовое ингибирование BMP процесса оптимально для поддержания низкого уровня экспрессии CDX2 и экспрессии SOX2 и для инициирования эндокринной дифференцировки, в то время как поддерживается высокая экспрессия маркеров панкреатической энтодермы.
Пример 8
Оптимальная продолжительность этапа 3 (этап передней кишки) и этапа 4 (этап панкреатической клетки-предшественницы передней кишки)
Этот пример был проведен, чтобы определить оптимальную продолжительность этапов S3 и S4 при пошаговой дифференцировки плюрипотентных клеток до популяции клеток линии панкреатических эндокринных клеток.
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 от различных пересевов (пересевы 40-52) были посеяны как отдельные клетки с плотностью 100 000 клеток/см2 на чашках, покрытых MATRIGEL™ (раствор 1:30), в среде mTesr™1, обогащенной 10 мкМ Y27632. Через сорок восемь часов после посева культуры были дифференцированы в линию панкреатических эндокринных клеток следующим образом.
а. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 4 дня). Перед началом DE культуры были промыты и инкубированы при помощи неполной PBS (без Mg или Са) в течение 30 секунд, после чего произошло добавление среды этапа 1. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, культивированные как отдельные клетки на чашках, покрытых средой MATRIGEL™, обрабатывались средой MCDB- 131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™; 2,5 мМ D-глюкозы; 100 нг/мл GDF8 и 1,5 мкМ смеси МСХ (ингибитор GSK3B) в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот; 0,0012 г/мл бикарбоната натрия; IX GlutaMax™; 2,5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8 в течение дней 2-4.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 2 дня). Клетки этапа 1 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы и 50 нг/мл FGF7 в течение двух дней.
c. Этап 3 (передняя кишка - 2-3 дня). Клетки этапа 2 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкМ SANT-1, 50 нг/мл FGF7, 2 мкМ RA, 20 нг/мл активина А и 100 нМ ТРВ, содержащего 100 нМ LDN-193189, в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкМ SANT-1, 50 нг/мл FGF7, 2 мкМ RA, 20 нг/мл активина А и 100 нМ ТРВ.
d. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 2-3 дня). Клетки этапа 3 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 25 нМ LDN-193189, 100 нМ ингибитора CYP26 А и 100 нМ ТРВ от двух до трех дней.
e. Этап 5 (панкреатическая энтодерма/эндокринный прекурсор 2 дня). Клетки этапа 4 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот и 1 мкМ ингибитора ALk5 в течение двух дней.
f. Этап 6 (панкреатический эндокринный прекурсор/гормон - 2 дня). Клетки этапа 5 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия и 2% BSA без жирных кислот в течение двух дней.
Данные из анализов ПЦР образцов в реальном времени, собранные на этапе 3, 4, 5 или 6, показаны на фиг. 13A-13G. Эти данные показывают, что увеличение S3 и S4 до трех дней увеличивает экспрессию NKX6.1 по сравнению с культурой, имеющей двухдневный S3 и S4 (фиг. 13А). Клетки, обработанные в течение трех дней на этапе 3, показывают уменьшение экспрессии проэндокринных маркеров по сравнению с культурами, где длительность S3 и S4 составляет только двух дней (фиг. 13D и 13Е). Также увеличение этапа 4 до трех дней значительно увеличило экспрессию SOX2 (фиг. 13G).
Данные, полученные в этом примере, соответствуют данным, полученным в предыдущих примерах, относительно того, что продленное ингибирование BMP смещает клетки передней кишки в сторону популяции с высоким SOX2. На основании данных из этого примера и предыдущих примеров можно сделать вывод, что оптимальная продолжительность этапа 3 и этапа 4 составляет два дня. Идеальный протокол приведет к дифференцированным клеткам с высокими уровнями экспрессии проэндокринных маркеров, высокой экспрессией NKX6.1, низкой экспрессией CDX2 и низкой экспрессией SOX2.
Пример 9
Длительное воздействие ингибированием BMP при наличии высокой глюкозы и добавление В27 значительно увеличивают экспрессию SOX2 на этапе S3 и S4
Этот протокол был проведен для определения факторов, влияющих на экспрессию SOX2 на этапе S3 и S4 при пошаговой дифференцировке плюрипотентных клеток в производящие гормон клетки.
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 были культивированы на покрытых MATRIGEL™ (раствор 1:30) чашках в среде mTesr™1 до ~70% слияния и были дифференцированы следующим образом.
а. Недифференцированные клетки были культивированы в среде RPMI (инвитроген), обогащенной 0,2% FBS; 100 нг/мл активина А; 20 нг/мл WNT-За в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой RPMI, обогащенной 0,5% FBS; 100 нг/мл активина А в течение еще двух дней (этап 1).
b. Клетки этапа 1 обрабатывались средой DMEM/F12, обогащенной 2% FBS; 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (этап 2).
c. Клетки этапа 2 были культивированы в DMEM-высокоглюкозной среде, обогащенной 1% В27; 0,25 мкМ SANT-1; 2 мкМ RA; 100 нг/мл Noggin (R&D systems, Миннесота, США) в течение четырех дней (этап 3).
d. Клетки этапа 3 обрабатывались DMEM-высокоглюкозной средой, обогащенной 1% В27; 100 нг/мл Noggin; 1 мкМ ингибитора ALk5 II (Аххога, Калифорния, США); 50 нМ ТРВ в течение четырех дней (этап 4).
Фиг. 4А-14Н показывают FACS-гистограммы для клеток, собранных на этапе 3, день 4, полученные для следующих маркеров: изотипный контроль (фиг. 4А), хромогранин (фиг. 4В), KI-67 (фиг. 4С), NKX6.1 (фиг. 4D), SOX2 (фиг.14Е), HNF3B (фиг. 14F), CDX2 (фиг. 4G), PDX-1 (фиг. 4Н). На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера. Большинство клеток на этапе 3 были положительны по экспрессии PDX-1 (фиг. 4Н) и HNF3B (фиг. 4F), отрицательны по экспрессии NKX6.1 (фиг. 4D) и показали низкую экспрессию хромогранина (фиг. 4В) и CDX2 (фиг. 4G). Тем не менее более 90% клеток также были сильно положительны на SOX2 (фиг. 4Е). Это показывает, что на этапе 3 большинство клеток были положительны на PDX-1 и SOX2 и отрицательны на NKX6.1, что указывает на создание энтодермной популяции в соответствии с популяцией передней кишки, расположенной спереди от домена PDX-1 поджелудочной железы.
Также процент клеток, которые были SOX2+на этапе 3 в популяции клеток, созданной с помощью протокола, приведенного в этом примере, был значительно выше, чем процент клеток, которые были SOX2+в популяции клеток, созданной с помощью протокола, приведенного в примере 1. Эту разницу можно объяснить длительным воздействием антагониста BMP, Noggin, нехваткой FGF7 и активатора РКС в культурной среде на этапе 3 этого примера.
Фиг. 5A-15G показывают FACS-гистограмму профилей экспрессии следующих маркеров на этапе S4, день 2 у клеток, дифференцированных согласно примеру 9. Фиг. 5А: изотипный контроль, фиг. 15В: NKX6.1, фиг. 15С: KI-67, фиг. 15D: хромогранин, фиг. 15Е: SOX2, фиг. 15F: CDX2, фиг. 15G: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
Фиг. 16A-16F содержат гистограмму профилей экспрессии FACS следующих маркеров в S4, день 4 для клеток, дифференцирующихся согласно примеру 9. Фиг. 16А: изотипный контроль, фиг. 16В: NKX6.1, фиг. 16С: хромогранин, фиг. 16D: SOX2, фиг. 16Е: CDX2, фиг. 16F: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
Таблица V ниже обобщает данные, полученные для % экспрессии маркеров энтодермы на этапе S3 и S4 у клеток, дифференцированных согласно протоколу, приведенному в этом примере.
Фиг. 17A-17J показывают результаты анализов ПЦР в реальном времени экспрессии следующих генов у клеток линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных согласно примеру 9. Фиг. 17А: CDX2, фиг. 17В: ННех, фиг. 17С: FOXE1, фиг. 17D: IPF1 (PDX-1), фиг. 17Е: NKX2.1, фиг. 17F: NKX2.2, фиг. 17G: NKX6.1, фиг. 17Н: PROX1, фиг. 17I: SOX2, фиг. 17J: SOX9.
Как показано на фиг. 14-17 и в таблице V, на день 2-4 этапа 4 было значительное увеличение экспрессии NKX6.1, в то время как оставалась высокой экспрессия PDX-1. Несмотря на то что экспрессия SOX2 уменьшилась с этапа 3 до этапа 4, ~75% клеток оставались SOX2+. Так же как на фиг.5, клетки CDX2+, SOX2+ и NKX6.1+ были взаимно исключающими из популяции хромогранина. Это подразумевает, что популяция клеток этапа 4 дня 4, полученная с помощью протокола, приведенного в примере 9, имеет хромогранин-отрицательную фракцию ~50% NKX6.1+SOX2+PDX-1+CDX2-. Это отличается от клеточной популяции, полученной в примере 1, которая имеет 40-70% PDX-1+NKX6.1+SOX2-, CDX2-, хромогранин-отрицательную фракцию и 2-25% PDX-1+NKX6.1+SOX2+ на этапе S4-S5. Очевидно, что клетки, полученные с помощью протокола в примере 1, имеют гораздо больший процент панкреатической энтодермы, так как определено, что популяция имеет PDX-1+ и NXK6.1+ и в то же время малый или отрицательный SOX2 и CDX2 по сравнению с клетками, полученными в примере 9.
Данные, полученные в этом примере, подтверждают, что длительное воздействие ингибированием BMP при наличии высокой глюкозы и добавления В27 значительно увеличивает экспрессию SOX2 на этапе дифференцировки 3 и 4.
Пример 10
Ранее опубликованный протокол приводит к образованию значительного числа SOX2+ популяции на этапе 3-4
Kroon et al. опубликовали протокол для приготовления клеток линии панкреатической энтодермы из человеческих эмбриональных стволовых клеток (Nature Biotech 2008, 26: 443-452, далее указываемый как Kroon). В представленном здесь примере человеческие эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы по протоколу Kroon и проверены на экспрессию маркеров, характерных для разных этапов дифференцировки.
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 были посеяны на чашках, покрытых MATRIGEL™ (раствор 1:30), культивированы в среде mTesr™1 до ~70% слияния и дифференцированы с помощью ранее опубликованного протокола Kroon следующим образом.
а. Недифференцированные клетки были подвергнуты воздействию среды RPMI, обогащенной 0,2% FBS, 100 нг/мл активина А, 20 нг/мл WNT-3а в течение одного дня, после чего были обработаны средой RPMI, обогащенной 0,5% FBS, 100 нг/мл активина А в течение еще двух дней (этап 1).
b. Клетки этапа 1 были подвергнуты воздействию среды RPMI, обогащенной 2% FBS, 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (этап 2).
c. Клетки этапа 2 обрабатывались DMEM-высокоглюкозной средой, обогащенной 1% В27, 0,25 мкМ SANT-1, 2 мкМ RA, 50 нг/мл Noggin (R&D systems, Миннесота) в течение трех дней (этап 3).
d. Клетки этапа 3 были культивированы в DMEM-высокоглюкозной среде, обогащенной 1% В27, в течение трех дней (этап 4).
e. Клетки этапа 4 были соскоблены со стенок и ресуспензированы как кластеры в DMEM-высокоглюкозной среде, обогащенной 1% В27, в течение двух дней.
Фиг. 18A-18G показывают FACS-гистограмму профилей экспрессии следующих маркеров на этапе S3, день 3 у клеток, дифференцированных согласно примеру 10: изотипный контроль (фиг. 18А), NKX6.1 (фиг. 18В), хромогранин (фиг. 18С), SOX2 (фиг. 18D), CDX2 (фиг. 18Е), KI-67 (фиг. 18F), PDX-1 (фиг. 18G). На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
Фиг. 19A-19G показывают FACS-гистограмму профилей экспрессии следующих маркеров на этапе S4, день 5 у клеток, дифференцированных согласно примеру 10: изотипный контроль (фиг. 19А), NKX6.1 (фиг. 19В), хромогранин (фиг. 19С), SOX2 (фиг. 19D), CDX2 (фиг. 19Е), KI-67 (фиг. 19F), PDX-1 (фиг. 19G). Процентная экспрессия для каждого маркера показана на каждой гистограмме.
Как показано на фиг.18 и 19, к концу этапа 4 (день 5) кластеры клеток в суспензии были ~20% NKX6.1+PDX-1+SOX2- и -20% PDX-1+NKX6.1+SOX2+. Эти результаты показывают, что значительная фракция популяции клеток на этапе 4, полученных согласно примеру 10, которые были NKX6.1+, также были SOX2+.
Таблица VI, приведенная ниже, обобщает процент маркеров энтодермы на этапе S3-S4 у клеток, полученных в этом примере.
Пример 11
Добавление аскорбиновой кислоты приводит к значительному уменьшению числа полигормональных клеток и параллельному увеличению числа одногормональных инсулинположительных клеток
Было проверено влияние аскорбиновой кислоты на экспрессию маркеров при дифференцировке плюрипотентных клеток в производящие гормон клетки. Клетки были культивированы в среде, обогащенной глюкозой на каждой стадии дифференцировки и обогащенной аскорбиновой кислотой на образовании этапов 3, 4 и 5 следующим образом.
Клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека H1 от различных пересевов (пересевы 4 0-52) были посеяны как отдельные клетки с плотностью 100 000 клеток/см2 на чашках, покрытых средой MATRIGEL™ (раствор 1:30), в среде mTesr™1 и 10 мкМ Y27632. Через сорок восемь часов после посева культуры были дифференцированы в линию панкреатических эндокринных клеток следующим образом.
а. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 3 дня). Перед началом DE культуры были промыты и инкубированы при помощи неполной PBS (без Mg или Са) в течение 30 секунд, после чего произошло добавление среды этапа 1. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, культивированные как отдельные клетки на чашках, покрытых средой MATRIGEL™, обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 5 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 1 мкМ смеси МСХ (ингибитор GSK3B) в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 5 мМ глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 100 нМ смеси МСХ в течение второго дня, после чего были еще день выдержаны в среде MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 2 дня). Клетки этапа 1 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 5 мМ D-глюкозы и 25 нг/мл FGF7 в течение двух дней.
c. Этап 3 (передняя кишка - 2 дня). Клетки этапа 2 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 нг/мл активина А, 25 нг/мл FGF7, 0,25 мкМ SANT-1, 1 мкМ RA, 200 нМ ТРВ (активатор РКС), 100 нМ LDN-193189 (ингибитор BMP-рецептора) в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 нг/мл активина А, 25 нг/мл FGF7, 0,25 мкМ SANT-1, 1 мкМ RA, 200 нМ ТРВ (активатор РКС), 10 нМ LDN-193189 в течение еще одного дня. Некоторые культуры обрабатывались 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (номер по каталогу А4544, Sigma, Миссури, США) в течение этапа 3.
d. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 2 дня). Клетки этапа 3 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкМ SANT-1, 50 нМ RA, 200 нМ ТРВ, 50 нМ LDN-193189, с или без 0,25 мМ аскорбиновой кислоты в течение двух дней.
e. Этап 5 (панкреатическая энтодерма, 2-7 дней). Клетки этапа 4 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,2 5 мкМ SANT-1, 50 нМ RA, с или без 0,25 мМ аскорбиновой кислоты в течение 2-7 дней.
Фиг. 20A-20J показывают анализы ПЦР экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека Hi, дифференцированных согласно примеру 11, в реальном времени. Фиг 20А: соматостатин, фиг. 20В: PDX1, фиг. 20С: Рах6, фиг. 20D: Рах4, фиг. 20Е: NKX6.1, фиг. 20F: NGN3, фиг. 20G: глюкагон, фиг. 20Н: NeuroD, фиг. 20I: инсулин, фиг.20J: хромогранин. Эта фигура показывает, что добавление аскорбиновой кислоты на этапе 3 или на этапе 3 и 4 значительно уменьшает экспрессию соматостатина и глюкагона на этапе 4-5, в то же время увеличивая экспрессию инсулина (см. фиг. 20А, 20G и 20I). Также на этапе 4-5 экспрессия маркеров панкреатической энтодермы, таких как PDX-1 и NKX6.1, незначительно изменилась при добавлении 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (см. фиг. 20В и 20D). На этапе 4-5 экспрессия Рах6 уменьшилась, а экспрессия Рах4 осталась прежней (см. фиг. 20С и 20D). В конце этапа 5 культуры, обработанные ± аскорбиновой кислотой на этапе S3-S5, были иммуногистохимически окрашены антителами к гормонам инсулину, глюкагону и соматостатину. Таблица VII обобщает средний процент инсулин-, глюкагон- и соматостатин-положительных клеток и полигормональных клеток (экспрессия еще двух гормонов в одной клетке).
Пример 12
Оптимальная доза аскорбиновой кислоты на этапе 3 Этот пример был проведен, чтобы определить оптимальную дозу аскорбиновой кислоты, которую нужно использовать для генерирования инсулинположительных клеток, которые являются одногормональными, PDX-1-положительными и NKX6.1-положительными.
Клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека H1 от различных пересевов (пересевы 40-52) были посеяны как отдельные клетки с плотностью 100 000 клеток/см2 на чашках, покрытых средой MATRIGEL™ (раствор 1:30), в среде mTesr™1 и 10 мкМ Y27632. Через сорок восемь часов после посева культуры были дифференцированы в линию панкреатических эндокринных клеток следующим образом.
a. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 3 дня). Перед началом DE культуры были промыты и инкубированы при помощи неполной PBS (без Mg или Са) в течение 30 секунд, после чего произошло добавление среды этапа 1. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, культивированные как отдельные клетки на чашках, покрытых средой MATRIGEL™, обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 5 мМ D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8 плюс 1 мкМ смеси МСХ (ингибитор GSK3B) в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8 плюс 100 нМ смеси МСХ в течение второго дня, после чего еще один день в среде MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 2 дня). Клетки этапа 1 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 5 мМ D-глюкозы, с добавлением или без добавления 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 25 нг/мл FGF7 в течение двух дней.
c. Этап 3 (передняя кишка - 2 дня). Клетки этапа 2 обрабатывались средой MCDB131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 нг/мл активина А, 25 нг/мл FGF7, 0,25 мкМ SANT-1, ±0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 1 мкМ RA, 200 нМ ТРВ, 100 нМ LDN-193189 в течение дня 1, после чего были обработаны средой MCDB131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 нг/мл активина А, 25 нг/мл FGF7, 0,25 мкМ SANT-1, ±0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 1 мкМ RA, 200 нМ ТРВ, 10 нМ LDN-193189 в течение еще одного дня.
d. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 2 дня). Клетки этапа 3 обрабатывались средой MCDB131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкМ SANT-1, 50 нМ RA, 200 нМ ТРВ, 50 нМ LDN-193189, с добавлением или без добавления 0,25-1 мМ аскорбиновой кислоты в течение двух дней.
e. Этап 5 (панкреатическая энтодерма, 2-9 дней). Клетки этапа 4 обрабатывались средой MCDB131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкМ SANT-1, 50 нМ RA, с добавлением или без добавления 0,25 мМ аскорбиновой кислоты в течение 2-9 дней.
Фиг. 21A-21J показывают данные анализов ПЦР экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных согласно примеру 12, в реальном времени. Фиг 21А: соматостатин, фиг. 21В: PDX1, фиг. 21С: Рах6, фиг. 21D: Рах4, фиг. 21Е: NKX6.1, фиг. 21F: NGN3, фиг. 21G: NeuroD, фиг. 21Н: инсулин, фиг. 21I: глюкагон, фиг. 21J: хромогранин. В соответствии с данными из примера 10 добавление аскорбиновой кислоты на этапе 2-4 значительно уменьшило экспрессию соматостатина, глюкагона и Рах6, в то же время сохраняя экспрессию инсулина и Рах4 на этапе 5. Также было незначительное преимущество использования на этапе S4 0,5-1 мМ аскорбиновой кислоты по сравнению с 0,25 мМ аскорбиновой кислоты. И наконец, добавление аскорбиновой кислоты на этапе 2 также оказалось эффективным для уменьшения экспрессии глюкагона и соматостатина на этапе S3-5, в то же время сохраняя экспрессию инсулина. Таким образом, аскорбиновая кислота выступает как специфичный для этапа способ регулирования экспрессии единичных гормональных клеток. Добавление аскорбиновой кислоты важно на ранних этапах протокола дифференцировки, причем на более поздних этапах она не показала себя такой же эффективной в плане уменьшения числа полигормональных клеток.
Пример 13
Сочетание ретиноевой кислоты и аскорбиновой кислоты необходимо для генерирования единичных гормональных инсулинположительных клеток
Этот пример был проведен, чтобы дать представление о требованиях к генерированию единичных гормональных инсулинположительных клеток при дифференцировке плюрипотентных клеток.
Клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека H1 от различных пересевов (пересевы 40-52) были посеяны как отдельные клетки с плотностью 100 000 клеток/см2 на чашках, покрытых средой MATRIGEL™ (раствор 1:30), в среде mTesr™1 и 10 мкМ Y27632. Через сорок восемь часов после посева культуры были дифференцированы в линию панкреатических эндокринных клеток следующим образом.
a. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 3 дня). Перед началом DE культуры были промыты и инкубированы при помощи неполной PBS (без Mg или Са) в течение 30 секунд, после чего произошло добавление среды этапа 1. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, культивированные как отдельные клетки на чашках, покрытых средой MATRIGEL™, обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 5 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8, 1 мкМ смеси МСХ (ингибитор GSK3B) в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, бикарбоната натрия, GlutaMax™, дополнительными 5 мМ глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 100 нМ смеси МСХ в течение второго дня, после чего еще день обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 2 дня). Клетки обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, IX GlutaMax™, 5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 25 нг/мл FGF7 в течение двух дней.
c. Этап 3 (передняя кишка - 2 дня). Клетки обрабатывались средой MCDB131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 нг/мл активина А, 2 5 нг/мл FGF7, 0,2 5 мМ аскорбиновой кислоты, 0,25 мкМ SANT-1, 1 мкМ RA, 200 нМ ТРВ, 100 нМ LDN-19318 9 в течение дня 1, после чего обрабатывались tMCDB131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 нг/мл активина А, 25 нг/мл FGF7, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 0,25 мкМ SANT-1, 1 мкМ RA, 200 нМ ТРВ, 10 нМ LDN-193189 в течение еще одного дня.
d. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 2 дня). Клетки обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкМ SANT-1, 50 нМ RA, 200 нМ ТРВ, 50 нМ LDN-193189, 0, 1 мМ аскорбиновой кислоты в течение двух дней.
e. Этап 5 (панкреатическая энтодерма, 3 дня). Клетки обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, IX GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот и следующими культурными условиями в течение 3 дней:
- +0,1 мМ аскорбиновой кислоты;
- 0,1 мМ аскорбиновой кислоты +50 нМ RA;
- 0,1 мМ аскорбиновой кислоты +50 нМ RA+0,25 мкМ SANT-1;
- 0,1 мМ аскорбиновой кислоты +50 нМ RA+0,25 мкМ SANT-1+50 нМ LDN-193189;
- 0,1 мМ аскорбиновой кислоты+50 нМ RA+0,25 мкМ SANT-1+1 мкМ Alk5 инг;
- 0,1 мМ аскорбиновой кислоты+50 нМ RA+0,25 мкМ SANT-1+1 мкМ Alk5 инг + 50 нМ LDN-193189.
Фиг. 22A-22L показывают данные анализов ПЦР экспрессии Рах4 в реальном времени (фиг. 22А); Рах6 (фиг. 22В); PDX1 (фиг. 22С); PTF1a (фиг. 22D); глюкагон (фиг. 22Е); инсулин (фиг. 22F); NeuroD (фиг. 22G); ngn3 (фиг. 22Н); Zic1 (фиг. 22I); CDX2 (фиг. 22J); альбумин (фиг. 22K); NKX6.1 (фиг. 22L) в клетках линии эмбриональных стволовых клеток Hi, дифференцированных согласно примеру 13 и собранных на этапе S5 в день 3.
В конце этапа 5 культуры, обработанные вышеуказанными сочетаниями реагентов, были окрашены методами иммуногистохимии для проверки наличия гормонов инсулина, глюкагона и соматостатина. Таблица VIII показывает средний процент инсулин-, глюкагон- и соматостатин-положительных клеток и полигормональных клеток (экспрессия еще двух гормонов в одной клетке).
Как показано на фиг. 22 и в таблице VIII ниже, добавление малой дозы ретиноевой кислоты плюс аскорбиновой кислоты на этапе 5 значительно уменьшает общее число гормон-положительных клеток, в то же время увеличивая процент единичных гормональных инсулинположительных клеток по сравнению с культурами, обработанными только витамином С на этапе S5. Также сочетание ретиноевой кислоты, аскорбиновой кислоты, ингибитора гена sonic hedgehog и ингибитора ALk5 также увеличивает число единичных гормональных инсулинположительных клеток по сравнению с культурами, обработанными только аскорбиновой кислотой (витамином С). Эти данные показывают, что необходима уникальная комбинация факторов для генерирования единичных гормональных инсулинположительных клеток.
Claims (50)
1. Способ in vitro пошаговой дифференцировки плюрипотентных клеток в популяцию клеток линии панкреатической энтодермы, который включает обработку клеток на каждой стадии дифференцировки глюкозой в количестве от 5 до 20 мМ и который дополнительно включает обработку панкреатических клеток передней кишки ингибитором shh, ингибитором TGF-B и ретиноидом, причем популяция клеток панкреатической энтодермы экспрессирует PDX-1, более высокий уровень NKX6.1 и более низкий уровень SOX2 по сравнению с панкреатическими клетками передней кишки, причем плюрипотентные стволовые клетки выбраны из группы, состоящей из клеток линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, клеток линии эмбриональных стволовых клеток человека H7, клеток линии эмбриональных стволовых клеток человека H9, перепрограммированных плюрипотентных клеток, индуцибельных плюрипотентных клеток или плюрипотентных стволовых клеток неэмбрионального происхождения.
2. Способ in vitro по п.1, дополнительно включающий дифференцировку плюрипотентных клеток в клетки дефинитивной энтодермы (DE) путем обработки плюрипотентных клеток лигандом TGF-B и активатором WNT.
3. Способ in vitro по п.2, дополнительно включающий дифференцировку клеток DE в клетки первичной кишечной трубки путем обработки клеток DE лигандом FGF.
4. Способ in vitro по п.3, дополнительно включающий дифференцировку клеток первичной кишечной трубки в клетки энтодермы заднего отдела передней кишки путем обработки клеток первичной кишечной трубки ингибитором shh, лигандом FGF, активатором PKC, лигандом TGF-B, ретиноидом и ингибитором BMP.
5. Способ in vitro по п.4, дополнительно включающий дифференцировку клеток энтодермы заднего отдела передней кишки в панкреатические клетки-предшественники передней кишки путем обработки клеток энтодермы заднего отдела передней кишки активатором PKC, ингибитором shh, ретиноидом и ингибитором BMP.
6. Способ in vitro по п.5, дополнительно включающий дифференцировку панкреатических клеток-предшественников передней кишки в клетки панкреатической энтодермы путем обработки панкреатических клеток передней кишки ингибитором shh, ингибитором TGF-B и ретиноидом.
7. Способ in vitro по п.6, дополнительно включающий дифференцировку клеток панкреатической энтодермы в популяцию панкреатических бета-клеток.
8. Способ in vitro по любому из пп. 1-7, в котором по меньшей мере на одной стадии способ дополнительно включает обработку аскорбиновой кислотой.
9. Способ in vitro по любому из пп. 1-7, в котором более чем 10% клеток в дифференцированной популяции являются единичными гормональными инсулин-положительными клетками.
10. Способ in vitro по п.9, в котором более чем 30% клеток панкреатической энтодермы в культуре представляют собой PDX-1+, NKX6.1+, SOX2- и CDX2-.
11. Способ по п.2, в котором плюрипотентные клетки дифференцируют в клетки дефинитивной энтодермы (DE), обрабатывая плюрипотентные клетки GDF-8 и ингибитором GSK3B.
12. Способ по п.11, в котором ингибитор GSK3B представляет собой 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло [19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-он.
13. Способ по п.3, включающий дифференцировку клеток DE в клетки первичной кишечной трубки путем обработки клеток DE в среде, дополненной FGF-7.
14. Способ по п.4, включающий дифференцировку клеток первичной кишечной трубки в клетки энтодермы заднего отдела передней кишки путем обработки клеток первичной кишечной трубки SANT-1, FGF-7, TPB, активином A, ретиноидом и ингибитором ALk5.
15. Способ по п.5, включающий дифференцировку клеток энтодермы заднего отдела передней кишки в панкреатические клетки-предшественники передней кишки путем обработки клеток энтодермы заднего отдела передней кишки TBP, SAN T-1, ретиноидом и LDN-193189.
16. Способ по п.6, включающий дифференцировку панкреатических клеток-предшественников передней кишки в клетки панкреатической энтодермы путем обработки панкреатических клеток-предшественников передней кишки SANT-1, ингибитором ALk5 и ретиноидом.
17. Способ по п. 4 или 5, в котором ингибитор shh представляет собой SANT-1.
18. Способ по п. 4 или 5, в котором активатор PKC представляет собой TPB.
19. Способ по п. 4 или 5, в котором ингибитор BMP представляет собой LDN-193189.
20. Способ по любому из пп. 1-7, включающий обработку клеток в среде, выбранной из среды MCDB-131 или DMEM-высокоглюкозной среды.
21. Способ in vitro дифференцировки человеческих плюрипотентных стволовых клеток в панкреатические бета-клетки, включающий:
обработку недифференцированных плюрипотетных стволовых клеток человека глюкозой, лигандом TGF-B и активатором WNT для генерирования группы клеток дефинитивной энтодермы (DE);
обработку клеток DE глюкозой и лигандом FGF для генерирования группы клеток кишечной трубки;
обработку клеток кишечной трубки глюкозой, ингибитором shh, лигандом FGF, активатором PKC, лигандом TGF-B, ретиноидом и градиентом ингибитора BMP для генерирования группы задних клеток энтодермы передней кишки, экспрессирующих PDX-1 и SOX2;
обработку клеток передней кишки глюкозой, активатором PKC, ингибитором shh, ретиноидом и ингибитором BMP для генерирования группы клеток передней кишки поджелудочной железы, экспрессирующих PDX-1 и NKX6.1 и экспрессирующих более низкий уровень SOX2 по сравнению с задними клетками передней кишки;
обработку клеток поджелудочной железы передней кишки глюкозой, ингибитором shh, ингибитором TGF-B и ретиноидом для получения группы клеток энтодермы поджелудочной железы, экспрессирующих PDX-1, более высокий уровень NKX6.1 и более низкий уровень SOX2 по сравнению с клетками поджелудочной железы передней кишки;
дифференцировку клеток панкреатической энтодермы в популяцию панкреатических бета-клеток,
причем плюрипотентные стволовые клетки выбраны из группы, состоящей из клеток линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, клеток линии эмбриональных стволовых клеток человека H7, клеток линии эмбриональных стволовых клеток человека H9, перепрограммированных человеческих плюрипотентных клеток или индуцибельных человеческих плюрипотентных клеток.
22. Способ по п.21, в котором популяция панкреатических бета-клеток представляет собой PDX-1 +, NKX6.1+, SOX2- и CDX2-.
23. Способ по п.21 или 22, в котором по меньшей мере на одной стадии способ дополнительно включает обработку аскорбиновой кислотой.
24. Способ по п.22, в котором панкреатические бета-клетки являются одногормональными инсулинпроизводящими клетками, которые также представляют собой NKX6.1+ и PDX-1+.
25. Способ по п.21, в котором плюрипотентные стволовые клетки выбраны из группы, состоящей из клеток линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, клеток линии эмбриональных стволовых клеток человека H7, клеток линии эмбриональных стволовых клеток человека H9, перепрограммированных человеческих плюрипотентных клеток и индуцибельных человеческих плюрипотентных клеток.
26. Способ по п.21, включающий обработку недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток человека глюкозой, GDF-8 и ингибитором GSK3B для генерации популяции клеток дефинитивной энтодермы (DE).
27. Способ по п.22, в котором ингибитором GSK3B является 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло [19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-он.
28. Способ по п.21, в котором лигандом FGF на стадии b., стадии с. или стадии b. и с. является FGF7.
29. Способ по п.21, в котором ингибитором shh на одной или более из стадии с., стадии d. и стадии е. является SANT-1.
30. Способ по п.21, в котором активатором PKC на стадии c., стадии d. или стадии c. и стадии d. является ТРВ.
31. Способ по п.21, в котором лигандом TGF-B на стадии с. является активин А.
32. Способ по п.21, в котором ингибитором ВМР на стадии c., стадии d. или стадии c. и стадии d. является LDN-193189.
33. Способ по п.21, в котором ингибитором TGF-B является ингибитор ALk5.
34. Способ по п.21, в котором способ на стадии от стадии а. до стадии е. включает обработку клеток в среде, выбранной из группы, состоящей из среды MCDB-131, среды DMEM/F12, среды RPMI и DMEM-высокоглюкозной среды.
35. Способ по п.34, в котором
среда на стадии a. представляет собой среду RPMI или среду MCDB-131;
среда на стадии b. представляет собой среду MCDB-131 или среду DMEM/F12; и
среда на стадиях c. или d. представляет собой среду MCDB-131 или DMEM-высокоглюкозную среду.
36. Способ по п.34, в котором среда на стадии a. представляет собой среду RPMI или среду MCDB-131.
37. Способ по п.34, в котором среда на стадии b. представляет собой среду MCDB-131 или среду DMEM/F12.
38. Способ по п.34, в котором среда на стадии b. представляет собой среду MCDB-131 или среду DMEM/F12.
39. Способ по п.34, в котором среда на стадиях c. или d. представляет собой среду MCDB-131 или DMEM-высокоглюкозную среду.
40. Способ по п.34, в котором среда на стадиях c. и d. представляет собой DMEM-высокоглюкозную среду.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161579351P | 2011-12-22 | 2011-12-22 | |
US61/579,351 | 2011-12-22 | ||
PCT/US2012/068439 WO2013095953A1 (en) | 2011-12-22 | 2012-12-07 | Differentiation of human embryonic stem cells into single hormonal insulin positive cells |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018132199A Division RU2705001C2 (ru) | 2011-12-22 | 2012-12-07 | Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в одногормональные инсулинположительные клетки |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2014130042A RU2014130042A (ru) | 2016-02-20 |
RU2668798C2 true RU2668798C2 (ru) | 2018-10-02 |
Family
ID=48669355
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014130042A RU2668798C2 (ru) | 2011-12-22 | 2012-12-07 | Способы in vitro пошаговой дифференцировки полюрипотентных клеток |
RU2018132199A RU2705001C2 (ru) | 2011-12-22 | 2012-12-07 | Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в одногормональные инсулинположительные клетки |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018132199A RU2705001C2 (ru) | 2011-12-22 | 2012-12-07 | Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в одногормональные инсулинположительные клетки |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US9388386B2 (ru) |
EP (1) | EP2794857A4 (ru) |
JP (4) | JP6441080B2 (ru) |
KR (2) | KR102090751B1 (ru) |
CN (1) | CN105143446B (ru) |
AR (1) | AR089426A1 (ru) |
AU (3) | AU2012355698B2 (ru) |
BR (1) | BR112014015417A8 (ru) |
CA (1) | CA2860107C (ru) |
HK (1) | HK1203552A1 (ru) |
MX (1) | MX2014007744A (ru) |
PH (1) | PH12014501429A1 (ru) |
RU (2) | RU2668798C2 (ru) |
SG (2) | SG10201608914WA (ru) |
WO (1) | WO2013095953A1 (ru) |
Families Citing this family (78)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9080145B2 (en) | 2007-07-01 | 2015-07-14 | Lifescan Corporation | Single pluripotent stem cell culture |
EP2185693B1 (en) | 2007-07-31 | 2019-07-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
EP2229434B1 (en) | 2007-11-27 | 2011-09-07 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
CA2959401C (en) | 2008-02-21 | 2021-12-07 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Methods, surface modified plates and compositions for cell attachment, cultivation and detachment |
EP2310492B1 (en) | 2008-06-30 | 2015-07-22 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
US9012218B2 (en) * | 2008-10-31 | 2015-04-21 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
CA2742268C (en) | 2008-10-31 | 2020-02-18 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage |
RU2555538C2 (ru) | 2008-11-20 | 2015-07-10 | Сентокор Орто Байотек Инк. | Культура плюрипотентных стволовых клеток на микроносителях |
AU2009316583B2 (en) | 2008-11-20 | 2016-04-21 | Janssen Biotech, Inc. | Methods and compositions for cell attachment and cultivation on planar substrates |
BR112012001480A2 (pt) | 2009-07-20 | 2015-09-01 | Janssen Biotech Inc | Diferenciação de células-tronco embriônicas humanas |
US9150833B2 (en) | 2009-12-23 | 2015-10-06 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
WO2011109279A2 (en) | 2010-03-01 | 2011-09-09 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells |
CN102884176B (zh) | 2010-05-12 | 2017-09-05 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
PL2611910T3 (pl) | 2010-08-31 | 2018-06-29 | Janssen Biotech, Inc | Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych |
PL2611909T3 (pl) | 2010-08-31 | 2018-05-30 | Janssen Biotech, Inc | Zróżnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych |
BR112014015417A8 (pt) * | 2011-12-22 | 2017-07-04 | Janssen Biotech Inc | diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células positivas de insulina hormonal únicas |
AU2013230020B2 (en) | 2012-03-07 | 2018-08-09 | Janssen Biotech, Inc. | Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells |
CN104334719B (zh) | 2012-06-08 | 2018-02-13 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化 |
RU2018116647A (ru) | 2012-12-31 | 2018-10-24 | Янссен Байотек, Инк. | Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки |
MX2015008619A (es) | 2012-12-31 | 2016-01-12 | Janssen Biotech Inc | Suspension y agrupamiento de celulas humanas pluripotentes para la diferenciacion a celulas endocrinas pancreaticas. |
US10370644B2 (en) * | 2012-12-31 | 2019-08-06 | Janssen Biotech, Inc. | Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom |
MX2015008578A (es) | 2012-12-31 | 2015-09-07 | Janssen Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas en celulas endocrinas pancreaticas mediante el uso de relugadores de hb9. |
US8859286B2 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-14 | Viacyte, Inc. | In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells |
CN106414718A (zh) | 2013-06-11 | 2017-02-15 | 哈佛学院校长同事会 | SC-β细胞以及用于产生其的组合物和方法 |
CN107223019A (zh) | 2013-09-25 | 2017-09-29 | 胺细拉健康公司 | 用于维持和提高肌肉质量、强度和性能的组合物和制剂及其产生和使用方法 |
KR20160079072A (ko) * | 2013-11-01 | 2016-07-05 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 췌장 내분비 세포로의 분화를 위한 인간 만능 줄기세포의 현탁 및 클러스터링 |
RU2694311C2 (ru) * | 2014-05-16 | 2019-07-11 | Янссен Байотек, Инк. | Применение малых молекул для увеличения экспрессии mafa в панкреатических эндокринных клетках |
EP3147356B1 (en) * | 2014-05-20 | 2024-03-13 | Tokyo Institute of Technology | Method for inducing differentiation of insulin-producing cells |
US10472610B2 (en) * | 2014-05-21 | 2019-11-12 | Kyoto University | Method for generating pancreatic bud cells and therapeutic agent for pancreatic disease containing pancreatic bud cells |
SG11201701844YA (en) * | 2014-10-08 | 2017-04-27 | Agency Science Tech & Res | Methods of differentiating stem cells into liver cell lineages |
WO2016100930A1 (en) * | 2014-12-18 | 2016-06-23 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for generating stem cell-derived b cells and methods of use thereof |
WO2016100898A1 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | President And Fellows Of Harvard College | Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived b cells and uses thereof |
WO2016100921A1 (en) * | 2014-12-18 | 2016-06-23 | President And Fellows Of Harvard College | METHODS FOR GENERATING STEM CELL-DERIVED β CELLS AND USES THEREOF |
WO2016100909A1 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | President And Fellows Of Harvard College | METHODS FOR GENERATING STEM CELL-DERIVED β CELLS AND USES THEREOF |
EP3234109A4 (en) * | 2014-12-19 | 2018-06-27 | Janssen Biotech, Inc. | Suspension culturing of pluripotent stem cells |
MA45479A (fr) * | 2016-04-14 | 2019-02-20 | Janssen Biotech Inc | Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen |
MA45502A (fr) * | 2016-06-21 | 2019-04-24 | Janssen Biotech Inc | Génération de cellules bêta fonctionnelles dérivées de cellules souches pluripotentes humaines ayant une respiration mitochondriale glucose-dépendante et une réponse en sécrétion d'insuline en deux phases |
CA3081762A1 (en) * | 2017-11-15 | 2019-05-23 | Semma Therapeutics, Inc. | Islet cell manufacturing compositions and methods of use |
WO2019217487A1 (en) * | 2018-05-07 | 2019-11-14 | President And Fellows Of Harvard College | Stem cell-derived alpha cells and methods of generating same |
CA3108275A1 (en) | 2018-08-10 | 2020-02-13 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Stem cell derived islet differentiation |
US20200080107A1 (en) | 2018-09-07 | 2020-03-12 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
JP7295576B2 (ja) * | 2018-09-19 | 2023-06-21 | オリヅルセラピューティクス株式会社 | インスリン産生細胞 |
CN109749986B (zh) * | 2019-03-13 | 2021-04-02 | 武汉大学 | 一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法 |
JP2020146307A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146297A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146302A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146312A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146315A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146303A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146309A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146308A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146314A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146298A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146301A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146310A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146313A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146305A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146304A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146300A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146318A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146311A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146299A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146317A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146306A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
EP3975926A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-04-06 | W.L. Gore & Associates, Inc. | A biocompatible membrane composite |
CA3139591C (en) | 2019-05-31 | 2024-01-16 | Timothy M. BRUHN | A biocompatible membrane composite |
JP2022534545A (ja) | 2019-05-31 | 2022-08-01 | ダブリュ.エル.ゴア アンド アソシエイツ,インコーポレイティド | 生体適合性メンブレン複合体 |
WO2020243668A1 (en) | 2019-05-31 | 2020-12-03 | W. L. Gore & Associates, Inc. | Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances |
CN114364791A (zh) | 2019-09-05 | 2022-04-15 | 克里斯珀医疗股份公司 | 通用供体细胞 |
US11104918B2 (en) | 2019-09-05 | 2021-08-31 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
CA3158631A1 (en) * | 2019-10-21 | 2021-04-29 | Orizuru Therapeutics, Inc. | Growth inhibitor |
AU2021319209A1 (en) | 2020-07-31 | 2023-03-02 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Differentiation of pancreatic endocrine cells |
CN112251396B (zh) * | 2020-10-09 | 2022-08-16 | 北京呈诺医学科技有限公司 | 培养基及其应用与诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法 |
CA3203392A1 (en) | 2020-12-31 | 2022-07-07 | Alireza Rezania | Universal donor cells |
CN113234664B (zh) * | 2021-05-11 | 2024-05-10 | 澳门大学 | 一种胰腺祖细胞的制备方法及其应用 |
AU2022377078A1 (en) | 2021-11-01 | 2024-04-04 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Stem cell derived pancreatic islet differentiation |
WO2023201361A1 (en) | 2022-04-15 | 2023-10-19 | Aspen Neuroscience, Inc. | Methods of classifying the differentiation state of cells and related compositions of differentiated cells |
CN114836369B (zh) * | 2022-05-20 | 2023-01-17 | 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 | 一种诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法及其在治疗i型糖尿病中的应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009018453A1 (en) * | 2007-07-31 | 2009-02-05 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
EA011953B1 (ru) * | 2004-04-27 | 2009-06-30 | Китера, Инк. | Pdx1-экспрессирующая энтодерма |
WO2010051213A1 (en) * | 2008-10-31 | 2010-05-06 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage |
WO2011143299A2 (en) * | 2010-05-12 | 2011-11-17 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
Family Cites Families (276)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3209652A (en) | 1961-03-30 | 1965-10-05 | Burgsmueller Karl | Thread whirling method |
AT326803B (de) | 1968-08-26 | 1975-12-29 | Binder Fa G | Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben |
US3935067A (en) | 1974-11-22 | 1976-01-27 | Wyo-Ben Products, Inc. | Inorganic support for culture media |
CA1201400A (en) | 1982-04-16 | 1986-03-04 | Joel L. Williams | Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture |
US4499802A (en) | 1982-09-29 | 1985-02-19 | Container Graphics Corporation | Rotary cutting die with scrap ejection |
US4537773A (en) | 1983-12-05 | 1985-08-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | α-Aminoboronic acid derivatives |
US4557264A (en) | 1984-04-09 | 1985-12-10 | Ethicon Inc. | Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene |
US5089396A (en) | 1985-10-03 | 1992-02-18 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US5215893A (en) | 1985-10-03 | 1993-06-01 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US4737578A (en) | 1986-02-10 | 1988-04-12 | The Salk Institute For Biological Studies | Human inhibin |
US5863531A (en) | 1986-04-18 | 1999-01-26 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework |
CA1340581C (en) | 1986-11-20 | 1999-06-08 | Joseph P. Vacanti | Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices |
US5759830A (en) | 1986-11-20 | 1998-06-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo |
US5567612A (en) | 1986-11-20 | 1996-10-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making |
NZ229354A (en) | 1988-07-01 | 1990-09-26 | Becton Dickinson Co | Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface |
EP0363125A3 (en) | 1988-10-03 | 1990-08-16 | Hana Biologics Inc. | Proliferated pancreatic endocrine cell product and process |
SU1767433A1 (ru) | 1989-11-27 | 1992-10-07 | Пермский государственный медицинский институт | Способ определени инсулинорезистентности имунного генеза у больных сахарным диабетом I типа |
US5837539A (en) | 1990-11-16 | 1998-11-17 | Osiris Therapeutics, Inc. | Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells |
WO1992019759A1 (en) | 1991-04-25 | 1992-11-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor |
US5449383A (en) | 1992-03-18 | 1995-09-12 | Chatelier; Ronald C. | Cell growth substrates |
GB9206861D0 (en) | 1992-03-28 | 1992-05-13 | Univ Manchester | Wound healing and treatment of fibrotic disorders |
CA2114282A1 (en) | 1993-01-28 | 1994-07-29 | Lothar Schilder | Multi-layered implant |
JP3525221B2 (ja) | 1993-02-17 | 2004-05-10 | 味の素株式会社 | 免疫抑制剤 |
AU687386B2 (en) | 1993-04-08 | 1998-02-26 | Human Cell Cultures, Inc. | Cell culturing method and medium |
US5523226A (en) * | 1993-05-14 | 1996-06-04 | Biotechnology Research And Development Corp. | Transgenic swine compositions and methods |
GB9310557D0 (en) | 1993-05-21 | 1993-07-07 | Smithkline Beecham Plc | Novel process and apparatus |
TW257671B (ru) | 1993-11-19 | 1995-09-21 | Ciba Geigy | |
US6001647A (en) | 1994-04-28 | 1999-12-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof |
US6703017B1 (en) | 1994-04-28 | 2004-03-09 | Ixion Biotechnology, Inc. | Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures |
US5834308A (en) | 1994-04-28 | 1998-11-10 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans |
US6083903A (en) | 1994-10-28 | 2000-07-04 | Leukosite, Inc. | Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses |
KR100252743B1 (ko) | 1994-12-29 | 2000-09-01 | 나가야마 오사무 | Il-6 안타고니스트를 함유하는 항종양제의 작용증강제 |
US5843780A (en) | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
US5718922A (en) | 1995-05-31 | 1998-02-17 | Schepens Eye Research Institute, Inc. | Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation |
US5908782A (en) | 1995-06-05 | 1999-06-01 | Osiris Therapeutics, Inc. | Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells |
US5681561A (en) | 1995-06-07 | 1997-10-28 | Life Medical Sciences, Inc. | Compositions and methods for improving autologous fat grafting |
CA2277278A1 (en) | 1997-01-10 | 1998-07-16 | Life Technologies, Inc. | Embryonic stem cell serum replacement |
ES2202840T3 (es) | 1997-04-24 | 2004-04-01 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Imidazoles sustituidos utiles en el tratamiento de enfermedades inflamatorias. |
DE69837491T2 (de) | 1997-07-03 | 2008-01-17 | Osiris Therapeutics, Inc. | Menschliche mesenchymale stammzellen aus peripherem blut |
US6670127B2 (en) | 1997-09-16 | 2003-12-30 | Egea Biosciences, Inc. | Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide |
EP1538206B1 (en) | 1997-09-16 | 2010-03-24 | Centocor, Inc. | Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes |
CA2307807C (en) | 1997-10-23 | 2008-09-02 | Andrea G. Bodnar | Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture |
CO4980885A1 (es) | 1997-12-29 | 2000-11-27 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Compuestos de trifenilpropanamida utiles en el tratamiento de inflamaciones y metodos para preparar dicho compuesto |
AU755888B2 (en) | 1998-03-18 | 2003-01-02 | Mesoblast International Sarl | Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation |
MY132496A (en) | 1998-05-11 | 2007-10-31 | Vertex Pharma | Inhibitors of p38 |
US6413773B1 (en) | 1998-06-01 | 2002-07-02 | The Regents Of The University Of California | Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation |
US6667176B1 (en) | 2000-01-11 | 2003-12-23 | Geron Corporation | cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells |
US7410798B2 (en) | 2001-01-10 | 2008-08-12 | Geron Corporation | Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells |
US6610540B1 (en) | 1998-11-18 | 2003-08-26 | California Institute Of Technology | Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells |
US6413556B1 (en) | 1999-01-08 | 2002-07-02 | Sky High, Llc | Aqueous anti-apoptotic compositions |
US6458593B1 (en) | 1999-01-21 | 2002-10-01 | Vitro Diagnostics, Inc. | Immortalized cell lines and methods of making the same |
DE60037107T2 (de) | 1999-02-11 | 2008-09-25 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | Pluripotente embryonale keimzellinie aus vögeln |
US6815203B1 (en) | 1999-06-23 | 2004-11-09 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Methods of making pancreatic islet cells |
US6306424B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-10-23 | Ethicon, Inc. | Foam composite for the repair or regeneration of tissue |
US6333029B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-12-25 | Ethicon, Inc. | Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue |
CA2385628A1 (en) | 1999-09-27 | 2001-04-05 | Ammon B. Peck | Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures |
US6685936B2 (en) | 1999-10-12 | 2004-02-03 | Osiris Therapeutics, Inc. | Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation |
US20030082155A1 (en) | 1999-12-06 | 2003-05-01 | Habener Joel F. | Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus |
US6753153B2 (en) | 1999-12-13 | 2004-06-22 | The Scripps Research Institute | Markers for identification and isolation of pancreatic islet α and β progenitors |
US7439064B2 (en) | 2000-03-09 | 2008-10-21 | Wicell Research Institute, Inc. | Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium |
US7005252B1 (en) | 2000-03-09 | 2006-02-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Serum free cultivation of primate embryonic stem cells |
US6436704B1 (en) | 2000-04-10 | 2002-08-20 | Raven Biotechnologies, Inc. | Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof |
US6458589B1 (en) | 2000-04-27 | 2002-10-01 | Geron Corporation | Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells |
JP4621410B2 (ja) | 2000-06-26 | 2011-01-26 | Ncメディカルリサーチ株式会社 | 神経細胞へ分化しうる細胞分画の調製方法及び神経変性疾患治療薬の製造方法 |
JP4524072B2 (ja) | 2000-10-23 | 2010-08-11 | グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | 新規化合物 |
AU2737102A (en) | 2000-12-08 | 2002-06-18 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Macroheterocylic compounds useful as kinase inhibitors |
YU46603A (sh) | 2000-12-08 | 2006-05-25 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical Inc. | Indazolil-supstituisana jedinjenja pirolina, kao inhibitori kinaze |
US6599323B2 (en) | 2000-12-21 | 2003-07-29 | Ethicon, Inc. | Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use |
JP2005503759A (ja) | 2001-01-24 | 2005-02-10 | アメリカ合衆国 | 幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化方法 |
US6713446B2 (en) | 2001-01-25 | 2004-03-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Formulation of boronic acid compounds |
US6656488B2 (en) | 2001-04-11 | 2003-12-02 | Ethicon Endo-Surgery, Inc. | Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering |
JP2004527249A (ja) | 2001-04-19 | 2004-09-09 | デヴェロゲン アクチエンゲゼルシャフト フュア エントヴィックルングスビオローギッシェ フォルシュング | 幹細胞をインスリン産生細胞に分化する方法 |
WO2002088335A1 (fr) | 2001-04-24 | 2002-11-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Cellules souches et procede d'extraction de ces cellules |
EP1393066A4 (en) | 2001-05-15 | 2006-01-25 | Rappaport Family Inst For Res | INSULIN-PRODUCING CELLS DERIVED FROM HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS |
US6626950B2 (en) | 2001-06-28 | 2003-09-30 | Ethicon, Inc. | Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue |
KR100418195B1 (ko) | 2001-07-05 | 2004-02-11 | 주식회사 우리기술 | 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법 |
GB0117583D0 (en) | 2001-07-19 | 2001-09-12 | Astrazeneca Ab | Novel compounds |
AU2002319780A1 (en) | 2001-08-06 | 2003-02-24 | Bresagen, Ltd. | Alternative compositions and methods for the culture of stem cells |
US6617152B2 (en) | 2001-09-04 | 2003-09-09 | Corning Inc | Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate |
EP1298201A1 (en) | 2001-09-27 | 2003-04-02 | Cardion AG | Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state |
US20050053588A1 (en) | 2001-10-18 | 2005-03-10 | Li Yin | Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells |
ATE438708T1 (de) | 2001-11-15 | 2009-08-15 | Childrens Medical Center | Verfahren zur isolierung, expansion und differenzierung fötaler stammzellen aus chorionzotte, fruchtwasser und plazenta und therapeutische verwendungen davon |
US20030161816A1 (en) | 2001-12-07 | 2003-08-28 | Fraser John K. | Systems and methods for treating patients with processed lipoaspirate cells |
CA2692325C (en) | 2001-12-07 | 2015-10-20 | Geron Corporation | Islet cells from human embryonic stem cells |
WO2003054169A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-03 | Thromb-X Nv | Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability |
WO2003055992A2 (en) | 2001-12-28 | 2003-07-10 | Cellartis Ab | A method for the establishment of a pluripotent human blastocyst-derived stem cell line |
US20030162290A1 (en) | 2002-01-25 | 2003-08-28 | Kazutomo Inoue | Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells |
US20030180268A1 (en) | 2002-02-05 | 2003-09-25 | Anthony Atala | Tissue engineered construct for supplementing or replacing a damaged organ |
AU2003231358A1 (en) | 2002-04-17 | 2003-10-27 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | METHOD OF FORMING PANCREATIC Beta CELLS FROM MESENCHYMAL CELLS |
US20040161419A1 (en) | 2002-04-19 | 2004-08-19 | Strom Stephen C. | Placental stem cells and uses thereof |
ATE387444T1 (de) | 2002-05-08 | 2008-03-15 | Janssen Pharmaceutica Nv | Substituierte pyrroline als kinase inhibitoren |
US20060003446A1 (en) | 2002-05-17 | 2006-01-05 | Gordon Keller | Mesoderm and definitive endoderm cell populations |
CN1662643A (zh) | 2002-05-28 | 2005-08-31 | 贝克顿·迪金森公司 | 人腺泡细胞的扩增和转分化 |
MXPA04012188A (es) | 2002-06-05 | 2005-07-25 | Johnson & Johnson | Derivados de bisindolil-maleimida como inhibidores de cinasa. |
GB0212976D0 (en) | 2002-06-06 | 2002-07-17 | Tonejet Corp Pty Ltd | Ejection method and apparatus |
CN1171991C (zh) | 2002-07-08 | 2004-10-20 | 徐如祥 | 人神经干细胞的培养方法 |
US6877147B2 (en) | 2002-07-22 | 2005-04-05 | Broadcom Corporation | Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison |
US7838290B2 (en) | 2002-07-25 | 2010-11-23 | The Scripps Research Institute | Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith |
AU2003257938A1 (en) | 2002-07-29 | 2004-02-16 | Es Cell International Pte Ltd. | Multi-step method for differentiation of insulin positive, glucose |
WO2004016747A2 (en) | 2002-08-14 | 2004-02-26 | University Of Florida | Bone marrow cell differentiation |
WO2004023100A2 (en) | 2002-09-06 | 2004-03-18 | Amcyte Inc. | Cd56 positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells |
US9969977B2 (en) | 2002-09-20 | 2018-05-15 | Garnet Biotherapeutics | Cell populations which co-express CD49c and CD90 |
US20040062753A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-04-01 | Alireza Rezania | Composite scaffolds seeded with mammalian cells |
US20060252150A1 (en) | 2002-11-08 | 2006-11-09 | Linzhao Cheng | Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same |
US7144999B2 (en) | 2002-11-23 | 2006-12-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression |
EP1567639A4 (en) | 2002-12-05 | 2005-12-21 | Technion Res & Dev Foundation | CULTURE OF HUMAN PANCREATIC ISLANDS AND USES THEREOF |
CN100549163C (zh) | 2002-12-16 | 2009-10-14 | 技术研究及发展基金有限公司 | 制备无饲养细胞、无异源的人胚胎干细胞的方法以及使用该方法制备的干细胞培养物 |
US20050118148A1 (en) | 2002-12-20 | 2005-06-02 | Roland Stein | Compositions and methods related to mammalian Maf-A |
RU2359671C2 (ru) | 2003-01-29 | 2009-06-27 | Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед | Способ получения препарата с покрытием |
US7976853B2 (en) | 2003-01-29 | 2011-07-12 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Process for producing coated preparation |
US20070155661A1 (en) | 2003-02-14 | 2007-07-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University | Methods and compositions for modulating the development of stem cells |
WO2005045001A2 (en) | 2003-02-14 | 2005-05-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Insulin-producing cells derived from stem cells |
CA2520861A1 (en) | 2003-03-27 | 2004-10-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway |
US20060194315A1 (en) | 2003-03-31 | 2006-08-31 | Condie Brian G | Compositions and methods for the control, differentiaton and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway |
US20090203141A1 (en) | 2003-05-15 | 2009-08-13 | Shi-Lung Lin | Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents |
JP4950660B2 (ja) | 2003-06-27 | 2012-06-13 | エチコン、インコーポレイテッド | 分娩後由来細胞を使用する眼組織の修復および再生 |
IL161903A0 (en) | 2003-07-17 | 2005-11-20 | Gamida Cell Ltd | Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs |
ITRM20030395A1 (it) | 2003-08-12 | 2005-02-13 | Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz | Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero. |
US7569385B2 (en) | 2003-08-14 | 2009-08-04 | The Regents Of The University Of California | Multipotent amniotic fetal stem cells |
US7157275B2 (en) | 2003-08-15 | 2007-01-02 | Becton, Dickinson And Company | Peptides for enhanced cell attachment and growth |
WO2005021728A2 (en) | 2003-08-27 | 2005-03-10 | Stemcells California, Inc. | Enriched pancreatic stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for these populations |
WO2005058301A1 (en) | 2003-12-17 | 2005-06-30 | Allergan, Inc. | Methods for treating retinoid responsive disorders using selective inhibitors of cyp26a and cyp26b |
US20060030042A1 (en) | 2003-12-19 | 2006-02-09 | Ali Brivanlou | Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime |
GB0329498D0 (en) | 2003-12-19 | 2004-01-28 | Novartis Ag | Organic compounds |
US20050266554A1 (en) | 2004-04-27 | 2005-12-01 | D Amour Kevin A | PDX1 expressing endoderm |
CN112813019A (zh) | 2003-12-23 | 2021-05-18 | 维亚希特公司 | 定形内胚层 |
US7541185B2 (en) | 2003-12-23 | 2009-06-02 | Cythera, Inc. | Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm |
US7625753B2 (en) | 2003-12-23 | 2009-12-01 | Cythera, Inc. | Expansion of definitive endoderm cells |
AU2004309421B2 (en) * | 2003-12-23 | 2011-04-21 | Viacyte, Inc. | Definitive endoderm |
TWI334443B (en) | 2003-12-31 | 2010-12-11 | Ind Tech Res Inst | Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells |
US20050233446A1 (en) | 2003-12-31 | 2005-10-20 | Parsons Xuejun H | Defined media for stem cell culture |
WO2005071066A1 (en) | 2004-01-23 | 2005-08-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for preparing pancreatic insulin secreting cells |
US7794704B2 (en) | 2004-01-23 | 2010-09-14 | Advanced Cell Technology, Inc. | Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration |
WO2005080551A2 (en) | 2004-02-12 | 2005-09-01 | University Of Newcastle Upon Tyne | Stem cells |
WO2005080598A1 (ja) | 2004-02-19 | 2005-09-01 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法 |
CA2581424A1 (en) | 2004-03-09 | 2005-09-22 | Gang Xu | Methods for generating insulin-producing cells |
AU2005221079B2 (en) | 2004-03-10 | 2010-07-22 | Regents Of The University Of California | Compositions and methods for growth of embryonic stem cells |
CN1934245B (zh) | 2004-03-23 | 2012-07-04 | 第一三共株式会社 | 多能干细胞的增殖方法 |
WO2005097980A2 (en) | 2004-03-26 | 2005-10-20 | Geron Corporation | New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells |
KR20070029681A (ko) | 2004-04-01 | 2007-03-14 | 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 | 줄기 세포의 내배엽 및 이자 혈통으로의 분화 |
CN102925406B (zh) | 2004-07-09 | 2019-11-22 | 维亚希特公司 | 鉴定用于分化定型内胚层的因子的方法 |
CA2576872C (en) | 2004-08-13 | 2013-11-12 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Compositions and methods for self-renewal and differentiation in human embryonic stem cells |
WO2006026473A2 (en) | 2004-08-25 | 2006-03-09 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS UTILIZING MYC AND GSK3ß TO MANIPULATE THE PLURIPOTENCY OF EMBRYONIC STEM CELLS |
DE102004043256B4 (de) | 2004-09-07 | 2013-09-19 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension |
CN101044235B (zh) | 2004-09-08 | 2013-01-02 | 威斯康星校友研究基金会 | 胚胎干细胞的培养基和培养 |
AU2005282414C1 (en) | 2004-09-08 | 2011-04-07 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Culturing human embryonic stem cells |
JP2008538276A (ja) | 2005-01-28 | 2008-10-23 | ノヴァセラ・リミテッド | 胚幹細胞培養のための方法 |
JP2008528038A (ja) | 2005-01-31 | 2008-07-31 | エス セル インターナショナル ピーティーイー リミテッド | 胚性幹細胞の指示された分化及びその利用 |
WO2006088867A2 (en) | 2005-02-15 | 2006-08-24 | Medistem Laboratories, Incorporated | Method for expansion of stem cells |
AU2006218359A1 (en) | 2005-03-04 | 2006-09-08 | John O'neil | Adult pancreatic derived stromal cells |
GB0505970D0 (en) | 2005-03-23 | 2005-04-27 | Univ Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof |
DK1864132T3 (da) | 2005-03-31 | 2012-07-16 | Stemnion Inc | Fra amnion stammende cellesammensætninger, fremgangsmåder til fremstilling deraf og anvendelser deraf |
WO2006113470A2 (en) | 2005-04-15 | 2006-10-26 | Geron Corporation | Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities |
CN100425694C (zh) | 2005-04-15 | 2008-10-15 | 北京大学 | 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法 |
WO2006114097A2 (en) | 2005-04-26 | 2006-11-02 | Aarhus Universitet | Biosurface structure array |
WO2006117925A1 (ja) * | 2005-04-26 | 2006-11-09 | Hitachi Medical Corporation | 膵臓β細胞再生方法および装置 |
WO2006126574A1 (ja) | 2005-05-24 | 2006-11-30 | Kumamoto University | Es細胞の分化誘導方法 |
AU2006202209B2 (en) | 2005-05-27 | 2011-04-14 | Lifescan, Inc. | Amniotic fluid derived cells |
CA2610598A1 (en) | 2005-06-10 | 2006-12-21 | Irm Llc | Compounds that maintain pluripotency of embryonic stem cells |
WO2006138433A2 (en) | 2005-06-14 | 2006-12-28 | The Regents Of The University Of California | Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides |
EP1931764A1 (en) | 2005-06-21 | 2008-06-18 | GE Healthcare Bio-Sciences AB | Method for cell culture |
CN101233226B (zh) | 2005-06-22 | 2017-08-11 | 阿斯特利亚斯生物治疗股份公司 | 人胚胎干细胞的悬浮培养物 |
ES2330789T3 (es) | 2005-06-30 | 2009-12-15 | Janssen Pharmaceutica Nv | Anilino-piridinotriazinas ciclicas como inhibidores de gsk-3. |
US20080194021A1 (en) | 2005-07-29 | 2008-08-14 | Mays Robert W | Use of a Gsk-3 Inhibitor to Maintain Potency of Culture Cells |
GB2443370A (en) | 2005-07-29 | 2008-04-30 | Australian Stem Cell Ct Ltd | Compositions and methods for growth of pluripotent cells |
WO2007025234A2 (en) | 2005-08-26 | 2007-03-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes |
AU2006286149B2 (en) | 2005-08-29 | 2012-09-13 | Technion Research And Development Foundation Ltd. | Media for culturing stem cells |
AU2006285468A1 (en) | 2005-09-02 | 2007-03-08 | Agency For Science, Technology And Research | Method of deriving progenitor cell line |
GB2444686B (en) | 2005-09-12 | 2010-08-25 | Es Cell Int Pte Ltd | Differentiation of pluripotent stem cells using p38 MAPK inhibitors or prostaglandins |
JP5131833B2 (ja) | 2005-10-05 | 2013-01-30 | 晃文 松山 | 脂肪組織由来細胞から膵内分泌細胞を得る方法 |
WO2008048671A1 (en) | 2006-10-18 | 2008-04-24 | University Of Illinois | Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use |
NZ567082A (en) | 2005-10-14 | 2012-08-31 | Univ Minnesota | Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype |
US7732202B2 (en) | 2005-10-21 | 2010-06-08 | International Stem Cell Corporation | Oxygen tension for the parthenogenic activation of human oocytes for the production of human embryonic stem cells |
DK2674485T3 (da) | 2005-10-27 | 2019-08-26 | Viacyte Inc | Pdx-1 udtrykkende dorsal og ventral fortarm endoderm |
EP2208786B1 (en) | 2005-12-13 | 2018-08-01 | Kyoto University | Nuclear reprogramming factor |
WO2007082963A1 (es) | 2006-01-18 | 2007-07-26 | Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad | Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas |
CA2643478C (en) | 2006-02-23 | 2019-06-18 | Novocell, Inc. | Compositions and methods useful for culturing differentiable cells |
US7695965B2 (en) | 2006-03-02 | 2010-04-13 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
CA2644468C (en) | 2006-03-02 | 2022-02-01 | Cythera, Inc. | Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production |
WO2007127927A2 (en) | 2006-04-28 | 2007-11-08 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US8741643B2 (en) | 2006-04-28 | 2014-06-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage |
US20070259423A1 (en) | 2006-05-02 | 2007-11-08 | Jon Odorico | Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage |
US8685730B2 (en) | 2006-05-02 | 2014-04-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage |
US9598673B2 (en) | 2006-05-19 | 2017-03-21 | Creative Medical Health | Treatment of disc degenerative disease |
WO2007139929A2 (en) | 2006-05-25 | 2007-12-06 | The Burnham Institute For Medical Research | Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells |
CN101541953A (zh) | 2006-06-02 | 2009-09-23 | 佐治亚大学研究基金会 | 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织 |
US20090298169A1 (en) | 2006-06-02 | 2009-12-03 | The University Of Georgia Research Foundation | Pancreatic and Liver Endoderm Cells and Tissue by Differentiation of Definitive Endoderm Cells Obtained from Human Embryonic Stems |
WO2007149182A2 (en) | 2006-06-19 | 2007-12-27 | Geron Corporation | Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells |
CN100494359C (zh) | 2006-06-23 | 2009-06-03 | 中日友好医院 | 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法 |
CA2656175C (en) | 2006-06-26 | 2018-08-28 | Lifescan, Inc. | Conditioned media obtained from amniotic fluid-derived cells for pluripotent stem cell culture |
US20080003676A1 (en) | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Millipore Corporation | Growth of embryonic stem cells |
US8968994B2 (en) | 2006-07-06 | 2015-03-03 | Jeremy Micah Crook | Method for stem cell culture and cells derived therefrom |
WO2008013664A2 (en) | 2006-07-26 | 2008-01-31 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
DK2733203T3 (en) | 2006-08-02 | 2019-02-04 | Technion Res & Dev Foundation | PROCEDURES FOR EXPANSION OF EMBRYONAL STEM CELLS IN A SUSPENSION CULTURE |
KR101331510B1 (ko) | 2006-08-30 | 2013-11-20 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴 |
JP2008099662A (ja) | 2006-09-22 | 2008-05-01 | Institute Of Physical & Chemical Research | 幹細胞の培養方法 |
WO2008039521A2 (en) | 2006-09-26 | 2008-04-03 | Nmt Medical, Inc. | Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth |
BRPI0718310A2 (pt) | 2006-10-17 | 2013-11-19 | Stiefel Laboratories | Metabólitos de talarozol |
WO2008048647A1 (en) | 2006-10-17 | 2008-04-24 | Cythera, Inc. | Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells |
WO2008056779A1 (fr) | 2006-11-09 | 2008-05-15 | Japan As Represented By The President Of International Medical Center Of Japan | Procédé destiné à la culture et au passage d'une cellule souche embryonnaire de primate, et procédé destiné à induire la différenciation de la cellule souche embryonnaire |
US8217027B2 (en) | 2006-12-21 | 2012-07-10 | Abbott Laboratories | Sphingosine-1-phosphate receptor agonist and antagonist compounds |
WO2008086005A1 (en) | 2007-01-09 | 2008-07-17 | University Of South Florida | Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof |
CN103627671A (zh) | 2007-01-30 | 2014-03-12 | 佐治亚大学研究基金会 | 产生中内胚层细胞及多能游走细胞的方法与细胞群及用途 |
GB0703188D0 (en) | 2007-02-19 | 2007-03-28 | Roger Land Building | Large scale production of stem cells |
US20090053182A1 (en) | 2007-05-25 | 2009-02-26 | Medistem Laboratories, Inc. | Endometrial stem cells and methods of making and using same |
DK2173863T3 (en) | 2007-06-29 | 2019-01-21 | Fujifilm Cellular Dynamics Inc | Automated method and apparatus for embryonic stem cell culture |
EP2559756B1 (en) | 2007-07-01 | 2019-12-18 | Janssen Biotech, Inc. | Single pluripotent stem cell culture |
CN105176919A (zh) | 2007-07-18 | 2015-12-23 | 生命扫描有限公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
WO2009048675A1 (en) | 2007-07-31 | 2009-04-16 | Lifescan, Inc. | Pluripotent stem cell differentiation by using human feeder cells |
WO2009027644A2 (en) | 2007-08-24 | 2009-03-05 | Stichting Het Nederlands Kanker Instituut | Composition |
US20110151447A1 (en) | 2007-11-06 | 2011-06-23 | Children's Medical Center Corporation | Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells from non-embryonic human cells |
EP2229434B1 (en) | 2007-11-27 | 2011-09-07 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
SG154367A1 (en) | 2008-01-31 | 2009-08-28 | Es Cell Int Pte Ltd | Method of differentiating stem cells |
WO2009096049A1 (ja) | 2008-02-01 | 2009-08-06 | Kyoto University | 人工多能性幹細胞由来分化細胞 |
EP2250252A2 (en) | 2008-02-11 | 2010-11-17 | Cambridge Enterprise Limited | Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained |
CA2959401C (en) | 2008-02-21 | 2021-12-07 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Methods, surface modified plates and compositions for cell attachment, cultivation and detachment |
WO2009110215A1 (ja) | 2008-03-03 | 2009-09-11 | 独立行政法人 科学技術振興機構 | 繊毛細胞の分化誘導方法 |
WO2009116951A2 (en) | 2008-03-17 | 2009-09-24 | Agency For Science, Technology And Research | Microcarriers for stem cell culture |
RU2359030C1 (ru) | 2008-03-19 | 2009-06-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" | Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (варианты) |
DK2283117T3 (da) | 2008-04-21 | 2014-01-20 | Viacyte Inc | Fremgangsmåde til oprensning af pancreatiske endodermceller afledt fra humane embryoniske stamceller |
US8338170B2 (en) | 2008-04-21 | 2012-12-25 | Viacyte, Inc. | Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells |
WO2009132083A2 (en) | 2008-04-22 | 2009-10-29 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for promoting the generation of pdx1+ pancreatic cells |
US7939322B2 (en) | 2008-04-24 | 2011-05-10 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm |
US8623648B2 (en) | 2008-04-24 | 2014-01-07 | Janssen Biotech, Inc. | Treatment of pluripotent cells |
US20090291494A1 (en) | 2008-05-21 | 2009-11-26 | Bioe, Inc. | Differentiation of Multi-Lineage Progenitor Cells to Pancreatic Cells |
US20090298178A1 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-03 | D Amour Kevin Allen | Growth factors for production of definitive endoderm |
WO2009154606A1 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-23 | Cythera, Inc. | Growth factors for production of definitive endoderm |
EP2310492B1 (en) | 2008-06-30 | 2015-07-22 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
DE102008032236A1 (de) | 2008-06-30 | 2010-04-01 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen | Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential |
US20100028307A1 (en) | 2008-07-31 | 2010-02-04 | O'neil John J | Pluripotent stem cell differentiation |
US9683215B2 (en) | 2008-08-22 | 2017-06-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of reprogramming cells |
US20110262956A1 (en) | 2008-10-07 | 2011-10-27 | Guillermo Munoz Elias | Co-culture compositions and methods |
CA2742268C (en) * | 2008-10-31 | 2020-02-18 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage |
CA2742583C (en) | 2008-11-04 | 2022-09-27 | Viacyte, Inc. | Stem cell aggregate suspension compositions and methods for differentiation thereof |
US8008075B2 (en) | 2008-11-04 | 2011-08-30 | Viacyte, Inc. | Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof |
ES2932850T3 (es) | 2008-11-14 | 2023-01-27 | Viacyte Inc | Encapsulación de células pancreáticas derivadas de células madre pluripotentes humanas |
RU2555538C2 (ru) | 2008-11-20 | 2015-07-10 | Сентокор Орто Байотек Инк. | Культура плюрипотентных стволовых клеток на микроносителях |
EP2356218B1 (en) | 2008-12-05 | 2017-05-03 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Method and medium for neural differentiation of pluripotent cells |
GB2485113B (en) | 2009-07-20 | 2016-12-28 | Janssen Biotech Inc | Differentiation of human embryonic stem cells into cells of the pancreatic endoderm lineage |
CN102482640B (zh) | 2009-07-20 | 2015-03-11 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
BR112012001480A2 (pt) | 2009-07-20 | 2015-09-01 | Janssen Biotech Inc | Diferenciação de células-tronco embriônicas humanas |
EP2464723B1 (en) | 2009-08-12 | 2016-06-22 | Kyoto University | Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into neural precursor cells |
AU2010319921A1 (en) | 2009-10-29 | 2012-05-17 | Janssen Biotech Inc. | Pluripotent stem cells |
EP4166652A1 (en) | 2009-11-12 | 2023-04-19 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Culture media, cell cultures and methods of culturing pluripotent stem cells in an undifferentiated state |
FI20096288A0 (fi) | 2009-12-04 | 2009-12-04 | Kristiina Rajala | Formulations and methods for culturing stem cells |
US9150833B2 (en) | 2009-12-23 | 2015-10-06 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
RU2664864C1 (ru) | 2009-12-23 | 2018-08-23 | Янссен Байотек, Инк. | Способы увеличения экспрессии ngn3 и nkx6.1 в эндокринных клетках поджелудочной железы |
WO2011081222A1 (ja) | 2009-12-29 | 2011-07-07 | 武田薬品工業株式会社 | 膵ホルモン産生細胞の製造法 |
TR201000243A2 (tr) | 2010-01-13 | 2010-06-21 | Akdeni̇z Ahmet | Mile açılan kama kanalını ölçmeye ve kontrol etmeye yarayan ölçüm cihazı |
WO2011096223A1 (ja) | 2010-02-03 | 2011-08-11 | 独立行政法人国立がん研究センター | 誘導肝幹細胞及びその製造方法、並びに、該細胞の応用 |
WO2011109279A2 (en) * | 2010-03-01 | 2011-09-09 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells |
CA2791846A1 (en) | 2010-03-02 | 2011-09-09 | National University Of Singapore | Culture additives to boost stem cell proliferation and differentiation response |
CN105176930B (zh) | 2010-03-31 | 2021-05-04 | 斯克里普斯研究所 | 重编程细胞 |
EP2563908B1 (en) | 2010-04-25 | 2019-01-09 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Generation of anterior foregut endoderm from pluripotent cells |
US8932857B2 (en) | 2010-06-15 | 2015-01-13 | Kyoto University | Method for selecting reduced differentiation resistance human induced pluripotent stem cells |
US9085757B2 (en) | 2010-06-17 | 2015-07-21 | Regents Of The University Of Minnesota | Production of insulin producing cells |
AU2011285531B2 (en) | 2010-08-05 | 2015-04-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Simplified basic media for human pluripotent cell culture |
RU2576000C2 (ru) | 2010-08-09 | 2016-02-27 | Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед | Способ получения клеток, продуцирующих панкреатические гормоны |
RU2673946C1 (ru) | 2010-08-31 | 2018-12-03 | Янссен Байотек, Инк. | Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток |
PL2611910T3 (pl) | 2010-08-31 | 2018-06-29 | Janssen Biotech, Inc | Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych |
WO2012117333A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-09-07 | Stempeutics Research Malaysia Sdn Bhd | Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof |
WO2013055834A2 (en) | 2011-10-11 | 2013-04-18 | The New York Stem Cell Foundation | Er stress relievers in beta cell protection |
WO2013056072A1 (en) | 2011-10-13 | 2013-04-18 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells |
US9670463B2 (en) | 2011-10-14 | 2017-06-06 | Children's Medical Center Corporation | Inhibition and enhancement of reprogramming by chromatin modifying enzymes |
EP2795515A4 (en) | 2011-12-22 | 2015-09-02 | Intel Corp | STILL AVAILABLE EMBEDDED THEFT REACTION SYSTEM |
BR112014015417A8 (pt) | 2011-12-22 | 2017-07-04 | Janssen Biotech Inc | diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células positivas de insulina hormonal únicas |
US10519422B2 (en) | 2012-02-29 | 2019-12-31 | Riken | Method of producing human retinal pigment epithelial cells |
CN104334719B (zh) | 2012-06-08 | 2018-02-13 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化 |
US20150247123A1 (en) | 2012-09-03 | 2015-09-03 | Novo Nordisk A/S | Generation of pancreatic endoderm from Pluripotent Stem cells using small molecules |
RU2018116647A (ru) | 2012-12-31 | 2018-10-24 | Янссен Байотек, Инк. | Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки |
MX2015008578A (es) | 2012-12-31 | 2015-09-07 | Janssen Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas en celulas endocrinas pancreaticas mediante el uso de relugadores de hb9. |
WO2014127164A1 (en) | 2013-02-14 | 2014-08-21 | Allergan, Inc. | Substituted dihydropyrazoles as sphingosine receptor modulators |
US8859286B2 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-14 | Viacyte, Inc. | In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells |
TW201522637A (zh) | 2013-03-15 | 2015-06-16 | Jackson Lab | 非胚胎幹細胞之單離及其用途 |
CN106414718A (zh) | 2013-06-11 | 2017-02-15 | 哈佛学院校长同事会 | SC-β细胞以及用于产生其的组合物和方法 |
CN108699515A (zh) | 2016-02-24 | 2018-10-23 | 诺和诺德股份有限公司 | 由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性β细胞 |
-
2012
- 2012-12-07 BR BR112014015417A patent/BR112014015417A8/pt not_active Application Discontinuation
- 2012-12-07 SG SG10201608914WA patent/SG10201608914WA/en unknown
- 2012-12-07 WO PCT/US2012/068439 patent/WO2013095953A1/en active Application Filing
- 2012-12-07 JP JP2014549094A patent/JP6441080B2/ja active Active
- 2012-12-07 CN CN201280070187.1A patent/CN105143446B/zh active Active
- 2012-12-07 EP EP12860751.2A patent/EP2794857A4/en active Pending
- 2012-12-07 US US13/708,369 patent/US9388386B2/en active Active
- 2012-12-07 MX MX2014007744A patent/MX2014007744A/es unknown
- 2012-12-07 RU RU2014130042A patent/RU2668798C2/ru active
- 2012-12-07 AU AU2012355698A patent/AU2012355698B2/en active Active
- 2012-12-07 CA CA2860107A patent/CA2860107C/en active Active
- 2012-12-07 KR KR1020147020267A patent/KR102090751B1/ko active IP Right Grant
- 2012-12-07 RU RU2018132199A patent/RU2705001C2/ru active
- 2012-12-07 SG SG11201403473QA patent/SG11201403473QA/en unknown
- 2012-12-07 KR KR1020207007316A patent/KR102203056B1/ko active IP Right Grant
- 2012-12-21 AR ARP120104934A patent/AR089426A1/es unknown
-
2014
- 2014-06-20 PH PH12014501429A patent/PH12014501429A1/en unknown
-
2015
- 2015-04-27 HK HK15104026.3A patent/HK1203552A1/xx unknown
- 2015-08-20 US US14/831,115 patent/US10358628B2/en active Active
-
2018
- 2018-11-21 JP JP2018218327A patent/JP6851358B2/ja active Active
-
2019
- 2019-02-25 AU AU2019201293A patent/AU2019201293B2/en active Active
- 2019-06-07 US US16/435,428 patent/US11377640B2/en active Active
-
2020
- 2020-12-18 JP JP2020210764A patent/JP7191925B2/ja active Active
-
2021
- 2021-08-23 AU AU2021221411A patent/AU2021221411B2/en active Active
-
2022
- 2022-05-20 US US17/749,735 patent/US20220275340A1/en active Pending
- 2022-12-06 JP JP2022194566A patent/JP2023025204A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EA011953B1 (ru) * | 2004-04-27 | 2009-06-30 | Китера, Инк. | Pdx1-экспрессирующая энтодерма |
WO2009018453A1 (en) * | 2007-07-31 | 2009-02-05 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
WO2010051213A1 (en) * | 2008-10-31 | 2010-05-06 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage |
WO2011143299A2 (en) * | 2010-05-12 | 2011-11-17 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ГИЛБЕРТ С. Биология развития: В 3-х т. Т.1: Пер. с англ. - М.: Мир, 1993. - 228 с. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2668798C2 (ru) | Способы in vitro пошаговой дифференцировки полюрипотентных клеток | |
JP7278990B2 (ja) | Hb9調節物を用いたヒト胚性幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化 | |
RU2670064C2 (ru) | Дифференцировка in vitro плюрипотентных стволовых клеток в панкреатические эндодермальные клетки (пэк) и эндокринные клетки | |
RU2668814C2 (ru) | Способы продуцирования клеток дефинитивной энтодермы и панкреатической энтодермы |