RU2673946C1 - Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток - Google Patents
Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток Download PDFInfo
- Publication number
- RU2673946C1 RU2673946C1 RU2016135361A RU2016135361A RU2673946C1 RU 2673946 C1 RU2673946 C1 RU 2673946C1 RU 2016135361 A RU2016135361 A RU 2016135361A RU 2016135361 A RU2016135361 A RU 2016135361A RU 2673946 C1 RU2673946 C1 RU 2673946C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- inhibitor
- cell
- population
- pancreatic
- Prior art date
Links
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title abstract description 45
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title description 72
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 263
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 81
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 66
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 claims abstract description 37
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 36
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 22
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108010069241 Connexin 43 Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000001045 Connexin 43 Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 102100037060 Forkhead box protein D3 Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 101001029308 Homo sapiens Forkhead box protein D3 Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 101000777245 Homo sapiens Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 101000976622 Homo sapiens Zinc finger protein 42 homolog Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 108010090306 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000013013 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 102100031278 Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 102100023550 Zinc finger protein 42 homolog Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 101100369076 Mus musculus Tdgf1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 32
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 28
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 claims description 21
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 19
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 19
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 claims description 18
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 claims description 18
- -1 CONNEX IN45 Proteins 0.000 claims description 15
- 102100038553 Neurogenin-3 Human genes 0.000 claims description 14
- 101000603702 Homo sapiens Neurogenin-3 Proteins 0.000 claims description 13
- 210000003577 pancreatic endocrine progenitor Anatomy 0.000 claims description 12
- CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 4-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]-3-pyrazolo[1,5-a]pyrimidinyl]quinoline Chemical group C1CNCCN1C1=CC=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C3=CC=CC=C3N=CC=2)C=C1 CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 102100032063 Neurogenic differentiation factor 1 Human genes 0.000 claims description 10
- 102000001893 Bone Morphogenetic Protein Receptors Human genes 0.000 claims description 9
- 108010040422 Bone Morphogenetic Protein Receptors Proteins 0.000 claims description 9
- 108010083123 CDX2 Transcription Factor Proteins 0.000 claims description 9
- 102000006277 CDX2 Transcription Factor Human genes 0.000 claims description 9
- BERLXWPRSBJFHO-UHFFFAOYSA-N 2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-n-pyridin-4-ylpteridin-4-amine Chemical group FC1=CC=C(Cl)C=C1C1=NC(NC=2C=CN=CC=2)=C(N=CC=N2)C2=N1 BERLXWPRSBJFHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 8
- 102000052651 Pancreatic hormone Human genes 0.000 claims description 7
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 claims description 7
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 claims description 7
- 239000004025 pancreas hormone Substances 0.000 claims description 7
- 229940032957 pancreatic hormone Drugs 0.000 claims description 7
- BQJRUJTZSGYBEZ-YVQNUNKESA-N phorbol 12,13-dibutanoate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(=O)CCC)C1(C)C BQJRUJTZSGYBEZ-YVQNUNKESA-N 0.000 claims description 7
- 101800001268 Pancreatic hormone Proteins 0.000 claims description 6
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- SNFYYXUGUBUECJ-UHFFFAOYSA-N N-{4-[2-ethyl-1-(1,2,4-triazol-1-yl)butyl]phenyl}-1,3-benzothiazol-2-amine Chemical group C=1C=C(NC=2SC3=CC=CC=C3N=2)C=CC=1C(C(CC)CC)N1C=NC=N1 SNFYYXUGUBUECJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 claims description 5
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 claims description 5
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 claims description 5
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 claims description 5
- LUZOFMGZMUZSSK-LRDDRELGSA-N (-)-indolactam V Chemical compound C1[C@@H](CO)NC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C2=CC=CC3=C2C1=CN3 LUZOFMGZMUZSSK-LRDDRELGSA-N 0.000 claims description 4
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LUZOFMGZMUZSSK-UHFFFAOYSA-N Indolactam-V Natural products C1C(CO)NC(=O)C(C(C)C)N(C)C2=CC=CC3=C2C1=CN3 LUZOFMGZMUZSSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108050000588 Neurogenic differentiation factor 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 108091005735 TGF-beta receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016715 Transforming Growth Factor beta Receptors Human genes 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 claims description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000012826 P38 inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 101150075928 Pax4 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 3
- 150000004492 retinoid derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 abstract description 25
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 abstract description 9
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 abstract description 7
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 abstract description 6
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 abstract description 4
- 102100039290 Gap junction gamma-1 protein Human genes 0.000 abstract description 3
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 abstract description 3
- 108010015426 connexin 45 Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 77
- 230000009996 pancreatic endocrine effect Effects 0.000 description 28
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 101710183548 Pyridoxal 5'-phosphate synthase subunit PdxS Proteins 0.000 description 25
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 102100028096 Homeobox protein Nkx-6.2 Human genes 0.000 description 16
- 101000578254 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-6.1 Proteins 0.000 description 16
- 101000578258 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-6.2 Proteins 0.000 description 16
- 102100041030 Pancreas/duodenum homeobox protein 1 Human genes 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 13
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 13
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 13
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 13
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 12
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 10
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 10
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 10
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 8
- FOORCIAZMIWALX-ULJHMMPZSA-N (z)-n-(4-benzylpiperazin-1-yl)-1-(3,5-dimethyl-1-phenylpyrazol-4-yl)methanimine Chemical compound CC1=NN(C=2C=CC=CC=2)C(C)=C1\C=N/N(CC1)CCN1CC1=CC=CC=C1 FOORCIAZMIWALX-ULJHMMPZSA-N 0.000 description 7
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 7
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 7
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 7
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 7
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 7
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 7
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 6
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 6
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 6
- 101150079937 NEUROD1 gene Proteins 0.000 description 6
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 6
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 description 6
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 6
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 6
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 5
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 5
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 5
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 5
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 5
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 5
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 5
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 5
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 4
- 102100029087 Hepatocyte nuclear factor 6 Human genes 0.000 description 4
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 4
- 101000988619 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 6 Proteins 0.000 description 4
- 101000819074 Homo sapiens Transcription factor GATA-4 Proteins 0.000 description 4
- 101000652324 Homo sapiens Transcription factor SOX-17 Proteins 0.000 description 4
- 102100021380 Transcription factor GATA-4 Human genes 0.000 description 4
- 102100030243 Transcription factor SOX-17 Human genes 0.000 description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 75976-10-2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)N)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 0.000 description 3
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 3
- 102000024905 CD99 Human genes 0.000 description 3
- 108060001253 CD99 Proteins 0.000 description 3
- 102100025745 Cerberus Human genes 0.000 description 3
- 101100518002 Danio rerio nkx2.2a gene Proteins 0.000 description 3
- 108700014808 Homeobox Protein Nkx-2.2 Proteins 0.000 description 3
- 102100027886 Homeobox protein Nkx-2.2 Human genes 0.000 description 3
- 101100460496 Homo sapiens NKX2-2 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000613495 Homo sapiens Paired box protein Pax-4 Proteins 0.000 description 3
- 102100026818 Inhibin beta E chain Human genes 0.000 description 3
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 102100040909 Paired box protein Pax-4 Human genes 0.000 description 3
- 102000018886 Pancreatic Polypeptide Human genes 0.000 description 3
- 101000983124 Sus scrofa Pancreatic prohormone precursor Proteins 0.000 description 3
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 3
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 3
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 3
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 3
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 3
- 230000007045 gastrulation Effects 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 125000006201 3-phenylpropyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000001255 4-fluorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C([H])=C1F 0.000 description 2
- 101000810330 Arabidopsis thaliana Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit E Proteins 0.000 description 2
- 102100036008 CD48 antigen Human genes 0.000 description 2
- 102100037986 Dickkopf-related protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 101000704130 Escherichia coli (strain K12) Signal recognition particle protein Proteins 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102100035308 Fibroblast growth factor 17 Human genes 0.000 description 2
- 102100028072 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 description 2
- 102100037680 Fibroblast growth factor 8 Human genes 0.000 description 2
- 102100039939 Growth/differentiation factor 8 Human genes 0.000 description 2
- 102100024208 Homeobox protein MIXL1 Human genes 0.000 description 2
- 102100030634 Homeobox protein OTX2 Human genes 0.000 description 2
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101000716130 Homo sapiens CD48 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000914195 Homo sapiens Cerberus Proteins 0.000 description 2
- 101000951340 Homo sapiens Dickkopf-related protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000878124 Homo sapiens Fibroblast growth factor 17 Proteins 0.000 description 2
- 101001060274 Homo sapiens Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 2
- 101001027382 Homo sapiens Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 2
- 101001052462 Homo sapiens Homeobox protein MIXL1 Proteins 0.000 description 2
- 101000584400 Homo sapiens Homeobox protein OTX2 Proteins 0.000 description 2
- 101001053263 Homo sapiens Insulin gene enhancer protein ISL-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000576323 Homo sapiens Motor neuron and pancreas homeobox protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000738523 Homo sapiens Pancreas transcription factor 1 subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 101001069749 Homo sapiens Prospero homeobox protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 description 2
- 102100024392 Insulin gene enhancer protein ISL-1 Human genes 0.000 description 2
- 102100025170 Motor neuron and pancreas homeobox protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 101000720386 Mus musculus Acyl-coenzyme A thioesterase 9, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 108010056852 Myostatin Proteins 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000741177 Oat chlorotic stunt virus (isolate United Kingdom) Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 102100037878 Pancreas transcription factor 1 subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 102100033880 Prospero homeobox protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 2
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 2
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N (2s,4s,5r,6r)-5-acetamido-2-{[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-{[(2r,3r,4r,5r)-5-acetamido-1,2-dihydroxy-6-oxo-4-{[(2s,3s,4r,5s,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy}hexan-3-yl]oxy}-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-4-hydroxy-6-[(1r,2r)-1,2,3-trihydrox Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]([C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N 0.000 description 1
- 125000003626 1,2,4-triazol-1-yl group Chemical group [*]N1N=C([H])N=C1[H] 0.000 description 1
- QSUSKMBNZQHHPA-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(4-fluorophenyl)-1-(3-phenylpropyl)-5-pyridin-4-ylimidazol-2-yl]but-3-yn-1-ol Chemical compound C=1C=CC=CC=1CCCN1C(C#CCCO)=NC(C=2C=CC(F)=CC=2)=C1C1=CC=NC=C1 QSUSKMBNZQHHPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 241000202252 Cerberus Species 0.000 description 1
- 101710010675 Cerberus Proteins 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000011108 Cytochrome P450 Family 26 Human genes 0.000 description 1
- 108010037848 Cytochrome P450 Family 26 Proteins 0.000 description 1
- 101000923091 Danio rerio Aristaless-related homeobox protein Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100028412 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 description 1
- 108090001047 Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000012004 Ghrelin Human genes 0.000 description 1
- 101800001586 Ghrelin Proteins 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 102100036646 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit A, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 description 1
- 102100038104 Glycogen synthase kinase-3 beta Human genes 0.000 description 1
- 108700031316 Goosecoid Proteins 0.000 description 1
- 102000050057 Goosecoid Human genes 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100022054 Hepatocyte nuclear factor 4-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108700005087 Homeobox Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100031470 Homeobox protein ARX Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001072655 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit A, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101001045751 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001045740 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 4-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000923090 Homo sapiens Homeobox protein ARX Proteins 0.000 description 1
- 101000971533 Homo sapiens Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000835745 Homo sapiens Teratocarcinoma-derived growth factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000819088 Homo sapiens Transcription factor GATA-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000979205 Homo sapiens Transcription factor MafA Proteins 0.000 description 1
- 101000979190 Homo sapiens Transcription factor MafB Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101710096141 Neurogenin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101100519293 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pdx-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037369 Nidogen-1 Human genes 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 101150092239 OTX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007354 PAX6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010032788 PAX6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 101150081664 PAX6 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037506 Paired box protein Pax-6 Human genes 0.000 description 1
- 101710144033 Pancreas/duodenum homeobox protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108700020479 Pancreatic hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026404 Teratocarcinoma-derived growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102100021382 Transcription factor GATA-6 Human genes 0.000 description 1
- 102100023237 Transcription factor MafA Human genes 0.000 description 1
- 102100023234 Transcription factor MafB Human genes 0.000 description 1
- 102000011117 Transforming Growth Factor beta2 Human genes 0.000 description 1
- 101800000304 Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000012790 adhesive layer Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000002876 beta blocker Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 210000000646 extraembryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N ghrelin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)COC(=O)CCCCCCC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000002660 insulin-secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- OGQSCIYDJSNCMY-UHFFFAOYSA-H iron(3+);methyl-dioxido-oxo-$l^{5}-arsane Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].C[As]([O-])([O-])=O.C[As]([O-])([O-])=O.C[As]([O-])([O-])=O OGQSCIYDJSNCMY-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 108010008217 nidogen Proteins 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002935 phosphatidylinositol 3 kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940043441 phosphoinositide 3-kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000920 spermatogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 1
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0613—Cells from endocrine organs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
- C12N5/0678—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области клеточной биологии, а именно к дифференцировке популяции клеток заднего сегмента передней кишки в популяцию клеток-предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы. Способ включает культивирование популяции клеток заднего сегмента передней кишки, полученных из линий эмбриональных стволовых клеток человека Н1, Н7, Н9 или SA002 или из неэмбриональных клеток, экспрессирующих по меньшей мере один из следующих маркеров: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, HTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81, в средах DMEM или MCDB-131, содержащих высокую концентрацию глюкозы, дополненной ингибитором CYP26A. Изобретение позволяет повысить эффективность дифференцирования клеток заднего сегмента передней кишки в клетки-предшественники эндокринных клеток поджелудочной железы. 22 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка притязает на приоритет предварительной патентной заявки серийный номер 61/378480, поданной 31 августа 2010 г, которая включена в настоящий документ посредством ссылки.
Область применения изобретения
В данном изобретении описываются способы содействия дифференциации плюрипотентных стволовых клеток в клетки, вырабатывающие инсулин. В частности, настоящее изобретение представляет способ использования агента, разрушающего ретиноевую кислоту, для получения популяции клеток-предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1 типа и нехватка островков Лангерганса для трансплантации заставили обратить внимание на разработку источников инсулин-продуцирующих клеток, или β-клеток, подходящих для трансплантации. Одним из подходов является формирование функциональных β-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.
При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентные клетки дают начало группе клеток, формирующих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и эндодерму) в ходе процесса, именуемого гаструляцией. Такие ткани, как, например, щитовидная железа, тимус, поджелудочная железа, кишечник и печень, будут развиваться из эндодермы через промежуточную стадию. Промежуточной стадией данного процесса является образование сформированной эндодермы. Клетки сформированной эндодермы экспрессируют ряд маркеров, как например, HNF3 beta, GATA4, MIXL1, CXCR4 и SOX17.
Формирование поджелудочной железы происходит при дифференцировании сформированной эндодермы в панкреатическую эндодерму. Клетки панкреатической эндодермы экспрессируют ген панкреатическо-дуоденального гомеобокса, Pdx1. При отсутствии Pdx1 развитие поджелудочной железы не идет дальше формирования вентрального и дорзального зачатков. Таким образом, экспрессия PDX1 характеризует критическую стадию органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит, помимо других типов клеток, экзокринную ткань и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются при дифференцировании панкреатической эндодермы.
Развитие клеток поджелудочной железы in vivo по меньшей мере частично зависит от надлежащей регуляции сигналов, определяющих расположение клеток-предшественников органа. Kinkel et al (PNAS May 12, 2009 vol. 106 no. 19 7864-7869) утверждают: “Путь развития клеток поджелудочной железы определяется ретиноевой кислотой (РК), а соответствующий размер и локализация ткани поджелудочной железы зависит от строгого контроля сигнальных путей с участием ретиноевой кислоты. Здесь мы показали, что ферменты Cyp26, разрушающие РК, играют решающую роль в развитии поджелудочной железы с нормальной передней границей”.
По имеющимся данным, клетки, обладающие свойствами островковых клеток, были получены из эмбриональных клеток мыши. Например, Lumelsky et al. описывает дифференцирование мышиных эмбриональных стволовых клеток в инсулин-секретирующие структуры, аналогичные островкам поджелудочной железы. Soria et al. (Diabetes 49:157, 2000) описывают инсулин-секретирующие клетки, производные мышиных эмбриональных стволовых клеток, которые нормализуют гликемию у мышей с диабетом, индуцированным стрептозотоцином.
В одном примере, Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002) описывают, что обработка мышиных эмбриональных стволовых клеток ингибиторами фосфоинозитид-3-киназы (LY294002) приводила к получению клеток, подобных β-клеткам.
в другом примере, Blyszczuk et al. (PNAS 100:998, 2003) сообщают о получении инсулин-продуцирующих клеток из мышиных эмбриональных стволовых клеток с конститутивной экспрессией Pax4.
В публикации Micallef et al. сообщается, что ретиноевая кислота может регулировать способность эмбриональных стволовых клеток формировать Pdx1-положительную панкреатическую эндодерму. Ретиноевая кислота с наибольшей эффективностью индуцирует экспрессию Pdx1 при добавлении в культуру на 4 день дифференцирования эмбриональных стволовых клеток в течение периода, соответствующего концу гаструляции эмбриона (Diabetes 54:301, 2005).
В публикации Miyazaki et al. сообщается о линии мышиных эмбриональных стволовых клеток со сверхэкспрессией Pdx1. Результаты показывают, что экспрессия экзогенного Pdx1 очевидно повышает экспрессию генов инсулина, соматостатина, глюкокиназы, нейрогенина 3, p48, Pax6 и HNF6 в образующихся дифференцированных клетках (Diabetes 53: 1030, 2004).
В публикации Skoudy et al. сообщается, что активин A (входящий в суперсемейство TGF-β) повышает экспрессию экзокринных панкреатических генов (p48 и амилаза) и эндокринных генов (Pdx1, инсулин и глюкагон) в эмбриональных стволовых клетках мыши. Максимальный эффект наблюдался при использовании 1 нмоль/л активина A. Кроме того, авторы отметили, что экспрессия инсулина и Pdx1 мРНК не изменялась под действием ретиноевой кислоты; однако лечение с использованием 3nM FGF7 привело к повышению уровня транскрипта для Pdx1 (Biochem. J. 379: 749, 2004).
В работе Shiraki et al. изучались эффекты факторов роста, специфически ускоряющих дифференцирование эмбриональных стволовых клеток в Pdx1-положительные клетки. Эти авторы наблюдали, что TGF-β2 приводил к воспроизводимому увеличению доли Pdx1-положительных клеток (Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16.).
В работе Gordon et al. показана индукция образования брахиурических [положительных]/HNF3 бета [положительных] эндодермальных клеток из эмбриональных стволовых клеток мыши в отсутствие сыворотки и в присутствии активина в сочетании с ингибитором сигнального каскада Wnt (патент США № 2006/0003446A1).
Gordon et al. (PNAS, т. 103, с. 16806, 2006) утверждают: «Для образования передней первичной полоски одновременно требовались сигнальные пути Wnt и TGF-бета/nodal/активин».
Однако модель развития эмбриональных стволовых клеток на мышах может не имитировать в точности программу развития у высших млекопитающих, например, у человека.
В работе Thomson et al. эмбриональные стволовые клетки выделяли из человеческих бластоцист (Science 282:114, 1998). Параллельно, Gearhart и соавторы получили клеточные линии эмбриональных зародышевых клеток человека (hEG) из ткани половых желез эмбриона (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). В отличие от эмбриональных стволовых клеток мыши, воспрепятствовать дифференцированию которых можно путем простого культивирования с фактором, ингибирующим лейкемию (LIF), эмбриональные стволовые клетки человека необходимо культивировать в крайне специфических условиях (патент США № 6200806; WO 99/20741, WO 01/51616).
D’Amour et al. описывают производство обогащенных культур сформированной эндодермы, производной от человеческих эмбриональных стволовых клеток, в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology 2005). Трансплантация этих клеток под почечную капсулу мышей привела к их дифференцированию в более зрелые клетки, обладающие характерными особенностями некоторых эндодермальных органов. Клетки сформированной эндодермы, производные от эмбриональных стволовых клеток человека, могут подвергаться дальнейшему дифференцированию в Pdx1-положительные клетки после добавления FGF-10 (US 2005/0266554A1).
D’Amour et al. (Nature Biotechnology-24, 1392-1401 (2006)) утверждают: “Мы разработали процесс дифференцировки, преобразующий эмбриональные клетки человека (hES) в эндокринные клетки, способные синтезировать гормоны поджелудочной железы: инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид и грелин. Данный процесс имитирует органогенез поджелудочной железы in vivo, проводя клетки через фазы, напоминающие образование сформированной эндодермы, эндодермы кишечной трубки, панкреатической эндодермы и превращение предшественников эндокринных клеток в клетки, экспрессирующие эндокринные гормоны”.
В другом примере, в публикации Fisk et al., сообщается о системе для производства островковых клеток поджелудочной железы из эмбриональных стволовых клеток человека (US2006/0040387A1). В данном случае процесс дифференцирования был разделен на три стадии. Человеческие эмбриональные стволовые клетки были впервые дифференцированы до эндодермы с помощью сочетания бутирата натрия и активина A. Затем клетки культивировали с антагонистами ФНО-β, например, Noggin, в сочетании с EGF или бетацеллюлином для получения PDX1-положительных клеток. Окончательное дифференцирование запускалось никотинамидом.
Таким образом, сохраняется значительная потребность в разработке лабораторных способов создания in vitro функциональной экспрессирующей инсулин клетки, которая была бы более близка к β-клетке. Настоящее изобретение представляет собой альтернативный подход к повышению эффективности дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие инсулин, основанный на получении клеток-предшественников поджелудочной железы с помощью агента, разрушающего ретиноевую кислоту.
Краткое описание
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ использования агента, разрушающего ретиноевую кислоту, для получения популяции клеток-предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы.
В одном варианте осуществления формирование популяции клеток-предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы достигается путем использования пошагового протокола дифференцирования, при этом популяция плюрипотентных стволовых клеток сначала дифференцируется в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы. Далее, популяция клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, дифференцируется в популяцию клеток первичной кишечной трубки. Далее, популяция клеток первичной кишечной трубки дифференцируется в популяцию клеток заднего сегмента передней кишки. Затем популяция клеток заднего сегмента передней кишки дифференцируется в популяцию предшественников эндокринных клеток путем культивирования в среде с добавлением агента, расщепляющего ретиноевую кислоту.
В одном варианте осуществления изобретения популяция предшественников эндокринных клеток далее дифференцируется в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 показаны результаты анализа методом ПЦР в реальном времени образцов клеток на стадиях III-IV протокола, описанного в Примере 1, на a) PAX4, b) NGN3, c) PDX1, d) NEUROD, e) NKX6.1, f) CDX2 и g) альбумин. Ось у - кратность повышения по сравнению с недифференцированными Н1-клетками. На панели показан результат иммунологического окрашивания NGN3 контроля и культур с добавлением CYP26A на стадии IV.
На фиг. 2 показаны результаты анализа методом ПЦР в реальном времени образцов клеток на стадиях III-IV протокола, описанного в Примере 2, на a) NGN3, b) NEUROD, c) CDX2, d) NKX6.1 и e) PDX1. Ось у - кратность повышения по сравнению с недифференцированными Н1-клетками.
На фиг. 3 показаны фазово-контрастные изображения клеток на стадиях I-VI протокола, описанного в Примере 3.
На фиг. 4 показаны графики экспрессии NKX6.1 в клетках на стадиях IV-VII протокола, описанного в Примере 3, по результатам флуоресцентной проточной цитометрии.
На фиг. 5 показаны результаты иммунохимического окрашивания на PDX1, NKX6.1 и CDX2 в клетках на стадиях V и VII протокола, описанного в Примере 3.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для ясности описания, а не для ограничения изобретения, подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.
Определения
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцирования из нескольких зародышевых листков (эндодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от нескольких зародышевых листков, и вносить существенный вклад в формирование большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.
Стволовые клетки классифицируют по потенциалу развития: (1) тотипотентные, то есть способные преобразоваться в любой из эмбриональных и внеэмбриональных типов клеток; (2) плюрипотентные, то есть способные преобразоваться во все типы эмбриональных клеток; (3) мультипотентные, то есть способные преобразоваться во множество клеточных линий, но в рамках одной ткани, органа или физиологической системы (например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) могут порождать ГСК (самообновление), олигопотентные ограниченные клетки-предшественники крови и все типы клеток и элементов (например, тромбоциты), являющиеся стандартными составляющими крови); (4) олигопотентные, то есть способные преобразоваться в более ограниченное подмножество клеточных линий, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, то есть способные преобразоваться в единственную клеточную линию (например, сперматогенные стволовые клетки).
Дифференцирование представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например, нервной или мышечной клетки. Дифференцированная клетка или клетка с индуцированным дифференцированием представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцирования клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцирования обозначает клетку, дошедшую в ходе процесса дифференцирования до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного типа клеток или набора типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному типу. Дедифференцированием называется процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в линии дифференцирования. Используемый в настоящей заявке термин «линия дифференцирования клетки» определяет наследственность клетки, то есть определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В линии дифференцирования клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцирования. Маркером, специфичным для линии дифференцирования, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцирования, которая может использоваться для оценки дифференцирования некоммитированных клеток в клетки данной линии дифференцирования.
Используемые в настоящей заявке термины «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы», «клетки стадии 1» или «стадия 1», относятся к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 или OTX2. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, относятся клетки-предшественники первичной полоски, клетки первичной полоски, клетки мезэндодермы и клетки сформированной эндодермы.
Используемый в настоящей заявке термин «клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы» относится к клеткам с экспрессией по меньшей мере одного из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF1-бета, PTF1-альфа, HNF6, HNF4-альфа, SOX9, HB9 или PROX1. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, относятся клетки панкреатической эндодермы, клетки первичной кишечной трубки и клетки поздней передней кишки.
Используемый в настоящей заявке термин «сформированная эндодерма» относится к клеткам, обладающим характерными особенностями клеток, происходящих в ходе гаструляции от эпибласта, и формирующим желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки сформированной эндодермы экспрессируют следующие маркеры: HNF3-бета, GATA4, SOX17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 и MIXL1.
Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из множества известных в данной области способов.
Используемый в настоящей заявке термин “клетка-предшественник эндокринной клетки поджелудочной железы” относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: NGN3, NEUROD или NKX2.2.
Используемый в настоящей заявке термин “клетка заднего сегмента передней кишки” относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1 или HNF6.
Термин “Незрелые клетки поджелудочной железы, экспрессирующие гормоны” в настоящей заявке относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: инсулин, глюкагон, соматостатин, MAFB, PDX1, ARX, NKX6.1, NKX2.2 или NEUROD.
Используемый в настоящей заявке термин "клетка первичной кишечной трубки” относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: HNF1-бета или HNF4-альфа.
«Панкреатической эндокринной клеткой», «клеткой, экспрессирующей гормон поджелудочной железы» или «клеткой, экспрессирующей характеристики эндокринной линии поджелудочной железы» в настоящем документе называется клетка, способная экспрессировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.
Выделение, размножение и культивирование полипотентных стволовых клеток
Характеристика плюрипотентных стволовых клеток
Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или более стадийно-специфичных эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые антителами, обозначенными как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к потере экспрессии SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81 (при наличии) и к повышению экспрессии SSEA-1. В недифференцированных полипотентных стволовых клетках, как правило, активна щелочная фосфатаза, которая может быть обнаружена путем фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида, с последующим обнаружением с помощью Vector Red, применяемого в качестве субстрата, в соответствии с инструкциями производителя (Vector Laboratories, Burlingame Calif.). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, определяемые с помощью ПЦР в реальном времени.
Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных стволовых клеток является потенциал дифференцирования в клетки всех трех зародышевых листков: в эндодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Полипотентность полипотентных стволовых клеток может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида, и их гистологического исследования для получения доказательств наличия клеточных типов, происходящих от трех зародышевых листков. В качестве альтернативы плюрипотентность можно определить по созданию эмбриоидных телец и анализа их на предмет присутствия маркеров, ассоциирующихся с тремя зародышевыми листками.
Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток могут быть кариотипированы с применением стандартного способа окрашивания с использованием красителя Гимза (G-banding) и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», т.е. эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений.
Источники плюрипотентных стволовых клеток
К типам плюрипотентных стволовых клеток, которые можно использовать, относятся устойчивые линии плюрипотентных клеток, получаемые из формируемой после вынашивания плода ткани, в том числе из преэмбриональной ткани (такой как бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент в ходе вынашивания, как правило, но не обязательно, до срока приблизительно 10-12 недель беременности. Примерами, не ограничивающими настоящее изобретение, являются стабильные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток или человеческих эмбриональных зародышевых клеток, например, клеточные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, H7 и H9 (WiCell). Также возможно использование описываемых в настоящей заявке составов в ходе первоначального установления или стабилизации таких клеток, в этом случае исходными клетками являются первичные плюрипотентные клетки, взятые напрямую из тканей-источников. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки мутантных линий эмбриональных стволовых клеток человека, таких как, например, BG01v (BresaGen, Атенс, Джорджия, США).
В одном варианте осуществления получение человеческих эмбриональных стволовых клеток было описано Thomson et al. в патенте США № 5843780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995).
Культивирование плюрипотентных стволовых клеток
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки культивируют на питающем слое клеток, которые поддерживают плюрипотентные стволовые клетки в различных отношениях. Как вариант, полипотентные стволовые клетки культивируются в культуральной системе, по существу не содержащей питающих клеток, но, тем не менее, поддерживающей пролиферацию полипотентных стволовых клеток и не допускающей существенной дифференцировки. Рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды, кондиционированной посредством предварительного культивирования клеток иного типа. В качестве альтернативы рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды с химически определенным составом.
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое эмбриональных фибробластов мыши в соответствии со способами, изложенными в работе Reubinoff et al (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое эмбриональных фибробластов мыши в соответствии со способами, изложенными в работе Thompson et al (Science 6, ноябрь 1998 г: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145-1147). В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на любом из питающих слоев клеток, описанных в работе Richards et al, (Stem Cells 21: 546-556, 2003).
В одном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое клеток человека в соответствии со способами, изложенными в работе Wang et al (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005). В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое клеток человека, описанных в работе Stojkovic et al (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005). В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое клеток человека, описанных в работе Miyamoto et al (Stem Cells 22: 433-440, 2004). В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое клеток человека, описанных в работе Amit et al (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003). В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое клеток человека, описанных в работе Inzunza et al (Stem Cells 23: 544-549, 2005).
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20020072117. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 6642048. В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в международной заявке WO2005014799. В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в работе Xu et al (Stem Cells 22: 972-980, 2004). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20070010011. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050233446. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 6800480. В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, описанными в международной заявке WO2005065354.
В одном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать по методам, описанным Cheon et al (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005). В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в работе Levenstein et al (Stem Cells 24: 568-574, 2006). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050148070. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050244962. В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, описанными в международной заявке WO2005086845.
Плюрипотентные стволовые клетки могут быть высеяны на соответствующий культуральный субстрат. В одном из вариантов осуществления соответствующим культуральным субстратом является компонент внеклеточного матрикса, такой как, например, компонент, полученный из базальной мембраны, или компонент, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с участием молекулы адгезивного слоя. В одном из вариантов осуществления подходящим культуральным субстратом является МАТРИГЕЛЬ® (Becton Dickenson). МАТРИГЕЛЬ® представляет собой растворимый препарат из клеток опухоли Энгельбрета-Холма-Суорма, который при комнатной температуре превращается в гель и образует восстановленную базальную мембрану.
В качестве альтернативы можно использовать другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. В зависимости от типа пролиферирующих клеток, это может быть ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.п., по отдельности или в различных сочетаниях.
Плюрипотентные стволовые клетки могут высеиваться на субстрат с соответствующим распределением по поверхности и в присутствии среды, поддерживающей выживание, размножение и сохранение требуемых характеристик клеток. Все эти характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению клеток при посеве и могут быть определены специалистом в данной области.
Подходящая культуральная среда может быть изготовлена, например, из следующих компонентов модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), Gibco № 11965-092, нокаутная модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (KO DMEM), Gibco № 10829-018, базовая среда Хэма F12/50% DMEM, 200 ммоль/л L-глутамина, Gibco № 15039-027; раствор неосновных аминокислот, Gibco 11140-050; β-меркаптоэтанол, Sigma № M7522; человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF), Gibco № 13256-029.
Образование клеток-предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы из плюрипотентных стволовых клеток
Настоящее изобретение представляет способы получения популяции клеток-предшественников клеток поджелудочной железы из популяции плюрипотентных стволовых клеток. В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способы дальнейшей дифференциации клеток-предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы в клетки, экспрессирующие маркеры линии эндокринных клеток поджелудочной железы.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается способ получения клеток-предшественников панкреатических эндокринных клеток, включающий следующие этапы:
a. Культивирование популяции плюрипотентных стволовых клеток;
b. Дифференцирование популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы;
с. Диференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в популяцию клеток первичной кишечной трубки;
D. Дифференцирование популяции клеток первичной кишечной трубки в популяцию клеток заднего сегмента передней кишки; и
E. Дифференцирование популяции клеток заднего сегмента передней кишки в популяцию предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы путем использования среды с добавлением агента, расщепляющего ретиноевую кислоту.
Популяция предшественников эндокринных клеток может подвергаться дальнейшей обработке для получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы.
Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессируемый клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для желательного вида клеток.
Способы оценки экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. Сюда относятся количественная ревертазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Нозерн-блот, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001, доп.)), а также способы иммунологического анализа, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для маркеров, доступных в интактных клетках, - способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. К маркерам плюрипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или нескольких следующих маркеров: ABCG2, CRIPTO, FOXD3, Connexin43, Connexin45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.
После обработки плюрипотентных стволовых клеток с применением способов, составляющих предмет настоящего изобретения, дифференцированные клетки могут быть выделены путем воздействия на популяцию клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, например CXCR4, экспрессируемый клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.
К плюрипотентным стволовым клеткам, которые могут использоваться в настоящем изобретении, относятся, например, человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H9 (код NIH: WA09), человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1 (код NIH: WA01), человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H7 (код NIH: WA07) и человеческие эмбриональные стволовые клетки линии SA002 (Cellartis, Швеция). Также для использования в рамках настоящего изобретения подходят клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81.
Маркеры характерные для сформированной линии эндодермы выбираются из группы, содержащей SOX17, GATA4, HNF3-бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок, FGF4, CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и Otx2. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая, как минимум, один из маркеров, характерных для линии сформированной эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку-предшественника первичной полоски. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой мезэндодермальную клетку. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку сформированной эндодермы.
Маркеры, характерные для линии эндодермы поджелудочной железы (включающей клетки первичной кишечной трубки и клетки задней части передней кишки), выбираются из группы, состоящей из: PDX1, NKX6.1, HNF1-бета, PTF1-альфа, HNF6, HNF4-альфа, SOX9, HB9 и PROX1. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая, как минимум, один из маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, представляет собой клетку панкреатической эндодермы.
Маркеры, характерные для линии дифференцирования панкреатических эндокринных клеток, выбирают из группы, состоящей из следующих маркеров: NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, NGN3 и PTF-1-альфа. В одном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка способна к экспрессии по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид. Соответствующей целям настоящего изобретения является клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. Панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, экспрессирующую гормоны. В альтернативном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, секретирующую гормоны.
В одном аспекте настоящего изобретения панкреатическая эндокринная клетка представляет собой клетку с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования β-клеток. Клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии β-клеток, экспрессирует PDX1 и по меньшей мере один из следующих транскрипционных факторов: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3-бета, MAFA, PAX4 и PAX6. В одном аспекте настоящего изобретения клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования β-клеток, представляет собой β-клетку.
Формирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, из плюрипотентных стволовых клеток
Популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной панкреатической эндодермы, могут быть получены из популяций плюрипотентных стволовых клеток любыми известными способами.
Например, популяции плюрипотентных стволовых клеток могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D’Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).
Например, популяции плюрипотентных стволовых клеток могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации Shinozaki et al, Development 131, 1651-1662 (2004).
Например, популяции плюрипотентных стволовых клеток могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации McLean et al, Stem Cells 25, 29-38 (2007).
Например, популяции плюрипотентных стволовых клеток могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D’Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, популяции плюрипотентных стволовых клеток могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. № 11/736908.
Например, популяции плюрипотентных стволовых клеток могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. № 11/779311.
Например, популяции плюрипотентных стволовых клеток могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. № 12/493741.
Например, популяции плюрипотентных стволовых клеток могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. № 12/494789.
Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы
К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, относятся клетки панкреатической эндодермы, клетки первичной кишечной трубки и клетки поздней передней кишки. В одном варианте осуществления изобретения популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, которая была получена способами настоящего изобретения, далее дифференцируют в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, любым известным способом.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, полученные по способам настоящего изобретения, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, представленными в работе D’ Amour et al., Nature Biotechnology, 24, 1392-1401 (2006)
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, полученные по методам настоящего изобретения, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, представленными в заявке на патент США Сер. № 11/736908.
Формирование популяции клеток-предшественников панкреатических эндокринных клеток
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается способ получения клеток-предшественников панкреатических эндокринных клеток, включающий следующие этапы:
a. Культивирование популяции плюрипотентных стволовых клеток;
b. Дифференцирование популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы;
с. Диференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в популяцию клеток первичной кишечной трубки;
D. Дифференцирование популяции клеток первичной кишечной трубки в популяцию клеток заднего сегмента передней кишки; и
E. Дифференцирование популяции клеток заднего сегмента передней кишки в популяцию предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы путем культивирования в среде с добавлением агента, расщепляющего ретиноевую кислоту.
В одном варианте осуществления изобретения агент, расщепляющий ретиноевую кислоту, представляет собой ингибитор CYP26A. Ингибитор CYP26A может применяться в концентрации от приблизительно 1 нмоль/л до приблизительно 1000 нмоль/л. Альтернативно, ингибитор CYP26A может применяться в концентрации от приблизительно 10 нмоль/л до приблизительно 100 нмоль/л.
Для использования в настоящем изобретении подходит любой ингибитор CYP26A. Например, ингибитор CYP26A может быть выбран из соединений, описанных в заявке на патент США № 7468391. Альтернативно, ингибитор CYP26A может быть выбран из соединений, описанных в патентной заявке США № 2005/0187298A1. Альтернативно, ингибитор CYP26A может быть выбран из соединений, описанных в заявке на патент США № 2004/0106216A1. Альтернативно, ингибитор CYP26A может быть выбран из соединений, описанных в международной заявке WO2005058301A1. Альтернативно, ингибитор CYP26A может быть выбран из соединений, описанных в PNAS от 12 мая 2009 г, т. 106, № 19 7864-7869. В одном варианте осуществления ингибитор CYP26A представляет собой N-{4-[2-этил-1-(1H-1, 2, 4-триазол-1-ил)бутил]фенил}-1, 3-бензотиазол-2-амин. См. Формулу 1.
В одном варианте осуществления изобретения в среду с добавлением агента, расщепляющего ретиноевую кислоту, дополнительно добавлен по меньшей мере один фактор, выбранный из группы, состоящей из фактора, способного ингибировать BMP, ингибитора сигнального каскада рецепторов TGFβ, а также витамина А и активатора РКС.
В одном варианте фактором, способным ингибировать BMP, является Noggin. Noggin может использоваться в концентрациях от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 500 мкг/мл. В одном из вариантов осуществления Noggin используется в концентрации 100 нг/мл.
В одном из вариантов ингибитором сигнализации рецептора TGFβ является ингибитор ALK5. В одном из вариантов ингибитором ALK5 является ингибитор ALK5 II. Ингибитор ALK5 II может применяться в концентрации от приблизительно 0,1 мкмоль/л до приблизительно 10 мкмоль/л. В одном варианте осуществления ингибитор ALK5 II применяется в концентрации 1 мкмоль/л.
В одном варианте осуществления активатор протеинкиназы С (РКС) выбран из группы, состоящей из (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактама, индолактама V (ILV), форбол-12-миристат-13-ацетата (PMA) и форбол-12,13-дибутирата (PDBu). В одном из вариантов активатором протеинкиназы С является (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил) -2,4-пентадиемоиламин)бензолактам. (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил) -2,4-пентадиемоиламин)бензолактам может использоваться в концентрации приблизительно от 20 нм до 500 нм. (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(Трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактам в настоящем документе называется «TPB».
Создание клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток
В одном варианте осуществления популяция клеток-предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы, полученная методами настоящего изобретения, далее дифференцируется в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндокринных клеток поджелудочной железы, любым известным способом.
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, представленными в работе D’Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, представленными в работе D’Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут далее дифференцироваться в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных панкреатических клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США Сер. № 11/736908.
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут далее дифференцироваться в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных панкреатических клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США Сер. № 11/779311.
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут далее дифференцироваться в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных панкреатических клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США Сер. № 60/953178.
Например, популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут далее дифференцироваться в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных панкреатических клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США Сер. № 60/990529.
Настоящее изобретение далее иллюстрируется, помимо прочих, следующими примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Дифференциация клеток человеческой эмбриональной линии H1 в клетки-предшественники эндокринных клеток поджелудочной железы в культуральной среде без ФБС и с добавлением ингибитора CYP26A
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 (p40-p50) культивировали на чашках, покрытых субстратом МАТРИГЕЛЬ® (разведение 1:30) (BD Biosciences; Кат. № 356231) в среде MEF-CM (среда, кондиционированная мышиными эмбриональными фибробластами) в виде колоний, и дифференцировали в клетки-предшественники эндокринных клеток поджелудочной железы следующим образом:
a. Стадия I (сформированная эндодерма): Человеческие эмбриональные стволовые клетки культивировали в среде RPMI с добавлением 2% БСА без жирных кислот (кат. № 68700, Proliant, Огайо, США), 100 нг/мл активина A (R&D Systems, Миннесота, США, 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, Миннесота, США) и 8 нг/мл bFGF (№ по каталогу 00-18B, PeproTech, Нью-Джерси, США) в течение суток, затем использовали среду RPMI с добавлением 2% БСА, 100 нг/мл активина A, 8 нг/мл bFGF в течение еще двух суток; затем
b. Стадия II (клетки первичной кишечной трубки): Клетки культивировали в RPMI + 2% БСА без жирных кислот и 50 нг/мл FGF7 в течение 2 суток, затем
с. Стадия III (задний отдел передней кишки): Клетки помещали в среду DMEM/с высокой концентрацией глюкозы с добавлением ITS-X в разведении 1:200 (Invitrogen, Калифорния), 0,1% БСА (богатого липидами) (Invitrogen, кат. № 11021-045), 50 нг/мл FGF7, 0,25 мкM SANT-1, 2 мкмоль/л ретиноевой кислоты (РК) (Sigma, Миссури),100 нг/мл белка Noggin (R&D Systems, Миннесота), 2,5 мкмоль/л 4-[4-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-5-пиридин-4-ил-1H-имидазол-2-ил]бут-3-ин-1-ола (ингибитор P38, описанный в патенте США № 6521655) и активина A 20 нг/мл на пять суток, затем
D. Стадия IV (предшественник эндокринных клеток поджелудочной железы): Клетки помещали в среду DMEM/высокую концентрацию глюкозы с добавлением ITS-X в разведении ITS-X (Invitrogen, Калифорния), 0,1% БСА (Invitrogen, Калифорния), 100 нг/мл белка Noggin, 1 мкмоль/л ингибитора ALK5(SD-208, описанного в Molecular Pharmacology 2007 72:152-161), 500 нмоль/л TPB (модулятор белка-предшественника α-амилоида) (Кат. № 565740, EMD, Калифорния), 10-100 нмоль/л ингибитора CYP26A N-{4-[2-этил-1-(1H-1, 2, 4-триазол-1-ил)бутил]фенил}-1, 3-бензотиазол-2-амина и 10-100 нмоль/л витамина А (Кат. № R7632, Sigma, Миссури) в течение 4 суток, или
В некоторых культурах стадию IV продлевали до 6 суток. мРНК выделяли на стадиях III и IV для анализа генов панкреатических клеток методом ПЦР в реальном времени. Как показано на фиг. 1, добавление ингибитора CYP26A на стадии IV значительно усиливало экспрессию предшественников эндокринных клеток (NGN3, Pax4, NeuroD) вместе с маркером панкреатической эндодермы NKX6.1 в зависимости от дозы. Добавление витамина А вместе с ингибитором CYP26A значительно не изменяло экспрессию маркеров панкреатической эндодермы или предшественников эндокринных клеток. Кроме того, добавление ингибитора CYP26A на стадии IV уменьшало экспрессию CDX2 (маркера кишечных клеток) и альбумина (маркера клеток печени). Иммунохимическое окрашивание на NGN3 (Кат. № AF3444, R&D systems, MN) на стадии IV очевидно показало значительное ускорение экспрессии NGN3 в культурах с добавлением 100 нмоль/л ингибитора CYP26A.
Пример 2
Альтернативный способ дифференцирования клеток человеческой эмбриональной линии стволовых клеток H1 в клетки-предшественники эндокринных клеток поджелудочной железы в питательной среде без ФБС с ингибитором CYP26A
Стволовые клетки человеческой эмбриональной линии H1 (p40-p52) высевали по отдельности из суспензии 100000 кл./см2 на чашки, покрытие субстратом МАТРИГЕЛЬ® (разведение 1:30) (BD Biosciences; Кат. № 356231) в MEF-CM (среду, кондиционированную мышиными фибробластами) с добавлением 16 нг/мл FGF2 (Кат. № 100-18B, PeproTech, Нью Джерси) и 10 мкмоль/л Y27632 (ингибитор Rock, Кат. № Y0503, Sigma, Миссури). Через 72 ч после посева культуры дифференцировали в сформированную эндодерму (СЭ) следующим образом:
a. Стадия I (сформированная эндодерма): Человеческие эмбриональные клетки культивировали на среде MCDB-131 (Кат. № 10372-019, Invitrogen, Калифорния) с добавлением 2% БСА без жирных кислот (кат. № 68700, Proliant, Айова), 0,0025 г/мл бикарбоната натрия (Кат. № S3187, Sigma, Миссури), 1X ГлутаМакса™ (кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния) и 100 нг/мл активина A (R&D Systems, MN) + 20 нг/мл WNT-3a (кат. № 1324-WN-002, R&D Systems, MN) в течение суток, затем использовали среду MCDB-131 с добавлением 2% БСА, натрия бикарбоната, Глутамакса и 100 нг/мл активина A каждый день в течение последующих трех суток, затем
b. Стадия II (клетки первичной кишечной трубки): Клетки культивировали на среде MCDB-131 + 2% БСА без жирных кислот + 50 нг/мл FGF7 в течение 3 суток, затем
с. Стадия III (задний отдел передней кишки): Клетки культивировали в среде MCDB-131/высокой концентрации глюкозы (25 ммоль/л глюкозы) с добавлением ITS-X в разведении 1:200 Invitrogen, Калифорния), 1X ГлутаМакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (Кат. № S3187, Sigma, Миссури), 0,1% БСА (богатого липидами) (Invitrogen, Калифорния № 11021-045), 50 нг/мл FGF7, 0,25 мкмоль/л SANT-1, 2 мкмоль/л ретиноевой кислоты (РК) (Sigma, Миссури), 2,5 мкмоль/л 4-[4-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-5-пиридин-4-ил-1H-имидазол-2-ил]бут-3-ин-1-ол (ингибитор p38, описанный в патенте США № 6521655), 100 нмоль/л LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP, Кат. № 04-0019, Stemgent, Калифорния), 500 нмоль/л ингибитора CYP26A N-{4-[2-этил-1-(1H-1, 2, 4-триазол-1-ил)бутил]фенил}-1, 3-бензотиазол-2-амин и активин A 20 нг/мл в течение четырех суток, затем
D. Стадия IV (предшественник эндокринных клеток поджелудочной железы): Клетки культивировали в среде MCDB-131/высокой концентрации глюкозы (25 ммоль/л глюкозы) с добавлением ITS-X в разведении 1:200 Invitrogen, Калифорния), 1X ГлутаМакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (Кат. № S3187, Sigma, Миссури) Sigma Миссури, 1 мкмоль/л ингибитора ALK5 (SD-208, описан в Molecular Pharmacology 2007 72:152-161), 500 нмоль/л PDBu (активатор PKC) (Кат. № P1269, Sigma, Миссури), 100 нмоль/л LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP, кат. № 04-0019, Stemgent, Калифорния), 0,25 мкмоль/л SANT-1 (#S4572, Sigma, Миссури) и 500 нмоль/л ингибитора CYP26A N-{4-[2-этил-1-(1H-1, 2, 4-триазол-1-ил)бутил]фенил}-1, 3-бензотиазол-2-амина в течение 7 суток, или
E. Стадия IV (предшественник эндокринных клеток поджелудочной железы): Клетки культивировали в среде MCDB-131/высокой концентрации глюкозы (25 ммоль/л глюкозы) с добавлением ITS-X в разведении 1:200 Invitrogen, Калифорния), 1X ГлутаМакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (Кат. № S3187, Sigma, Миссури), 1 мкмоль/л ингибитора ALK5 (SD-208, описан в Molecular Pharmacology 2007 72:152-161), 500 нмоль/л PDBu (активатор PKC) (Кат. № P1269, Sigma, Миссури), 100 нмоль/л LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP кат. № 04-0019, Stemgent, Калифорния), 0,25 мкмоль/л SANT-1 (#S4572, Sigma, Миссури) в течение 7 суток.
мРНК для анализа генов клеток поджелудочной железы методом ПЦР в реальном времени выделяли на стадиях III и IV. Как и в описанном выше Примере 1 добавление ингибитора CYP26A на стадии IV усиливало экспрессию маркеров предшественников эндокринных клеток, например, NGN3 и NeuroD. (См. фиг. 2). Добавление ингибитора на стадиях III и IV дополнительно усиливало экспрессию NGN3 и NeuroD. Удивительно, что добавление ингибитора CYP26A на стадии III (в присутствии ретиноевой кислоты) значительно подавляло PDX-1 и NKX6.1, усиливая экспрессию CDX2. Эти результаты позволяют предположить, что оптимальной стадией для добавления ингибитора CYP26A является стадия IV.
Пример 3
Альтернативный способ дифференцирования клеток человеческой эмбриональной линии стволовых клеток H1 в эндокринные клетки поджелудочной железы в питательной среде без ФБС с ингибитором CYP26A
Стволовые клетки человеческой эмбриональной линии H1 (p40-p52) высевали отдельными клетками из суспензии 100000 кл./см2 на чашки, покрытые субстратом МАТРИГЕЛЬ® (разведение 1:30) (BD Biosciences; Кат. № 356231), в MEF-CM (среду, кондиционированную мышиными фибробластами) с добавлением 16 нг/мл FGF2 (Кат. № 100-18B, PeproTech, NJ) и 10 мкмоль/л Y27632 (ингибитор Rock, Кат. № Y0503, Sigma, Миссури). Через 72 ч после посева культуры дифференцировали в сформированную эндодерму (СЭ) следующим образом:
a. Стадия I (сформированная эндодерма): Человеческие эмбриональные стволовые клетки высевали одиночно на чашки, покрытые субстратом МАТРИГЕЛЬ, со средой MCDB-131 (Кат. № 10372-019, Invitrogen, Калифорния) с добавлением 2% БСА без жирных кислот (Кат. № 68700, Proliant, Айова), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (Кат. № S3187, Sigma, Миссури), 1X ГлутаМакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния) и 100 нг/мл GDF-8 (R&D Systems, MN) + 2,5 мкмоль/л ингибитора GSK3B 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазотетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-она в течение суток, затем использовали среду MCDB-131 с 2% БСА, натрия бикарбонатом, Глутамаксом и 100 нг/мл GDF-8 следующие трое суток, затем
b. Стадия II (клетки первичной кишечной трубки): Клетки культивировали в среде MCDB-131+2% БСА без жирных кислот +50 нг/мл FGF7 в течение 3 суток, затем
с. Стадия III (задний отдел передней кишки): Клетки культивировали в среде MCDB131 /высокой концентрации глюкозы (25 ммоль/л глюкозы) с добавлением ITS-X в разведении 1:200 Invitrogen, Калифорния), 1X ГлутаМакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната Кат. № S3187, Sigma, Миссури), 0,1% БСА (богатого липидами) (Invitrogen, Калифорния No. 11021-045), 50 нг/мл FGF7, 0,25 мкмоль/л SANT-1, 2 мкмоль/л ретиноевой кислоты (РК) (Sigma, Миссури), 2,5 мкмоль/л 4-[4-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-5-пиридин-4-ил-1H-имидазол-2-ил]бут-3-ин-1-ола, 100 нмоль/л LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP Кат. № 04-0019, Stemgent, Калифорния) и активина A 20 нг/мл в течение четырех суток, затем
D. Стадия IV (предшественники клеток поджелудочной железы): Клетки культивировали в среде MCDB131/высокой концентрации глюкозы (25 ммоль/л глюкозы) с добавлением ITS-X в разведении 1:200 Invitrogen, Калифорния), 0,5% БСА (Invitrogen, Калифорния), 1X ГлутаМакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (Кат. № S3187, Sigma, Миссури), 100 нмоль/л LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP, кат. № 04-0019, Stemgent, Калифорния), 50 нмоль/л PDBu (активатор PKC) (кат. №P1269, Sigma, Миссури), 0,25 мкмоль/л SANT-1 (#S4572, Sigma, Миссури) и 100 нмоль/л ингибитора CYP26A N-{4-[2-этил-1-(1H-1, 2, 4-триазол-1-ил)бутил]фенил}-1, 3-бензотиазол-2-амина в течение 3 суток, затем
E. Стадия V (предшественники эндокринных клеток поджелудочной железы): Клетки культивировали в среде MCDB13/высокой концентрации глюкозы (25 ммоль/л глюкозы) с добавлением ITS-X в разведении 1:200 Invitrogen, Калифорния), 1X ГлутаМакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (Кат. № S3187, Sigma, Миссури), 100 нмоль/л LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP, кат. № 04-0019, Stemgent, Калифорния), 0,25 мкмоль/л SANT-1 (#S4572, Sigma, Миссури), 2 мкмоль/л ингибитора ALK5 (SD-208, описан в Molecular Pharmacology 2007 72:152-161) и 100 нмоль/л ингибитора CYP26A N-{4-[2-этил-1-(1H-1, 2, 4-триазол-1-ил)бутил]фенил}-1, 3-бензотиазол-2-амина в течение 3 суток, затем F. Стадия VI (незрелые клетки поджелудочной железы, экспрессирующие гормоны): Клетки культивировали в среде MCDB131/высокой концентрации глюкозы (25 ммоль/л глюкозы) с добавлением ITS-X в разведении 1:200 Invitrogen, Калифорния), 0,1% БСА (Invitrogen, Калифорния), 1X ГлутаМакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (Кат. № S3187, Sigma, Миссури) 100 нмоль/л LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP, Кат. № 04-0019, Stemgent, Калифорния) и 2 мкмоль/л ингибитора ALK5 (SD-208, описан в Molecular Pharmacology 2007 72:152-161) в течение 3 суток, затем
G. Стадия VII (Клетки поджелудочной железы, экспрессирующие гормоны): Клетки культивировали на среде MCDB131/высокой концентрации глюкозы (25 ммоль/л глюкозы) с добавлением ITS-X в разведении 1:200 Invitrogen, Калифорния), 0,1% БСА (Invitrogen, Калифорния), 1X ГлутаМакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (Кат. № S3187, Sigma, Миссури) 100 нмоль/л LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP Кат. № 04-0019, Stemgent, Калифорния), 2 мкмоль/л ингибитора ALK5 (SD-208, описан в Molecular Pharmacology 2007 72:152-161) и 100 нмоль/л витамина А (Кат. № R7632, Сигма, Миссури) в течение 3 суток.
В некоторых культурах стадию VII продлевали до 18 дней. На стадиях V, VI отбирали пробы для ПЦР в реальном времени, иммунофлуоресцентного анализа (ИФА) и флуоресцентной проточной цитометрии. И при проточной цитометрии, и при иммунофлуоресцентном анализе антитела к NKX6.1 получали из банка гибридом Университета Айовы (Кат. № F55A12), антитела к CDX2 приобретали в компании Abcam (Кат. № ab76541, Кембридж, Массачусетс), а антитела к PDX-1 приобретали в компании Abcam (Кат. № ab47267). На фиг. 3 показана морфология культур на разных стадиях дифференциации. После стадии II культуры имели однородную морфологию на стадиях III-VI. На фиг. 4 показана экспрессия NKX6.1 по результатам флуоресцентной проточной цитометрии на разных стадиях дифференциации. На этом чертеже подчеркивается, что протокол, описанный в Примере 3, позволяет сохранить высокую экспрессию NKX6.1 на поздних стадиях дифференциации. На фиг. 4 показаны результаты иммунофлуоресцентного окрашивания на PDX1, NKX6.1, и CDX2 на стадиях V и VII по протоколу. Более 90% NKX6.1-положительных клеток также положительны по PDX1, однако менее 10% клеток положительны по CDX2.
Публикации, цитируемые в настоящем документе, полностью включаются в настоящий документ посредством ссылки. Хотя различные аспекты изобретения иллюстрируются выше ссылками на примеры и предпочтительные варианты осуществления, подразумевается, что область изобретения ограничивается не упомянутым выше описанием, а следующими пунктами формулы изобретения, составленными в соответствии с принципами патентного законодательства.
Claims (23)
1. Способ дифференцирования популяции клеток заднего сегмента передней кишки в популяцию клеток-предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы, включающий культивирование популяции клеток заднего сегмента передней кишки в среде, дополненной ингибитором CYP26A, где клетки заднего сегмента передней кишки получают из линий эмбриональных стволовых клеток человека H1, H7, H9 или SA002 или из неэмбриональных клеток, экспрессирующих по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, HTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81, и где среда представляет собой среду DMEM с высокой концентрацией глюкозы или среду MCDB-131 с высокой концентрацией глюкозы.
2. Способ по п. 1, в котором ингибитор CYP26A используют в концентрации от приблизительно 1 нмоль до приблизительно 1000 нмоль.
3. Способ по п. 1, в котором ингибитор CYP26A используют в концентрации от 10 нмоль до 100 нмоль.
4. Способ по п. 1, в котором ингибитор CYP26A представляет собой N-{4-[2-этил-1-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)бутил]фенил}-1,3-бензотиазол-2-амин.
5. Способ по п. 1, в котором обработка повышает экспрессию маркеров предшественников эндокринных клеток NGN3, Pax4, NeuroD.
6. Способ по п. 1, в котором обработка уменьшает экспрессию CDX2 и альбумина.
7. Способ по п. 1, в котором среда, дополненная ингибитором CYP26A, дополнительно дополнена по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из фактора, способного ингибировать BMP, ингибитора сигнального каскада рецепторов TGFβ и активатора РКС.
8. Способ по п. 7, в котором фактор, способный ингибировать BMP, включает Noggin.
9. Способ по п. 7, в котором ингибитор сигнального каскада рецепторов TGFβ включает ингибитор ALK5.
10. Способ по п. 9, в котором ингибитором ALK5 является ингибитор ALK5 II.
11. Способ по п. 7, в котором активатор РКС выбран из группы, состоящей из (2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактама, индолактама V (ILV), форбол-12-миристат-13-ацетата (PMA) и форбол-12,13-дибутирата (PDBu).
12. Способ по п. 1, в котором клетки заднего сегмента передней кишки получены путем ступенчатой дифференцировки клеток из линий эмбриональных стволовых клеток человека H1, H7, H9.
13. Способ по п. 12, в котором клетки заднего сегмента передней кишки получены культивированием популяции клеток первичной кишечной трубки в среде, дополненной ретиноевой кислотой и ингибитором P38.
14. Способ по п. 1, в котором клетки заднего сегмента передней кишки получены из клеток из линии эмбриональных стволовых клеток человека H1.
15. Способ по п. 1, дополнительно включающий дифференциацию клеток-предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы в клетки, не экспрессирующие панкреатический гормон.
16. Способ по п. 15, где клетки-предшественники эндокринных клеток поджелудочной железы дифференцируются путем культивирования клеток в среде, дополненной ингибитором рецептора BMP и ингибитором ALK5.
17. Способ по п. 16, где ингибитор BMP представляет собой LDN-193189 и/или где ингибитор ALK5 представляет собой SD-208.
18. Способ по пп. 1, 15 или 16, дополнительно включающий дифференциацию незрелых клеток, экспрессирующих панкреатический гормон, в клетки, экспрессирующие панкреатический гормон.
19. Способ по п. 18, где способ включает культивирование незрелых клеток, экспрессирующих панкреатический гормон, в среде, дополненной ингибитором BMP, ингибитором ALK5 и ретиноидом.
20. Способ по п. 19, где среда дополнена LDN-193189, SD-208 и витамином A.
21. Способ по п. 1, где плюрипотентные клетки представляют собой клетки, полученные из линий эмбриональных стволовых клеток человека H1, H7, H9 или SA002.
22. Способ по п. 1, где среда представляет собой среду DMEM с высокой концентрацией глюкозы.
23. Способ по п. 1, где среда представляет собой среду MCDB-131 с высокой концентрацией глюкозы.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US37848010P | 2010-08-31 | 2010-08-31 | |
| US61/378,480 | 2010-08-31 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013114374/10A Division RU2599420C2 (ru) | 2010-08-31 | 2011-08-17 | Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2673946C1 true RU2673946C1 (ru) | 2018-12-03 |
Family
ID=45697776
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016135361A RU2673946C1 (ru) | 2010-08-31 | 2011-08-17 | Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток |
| RU2013114374/10A RU2599420C2 (ru) | 2010-08-31 | 2011-08-17 | Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013114374/10A RU2599420C2 (ru) | 2010-08-31 | 2011-08-17 | Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9181528B2 (ru) |
| EP (1) | EP2611907B1 (ru) |
| JP (2) | JP6133776B2 (ru) |
| KR (1) | KR101836855B1 (ru) |
| CN (1) | CN103154237B (ru) |
| AR (1) | AR082821A1 (ru) |
| AU (1) | AU2011296383B2 (ru) |
| BR (1) | BR112013004614A2 (ru) |
| CA (1) | CA2809305C (ru) |
| ES (1) | ES2585028T3 (ru) |
| HK (1) | HK1186492A1 (ru) |
| MX (1) | MX348537B (ru) |
| PL (1) | PL2611907T3 (ru) |
| RU (2) | RU2673946C1 (ru) |
| SG (1) | SG187947A1 (ru) |
| WO (1) | WO2012030540A2 (ru) |
Families Citing this family (54)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9080145B2 (en) | 2007-07-01 | 2015-07-14 | Lifescan Corporation | Single pluripotent stem cell culture |
| CA3207103A1 (en) | 2007-07-31 | 2009-02-05 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to pancreatic endocrine |
| WO2009070592A2 (en) | 2007-11-27 | 2009-06-04 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
| KR20170001727A (ko) | 2008-02-21 | 2017-01-04 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 세포 부착, 배양 및 탈리를 위한 방법, 표면 개질 플레이트 및 조성물 |
| CN102159703B (zh) | 2008-06-30 | 2015-11-25 | 森托科尔奥索生物科技公司 | 多能干细胞的分化 |
| US9012218B2 (en) | 2008-10-31 | 2015-04-21 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
| RU2522001C2 (ru) | 2008-10-31 | 2014-07-10 | Сентокор Орто Байотек Инк. | Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток |
| MX2011005289A (es) | 2008-11-20 | 2011-06-01 | Centocor Ortho Biotech Inc | Metodos y composiciones para union y cultivo celular sobre sustratos planares. |
| KR101774546B1 (ko) | 2008-11-20 | 2017-09-04 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 마이크로-캐리어 상의 만능 줄기 세포 배양 |
| US10076544B2 (en) | 2009-07-20 | 2018-09-18 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
| US9150833B2 (en) | 2009-12-23 | 2015-10-06 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
| KR101928299B1 (ko) | 2010-03-01 | 2018-12-12 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 만능 줄기 세포로부터 유래된 세포의 정제 방법 |
| WO2011140441A2 (en) | 2010-05-06 | 2011-11-10 | Children's Hospital Medical Center | Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation |
| BR112012028855A2 (pt) | 2010-05-12 | 2015-09-22 | Janssen Biotech Inc | diferenciação das células-tronco embrionárias humanas |
| EP3372672A1 (en) | 2010-08-31 | 2018-09-12 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
| SG10201506852VA (en) | 2010-08-31 | 2015-10-29 | Janssen Biotech Inc | Differentiation of human embryonic stem cells |
| CN105143446B (zh) | 2011-12-22 | 2020-11-03 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞分化成单一激素胰岛素阳性细胞 |
| AU2013230020B2 (en) | 2012-03-07 | 2018-08-09 | Janssen Biotech, Inc. | Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells |
| US20140162359A1 (en) * | 2012-05-07 | 2014-06-12 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Pancreatic Endoderm |
| KR102285014B1 (ko) | 2012-06-08 | 2021-08-03 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화 |
| BR112014031676A2 (pt) * | 2012-06-26 | 2017-10-31 | Seraxis Inc | composição, e, métodos para gerar uma composição e para gerar células pancreáticas substitutas |
| EP2893000B1 (en) | 2012-09-03 | 2019-04-10 | Novo Nordisk A/S | Generation of pancreatic endoderm from pluripotent stem cells using small molecules |
| RU2768963C2 (ru) * | 2012-12-31 | 2022-03-25 | Янссен Байотек, Инк. | Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки |
| US10370644B2 (en) * | 2012-12-31 | 2019-08-06 | Janssen Biotech, Inc. | Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom |
| CN105705634A (zh) * | 2012-12-31 | 2016-06-22 | 詹森生物科技公司 | 用于分化成胰腺内分泌细胞的人多能细胞的悬浮和群集 |
| RU2684215C2 (ru) * | 2012-12-31 | 2019-04-04 | Янссен Байотек, Инк. | Способ получения панкреатических эндокринных клеток (варианты) и способ увеличения выхода бета-клеток |
| KR102523912B1 (ko) | 2013-06-11 | 2023-04-21 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | SC-β 세포 및 조성물 그리고 그 생성 방법 |
| WO2015098962A1 (ja) * | 2013-12-25 | 2015-07-02 | 東亞合成株式会社 | 多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化誘導方法 |
| SG11201609473XA (en) | 2014-05-16 | 2016-12-29 | Janssen Biotech Inc | Use of small molecules to enhance mafa expression in pancreatic endocrine cells |
| JP6687544B2 (ja) * | 2014-05-28 | 2020-04-22 | チルドレンズ ホスピタル メディカル センター | 前駆細胞を指向性分化によって胃組織に変換するための方法及びシステム |
| US20170304369A1 (en) * | 2014-10-08 | 2017-10-26 | Agency For Science, Technology And Research | Methods of differentiating stem cells into liver cell lineages |
| AU2015331848B2 (en) | 2014-10-17 | 2022-03-03 | Children's Hospital Medical Center, D/B/A Cincinnati Children's Hospital Medical Center | In vivo model of human small intestine using pluripotent stem cells and methods of making and using same |
| WO2016100898A1 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | President And Fellows Of Harvard College | Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived b cells and uses thereof |
| CN107614678B (zh) | 2014-12-18 | 2021-04-30 | 哈佛学院校长同事会 | 干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法 |
| EP4374863A2 (en) | 2014-12-18 | 2024-05-29 | President and Fellows of Harvard College | Methods for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof |
| JP6691756B2 (ja) | 2015-09-29 | 2020-05-13 | 東亞合成株式会社 | 合成ペプチドを用いた神経幹細胞の生産方法 |
| MA45479A (fr) | 2016-04-14 | 2019-02-20 | Janssen Biotech Inc | Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen |
| WO2017192997A1 (en) | 2016-05-05 | 2017-11-09 | Children's Hospital Medical Center | Methods for the in vitro manufacture of gastric fundus tissue and compositions related to same |
| JP7068305B2 (ja) | 2016-12-05 | 2022-05-16 | チルドレンズ ホスピタル メディカル センター | 結腸オルガノイドならびにその作製方法および使用方法 |
| US10767164B2 (en) | 2017-03-30 | 2020-09-08 | The Research Foundation For The State University Of New York | Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation |
| US10391156B2 (en) | 2017-07-12 | 2019-08-27 | Viacyte, Inc. | University donor cells and related methods |
| MX2020004939A (es) * | 2017-11-15 | 2020-11-11 | Semma Therapeutics Inc | Fabricacion de composiciones de celulas islote y metodos de uso de las mismas. |
| AU2019320072A1 (en) | 2018-08-10 | 2021-02-25 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Stem cell derived islet differentiation |
| US10724052B2 (en) | 2018-09-07 | 2020-07-28 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
| RS63573B1 (sr) | 2019-03-13 | 2022-10-31 | Valvoline Licensing & Intellectual Property LLC | Pogonski fluid sa poboljšanim osobinama na niskim temperaturama |
| EP3976237A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-04-06 | W.L. Gore & Associates Inc. | Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances |
| EP3975925A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-04-06 | W.L. Gore & Associates, Inc. | A biocompatible membrane composite |
| US20220234006A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-07-28 | W. L. Gore & Associates, Inc. | A biocompatible membrane composite |
| US20220233298A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-07-28 | W. L. Gore & Associates, Inc. | A biocompatible membrane composite |
| JP7385244B2 (ja) * | 2019-06-27 | 2023-11-22 | 国立大学法人 東京大学 | 膵前駆細胞の分離方法 |
| WO2021044377A1 (en) | 2019-09-05 | 2021-03-11 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
| US11104918B2 (en) | 2019-09-05 | 2021-08-31 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
| JP2024503291A (ja) | 2020-12-31 | 2024-01-25 | クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト | ユニバーサルドナー細胞 |
| CN113234664B (zh) * | 2021-05-11 | 2024-05-10 | 澳门大学 | 一种胰腺祖细胞的制备方法及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2004117530A (ru) * | 2001-11-09 | 2005-03-27 | Артесел Сайенсиз, Инк. (Us) | Дифференцировка стромальных клеток, полученных из жировой ткани, в эндокринные клетки поджелудочной железы и их использование |
Family Cites Families (210)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3209652A (en) | 1961-03-30 | 1965-10-05 | Burgsmueller Karl | Thread whirling method |
| AT326803B (de) | 1968-08-26 | 1975-12-29 | Binder Fa G | Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben |
| US3935067A (en) | 1974-11-22 | 1976-01-27 | Wyo-Ben Products, Inc. | Inorganic support for culture media |
| CA1201400A (en) | 1982-04-16 | 1986-03-04 | Joel L. Williams | Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture |
| US4499802A (en) | 1982-09-29 | 1985-02-19 | Container Graphics Corporation | Rotary cutting die with scrap ejection |
| US4537773A (en) | 1983-12-05 | 1985-08-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | α-Aminoboronic acid derivatives |
| US4557264A (en) | 1984-04-09 | 1985-12-10 | Ethicon Inc. | Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene |
| US5215893A (en) | 1985-10-03 | 1993-06-01 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
| US5089396A (en) | 1985-10-03 | 1992-02-18 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
| US4737578A (en) | 1986-02-10 | 1988-04-12 | The Salk Institute For Biological Studies | Human inhibin |
| US5863531A (en) | 1986-04-18 | 1999-01-26 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework |
| US5567612A (en) | 1986-11-20 | 1996-10-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making |
| CA1340581C (en) | 1986-11-20 | 1999-06-08 | Joseph P. Vacanti | Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices |
| US5804178A (en) | 1986-11-20 | 1998-09-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Implantation of cell-matrix structure adjacent mesentery, omentum or peritoneum tissue |
| NZ229354A (en) | 1988-07-01 | 1990-09-26 | Becton Dickinson Co | Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface |
| EP0363125A3 (en) | 1988-10-03 | 1990-08-16 | Hana Biologics Inc. | Proliferated pancreatic endocrine cell product and process |
| US5837539A (en) | 1990-11-16 | 1998-11-17 | Osiris Therapeutics, Inc. | Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells |
| US5449383A (en) | 1992-03-18 | 1995-09-12 | Chatelier; Ronald C. | Cell growth substrates |
| GB9206861D0 (en) | 1992-03-28 | 1992-05-13 | Univ Manchester | Wound healing and treatment of fibrotic disorders |
| CA2114282A1 (en) | 1993-01-28 | 1994-07-29 | Lothar Schilder | Multi-layered implant |
| JP3525221B2 (ja) | 1993-02-17 | 2004-05-10 | 味の素株式会社 | 免疫抑制剤 |
| US5523226A (en) | 1993-05-14 | 1996-06-04 | Biotechnology Research And Development Corp. | Transgenic swine compositions and methods |
| GB9310557D0 (en) | 1993-05-21 | 1993-07-07 | Smithkline Beecham Plc | Novel process and apparatus |
| TW257671B (ru) | 1993-11-19 | 1995-09-21 | Ciba Geigy | |
| US5834308A (en) | 1994-04-28 | 1998-11-10 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans |
| US6001647A (en) | 1994-04-28 | 1999-12-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof |
| US6703017B1 (en) | 1994-04-28 | 2004-03-09 | Ixion Biotechnology, Inc. | Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures |
| US6083903A (en) | 1994-10-28 | 2000-07-04 | Leukosite, Inc. | Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses |
| CN1075387C (zh) | 1994-12-29 | 2001-11-28 | 中外制药株式会社 | 含有il－6拮抗剂的抗肿瘤剂的作用增强剂 |
| US5843780A (en) | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
| US5718922A (en) | 1995-05-31 | 1998-02-17 | Schepens Eye Research Institute, Inc. | Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation |
| US5908782A (en) | 1995-06-05 | 1999-06-01 | Osiris Therapeutics, Inc. | Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells |
| HUP0002842A3 (en) | 1997-04-24 | 2002-01-28 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Substituted imidazoles, process for producing them, pharmaceutical compositions containing them, their use and their intermediates |
| DE69837491T2 (de) | 1997-07-03 | 2008-01-17 | Osiris Therapeutics, Inc. | Menschliche mesenchymale stammzellen aus peripherem blut |
| US6670127B2 (en) | 1997-09-16 | 2003-12-30 | Egea Biosciences, Inc. | Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide |
| WO1999014318A1 (en) | 1997-09-16 | 1999-03-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes |
| WO1999020741A1 (en) | 1997-10-23 | 1999-04-29 | Geron Corporation | Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells |
| CO4980885A1 (es) | 1997-12-29 | 2000-11-27 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Compuestos de trifenilpropanamida utiles en el tratamiento de inflamaciones y metodos para preparar dicho compuesto |
| EP1066052B1 (en) | 1998-03-18 | 2006-02-01 | Osiris Therapeutics, Inc. | Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation |
| MY132496A (en) | 1998-05-11 | 2007-10-31 | Vertex Pharma | Inhibitors of p38 |
| US6413773B1 (en) | 1998-06-01 | 2002-07-02 | The Regents Of The University Of California | Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation |
| US6667176B1 (en) | 2000-01-11 | 2003-12-23 | Geron Corporation | cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells |
| US7410798B2 (en) | 2001-01-10 | 2008-08-12 | Geron Corporation | Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells |
| US6610540B1 (en) | 1998-11-18 | 2003-08-26 | California Institute Of Technology | Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells |
| US6413556B1 (en) | 1999-01-08 | 2002-07-02 | Sky High, Llc | Aqueous anti-apoptotic compositions |
| EP1144597A2 (en) | 1999-01-21 | 2001-10-17 | Vitro Diagnostics, Inc. | Immortalized cell lines and methods of making the same |
| US6815203B1 (en) | 1999-06-23 | 2004-11-09 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Methods of making pancreatic islet cells |
| US6333029B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-12-25 | Ethicon, Inc. | Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue |
| US6306424B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-10-23 | Ethicon, Inc. | Foam composite for the repair or regeneration of tissue |
| EP1224259A4 (en) | 1999-09-27 | 2005-04-27 | Univ Florida | INVERSION OF INSULIN DEPENDENT DIABETES BY ISOLATED STEM CELLS, PROGENITOR ISLANDIC CELLS, AND INSULAR TYPE STRUCTURES |
| US6685936B2 (en) | 1999-10-12 | 2004-02-03 | Osiris Therapeutics, Inc. | Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation |
| US20030082155A1 (en) | 1999-12-06 | 2003-05-01 | Habener Joel F. | Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus |
| AU778155B2 (en) | 1999-12-13 | 2004-11-18 | Scripps Research Institute, The | Markers for identification and isolation of pancreatic islet alpha and beta cell progenitors |
| US7005252B1 (en) | 2000-03-09 | 2006-02-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Serum free cultivation of primate embryonic stem cells |
| US7439064B2 (en) | 2000-03-09 | 2008-10-21 | Wicell Research Institute, Inc. | Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium |
| US6436704B1 (en) | 2000-04-10 | 2002-08-20 | Raven Biotechnologies, Inc. | Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof |
| US6458589B1 (en) | 2000-04-27 | 2002-10-01 | Geron Corporation | Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells |
| WO2002000849A1 (fr) | 2000-06-26 | 2002-01-03 | Renomedix Institute Inc. | Fraction cellulaire contenant des cellules capables de se differencier en cellules du systeme nerveux |
| IL155367A0 (en) | 2000-10-23 | 2003-12-23 | Smithkline Beecham Corp | NOVEL 2,4,8-TRISUBSTITUTED-8h-PYRIDO[2,3,-d]PYRIMIDIN-7-ONE COMPOUNDS, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING THE SAME, PROCESSES FOR THE PREPARATION THEREOF, AND USE THEREOF IN THE PREPARATION OF MEDICAMENTS FOR TREATING CSBP/p38 KINASE MEDIATED DISEASES |
| EP1345946B1 (en) | 2000-12-08 | 2005-08-10 | Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. | Macroheterocylic compounds useful as kinase inhibitors |
| ES2263681T3 (es) | 2000-12-08 | 2006-12-16 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Compuestos de pirrolina indazolil-substituidos como inhibidores de la kinasa. |
| US6599323B2 (en) | 2000-12-21 | 2003-07-29 | Ethicon, Inc. | Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use |
| WO2002059278A2 (en) | 2001-01-24 | 2002-08-01 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Department Of Health & Human Services | Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells |
| JP4162491B2 (ja) | 2001-01-25 | 2008-10-08 | アメリカ合衆国 | ボロン酸化合物製剤 |
| US6656488B2 (en) | 2001-04-11 | 2003-12-02 | Ethicon Endo-Surgery, Inc. | Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering |
| WO2002086107A2 (en) | 2001-04-19 | 2002-10-31 | DeveloGen Aktiengesellschaft für entwicklungsbiologische Forschung | A method for differentiating stem cells into insulin-producing cells |
| EP1391505B1 (en) | 2001-04-24 | 2009-01-28 | Ajinomoto Co., Inc. | Stem cells and method of separating the same |
| JP2004531262A (ja) | 2001-05-15 | 2004-10-14 | ラッパポート ファミリー インスチチュート フォア リサーチ イン ザ メディカル サイエンシズ | ヒト胚性幹細胞由来インスリン産生細胞 |
| US6626950B2 (en) | 2001-06-28 | 2003-09-30 | Ethicon, Inc. | Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue |
| KR100418195B1 (ko) | 2001-07-05 | 2004-02-11 | 주식회사 우리기술 | 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법 |
| GB0117583D0 (en) | 2001-07-19 | 2001-09-12 | Astrazeneca Ab | Novel compounds |
| AU2002319780A1 (en) | 2001-08-06 | 2003-02-24 | Bresagen, Ltd. | Alternative compositions and methods for the culture of stem cells |
| US6617152B2 (en) | 2001-09-04 | 2003-09-09 | Corning Inc | Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate |
| EP1298201A1 (en) | 2001-09-27 | 2003-04-02 | Cardion AG | Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state |
| JP2005506074A (ja) | 2001-10-18 | 2005-03-03 | イクシオン・バイオテクノロジー・インコーポレーテッド | 肝臓の幹細胞および前駆細胞の膵臓機能細胞への転換 |
| JP4330995B2 (ja) | 2001-11-15 | 2009-09-16 | チルドレンズ メディカル センター コーポレーション | 絨毛膜絨毛、羊水、および胎盤からの胎児性幹細胞を単離、増殖、および分化させる方法、ならびにその治療的使用方法 |
| GB2399823B (en) | 2001-12-07 | 2006-02-15 | Geron Corp | Islet cells from primate pluripotent stem cells |
| BR0214772A (pt) | 2001-12-07 | 2007-01-09 | Macropore Biosurgery Inc | sistemas e métodos para o tratamento de pacientes com células lipoaspiradas processadas |
| AU2002218893A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-09 | Thromb-X Nv | Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability |
| AU2002367091A1 (en) | 2001-12-28 | 2003-07-15 | Cellartis Ab | A method for the establishment of a pluripotent human blastocyst-derived stem cell line |
| US20030162290A1 (en) | 2002-01-25 | 2003-08-28 | Kazutomo Inoue | Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells |
| AU2003231358A1 (en) | 2002-04-17 | 2003-10-27 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | METHOD OF FORMING PANCREATIC Beta CELLS FROM MESENCHYMAL CELLS |
| US20040161419A1 (en) | 2002-04-19 | 2004-08-19 | Strom Stephen C. | Placental stem cells and uses thereof |
| WO2003095452A1 (en) | 2002-05-08 | 2003-11-20 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Substituted pyrroline kinase inhibitors |
| US20060003446A1 (en) | 2002-05-17 | 2006-01-05 | Gordon Keller | Mesoderm and definitive endoderm cell populations |
| WO2003102171A1 (en) | 2002-05-28 | 2003-12-11 | Becton, Dickinson And Company | Expansion and transdifferentiation of human acinar cells |
| JP2005531609A (ja) | 2002-06-05 | 2005-10-20 | ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ | キナーゼ阻害剤としてのシスインドリル−マレイミド誘導体 |
| GB0212976D0 (en) | 2002-06-06 | 2002-07-17 | Tonejet Corp Pty Ltd | Ejection method and apparatus |
| US20040106216A1 (en) | 2002-07-02 | 2004-06-03 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Method of measuring drug-metabolizing enzyme activity, method of evaluating inhibition of drug-metabolizing enzyme activity, and composition for these methods |
| CN1171991C (zh) | 2002-07-08 | 2004-10-20 | 徐如祥 | 人神经干细胞的培养方法 |
| US6877147B2 (en) | 2002-07-22 | 2005-04-05 | Broadcom Corporation | Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison |
| US7838290B2 (en) | 2002-07-25 | 2010-11-23 | The Scripps Research Institute | Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith |
| US20040110287A1 (en) | 2002-07-29 | 2004-06-10 | Es Cell International Pte Ltd. | Multi-step method for the differentiation of insulin positive, glucose responsive cells |
| AU2003262628A1 (en) | 2002-08-14 | 2004-03-03 | University Of Florida | Bone marrow cell differentiation |
| EP1539928A4 (en) | 2002-09-06 | 2006-09-06 | Amcyte Inc | POSIOTIVE PANCREATIC ENDOCRINE PROGENITOR CELLS CD56 IN ADULT HUMAN BEINGS |
| US9969977B2 (en) | 2002-09-20 | 2018-05-15 | Garnet Biotherapeutics | Cell populations which co-express CD49c and CD90 |
| US20040062753A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-04-01 | Alireza Rezania | Composite scaffolds seeded with mammalian cells |
| AU2003285172A1 (en) | 2002-11-08 | 2004-06-03 | The Johns Hopkins University | Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same |
| US7144999B2 (en) | 2002-11-23 | 2006-12-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression |
| WO2004050827A2 (en) | 2002-12-05 | 2004-06-17 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Cultured human pancreatic islets, and uses thereof |
| DK2457999T3 (en) | 2002-12-16 | 2019-02-11 | Technion Res & Dev Foundation | CULTIVATION MEDIUM FOR PLURIPOTENT STEM CELLS |
| WO2005045001A2 (en) | 2003-02-14 | 2005-05-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Insulin-producing cells derived from stem cells |
| US20070155661A1 (en) | 2003-02-14 | 2007-07-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University | Methods and compositions for modulating the development of stem cells |
| WO2004087885A2 (en) | 2003-03-27 | 2004-10-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway |
| US20060194315A1 (en) | 2003-03-31 | 2006-08-31 | Condie Brian G | Compositions and methods for the control, differentiaton and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway |
| US20090203141A1 (en) | 2003-05-15 | 2009-08-13 | Shi-Lung Lin | Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents |
| AU2004252570C1 (en) | 2003-06-27 | 2012-03-01 | Ethicon, Incorporated | Soft tissue repair and regeneration using postpartum-derived cells |
| IL161903A0 (en) | 2003-07-17 | 2005-11-20 | Gamida Cell Ltd | Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs |
| ITRM20030395A1 (it) | 2003-08-12 | 2005-02-13 | Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz | Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero. |
| WO2005017117A2 (en) | 2003-08-14 | 2005-02-24 | Martin Haas | Multipotent amniotic fetal stem cells (mafsc) and banking of same |
| US7157275B2 (en) | 2003-08-15 | 2007-01-02 | Becton, Dickinson And Company | Peptides for enhanced cell attachment and growth |
| AU2004269395A1 (en) | 2003-08-27 | 2005-03-10 | Stemcells California, Inc. | Enriched pancreatic stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for these populations |
| JP2007515433A (ja) | 2003-12-17 | 2007-06-14 | アラーガン インコーポレイテッド | Ｃｙｐ２６ａおよびｃｙｐ２６ｂの選択的阻害剤を使用するレチノイド反応性障害の処置方法 |
| US20060030042A1 (en) | 2003-12-19 | 2006-02-09 | Ali Brivanlou | Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime |
| US20050266554A1 (en) | 2004-04-27 | 2005-12-01 | D Amour Kevin A | PDX1 expressing endoderm |
| US7625753B2 (en) | 2003-12-23 | 2009-12-01 | Cythera, Inc. | Expansion of definitive endoderm cells |
| CN109628371B (zh) | 2003-12-23 | 2021-02-19 | 维亚希特公司 | 定形内胚层 |
| CN103898045B (zh) | 2003-12-23 | 2019-02-01 | 维亚希特公司 | 定形内胚层 |
| WO2005065354A2 (en) | 2003-12-31 | 2005-07-21 | The Burnham Institute | Defined media for pluripotent stem cell culture |
| TWI334443B (en) | 2003-12-31 | 2010-12-11 | Ind Tech Res Inst | Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells |
| US7794704B2 (en) | 2004-01-23 | 2010-09-14 | Advanced Cell Technology, Inc. | Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration |
| WO2005071066A1 (en) | 2004-01-23 | 2005-08-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for preparing pancreatic insulin secreting cells |
| US20070298453A1 (en) | 2004-02-12 | 2007-12-27 | University Of Newcastle Upon Tyne | Stem Cells |
| WO2005080598A1 (ja) | 2004-02-19 | 2005-09-01 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法 |
| WO2005086860A2 (en) | 2004-03-09 | 2005-09-22 | Gang Xu | Methods for generating insulin-producing cells |
| WO2005086845A2 (en) | 2004-03-10 | 2005-09-22 | Regents Of The University Of California | Compositions and methods for growth of embryonic stem cells |
| WO2005097980A2 (en) | 2004-03-26 | 2005-10-20 | Geron Corporation | New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells |
| KR20070029681A (ko) | 2004-04-01 | 2007-03-14 | 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 | 줄기 세포의 내배엽 및 이자 혈통으로의 분화 |
| CN103103158B (zh) | 2004-04-27 | 2016-08-03 | 韦尔赛特公司 | 细胞培养基 |
| WO2006016999A1 (en) | 2004-07-09 | 2006-02-16 | Cythera, Inc. | Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm |
| CA2576872C (en) | 2004-08-13 | 2013-11-12 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Compositions and methods for self-renewal and differentiation in human embryonic stem cells |
| US20080268533A1 (en) | 2004-08-25 | 2008-10-30 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Methods and Compositions Utilizing Myc and Gsk3Beta to Manipulate the Pluripotency of Embryonic Stem Cells |
| DE102004043256B4 (de) | 2004-09-07 | 2013-09-19 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension |
| JP5420837B2 (ja) | 2004-09-08 | 2014-02-19 | ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション | 胚幹細胞の培地及び培養 |
| CA2579652A1 (en) | 2004-09-08 | 2006-03-16 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Culturing human embryonic stem cells |
| WO2006083782A2 (en) | 2005-01-31 | 2006-08-10 | Es Cell International Pte Ltd. | Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof |
| EP1860950B1 (en) | 2005-03-04 | 2017-04-19 | Lifescan, Inc. | Adult pancreatic derived stromal cells |
| GB0505970D0 (en) | 2005-03-23 | 2005-04-27 | Univ Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof |
| US7998938B2 (en) | 2005-04-15 | 2011-08-16 | Geron Corporation | Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities |
| CN100425694C (zh) | 2005-04-15 | 2008-10-15 | 北京大学 | 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法 |
| EP1874367B1 (en) | 2005-04-26 | 2011-07-06 | Arhus Universitet | Biocompatible material for surgical implants and cell guiding tissue culture surfaces |
| EP1899344A1 (en) | 2005-06-10 | 2008-03-19 | Irm, Llc | Compounds that maintain pluripotency of embryonic stem cells |
| WO2006138433A2 (en) | 2005-06-14 | 2006-12-28 | The Regents Of The University Of California | Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides |
| US20080199959A1 (en) | 2005-06-21 | 2008-08-21 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Method For Cell Culture |
| CN101233226B (zh) | 2005-06-22 | 2017-08-11 | 阿斯特利亚斯生物治疗股份公司 | 人胚胎干细胞的悬浮培养物 |
| WO2007003525A2 (en) | 2005-06-30 | 2007-01-11 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Cyclic anilino-pyridinotriazines as gsk-3 inhibitors |
| US20090087907A1 (en) | 2005-07-29 | 2009-04-02 | Alice Pebay | Compositions and Methods for Growth of Pluripotent Cells |
| WO2007016485A2 (en) | 2005-07-29 | 2007-02-08 | Athersys, Inc. | Use of a gsk-3 inhibitor to maintain potency of cultured cells |
| WO2007025234A2 (en) | 2005-08-26 | 2007-03-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes |
| WO2007027157A1 (en) | 2005-09-02 | 2007-03-08 | Agency For Science, Technology And Research | Method of deriving progenitor cell line |
| AU2006292021B2 (en) | 2005-09-12 | 2012-05-31 | Es Cell International Pte Ltd. | Cardiomyocyte production |
| WO2008048671A1 (en) | 2006-10-18 | 2008-04-24 | University Of Illinois | Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use |
| WO2007047509A2 (en) | 2005-10-14 | 2007-04-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype |
| CN101351547A (zh) | 2005-10-27 | 2009-01-21 | 赛瑟拉公司 | 表达pdx1的背侧和腹侧前肠内胚层 |
| PT1970446E (pt) | 2005-12-13 | 2011-09-01 | Univ Kyoto | Factor de reprogramação nuclear |
| WO2007082963A1 (es) | 2006-01-18 | 2007-07-26 | Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad | Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas |
| DK2420565T3 (en) | 2006-02-23 | 2017-12-04 | Viacyte Inc | APPLICABLE COMPOSITIONS AND METHODS FOR CULTIVATING DIFFERENTIBLE CELLS |
| US8129182B2 (en) | 2006-03-02 | 2012-03-06 | Viacyte, Inc. | Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production |
| US7695965B2 (en) | 2006-03-02 | 2010-04-13 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
| US8741643B2 (en) | 2006-04-28 | 2014-06-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage |
| EP2021462B1 (en) | 2006-04-28 | 2019-01-09 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
| AU2007248609B2 (en) | 2006-05-02 | 2012-11-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage |
| US7964402B2 (en) | 2006-05-25 | 2011-06-21 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells |
| CN101541953A (zh) | 2006-06-02 | 2009-09-23 | 佐治亚大学研究基金会 | 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织 |
| WO2007143193A1 (en) | 2006-06-02 | 2007-12-13 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Pancreatic and liver endoderm cells and tissue by differentiation of definitive endoderm cells obtained from human embryonic stems |
| US8415153B2 (en) | 2006-06-19 | 2013-04-09 | Geron Corporation | Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells |
| CN100494359C (zh) | 2006-06-23 | 2009-06-03 | 中日友好医院 | 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法 |
| PL2046946T3 (pl) | 2006-06-26 | 2017-04-28 | Lifescan, Inc. | Hodowla pluripotencjalnych komórek macierzystych |
| US20080003676A1 (en) | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Millipore Corporation | Growth of embryonic stem cells |
| US8968994B2 (en) | 2006-07-06 | 2015-03-03 | Jeremy Micah Crook | Method for stem cell culture and cells derived therefrom |
| AU2007277364B2 (en) | 2006-07-26 | 2010-08-12 | Viacyte, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
| KR101331510B1 (ko) | 2006-08-30 | 2013-11-20 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴 |
| JP2008099662A (ja) | 2006-09-22 | 2008-05-01 | Institute Of Physical & Chemical Research | 幹細胞の培養方法 |
| US20080091234A1 (en) | 2006-09-26 | 2008-04-17 | Kladakis Stephanie M | Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth |
| AU2007311026B2 (en) * | 2006-10-17 | 2012-05-17 | Stiefel Laboratories, Inc. | Talarazole metabolites |
| WO2008048647A1 (en) | 2006-10-17 | 2008-04-24 | Cythera, Inc. | Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells |
| WO2008086005A1 (en) | 2007-01-09 | 2008-07-17 | University Of South Florida | Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof |
| WO2008094597A2 (en) | 2007-01-30 | 2008-08-07 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Early mesoderm cells, a stable population of mesendoderm cells that has utility for generation of endoderm and mesoderm lineages and multipotent migratory cells (mmc) |
| GB0703188D0 (en) | 2007-02-19 | 2007-03-28 | Roger Land Building | Large scale production of stem cells |
| JP5738591B2 (ja) | 2007-07-18 | 2015-06-24 | ライフスキャン・インコーポレイテッドＬｉｆｅｓｃａｎ，Ｉｎｃ． | ヒト胚幹細胞の分化 |
| CA3207103A1 (en) | 2007-07-31 | 2009-02-05 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to pancreatic endocrine |
| EP2185691B1 (en) | 2007-07-31 | 2018-03-14 | Lifescan, Inc. | Pluripotent stem cell differentiation by using human feeder cells |
| AU2008291930B2 (en) | 2007-08-24 | 2014-04-17 | Slotervaart Participaties Bv | Compositions for the treatment of neoplastic diseases |
| WO2009061442A1 (en) | 2007-11-06 | 2009-05-14 | Children's Medical Center Corporation | Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells form non-embryonic human cells |
| WO2009070592A2 (en) | 2007-11-27 | 2009-06-04 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
| SG154367A1 (en) | 2008-01-31 | 2009-08-28 | Es Cell Int Pte Ltd | Method of differentiating stem cells |
| WO2009096049A1 (ja) | 2008-02-01 | 2009-08-06 | Kyoto University | 人工多能性幹細胞由来分化細胞 |
| US20100330677A1 (en) | 2008-02-11 | 2010-12-30 | Cambridge Enterprise Limited | Improved Reprogramming of Mammalian Cells, and Cells Obtained |
| KR20170001727A (ko) | 2008-02-21 | 2017-01-04 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 세포 부착, 배양 및 탈리를 위한 방법, 표면 개질 플레이트 및 조성물 |
| EP2479260B1 (en) | 2008-03-17 | 2016-01-06 | Agency For Science, Technology And Research | Microcarriers for stem cell culture |
| DK2727998T3 (da) | 2008-04-21 | 2019-08-26 | Viacyte Inc | Fremgangsmåder til oprensning af pancreatiske endodermceller afledt fra humane embryoniske stamceller |
| US8338170B2 (en) | 2008-04-21 | 2012-12-25 | Viacyte, Inc. | Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells |
| WO2009132083A2 (en) | 2008-04-22 | 2009-10-29 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for promoting the generation of pdx1+ pancreatic cells |
| US7939322B2 (en) | 2008-04-24 | 2011-05-10 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm |
| US8623648B2 (en) | 2008-04-24 | 2014-01-07 | Janssen Biotech, Inc. | Treatment of pluripotent cells |
| WO2009154606A1 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-23 | Cythera, Inc. | Growth factors for production of definitive endoderm |
| US20090298178A1 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-03 | D Amour Kevin Allen | Growth factors for production of definitive endoderm |
| CN102159703B (zh) | 2008-06-30 | 2015-11-25 | 森托科尔奥索生物科技公司 | 多能干细胞的分化 |
| DE102008032236A1 (de) | 2008-06-30 | 2010-04-01 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen | Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential |
| US20100028307A1 (en) | 2008-07-31 | 2010-02-04 | O'neil John J | Pluripotent stem cell differentiation |
| RU2522001C2 (ru) | 2008-10-31 | 2014-07-10 | Сентокор Орто Байотек Инк. | Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток |
| US8008075B2 (en) | 2008-11-04 | 2011-08-30 | Viacyte, Inc. | Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof |
| JP5390624B2 (ja) | 2008-11-04 | 2014-01-15 | バイアサイト インク | 幹細胞集合体懸濁液組成物、その分化方法 |
| ES2667493T3 (es) | 2008-11-14 | 2018-05-11 | Viacyte, Inc. | Encapsulación de células pancreáticas derivadas de células madre humanas pluripotentes |
| KR101774546B1 (ko) | 2008-11-20 | 2017-09-04 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 마이크로-캐리어 상의 만능 줄기 세포 배양 |
| ES2633935T3 (es) | 2008-12-05 | 2017-09-26 | Inserm - Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale | Método y medio para la diferenciación neural de células pluripotentes |
| EP2456859A4 (en) | 2009-07-20 | 2015-03-18 | Janssen Biotech Inc | DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS |
| US10076544B2 (en) | 2009-07-20 | 2018-09-18 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
| US20120322152A1 (en) | 2010-03-02 | 2012-12-20 | Michael Raghunath | Culture Additives To Boost Stem Cell Proliferation And Differentiation Response |
| BR112013002811A8 (pt) | 2010-08-05 | 2020-01-28 | Wisconsin Alumni Res Found | meios básicos simplificados para cultura celular pluripotente de humano |
-
2011
- 2011-08-17 AU AU2011296383A patent/AU2011296383B2/en active Active
- 2011-08-17 CA CA2809305A patent/CA2809305C/en active Active
- 2011-08-17 RU RU2016135361A patent/RU2673946C1/ru active
- 2011-08-17 CN CN201180041628.0A patent/CN103154237B/zh active Active
- 2011-08-17 WO PCT/US2011/048131 patent/WO2012030540A2/en active Application Filing
- 2011-08-17 US US13/211,972 patent/US9181528B2/en active Active
- 2011-08-17 SG SG2013013594A patent/SG187947A1/en unknown
- 2011-08-17 MX MX2013002407A patent/MX348537B/es active IP Right Grant
- 2011-08-17 KR KR1020137007527A patent/KR101836855B1/ko active IP Right Grant
- 2011-08-17 RU RU2013114374/10A patent/RU2599420C2/ru active
- 2011-08-17 PL PL11822351.0T patent/PL2611907T3/pl unknown
- 2011-08-17 EP EP11822351.0A patent/EP2611907B1/en active Active
- 2011-08-17 JP JP2013527100A patent/JP6133776B2/ja active Active
- 2011-08-17 BR BR112013004614A patent/BR112013004614A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2011-08-17 ES ES11822351.0T patent/ES2585028T3/es active Active
- 2011-08-31 AR ARP110103177A patent/AR082821A1/es unknown
-
2013
- 2013-12-12 HK HK13113803.5A patent/HK1186492A1/zh not_active IP Right Cessation
-
2015
- 2015-10-14 US US14/882,661 patent/US9458430B2/en active Active
-
2017
- 2017-04-20 JP JP2017083570A patent/JP6353951B2/ja active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2004117530A (ru) * | 2001-11-09 | 2005-03-27 | Артесел Сайенсиз, Инк. (Us) | Дифференцировка стромальных клеток, полученных из жировой ткани, в эндокринные клетки поджелудочной железы и их использование |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KROON E. et al., Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo, Nature Biotechnology, 2008, Vol.26, No.4, pp.443-452. GILTAIRE S. et al., The CYP26 inhibitor R115866 potentiates the effects of all-trans retinoic acid on cultured human epidermal keratinocytes, British Journal of Dermatology, 2009, Vol.160, pp.505-513. KINKEL M.D. et al., Cyp26 enzymes Function in endoderm to regulate pancreatic field size, Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, Vol. 106, N.19, pp. 7864-7869. LAVON N. et al., The Effect of Overexpression of Pdxl and Foxa2 on the Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Pancreatic Cells, STEM CELLS, 2006, Vol. 24, pp. 1923-1930. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6133776B2 (ja) | 2017-05-24 |
| EP2611907B1 (en) | 2016-05-04 |
| US9458430B2 (en) | 2016-10-04 |
| BR112013004614A2 (pt) | 2024-01-16 |
| AU2011296383A1 (en) | 2013-03-07 |
| MX2013002407A (es) | 2013-04-05 |
| WO2012030540A3 (en) | 2012-05-31 |
| HK1186492A1 (zh) | 2014-03-14 |
| EP2611907A4 (en) | 2014-01-22 |
| ES2585028T3 (es) | 2016-10-03 |
| US20120052576A1 (en) | 2012-03-01 |
| JP6353951B2 (ja) | 2018-07-04 |
| CN103154237A (zh) | 2013-06-12 |
| AR082821A1 (es) | 2013-01-09 |
| PL2611907T3 (pl) | 2016-11-30 |
| US20160040130A1 (en) | 2016-02-11 |
| CN103154237B (zh) | 2016-03-16 |
| JP2013536687A (ja) | 2013-09-26 |
| CA2809305A1 (en) | 2012-03-08 |
| RU2013114374A (ru) | 2014-10-10 |
| RU2599420C2 (ru) | 2016-10-10 |
| CA2809305C (en) | 2019-06-11 |
| WO2012030540A2 (en) | 2012-03-08 |
| JP2017163988A (ja) | 2017-09-21 |
| SG187947A1 (en) | 2013-03-28 |
| KR101836855B1 (ko) | 2018-04-19 |
| EP2611907A2 (en) | 2013-07-10 |
| US9181528B2 (en) | 2015-11-10 |
| MX348537B (es) | 2017-06-07 |
| AU2011296383B2 (en) | 2016-03-10 |
| KR20130101029A (ko) | 2013-09-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2673946C1 (ru) | Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток | |
| US20170327793A1 (en) | Differentiation of human embryonic stem cells | |
| US20170081634A1 (en) | Differentiation of human embryonic stem cells | |
| US9951314B2 (en) | Differentiation of human embryonic stem cells |