ES2585028T3 - Diferenciación de células madre pluripotentes - Google Patents

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Abstract

Un método para derivar una población de células precursoras endocrinas pancreáticas de células madre pluripotentes que comprende las etapas de: a. cultivar una población de células madre pluripotentes; b. diferencia las células madre pluripotentes en una población de células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo; c. diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo en una población de células de tubo intestinal primitivo; d. diferenciar la población de células de tubo intestinal primitivo en una población de células del intestino proximal posterior; y e. tratar la población de las células del intestino proximal posterior con un medio complementado con un inhibidor de CYP26A.

Description

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Diferenciacion de celulas madre pluripotentes
Descripcion
Campo de la invencion
La presente invencion proporciona metodos para impulsar la diferenciacion de celulas madre pluripotentes en celulas productoras de insulina. En particular, la presente invencion proporciona un metodo que utiliza un inhibidor de CYP26A para producir una poblacion de celulas precursoras endocrinas pancreaticas.
Antecedentes
Los avances en terapia de sustitucion celular para diabetes mellitus de tipo I y una escasez de islotes de celulas de Langerhans transplantables han centrado el interes en desarrollar fuentes de celulas productoras de insulina, o celulas p, apropiadas para injerto. Una tecnica es la generacion de ceulas p funcionales a partir de celulas madre pluripotentes, como, por ejemplo, celulas madre embrionarias.
En el desarrollo embrionario de vertebrados, una celula pluripotente da lugar a un grupo de celulas que comprenden tres capas germinales (ectodermo, mesodermo y endodermo) en un proceso conocido como gastrulacion. Tejidos tales como, por ejemplo, tiroides, timo, pancreas, intestino e hlgado, se desarrollaran del endodermo, por medio de una fase intermedia. La fase intermedia en este proceso es la formacion de endodermo definitivo. Las celulas de endodermo definitivo expresan un numero de marcadores, como, HNF3 beta, GATA4, MIXL1, CXCR4 y SOX17.
La formacion del pancreas aparece de la diferenciacion de endodermo definitivo en endodermo pancreatico. Las celulas del endodermo pancreatico expresan el gen homeobox pancreatico-duodenal, PDX1. En ausencia de PDX1, el pancreas falla en el desarrollo mas alla de la formacion de brotes ventrales y dorsales. Asl, la expresion de PDX1 marca una etapa fundamental en la organogenesis pancreatica. El pancreas maduro contiene, entre otros tipos de celulas, tejido exocrino y tejido endocrino. Los tejidos endocrinos y exocrinos aparecen de la diferenciacion de endodermo pancreatico.
El desarrollo pancreatico in vivo se basa, al menos en parte, en la regulacion apropiada de las senales que especifican los campos progenitores de organos. Kinkel et al (PNAS 12 Mayo, 2009, vol. 106, n° 19 7864-7869) expone “los destinos de las celulas pancreaticas estan especificados por el acido retinoico (AR), y el tamano y localization apropiados del campo pancratico depende del control limitado de serialization de AR. Aqul mostramos que las enzimas Cyp26 degradantes de AR juegan un papel fundamental en la definition de llmite anterior normal del campo pancreatico”.
Las celulas que tienen las caracterlsticas de celulas islotes se han derivado supuestatmente de celulas embrionarias del raton. Por ejemplo, Lumelsky et al. (Science 292:1389, 2001) presenta la diferenciacion de ceulas madre embrionarias de raton con estructuras que secretan insulina similares a islotes pancreaticos. Soria et al. (Diabetes 49:157, 2000) presenta que las celulas que secretan insulina derivadas de celulas madre embrionarias de raton normalizan glicemia en ratones diabeticos inducidos con estreptozotocina.
En un ejemplo, Hori et al. (PNAS 99:15105, 2002) desvela que el tratamiento de celulas madre embrionarias de raton con inhibidores de fosfoinositida 3-quinasa (LY294002) produjo celulas que se parecen a celulas p.
En otro ejemplo, Blyszczuk et al. (PNAS 100:998, 2003) presenta la generacion de celulas productoras de insulina de celulas madre embrionarias de raton que constitutivamente expresan Pax4.
Micallef et al. Presenta que el acido retinoico puede regular el compromiso de celulas madre embrionarias para formar endodermo pancreatico positivo PDX1. El acido retinoico es mas efectivo en la induction de expresion Pdx1 cuando se anade a cultivos el dla 4 de diferenciacion de celula madre embrionaria durante un periodo correspondiente al final de gastrulacion en el embrion (Diabetes 54:301, 2005).
Miyazaki et al., presenta una llnea celular embrionaria de raton que sobreexpresa Pdx1. Sus resultados muestran que la expresion exogena de Pdx1 mejoro claramente la expresion de insulina, somatostatina, glucoquinasa, neurogenina3, p48, Pax6 y genes Hnf6 en las celulas resultantes diferenciadas (Diabetes 53: 1030, 2004).
Skoudy et al. Presenta que la activina A (un miembro de la superfamilia TGF-p) regular por incremento la expresion de genes pancreaticos exogenicos (p48 y amilasa) y los genes endocrinos (Pdx1, insulina y glucagon) en celulas madre embrionarias de raton. El efecto maximo se observo usando activina A 1nM. Tambien se observo que el nivel de expresion de insulina y Pdx1 mARN no estuvo afectado por el acido retinoico; sin embargo, el tratamiento con 3nM FGF7 dio como resultado un mayor nivel de la transcription para Pdx1 (Biochem. J. 379:749, 2004).
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Shiraki et al., estudio los efectos de los factores de crecimiento que especlficamente mejoran la diferenciacion de celulas madre embrionarias en celulas positivas PDX1. Se observo que TGF-p2 produjo reproduciblemente una mayor proporcion de celulas positivas PDX1 (Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16).
Gordon et al. Demostro la induccion de ceulas de endodermo de branquiuro [positivas]/HNF3 beta [positivas] de celulas madre embrionarias de raton en ausencia de suero y en presencia de activina junto con un inhibidor de senalizacion Wnt (US 2006/0003446A1).
Gordon et al. (PNAS, Vol 103, pagina 16806, 2006) expone “la senalizacion simultanea de Wnt y TGF- beta/nodal/activina fue necesaria para la generacion de la sucesion primitiva anterior”.
Sin embargo, el modelo de raton de desarrollo de celula madre embrionaria puede no imitar exactamente el programa de desarrollo en mamlferos mas grandes, como por ejemplo, humanos.
A diferencia de celulas madre embrionarias de raton, cuya diferenciacion puede prevenirse simplemente cultivandolas con Factor Inhibidor de la Leucemia (FIL), las ceulas madre embrionarias humanas deben mantenerse bajo condiciones muy especiales (Patente de Estados Unidos N° 6.200.806; WO 99/20741; WO 01/51616).
D'Amour et al. Describe3 la produccion de cultivos enriquecidos de endodermo definitivo derivado de celulas madre embrionaria humana en presencia de una alta concentracion de activina y suero bajo (Nature Biotechnology 2005). El trasplante de estas celulas bajo la capsula del rinon de ratones dio como resultado la diferenciacion en ceulas mas maduras con caracterlsticas de algunos organos del endodermo. Las celulas de endodermo definitivo derivada de celulas madre embrionaria humana pueden ademas diferenciarse en ceulas positivas PDX2 despues de la adicion de FGF-10 (US 2005/0266554A1).
D'Amour et al. (Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401 ((2006)) declara: “Hemos desarrollado un proceso de diferenciacion que convierte ceulas madre embrionarias humanas (MEh) en celulas endocrinas capaces de sintetizar las hormonas pancreaticas: insulina, glucagon, somatostatina, polipeptido pancreatico y ghrelina. Este proceso imita la organogenesis pancreatica in vivo al dirigir las celulas a traves de fases que se parecen al endodermo definitivo, endodermo de tubo intestinal, endodermo pancreatico y precursor endocrino en ruta a celulas que expresan hormonas endocrinas”.
En otro ejemplo, Fisk et al presenta un sistema para producir ceulas islotes pancreaticas a partir de celulas madre embrionarias humanas (US2006/0040387A1). En este caso, la secuencia de diferenciacion se dividio en tres fases. Primero las ceulas madre embrionarias humanas se diferenciaron del endodermo usando una combinacion de butirato sodico y activina A. Despues, las celulas se cultivaron con antagonistas de TGF-p como Nogina en combinacion con EGF o betacelulina para generar celulas positivas PDX1. La diferenciacion terminal fue inducida por nicotinamida.
Aun falta una significativa necesidad para desarrollar metodos in vitro para generar un ceulas que exprese insulina funcional, que se parezca lo maximo posible a una celula p. La presente invencion toma una tecnica alternativa para mejorar la eficiencia de diferenciacion de celulas madre pluripotentes hacia celulas que expresan insulina, generando una poblacion de ceulas precursoras pancreaticas que utilizan un inhibidor de CYP26A.
Resumen
La invencion proporciona un metodo para derivar una poblacion de ceulas precursoras endocrinas pancreaticas de celulas madre pluripotentes que comprende las etapas de:
a. cultivar una poblacion de celulas madre pluripotentes;
b. diferencia las celulas madre pluripotentes en una poblacion de celulas que expresan marcadores
caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo;
c. diferenciar las celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo en una
poblacion de celulas de tubo intestinal primitivo;
d. diferenciar la poblacion de celulas de tubo intestinal primitivo en una poblacion de celulas del intestino
proximal posterior; y
e. tratar la poblacion de las celulas del intestino proximal posterior con un medio complementado con un
inhibidor de CYP26A.
Resumen de la divulgacion
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La presente divulgacion describe un metodo que utiliza un acido inhibidor de CYP26A para producir una poblacion de celulas precursoras endocrinas pancreaticas.
En una realizacion, la formacion de la poblacion de celulas precursoras endocrinas pancreatica se consigue utilizando un protocolo de diferenciacion en forma de etapas, donde una poblacion de celulas madre pluripotentes primero se diferencia en una poblacion de celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo. Despues, la poblacion de celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo se diferencia en una poblacion de celulas de tubo intestinal primitivo. A continuacion, la poblacion de celulas de tubo intestinal primitivo se diferencia en una poblacion de celulas de intestino proximal posterior. Despues, la poblacion de celulas de intestino proximal posterior se diferencia en una poblacion de celulas precursoras endocrinas al tratar las celulas del intestino proximal posterior con un medio complementado con un inhibidor de CYP26A.
En una realizacion, la poblacion de celulas precursoras endocrinas se diferencia ademas en una poblacion de celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje de endocrino pancreatico.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra datos PCR en tiempo real obtenidos de muestras obtenidas de celulas en las fases III- IV, del protocolo descrito en el Ejemplo de Referencia 1, para a) PAX4, b) NGN3, c) PDX1, d) NEUROD, e) NKX6.1, f) CDX2 y g) Albumina. El eje y es una expresion de pliegue sobre celulas H1 no diferenciadas. El panel H muestra la inmunotincion de NGN3 para cultivos tratados con control y CYP26A en la fase IV.
La Figura 2 muestra datos PCR en tiempo real obtenidos de muestras obtenidas de celulas en las fases III- IV, del protocolo descrito en el Ejemplo de Referencia 2, para a) NGN3, b) NEUROD, c) CDX2, d), NKX6.1 y e) PDX1. El eje y es una expresion de pliegue sobre celulas H1 no diferenciadas.
La Figura 3 muestra imagenes de fase de celulas en las fases I-VI del protocolo descrito en el Ejemplo de Referencia 3.
La Figura 4 muestra graficos PACS para la expresion de KNX6.1 y CDX2 en celulas en las fases V y VII del protocolo descrito en el Ejemplo de Referencia 3.
Descripcion detallada
Por motivos de claridad de la divulgacion, y no a modo de limitacion, la descripcion detallada de la invencion esta dividida en las siguientes subsecciones que describen o ilustran ciertas caracterlsticas, realizaciones o aplicaciones de la presente invencion.
Definiciones
Las celulas madre son celulas no diferenciadas definidas por su habilidad en un unico nivel celular para auto-renovarse y diferenciarse para producir celulas progenie, incluyendo progenitores auto-renovadores, progenitores no renovadores y celulas terminalmente diferenciadas. Las celulas madres tambien se caracterizan por su habilidad para diferenciarse in vitro en celulas funcionales de varios linajes celulares a partir de multiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), as! como para dar lugar a multiples capas de tejidos despues del trasplante y para contribuir sustancialmente a la mayorla, sino a todos, los tejidos despues de inyeccion de blastocitos.
Las celulas madre se clasifican por su potencial en el desarrollo como: (1) totipotentes, lo que significa que son capaces de dar lugar a todos los tipos de celulas embrionarias y extraembrionarias; (2) pluripotentes, lo que significa que son capaces de dar lugar a todas las celulas embrionarias; (3) multipotentes, lo que significa que son capaces de dar lugar a un subconjunto de linajes celulares pero todos dentro de un tejido, organo o sistema fisiologico particular (por ejemplo, celulas madre hematopoyeticas (CMH) puede producir progenie que incluye HSC (auto-renovacion), progenitores oligopoentes restringidos de celula sangulnea y todos los tipos y elementos celulares (por ejemplo, plaquetas) que son componentes normales de la sangre); (4) oligopotentes, lo que significa que dan lugar a un subconjunto mas restringido de linajes celulares que las celulas madre multipotentes; y (5) unipotentes, lo que significa que pueden dar lugar a un unico linaje celular (por ejemplo, celulas madre espermatogenicas).
La diferenciacion es el proceso por el que una celula no especializada (“no comprometida”) o menos especializada adquiere las caracterlsticas de una celula especializad como, por ejemplo, una celula nerviosa o una celula muscular. Una celula diferenciada o inducida por diferenciacion es una que ha tomada una posicion mas especializada (“comprometida”) en el linaje de una celula. El termino “comprometido/a”, cuando se aplica al proceso de diferenciacion, se refiere a una celulas que se ha sometido a la secuencia de diferenciacion hasta un punto en el que, bajo circunstancias normales, continuara diferenciandose en un tipo especlfico de celula o subconjunto de tipos de celula, y no puede, bajo circunstancias normales, diferenciase en un tipo diferente de celula o volver a ser un tipo
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de celula menos diferenciada. La desdiferenciacion se refiere al proceso por el que una celula vuelve a una posicion menos especializada (o comprometida) en el linaje de una celula. Como aqui se usa, el linaje de una celula define la herencia de una celula, esto es, de que celula viene y que celula da lugar a. El linaje de una celula coloca a la celula en un programa hereditario de desarrollo y diferenciacion. Un marcador especifico de linaje se refiere a una caracteristica especificamente asociada con el fenotipo de celulas de linaje de interes y puede usase para evaluar la diferenciacion de una celula no comprometida con el linaje de interes.
“Las celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo definitivo” o “celulas de etapa 1” o “Etapa 1”, como aqui se usan, se refieren a celulas que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CERI, Nodal, FGF8, Braquiuro, proteina homeobox de tipo mezcla, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 u OTX2. Las celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo definitivo incluyen celulas precursoras de sucesion, celulas primitivas de sucesion, ceulas de mesendodermo y celulas de endodermo definitivo.
“Las celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo pancreatico”, como aqui se usan, se refieren a celulas que expresan uno de los siguientes marcadores: PDX1, NKX6.1, HNF1 beta, PTFI alfa, HNF6, HNF4 alfa, SOX9, HB9 o PROX1. Las celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo pancreatico incluyen celulas de endodermo pancreatico, celulas primitivas de tubo intestinal y celulas del intestino proximal posterior.
“El endodermo definitivo”, como aqui se usa, se refiere a celulas que tienen las caracteristicas de celulas que surgen del epiblasto durante la gastrulacion y que forma el tracto gastrointestinal y sus derivados. Las celulas de endodermo definitivo expesan los siguientes marcadores: HNF3 beta, GATA4, SOX17, Cerberus, OTX2, goosecoide, C-Kit, CD99 y MIXL1.
“Los marcadores”, como aqui se usan, son moleculas de acido nucleico o polipeptido que se expresan diferenciadamente en una celula de interes. En este contexto, la expresion diferencial significa un mayor nivel para un marcador positivo y un menor nivel para un marcador negativo. El nivel detectable del acido nucleico o polipeptido del marcador es suficientemente mas alto o mas bajo en las celulas de interes en comparacion con otras celulas, de tal manera que las celulas de interes pueden identificarse y distinguirse de otras celulas usando cualquiera de una variedad de metodos conocidos en la tecnica.
“La celula precursora endocrina pancreatica”, como aqui se usa, se refiere a una celula que expresa al menos uno de los siguientes marcadores: NGN3, NEUROD o NKX2.2.
“La celula de intestino proximal posterior”, como aqui se usa, se refiere a una celula que expresa al menos uno de los siguientes marcadores: PDX1 o HNF6.
“La hormona pancreatica inmadura que expresa celulas”, como aqui se usa, se refiere a una celula que expresa al menos uno de los siguientes marcadores: insulina, glucagon, somatostatina, MAFB, PDX1, ARX, NKX.6, NKX2.2 o NEUROD.
“La celula primitiva de tubo de intestino”, como aqui se usa, se refiere a una celula que expresa al menos uno de los siguientes marcadores: HNF1 beta o HNF4 alfa.
“La celula endocrina pancreatica” o “celula que expresa hormona pancreatica” o “celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje endocrino pancreatico”, como aqui se usa, se refiere a una celula capaz de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagon, somatostatina y polipeptido pancreatico.
Aislamiento, expansion y cultivo de celulas madre pluripotentes
Caracterizacion de celulas madre pluripotentes
Las celulas madre pluripotentes pueden expresar uno o mas antigenos embrionarios especificos de la etapa (SSEA) 3 y 4, y los marcadores detectables usando anticuerpos designados Tra-1-60 Tra-1-81. La
diferenciacion de celulas madre pluripotentes in vitro da como resultado la perdida de SSEA-4, la expresion de Tra 160 y Tra 1-81 (si esta presente) y una mayor expresion de SSEA-1. Las celulas madre pluripotentes no diferenciadas tienen tipicamente actividad de fosfatasa alcalina, que puede detectarse fijando las celulas con 4% formaldehido, y despues desarrollando con Vector Rojo como sustrato, como lo describe el fabricante (Vector Laboratories, Burlingame Calif.). Las celulas madre pluripotentes no diferenciadas tambien expresan tipicamente OCT4 y TERT, como lo detecta RT-PCR.
Otro fenotipo deseable de celulas madre pluripotentes propagadas es un potencial para diferenciarse en celulas de las tres capas germinales: tejidos de endodermo, mesodermo y ectodermo. La pluripotencia de celulas madre pluripotentes puede confirmarse, por ejemplo, inyectando celulas en ratones inmunodeficientes combinados severos (SCID), fijando los teratomas que se forman usando 4% formaldehido, y despues examinandolos
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histologicamente para evidencia de tipos de celulas de los tres grupos germinales. Alternativamente, la pluripotencia puede determinarse mediante la creacion de cuerpos embrionarios y evaluando los cuerpos embrionarios para la presencia de marcadores asociados con las tres capas germinales.
Las llneas de celulas madres pluripotentes propagadas pueden identificase con cariotipo usando una tecnica de calificacion G y compararse con cariotipos publicados de las correspondientes especies de primates. Si se desea obtener celulas que tengan un “cariotipo normal”, lo que significa que las celulas son euploides, donde todos los cromosomas humanos estan presentes y no se alteran perceptiblemente.
Fuentes de celulas madre pluripotentes
Los tipos de celulas madre pluripotentes que pueden usarse incluyen llneas establecidas de celulas pluripoentes derivadas de tejidos formados despues de la gestacion, incluyendo tejido pre-embrionario tejido fetal tomado en cualquier momento durante la gestacion, tlpicamente aunque no necesariamente antes de aproximadamente la semana 10 a 12 de gestacion. Los ejemplos no limitativos son llneas establecidas de celulas madre embrionarias humanas o celulas germinales embrionarias humanas. Tambien se contempla el uso de las composiciones de esta divulgacion durante el establecimiento inicial o estabilizacion de tales celulas, en cuyo caso las celulas fuente serlan celulas pluripotentes primarias tomadas directamente de los tejidos fuentes. Tambien son adecuadas las celulas tomadas de una poblacion de celulas madre pluripotentes ya cultivada en ausencia de celulas alimentadoras. Tambien son adecuadas las llneas de celulas madre embrionarias humanas mutantes.
Cultivo de celulas madre pluripotentes
En una realizacion, las celulas madre pluripotentes se cultivan en una capa de celulas alimentadoras que mantienen a las ceulas madre pluripotentes de varias maneras. Alternativamente, las celulas madre pluripotentes se cultivan en un sistema de cultivo que esta esencialmente libre de celulas alimentadoras, pero que, sin embargo, mantiene la proliferacion de celulas madre pluripotentes sin sufrir una sustancial diferenciacion. El crecimiento de celulas madre pluripotentes en un cultivo libre de alimentadores sin diferenciacion se mantiene usando un medio acondicionado cultivando previamente otro tipo de celula. Alternativamente, el crecimiento de celulas madre pluripotentes en un cultivo libre de alimentadores sin diferenciacion se mantiene usado un medio qulmicamente definido.
En una realizacion, las celulas madre pluripotentes pueden cultivarse en una capa celular alimentadora de fibroblasto embrionario de raton de acuerdo con los metodos desvelados en Reubinoff et al (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)). Alternativamente, las celulas madre pluripotentes pueden cultivarse en una capa celular alimentadora de fibroblasto embrionario de raton de acuerdo con los metodos desvelados en Thompson et al. (Science 6 noviembre 1998: Vol. 282, n° 5391, pags.: 1145 - 1147). Alternativamente, las celulas madre pluripotentes pueden cultivarse en uno cualquiera de las capas celulares alimentadoras desveladas en Richards et al (Stem Cell 21: 546-556, 2003).
En una realizacion, las celulas madre pluripotentes pueden cultivarse en una capa celular alimentadora humana de acuerdo con los metodos desvelados en Wang et al (Stem Cell 23: 1221-1227, 2005). En una realizacion alternativa, las celulas madre pluripotentes pueden cultivarse en la capa celular alimentadora humana desvelada en Stojkovic et al (Stem Cell 2005 23: 306-314, 2005). Alternativamente, las celulas madre pluripotentes pueden cultivase en la capa celular alimentadora humana desvelada en Miyamoto et al (Stem Cell 22: 433-440, 2004). Alternativamente, las celulas madre pluripotentes pueden cultivase en la capa celular alimentadora humana desvelada en Amit et al (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003). Alternativamente, las celulas madre pluripotentes pueden cultivase en la capa celular alimentadora humana desvelada Izunza et al. (Stem Cell 23: 544-549, 2005).
En una realizacion, las celulas madre pluripotentes pueden cultivarse en un medio de cultivo derivado de acuerdo con los metodos desvelados en US200020072117. Alternativamente, las celulas madre pluripotentes pueden cultivarse en un medio de cultivo derivado de acuerdo con los metodos desvelados en US6642048. Alternativamente, las celulas madre pluripotentes pueden cultivarse en un medio de cultivo derivado de acuerdo con los metodos desvelados en WO2005014799. Alternativamente, las celulas madre pluripotentes pueden cultivarse en un medio de cultivo derivado de acuerdo con los metodos desvelados en Xu et al (Stem Cell 22: 972-980, 2004). Alternativamente, las celulas madre pluripotentes pueden cultivarse en un medio de cultivo derivado de acuerdo con los metodos desvelados en US20070010011. Alternativamente, las celulas madre pluripotentes pueden cultivarse en un medio de cultivo derivado de acuerdo con los metodos desvelados en US20050233446. Alternativamente, las celulas madre pluripotentes pueden cultivarse en un medio de cultivo derivado de acuerdo con los metodos desvelados en US6800480. Alternativamente, las celulas madre pluripotentes pueden cultivarse en un medio de cultivo derivado de acuerdo con los metodos desvelados en WO2005065354.
En una realizacion, las celulas madre pluripotentes pueden cultivarse de acuerdo con los metodos desvelados en Cheon et al (BioReprod D0I:10.1095/biolreprod.105.046870, octubre 19, 2005). Alternativamente, las celulas madre pluripotentes pueden cultivarse de acuerdo con los metodos desvelados en Levenstein et al (Stem Cell 24: 568-574, 2006). Alternativamente, las celulas madre pluripotentes pueden cultivarse de acuerdo con los
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metodos desvelados en US20050148070. Alternativamente, las celulas madre pluripotentes pueden cultivarse de acuerdo con los metodos desvelados en US20050244962. Alternativamente, las celulas madre pluripotentes pueden cultivarse de acuerdo con los metodos desvelados en WO2005086845.
Las celulas madre pluripotentes pueden colocarse en placas en un sustrato adecuado de cultivo. En una realizacion, el sustrato adecuado de cultivo es un componente de matriz extracelular, como, por ejemplo, aquellos derivados de membrana de base o pueden formar parte de enlaces de adhesion molecular receptor-ligando. E una realizacion, el sustrato adecuado de cultivo es MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® es una preparacion soluble de celulas tumorales de Engelbreth-Holm que gelifica a temperatura ambiente para formar una membrana de base reconstituida.
Otro componente de matriz extracelular y mezclas de componentes son adecuados como alternativa. Dependiendo del tipo de celula que se esta proliferando, este puede incluir laminina, fibronectina, proteoglicano, entactina, heparan sulfato y similares, solos o en varias combinaciones.
Las celulas madre pluripotentes pueden colocarse en placa en un sustrato en una distribucion adecuada y en presencia de un medio que impulse la supervivencia, propagation y retention celular de las caracterlsticas deseable. Todas estas caracterlsticas se benefician de una atencion cuidadosa en la distribucion de siembra y un experto en la tecnica puede determinarlas facilmente.
Los medios de cultivo adecuados pueden hacerse a partir de los siguientes componentes, como, por ejemplo, medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), Gibco # 11965-092; medio de Eagle modificado de Dulbecco Knockout (DMEM KO), Gibco # 10829-018; F12 de Ham/50% medio basal DMEM; 200 mM L-glutamina, Gibco # 15039-027; solution de aminoacido no esencial, Gibco 11140-050; p-mercaptoetanol, Sigma # M7522; factor de crecimiento de fibroblasto basico recombinante humano (FCFb), Gibco # 13256-029.
Formacion de celulas precursoras endocrinas pancreaticas a partir de celulas madre pluripotentes
La presente invention proporciona metodos para la formacion de una poblacion de celulas precursoras pancreaticas a partir de una poblacion de celulas madre pluripotentes. En una realizacion, la presente invencion proporciona metodos para diferenciar ademas las celulas precursoras endocrinas en ceulas que expresan marcadores del linaje endocrino pancreatico.
En una realizacion, la presente invencion proporciona un metodo para producir ceulas precursoras pancreaticas, que comprende las etapas de:
a. Cultivar una poblacion de celulas madre pluripotentes;
b. Diferenciar la poblacion de celulas madre pluripotentes en una poblacion de celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo;
c. Diferenciar las celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo en una poblacion de celulas de tubo intestinal primitivo;
d. Diferenciar la poblacion de celulas de tubo intestinal primitivo en una poblacion de celulas del intestino proximal posterior; y
e. Diferenciar la poblacion de celulas del intestino proximal posterior en una poblacion de celulas precursoras endocrinas pancreaticas tratando la poblacion de celulas del intestino proximal posterior con un medio complementado con un inhibidor de CYP26A.
La poblacion de celulas precursoras endocrinas puede ademas tratarse para formar una poblacion de celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje endocrino pancreatico.
La eficiencia de diferenciacion puede determinarse exponiendo una poblacion celular tratada a un agente (tal como un anticuerpo) que especlficamente reconoce un marcador de protelna expresado por celulas que expresan marcadores caracterlsticos del tipo deseado de celula.
Los metodos para evaluar la expresion de marcadores de protelnas y de acido nucleico en ceulas cultivadas o aislada son estandar en la tecnica. Estos incluyen reaction en cadena de la polimerasa con transcription inversa (RT-PCR), hibridacion Northern, hibridacion in situ (vease, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, eds. 2001 suplemento)) e inmunoensayos como analisis inmunohistoqulmicos de material seccionado, electrotransferencia, y para marcadores que son accesible en celulas intactas, analisis de citometrla de flujo (FACS) (vease, por ejemplo, Harlow y Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
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Las caracterlsticas de celulas madre pluripotentes son bien conocidas para aquellos expertos en la tecnica, y continuan identificandose caracterlsticas adicionales de celulas madre pluripotentes. Los marcadores de ceulas madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, la expresion de uno o mas de los siguientes: ABCG2, cripto, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.
Despues de tratar las celulas madre pluripotentes con los metodos de la presente invencion, las celulas diferenciadas pueden purificarse exponiendo una poblacion de celula tratada a un agente (tal como un anticuerpo) que especlficamente reconoce un marcador proteico, como CXCR4, expresado por celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo.
Las celulas madre pluripotentes para su uso en la presente invencion incluyen, por ejemplo, la llnea de celula madre embrionaria humana SA002 (Cellartis, Suecia). Tambien adecuadas para su uso en la presente invencion son las celulas que expresan al menos uno de los siguientes marcadores caracterlsticos de celulas pluripotentes: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 y Tra 1-81.
Los marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo se seleccionan del grupo consistente en SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Branquiuro, protelna homeobox de tipo mezcla, FGF4, CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 y OTX2. Adecuada para su uso en la presente invencion es una celula que expresa al menos uno de los marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo. En un aspecto de la presente invencion, una celula que expresa marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo es una celula precursora primitiva de sucesion. En un aspecto alternativo, una celula que expresa marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo es una celula mesendodermo. En un aspecto alternativo, una celula que expresa marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo es una celula de endodermo definitivo.
Los marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo (que incluye celulas del tubo intestinal primitivo y celulas del intestino proximal posterior) se seleccionan del grupo consistente en PDX1, NKX6.1, HNF1 beta, PTF1 alfa, HNF6, HNF4 alfa, SOX9, HB9 y PROX1. Adecuada para su uso en la presente invencion es una celula que expresa al menos uno de los marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo pancreatico. En un aspecto de la presente invencion, una celula que expresa marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo pancreatico es una celula de endodermo pancreatico.
Los marcadores caracterlsticos del linaje endocrino pancreatico se seleccionan del grupo consistente en NGN2, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, NGN3 Y PTF-1 alfa. En una realizacion, una celula endocrina pancreatica es capaz de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagon, somatostatina y polipeptido pancreatico. Adecuada para su uso en la presente invencion es una celula que expresa al menos uno de los marcadores caracterlsticos del linaje endocrino pancreatico. En un aspecto de la presente invencion, una celula que expresa marcadores caracterlsticos del linaje endocrino pancreatico es una celula endocrina pancreatica. La celula endocrina pancreatica puede ser una celula que expresa hormona pancreatica. Alternativamente, la celula endocrina pancreatica puede ser una celula que secreta hormona pancreatica.
En un aspecto de la presente invencion, la celula endocrina pancreatica es una celula que expresa marcadores caracterlsticos del linaje celular p. Una celula que expresa marcadores caracterlsticos del linaje celular p. Una celula que expresa marcadores caracterlsticos del linaje celular p expresa PDX1 y al menos uno de los siguientes factores de transcripcion: NGN2, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 beta, MAFA, PAX4 y PAX6. En un aspecto de la presente invencion, una celula que expresa marcadores caracterlsticos del linaje celular p es una celula p.
Formation de celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo de celulas madre pluripotentes
Las poblaciones de celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo pueden formarse a partir de poblaciones de celulas madre pluripotentes mediante cualquier metodo en la tecnica.
Por ejemplo, las poblaciones de celulas madre pluripotentes pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los metodos desvelados en D' Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005).
Por ejemplo, las poblaciones de celulas madre pluripotentes pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los metodos desvelados en Shinozaki et al, Development 131, 1651 - 1662 (2004).
Por ejemplo, las poblaciones de celulas madre pluripotentes pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los metodos desvelados en McLean et al., Stem Cells 25, 29 - 38 (2007).
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Por ejemplo, las poblaciones de celulas madre pluripotentes pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los metodos desvelados en D' Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).
Por ejemplo, las poblaciones de celulas madre pluripotentes pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los metodos desvelados en la solicitud de patente de Estados Unidos N° de Serie 11/736.908.
Por ejemplo, las poblaciones de celulas madre pluripotentes pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los metodos desvelados en la solicitud de patente de Estados Unidos N° de Serie 11/779.311.
Por ejemplo, las poblaciones de celulas madre pluripotentes pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los metodos desvelados en la solicitud de patente de Estados Unidos N° de Serie 12/493.741.
Por ejemplo, las poblaciones de celulas madre pluripotentes pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los metodos desvelados en la solicitud de patente de Estados Unidos N° de Serie 12/494.789.
Formation de celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo pancreatico
Las celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo pancreatico incluyen ceulas de endodermo pancreatico, celulas de tubo intestinal primitivo y celulas de intestino proximal posterior. En una realizacion, las poblaciones de celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo definitivo formadas mediante los metodos de la presente invencion se diferencian ademas en poblaciones de celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo pancreatico mediante un metodo en la tecnica.
Por ejemplo, las poblaciones de celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo definitivo obtenidas de acuerdo con los metodos de la presente invencion pueden ademas diferenciarse en poblaciones de celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo pancreatico tratando la poblacion de celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los metodos desvelados en D' Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Por ejemplo, las poblaciones de celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo definitivo obtenidas de acuerdo con los metodos de la presente invencion pueden ademas diferenciarse en poblaciones de celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo pancreatico tratando la poblacion de celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los metodos desvelados en la solicitud de patente de Estados Unidos N° de Serie 11/736.908.
Formation de poblacion de ceulas precursoras endocrinas pancreaticas
En una realizacion, la presente invencion proporciona un metodo para producir celulas precursoras pancreaticas, que comprende las etapas de:
a. Cultivar una poblacion de celulas madre pluripotentes;
b. Diferenciar la poblacion de celulas madre pluripotentes en una poblacion de celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo definitivo;
c. Diferenciar las celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo definitivo en una poblacion de celulas de tubo intestinal primitivo;
d. Diferenciar la poblacion de celulas de tubo intestinal primitivo en una poblacion de celulas del intestino proximal posterior; y
e. Diferenciar la poblacion de celulas del intestino proximal posterior en una poblacion de celulas precursoras endocrinas pancreaticas tratando la poblacion de celulas del intestino proximal posterior con un medio complementado con un inhibidor de CYP26A.
El inhibidor de CYP26A puede usarse en una concentracion de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 1000 nM. Alternativamente, el inhibidor de CYP26A puede usare en una concentracion de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 100 nM.
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Cualquier inhibidor de CYP26A es adecuado para su uso en la presente invention. Por ejemplo, el inhibidor de CYP26A puede seleccionarse de los compuestos desvelados en la patente de Estados Unidos N° 7.468.391. Alternativamente, el inhibidor de CYP26A puede seleccionase de los compuestos desvelados en la solicitud de patente de Estados Unidos N° 2005/0187298A1. Alternativamente, el inhibidor de CYP26A puede seleccionarse de los compuestos desvelados en la solicitud de patente de Estados Unidos N° 2004/0106216A1. Alternativamente, el inhibidor de CYP26A puede seleccionarse de los compuestos desvelados en WO2005058301A1. Alternativamente, el inhibidor de CYP26A puede seleccionarse de los compuestos desvelados en PNAS 12 Mayo, 2009, vol. 106, n° 19 7864-7869. En una realization, el inhibidor de CYP26A es N-{4-[2-Etil-1-(1H-1, 2, 4, triazol-1-il)butilo]fenilo}-1, 3- benzotiazo-2-amina. Vease la Formula I.
Formula I
En una realizacion, el medio complementado con un inhibidor de CYP26A se complementa ademas con al menos un factor seleccionado del grupo consistente en un factor capaz de inhibir un BMP, un inhibidor senalizador receptor de TGFp, vitamina A y un activador de PKC.
En una realizacion, el factor capaz de inhibir BMP es nogina. Puede usarse nogina en una concentration de desde aproximadamente 50ng/ml a aproximadamente 500pg/ml. En una realizacion, se usa nogina en una concentracion de 100ng/ml.
En una realizacion, el inhibidor senalizador de TGFp es un inhibidor de ALK5. En una realizacion, el inhibidor de ALK5 es un inhibidor II de ALK5. El inhibidor II de ALK5 puede usarse en una concentracion de desde aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 10 pM. En una realizacion, el inhibidor II de ALK5 se usa en una concentracion de 1 pM.
En una realizacion, el activador de PKC se selecciona del grupo consistente en (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4- (Trifluorometil) fenil)-2,4-pentadiemoilamino) benzolactam, Indolactam V (ILV), forbol-12-miristato-13-acetato (PMA), y forbol-12,13-dibutirato (PDBu). En una realizacion, el activador de protelna quinasa C es (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4- (t rifluorometil) fenil)-2,4-pentadiemoilamino) benzolactam. (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(Trifluorometil)fenil)-2,4-
pentadiemoilamino) benzolactam puede usase en una concentracion de desde aproximadamente 20nM a aproximadamente 500nM. (2S, 5S)-(E, E)- 8-(5-(4-(Trifluorometil)fenil)-2,4-pentadiemoilamino) benzolactam, es aqul referido como "TPB".
Formation de celulas que expresan marcadores caracterfsticos del linaje endocrino pancreatico
En una realizacion, la poblacion de celulas precursoras endocrinas pancreaticas producidas mediante los metodos de la presente invencion se diferencian en poblaciones de celulas que expresan marcadores caracterfsticos del linaje endocrino pancreatico mediante un metodo en la tecnica.
Por ejemplo, las poblaciones de celulas que expresan marcadores caracterfsticos del linaje de endodermo pancreatico pueden ademas diferenciarse en poblaciones de celulas que expresan marcadores caracterfsticos del linaje endocrino pancreatico tratando la poblacion de celulas que expresan marcadores caracterfsticos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los metodos desvelados en D' Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Por ejemplo, las poblaciones de celulas que expresan marcadores caracterfsticos del linaje de endodermo pancreatico pueden ademas diferenciarse en poblaciones de celulas que expresan marcadores caracterfsticos del linaje endocrino pancreatico tratando la poblacion de celulas que expresan marcadores caracterfsticos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los metodos desvelados en D' Amour et al., Nature Biotechnology, 2006. (este parrafo es identico al anterior).
Por ejemplo, las poblaciones de celulas que expresan marcadores caracterfsticos del linaje de endodermo pancreatico pueden ademas diferenciarse en poblaciones de celulas que expresan marcadores caracterfsticos del linaje endocrino pancreatico tratando la poblacion de celulas que expresan marcadores caracterfsticos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los metodos desvelados en la solicitud de patente de Estados Unidos N° de Serie 11/736.908.
Por ejemplo, las poblaciones de celulas que expresan marcadores caracterfsticos del linaje de endodermo pancreatico pueden ademas diferenciarse en poblaciones de celulas que expresan marcadores caracterfsticos del linaje endocrino pancreatico tratando la poblacion de celulas que expresan marcadores caracterfsticos del linaje de
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Por ejemplo, las poblaciones de celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo pancreatico pueden ademas diferenciarse en poblaciones de celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje endocrino pancreatico tratando la poblacion de celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los metodos desvelados en la solicitud de patente de Estados Unidos N° de Serie 60/953.178.
Por ejemplo, las poblaciones de celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo pancreatico pueden ademas diferenciarse en poblaciones de celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje endocrino pancreatico tratando la poblacion de celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los metodos desvelados en la solicitud de patente de Estados Unidos N° de Serie 60/990.529.
La presente invencion se ilustra mas, pero no se limita a, los siguientes ejemplos.
EJEMPLOS
Ejemplo de Referenda 1
Diferenciacion de celulas de linea de celula madre embrionaria humana H1 en celulas precursoras endocrinas pancreaticas en medio de cultivo celular que carece de SFB y que contiene un inhibidor de CYP26A.
Las celulas de la linea de celulas madre embrionarias humanas H1 (p40-p50) se cultivaron en platos cubiertos con MATRIGEL® (dilucion 1:30) (BD Biosciences; Cat # 356231) en mEf-CM (medio acondicionado con fibroblasto embrionario de raton) como colonias y se diferenciaron en celulas precursoras endocrinas pancreaticas de la siguiente manera:
a. Fase I (Endodermo definitivo): Celulas madre embrionarias humanas se cultivaron en medio RPMI complementado con 2% BSA libre de acido graso (Catalogo# 68700, Proliant, IA), y 100 ng/ml activina A (R&D Systems, MN) mas 20 ng/ml WNT-3a (Catalogo# 100-18B-PeproTech, NJ), durante un dia, seguido de tratamiento con medio RMPI complementado con 2% BSA y 100 ng/ml activina A mas 8 ng/ml de bFGF durante dos dias adicionales, despues
b. Fase II (Tubo de intestino primitivo): Las celulas se trataron con RPMI + 2% BSA libre de acido graso y 50 ng/ml FGF7, durante dias, despues
c. Fase III (Instestino proximal posterior): Las celulas se trataron con DMEM/Glucosa alta complementado con dilucion 1:200 de ITS-X (Invitrogen, Ca) y 0,1% BSA (rico en lipido) (Invitrogen, Ca, N° 11021-045), 50 ng/ml FGF7, 0,25 pM SANT-1,2 acido retinoico (AR) (Sigma, MO); 100 mg/ml de Nogina (R&D Systems, MN), 2,5 pM 4-[4-(4-Fluorofenil)-1-(3-fenilpropil)-5-piridin-4-il-1H-imidazol-2-il]but-3-in-1-ol (un inhibidor de P38 desvelado en la patente de Estados Unidos 6.521.655),y activina A en 20 ng/ml durante cinco dias, despues,
d. Fase IV (precursor endocrino pancreatico): Las celulas se trataron con DMEM/Glucosa alta complementado con dilucion 1:200 de ITS-X (Invitrogen, CA) y 0,1% BSA (Invitrogen, Ca), 100 ng/ml Nogina, 1 mM inhibidor de ALK5 (SD-208, desvelado en Molecular Pharmacology 2007 72:152-161), 500 nM TPB (modulador de proteinas precursora amiloide a) (Catalogo #565740, EMD, CA), y 10-100 nM del inhibidor de CYP26A N-{4-[2-Etil-1-(1 H-1, 2, 4-triazol-1-il)butil]fenil}-1, 3-benzothiazol-2-amina, y10-100 nM Vitamina A (Catalogo# R7632, Sigma, MO) durante cuatro dias, o
En algunos cultivos, la Fase IV se extendio a seis dias. mARN se aislo en las fases III y IV para analisis PCR a tiempo real de genes pancreaticos relacionados. Como se muestra en la Figura 1, la adicion del inhibidor de CYP26A en la fase IV impulso de manera significativa la expresion de marcadores precursores endocrinos (NGN3, Pax4, NeuroD) junto con el marcador de endodermo pancreatico NKX6.1 de una manera dependiente de dosis. La adicion de Vitamina A junto con el inhibidor de CYP26A no modifico de manera significativa la expresion de endodermo pancreatico o marcadores de precursor endocrino. Ademas, la adicion del inhibidor de CYP26A en la fase IV disminuyo la expresion de CDX2 (un marcador intestinal) y albumina (un marcador del higado). La inmunotincion para NGN3 (Catalogo# AF3444, R&D Systems, MN) en la fase IV mostro claramente un impulso significativo en la expresion de NGN3 para cultivos tratados con 100 nM del inhibidor de CYP26A.
Ejemplo de Referencia 2
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Un metodo alternative para la diferenciacion de celulas de la ifnea de celula madre embrionaria humana H1 en celulas precursoras endocrinas pancreaticas en medio de cultivo celular que carece de SFB y que contiene un inhibidor de CYP26A.
Las celulas de la llnea de celulas madre embrionarias humanas H1 (p40-p52) se cultivaron como celulas sencillas en una densidad de 100000 celulas/m2 en platos cubiertos con mAtRIGEL® (dilucion 1:30) (BD Biosciences; Cat # 356231) en MEF-CM (medio acondicionado con fibroblasto embrionario de raton complementado) con 16 ng/ml de FGF2 (Catalogo# 100-18B, PeproTech, NJ) y 10 pM de Y27632 (Inhibidor Rock, , Catalogo# Y0503, Sigma, MO). 72 horas despues de la siembra, los cultivos se diferenciaron en endodermo definitivo (ED) de la siguiente manera:
a. Fase I (Endodermo Definitivo): Las celulas madre embrionarias humanas se trataron con medio MCDB- 131 (Catalogo# 10372-019, Invitrogen, CA) complementado con 2% BSA libre de acido graso (Catalogo# 68700, Proliant, IA), 0,0025 g/ml bicarbonato de sodio (Catalogo # S3187, Sigma, MO), 1X GlutaMax™ (Catalogo # 35050-079, Invitrogen, Ca) y 100 ng/ml activina A (R&D Systems, MN) mas 20 ng/ml WNT-3a (Catalog# 1324-WN-002, R&D Systems, MN) durante un dlas, seguido de tratamiento con medio MCDB-131 complementado con 2% BSA, bicarbonato de sodio, Glutamax y 100 ng/kl activina A durante tres dlas mas, despues
b. Fase II (Tubo de intestino primitivo): Las celulas se trataron con MCDB-131 + 2% BSA libre de acido graso y 50 ng/ml FGF7 y durante tres dlas, despues
c. Fase III (Intestino proximal posterior): Las celulas se trataron con MCDB-131/Glucosa alta (25 mM glucosa) complementado con dilucion 1:200 de ITS-X (Invitrogen, CA), 1X GlutaMax™ (Catalogo # 35050-079, Invitrogen, Ca), 0,0025 g/ml bicarbonato de sodio (Catalogo # S3187, Sigma, MO), 0,1% BSA (rico en llpico) (Invitrogen, Ca N° 11021-045) ,50 ng/ml FGF7, 0,25 pM SANT-1, 2 pM acido retinoico (AR) (Sigma, MO), 2,5 pM 4-[4-(4-Fluorofenil)-1-(3-fenilpropil)- 5-piridin-4-yl-1H-imidazol-2-il]but-3-in-1-ol (un inhibidor de p38, desvelado en la patente de Estados Unidos 6.521.65), 100 nM LdN-193189 (inhibidor de receptor BMP, Catalogo # 04-0019, Stemgent, CA), 500 nM del inhibidor de CYP26A N-{4-[2-Etil-1-(1H-1, 2, 4-triazol-1- il)butil]fenil}-1, 3-benzotiazol-2-amina, y activina A en 20 ng/ml durante cuatro dlas, despues
d. Fase IV (Precursor endocrino pancreatico): Las celulas se trataron con MCDB-131/Glucosa alta (25 mM glucosa) complementado con dilucion 1:200 de ITS-X (Invitrogen, CA) y 0,1% BSA (Invitrogen, CA), 1X, GlutaMax™ (Catalogo# 35050-079, Invitrogen, Ca), 0,0025 g/ml bicarbonato de sodio (Catalogo # S3187, Sigma, MO), 1 pM inhibidor de ALK5 (SD-208, desvelado en Molecular Pharmacology 2007 72:152-161), 500 nM PDBu (activador de PKC) (Catalogo #P1269, Sigma, MO), 100 nM LDN-193189 (receptor inhibidor de BMP, Catalogo # 04-0019, Stemgent, CA), 0.25 pM SANT-1 (#S4572, Sigma, MO), y 500 nM del inhibidor de CYP26A N-{4-[2-Etil-1-(1 H-1,2, 4-triazol-1-il)butil]fenil}-1, 3-benzotiazol-2-amina durante siete dlas, o
e. Fase IV (precursor endocrino pancreatico): Las celulas se trataron con MCDB-131/Glucosa alta (25 mM glucosa) complementado con dilucion 1:200 de ITS-X (Invitrogen, CA), y 0,1% BSA (Invitrogen, Ca), 1X GlutaMax™ (Catalogo# 35050-079, Invitrogen, Ca), 0,0025 g/ml bicarbonato de sodio (Catalogo # s3187, Sigma, MO), 1 pM inhibidor de ALK5 (SD-208, desvelado en Molecular Pharmacology 2007 72:152-161), 500 nM PDBu (activador de PKC) (Catalogo #P1269, Sigma, MO), 100 nM LDN-193189 (receptor inhibidor de BMP, Catalogo # 04-0019, Stemgent, CA), 0.25 pM SANT-1 (#S4572, Sigma, MO) durante siete dlas.
Se aislo mARN en las etapas III y IV para analisis PCR en tiempo real de genes pancreaticos relacionados. De manera similar a los resultados observados en el Ejemplo de Referenda 1 anterior, la adicion del inhibidor de CYP26A en la fase IV mejoro la expresion de marcadores precursores endocrinos pancreaticos, como NGN3 y NeuroD (Vease Figura 2). La adicion del inhibidor en las etapas III y IV mejoro ademas la expresion de NGN3 y NeuroD. Sorprendentemente, la adicion del inhibidor de CYP26A en la fase III (en presencia de acido retinoico) significativamente regulo mediante reduction de PDX-1 y NKX6.1, mientras mejoro la expresion de CDX2. Estos resultados sugieren que la fase optima para la adicion de inhibidor de CYP26A es la fase IV.
Ejemplo de Referencia 3
Un metodo alternativo para la diferenciacion de celulas de la lfnea de celula madre embrionaria humana H1 en celulas endocrinas pancreaticas en medio de cultivo celular que carece de SFB y que contiene un inhibidor de CYP26A.
Las celulas de la llnea de celulas madre embrionarias humanas H1 (p40-p52) se cultivaron como celulas sencillas en una densidad de 100000 celulas/m2 en platos cubiertos con mAtRIGEL® (dilucion 1:30) (BD Biosciences; Cat # 356231) en MEF-CM (medio acondicionado con fibroblasto embrionario de raton complementado) con 16 ng/ml de FGF2 (Catalogo# 100-18B, PeproTech, NJ) y 10 pM de Y27632 (Inhibidor Rock, , Catalogo# Y0503, Sigma, MO). 72 horas despues de la siembra, los cultivos se diferenciaron en endodermo definitivo (ED) de la siguiente manera:
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a. Fase I (Endodermo Definitivo): Las celulas madre embrionarias humanas se cultivaron como celulas sencillas en platos cubiertos con Matrigel con medio MCDB-131 (Catalogo# 10372-019, Invitrogen, CA) complementado con 2% BSA libre de acido graso (Catalogo# 68700, Proliant, IA), 0,0025 g/ml bicarbonato de sodio (Catalogo# S3187 Sigma, MO), 1X GlutaMax™ (Catalogo # 35050-079, Invitrogen, Ca) y 100 ng/ml GDF-8 (R&D Systems, MN) mas 2,5 pg/ml del inhibidor de GSK3B 14-Prop-2-en-1-il,3,5,7,14,17,23,27- heptaazatetraciclo [19.3.1.1=2,6=1=8,12=]heptacosa-1(25), 2(27), 3, 5, 8 (26), 9, 11, 21-23-nonaen-16-uno durante un dla seguido de tratamiento con medio MCDB-131 complementado con 2% BSA, bicarbonato de sodio, Glutamax y 100 ng/kl GDF-8 durante tres dlas mas, despues
b. Fase II (Tubo de intestino primitivo): Las celulas se trataron con MCDB-131 + 2% BSA libre de acido graso y 50 ng/ml FGF7 y durante dos dlas, despues
c. Fase III (Intestino proximal posterior): Las celulas se trataron con MCDB-131/Glucosa alta (25 mM glucosa) complementado con dilucion 1:200 de ITS-X (Invitrogen, CA), 1X GlutaMax™ (Catalogo # 35050-079, Invitrogen, Ca), 0,0025 g/ml bicarbonato de sodio (Catalogo # S3187, Sigma, MO), 0,1% BSA (rico en llpico) (Invitrogen, Ca N° 11021-045) ,50 ng/ml FGF7, 0,25 pM SANT-1, 2 pM acido retinoico (AR) (Sigma, MO), 2,5 pM 4-[4-(4-Fluorofenil)-1 -(3-fenilpropil)- 5-piridin-4-il-1H-imidazol-2-il]but-3-in-1-ol), 100 nM LDN-193189 (inhibidor de receptor BMP, Catalogo # 04-0019, Stemgent, CA) y activina A en 20 ng/ml durante cuatro dlas, despues
d. Fase IV (Precursor pancreatico): Las celulas se trataron con MCDB-131/Glucosa alta (25 mM glucosa) complementado con dilucion 1:200 de ITS-X (Invitrogen, CA) y 0,1% BSA (Invitrogen, CA), 1X, GlutaMax™ (Catalogo# 35050-079, Invitrogen, Ca), 0,0025 g/ml bicarbonato de sodio (Catalogo # S3187, Sigma, MO), 100 nM LDN-193189 (inhibidor de receptor BMP, Catalogo # 04-0019, Stemgent, CA), 50 nM pDbu (activador PKC) (Catalogo #P1269, Sigma, SO), 0.25 pM SANT-1 (#S4572, Sigma, MO), y 100 nM del inhibidor de CYP26A N-{4-[2-Etil-1-(1H-1,2, 4-triazol-1-il)butil]fenil}-1, 3-benzotiazol-2-amina durante tres dlas, despues
e. Fase V (precursor endocrino pancreatico): Las celulas se trataron con MCDB-131/Glucosa alta (25 mM glucosa) complementado con dilucion 1:200 de ITS-X (Invitrogen, CA), y 0,1% BSA (Invitrogen, Ca), 1X GlutaMax™ (Catalogo# 35050-079, Invitrogen, Ca), 0,0025 g/ml bicarbonato de sodio (Catalogo # s3187, Sigma, MO), 100 nM LDN-193189 (inhibidor de receptor BMP, Catalogo # 04-0019, Stemgent, CA), 0,25 pM SANT-1 (#S4572, Sigma, MO), 2 pM inhibidor de AlK5 (SD-208, desvelado en Molecular Pharmacology 2007 72:152-161) y 100 nM del inhibidor de CYP26A N-{4-[2-Etil-1-(1H-1,2, 4-triazol-1-il)butil]fenil}-1, 3- benzotiazol-2-amina durante tres dlas, despues
f. Fase VI (celulas que expresan hormona pancreatica inmadura). Las celulas se trataron con MCDB- 131/Glucosa alta (25 mM glucosa) complementado con dilucion 1:200 de ITS-X (Invitrogen, CA), y 0,1% BSA (Invitrogen, CA), 1X GlutaMax™ (Catalogo# 35050-079, Invitrogen, Ca), 0,0025 g/ml bicarbonato de sodio (Catalogo # S3187, Sigma, MO), 100 nM LDN-193189 (inhibidor de receptor BMP, Catalogo # 04-0019, Stemgent, CA) y 2 pM inhibidor de ALK5 (SD-208, desvelado en Molecular Pharmacology 2007 72:152-161) durante tres dlas, despues
g. Fase VII (celulas que expresan hormona pancreatica). Las celulas se trataron con MCDB-131/Glucosa alta (25 mM glucosa) complementado con dilucion 1:200 de ITS-X (Invitrogen, CA), y 0,1% BSA (Invitrogen, CA), 1x GlutaMax™ (Catalogo# 35050-079, Invitrogen, Ca), 0,0025 g/ml bicarbonato de sodio (Catalogo # S3187, Sigma, MO), 100 nM LDN-193189 (inhibidor de receptor BMP, Catalogo # 04-0019, Stemgent, CA)m 2 pM inhibidor de ALK5 (SD-208, desvelado en Molecular Pharmacology 2007 72:152-161) y 100 nM Vitamina A (Catalogo# R7632, Sigma, MO) durante tres dlas.
En algunos de los cultivos, la fase VII se extendio hasta 18 dlas. Se recogieron muestran en las fases V, VI y para analisis PCR en tiempo real, tincion con inmunofluorescencia (IF) y analisis FACS. Tanto para FACS como para tincion con inmunofluorescencia (IF), el anticuerpo NKX6.1 se obtuvo del banco de hibridomas de la Universidad de Iowa (Catalogo# ab76541, Cambridge, mA), y el anticuerpo PDX-1 se compro en Abcam (Catalogo# ab47267). La Figura 3 subraya la morfologla de cultivos en varias etapas de diferenciacion. Siguiendo la etapa II, los cultivos mostraron morfologla homogenea a lo largo de las etapas III-VI. La Figura 4 representa la expresion de NKX6.1 como lo midio FACS para varias etapas de diferenciacion. Esta figura subraya que el protocolo desvelado en el Ejemplo de Referencia 3 puede conservar la expresion de NKX6.1 a lo largo de las etapas tardlas de diferenciacion. La Figura 5 muestra la tincion IF para la expresion de PDX1, NKX6.1 y CDX2 para la etapa V y etapa VII del protocolo. Mas del 90% de las celulas positivas para NKx6.1 fueron tambien positivas para PDX1, mientras que menos del 10% de las celulas se tineron positivas para CDX2.
Aunque varios aspectos de la invencion se han ilustrado anteriormente por referencia a los ejemplos y realizaciones preferentes, se apreciara que el alcance de la invencion esta definida por la description anterior sino por las siguientes reivindicaciones construidas bajo principios de la ley de patentes.

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para derivar una poblacion de celulas precursoras endocrinas pancreaticas de celulas madre pluripotentes que comprende las etapas de:
    a. cultivar una poblacion de celulas madre pluripotentes;
    b. diferencia las celulas madre pluripotentes en una poblacion de celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo;
    c. diferenciar las celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje de endodermo definitivo en una poblacion de celulas de tubo intestinal primitivo;
    d. diferenciar la poblacion de celulas de tubo intestinal primitivo en una poblacion de celulas del intestino proximal posterior; y
    e. tratar la poblacion de las celulas del intestino proximal posterior con un medio complementado con un inhibidor de CYP26A.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, donde el inhibidor de CYP26A se usa en una concentracion de desde aproximadamente 1 nM a aproximadamente 1000 nM.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, donde el inhibidor de CYP26A se usa en una concentracion de desde aproximadamente 10 nM a aproximadamente 100 nM.
  4. 4. El metodo de una cualquiera de las reivindicadores 1 a 3, donde el inhibidor de CYP26A es N-{4-[2-Etil-1-(1H-1, 2, 4-triazol-1-il)butil]fenil}-1, 3-benzotiazol-2-amina.
  5. 5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la poblacion de celulas precursoras endocrinas pancreaticas se diferencia ademas en una poblacion de celulas que expresan marcadores caracterlsticos del linaje endocrino pancreatico.
  6. 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el medio complementado con un inhibidor de CYP26A se complementa ademas con al menos un factor seleccionado del grupo consistente en un factor capaz de inhibir BMP, un inhibidor senalizador de receptor TGFp, vitamina A y activador de protelna quinasa C (PCK).
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 6, donde el factor capaz de inhibir BMP es nogina.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 7, donde la nogina se usa en usa en una concentracion de desde aproximadamente 50ng/ml a aproximadamente 500pg/ml o en una concentracion de 100ng/ml.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 6, donde el inhibidor senalizador de receptor TGFp es un inhibidor de ALK5, opcionalmente un inhibidor II de ALK5.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 9, donde el inhibidor II de ALK5 se usa en una concentracion de desde aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 10 pM o en una concentracion de 1 pM.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 6, donde el activador PCK se selecciona del grupo consistente en (2S, 5S)-(E, E)- 8-(5-(4-(Trifluorometil) fenil)-2,4-pentadiemoilamino) benzolactam, Indolactam V (ILV), forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) y forbol-12,13-dibutirato (PDBu).
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 11, donde el activador de PCK es (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(Trifluorometil) fenil)-2,4- pentadiemoilamino) benzolactam, opcionalmente usado en una concentracion de desde aproximadamente 20nM a aproximadamente 500nM.
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