CN101541953A

CN101541953A - 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织

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Publication number: CN101541953A
Application number: CNA2007800289039A
Authority: CN
Inventors: 斯蒂芬·达尔顿; 戴维·雷诺兹; 迈克尔·库利克
Original assignee: University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Current assignee: University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Priority date: 2006-06-02
Filing date: 2007-06-04
Publication date: 2009-09-23

Abstract

本发明涉及允许从多能干细胞例如人胚胎干细胞和定形内胚层细胞的有效分化，以形成胰内胚层细胞的方法。本发明直接应用于制备终代胰岛β细胞，所述胰岛β细胞可作为治愈糖尿病的部分治疗使用。此外，本发明可用于从人胚胎干细胞和定形内胚层细胞制备肝内胚层细胞。本发明涉及使用没有饲养细胞的确定成分培养基，从干细胞，优选人胚胎干细胞，制备定形内胚层和胰内胚层细胞的方法。从胚胎干细胞提供胰内胚层细胞的简单的两个步骤代表了本发明的其他实施方案。

Description

通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织

发明领域

本发明涉及从多能干细胞例如人胚胎干细胞和定形内胚层(definitiveendoderm)细胞的有效分化，以形成胰内胚层细胞的方法。本发明直接应用于制备胰岛β细胞，所述胰岛β细胞可作为治愈糖尿病的治疗的一部分使用。此外，本发明可用于从人胚胎干细胞和定形内胚层细胞制备肝内胚层细胞。

本发明涉及用于使用无饲养细胞的确定成分培养基(defined media)从干细胞(优选人胚胎干细胞)制备定形内胚层和胰内胚层细胞的方法。

相关申请

本申请要求2006年6月2日提交的，标题为“通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰腺和肝内胚层细胞和组织”的临时申请US60/810,424，和2007年3月15日提交的，标题为“从人胚胎干细胞制备定形内胚层和胰腺内胚层的改进方法”的US60/918,100的利益，两个申请均在此全部引入作为参考。

发明背景

胚胎干(ES)细胞代表在早期胚胎内多能细胞生物学和分化的机制研究的有效模型系统，并且提供了哺乳动物基因操作的机会和由此得到的商业、医学和农业应用。此外，ES细胞的适当增殖和分化可用于制备适于移植的无限制的细胞源，用于治疗由细胞损伤或功能障碍引起的疾病。如国际专利申请WO 99/53021中所描述的包括早期原始外胚层样(EPL)细胞的其他多能细胞和细胞株、体内或体外衍生的ICM/上胚层、体内或体外衍生的原始外胚层、原始生殖细胞(EG细胞)、畸胎癌细胞(EC细胞)、和由分化或核转移衍生的多能细胞共有部分或全部的这些特性和应用。最近，已建立使ES细胞分化成为定形内胚层细胞的方法。本发明是从人胚胎干细胞和定形内胚层细胞开始。

多能细胞的成功分离、长期克隆维持、基因操作和种系传递(germ-linetransmission)通常很难，并且其原因未知。国际专利申请WO 97/32033和美国专利No.5,453,357描述了包括来自除啮齿类外物种的多能细胞。人ES细胞已在国际专利申请WO 00/27995和美国专利No.6,200,806中描述，且人EG细胞已在国际专利申请WO 98/43679中描述。

已证明通过多能细胞的体外分化，紧密控制分化或形成特殊分化或终末分化细胞的均一细胞群的能力是有问题的。当前的方法包括从多能细胞以无控制的方式形成胚胎体，并且不能形成均一的细胞群。混合的细胞群，例如此种类型的胚胎体中的细胞，通常不可能适于治疗或商业用途。

调节ES细胞多能性和分化的生物化学机制十分不明确。然而，有限可用的经验数据说明多能ES细胞在体外培养条件下的持续维持依赖于细胞外血清环境中存在的细胞因子和生长因子。已发现通过许多这类因子例如胰岛素、IGF(s)和FGF(s)通过脂激酶磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-激酶)激活细胞内信号事件(Carpenter & Cantley，(1996)Curr.Opin.Cell.Biol.，8：153-158)。响应这些可溶性因子对特异细胞表面受体的结合，PI3-激酶募集至细胞内膜表面，启动第二信号事件通路，导致几种下游的细胞内靶分子的功能调节，所述靶分子影响多种生物学过程。

称为′纳巴霉素的哺乳动物靶点′(mTOR)的蛋白激酶在PI3-激酶的下游靶点中。mTOR的刺激既在核糖体p70S6激酶激活之前，也是核糖体p70S6激酶激活所必须的，核糖体p70S6激酶是丝氨酸/苏氨酸激酶，是调节蛋白合成系统的主要激酶(Chung等人，(1994)Nature，370：71-75)。

在胚胎发育期间，从三种主要的细胞群形成身体组织：外胚层、中胚层和定形内胚层。这些细胞群，也称为原代生殖细胞层，通过称为原肠胚形成的过程形成。在原肠胚形成后，每个原代生殖细胞层产生特异的细胞群和组织。中胚层制备血细胞、内皮细胞、心脏和骨骼肌和脂肪细胞。定形内胚层产生肝、胰腺和肺。外胚层产生神经系统、皮肤和肾上腺组织。

因此，需要用于制备细胞谱系丰富的细胞群，并进一步分化定形内胚层细胞成为胰内胚层细胞和/或肝内胚层细胞，从而促进这些细胞的增殖，和这些细胞进一步分化的产物的确定方法和组合物。

人多能细胞，包括从人脐带血获得的细胞，提供了研究人发育早期和几种疾病状态例如糖尿病和帕金森氏病治疗干预的独特机会。例如，使用从hESCs衍生的胰岛素生成的β-细胞可提供对现有细胞治疗方法的巨大改进，现有细胞治疗方法利用来自供体胰腺的细胞。现有的对糖尿病的细胞治疗，利用来自供体胰腺的细胞，受到移植所需高质量胰岛细胞缺乏的限制。对单一I型糖尿病患者的细胞治疗需要约8x10⁸个胰腺胰岛细胞的移植(Shapiro等人，2000，N Engl J Med 343：230-238；Shapiro等人，2001a，BestPract Res Clin Endocrinol Metab 15：241-264；Shapiro等人，2001b，Bmj322：861)。像这样，当前对于成功的移植需要至少两个健康的供体器官以获得足够的胰岛细胞。自hESCs获得的定形内胚层细胞，提供了原料源，从原料可发展出大量的高质量的分化的胰腺内胚层或肝内胚层细胞，用于在人细胞治疗中使用的进一步分化和分化细胞的制备。

人胚胎干细胞(hESCs)可分化成为3个胚层(外胚层、中胚层和定形内胚层)或胚外内胚层，这依赖于所使用的培养条件(图1)。在多种条件下，hESCs已被成功地分化成为定形内胚层(DE)。D′Amour等人(2005)描述了将手动传代的hESCs置于小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上生长，在基因敲除代血清(knockout serum replacement)(KSR)存在的培养基中，作为分化起始点。分化成为DE，之后在包含低浓度的FCS或暂时无FCS的培养基存在下，加入激活蛋白A(Activin A)(或相似因子例如Nodal)。另一种我们开发的方法(McLean等人，2007)利用生长在无饲养层条件下的hESCs，培养基由补充Fgf2的MEF条件培养基组成。之后通过加入PI3K信号抑制剂例如LY294002或雷帕霉素，促进分化为DE。两种方法均制备包含～70-80％DE的细胞群，通过包括CXCR4、Sox17、FoxA2等的DE标记分析鉴定。

DE可进一步分化成胰腺内胚层(PE)，其为胰腺细胞谱系前体的细胞类型，并且表达如Pdx1的标记。在从DE至PE的转变中，细胞经过肠管样状态(gut tube like state)。从hESCs在手动传代的MEF饲养层上的生长描述PE形成的方法。从DE至PE的分化包括细胞经过肠管样状态，此时细胞表达例如Tcf2/HNF1B和HNF4A的标记，并且包括为了至少部分分化在FCS中的培养(D′Amour等人，2006)。我们也描述了通过加入视黄酸直接从DE培养物形成PE的方法，也包括在FCS中在基质胶(Matrigel)上胶原酶传代的细胞的培养(Dalton和Kulik UGARF提交2006)。

D′Amour等人，Nature Biotech，2005

McLean等人，Stem Cells，Jan.2007

D′Amour等人，Nature Biotech，2006

如上文所述的方法，在专利提交中或同级别的出版物中已经报道了几种用于从hESCs制备DE的方法。这些方法使用饲养成纤维细胞或无饲养层条件，但是胎牛血清和/或KSR总是存在的。这就存在问题，因为由于批次的差异，这些成分产生了实验的不一致性。因为FCS和KSR包含不确定的活性，当使用hESCs用于治疗开发时，这就存在问题。

附图说明

图1表示在处理定形内胚层后，表达胚胎肝标记物(embryonic livermarker)甲胎蛋白(AFP)的细胞的制备。在加入LY 294002(50μM)后4天，BG01hESCs分化成为定形内胚层。培养基更换为DMEM/F12，10％FCS，并且细胞生长至6天以上。未处理：未处理的hESCs。通过QRT-PCR分析AFP转录水平，一式三份，在标准化为GAPDH的参照转录后，转录水平表示为相对未处理样本(hESCs)的倍数增加。注意：尽管在加入Fgf10后可见最佳的AFP诱导，但在Fgf10存在或不存在时都可得到此结果。

图2表明在RA处理后，Pdx1转录诱导的时程。BG01hESCs使用LY294002(50μM)处理4天，之后换至包含DMEM/F12，10％FCS，50ng/mlFgf10和2μM视黄酸的培养基中至多4天。未处理-未处理的hESCs。通过QRT-PCR分析转录水平，一式三份，在标准化为GAPDH的参照转录后，转录水平表示为相对未处理样本(hESCs)的倍数增加。表明Pdx1转录水平的倍数诱导。

图3表明在RA处理后，Pdx1和Isl1转录诱导的时程。用LY 294002(50μM)处理BG01hESCs4天，之后换至由DMEM/F12，10％FCS，50ng/mlFgf10和2μM视黄酸组成的培养基中至多4天。未处理：未处理的hESCs。通过QRT-PCR分析转录水平，一式三份，在标准化为GAPDH的参照转录后，转录水平表示为相对未处理样本(hESCs)的倍数增加。

图4表明在不同培养条件下，Sox17、AFP和Pdx1的改变。未处理：在MEF-CM、Fgf2、20％KSR存在下，培养在基质胶上的未处理的BG01 hESCs。LYA：在MEF-CM和Fgf2中生长在基质胶上的hESCs用LY 294002处理4天。F106d：用LY 294002处理4天的hESCs，换至包含Fgf10(50ng/ml)、10％FCS的培养基中6天。RA4d/2d：用LY 294002处理4天的hESCs，换至包含Fgf10(50ng/ml)、2μM RA、10％FCS的培养基(DMEM/F12)中4天。随后在缺少RA和Fgf10的相同培养基中再培养2天。通过QRT-PCR分析Sox17、AFP和Pdx1转录，一式三份，在标准化为GAPDH的参照转录后，转录水平表示为相对未处理样本(hESCs)的倍数增加。

图5表明用RA处理的Pdx1+细胞的免疫荧光染色。在加入LY 294002(50μM)后4天BG01 hESCs分化至定形内胚层。培养基换为DMEM/F12，10％FCS，并且如下细胞再生长至多5天。用LY 294002处理4天的hESCs换至包含Fgf10(50ng/ml)、2μM RA、10％FCS的培养基(DMEM/F12)5天。处理和未处理(hESCs)生长在用4％多聚甲醛包被的LabTec细胞培养玻片上，与探针兔抗-人Pdx1抗体(Chemicon，1∶1,000)一起孵育，随后与AlexaFluor(594nm)标记的山羊抗-兔二抗(红色)一起孵育。在包含DAPI的培养基中计数细胞，所述DAPI用于使核DAN(蓝色)可视化。

图6表明当在合适的条件下培养时，表达例如Oct4、Nanog、Sox2和Rex1的hESCs可分化成三胚层(中胚层、外胚层和定形内胚层)或胚外细胞类型。为了制备定形内胚层，hESCs转变首选经过中内胚层样状态(T+、MixL1+、Wnt3a+)。在经过中内胚层细胞的转变后，可成为定形内胚层(CXCR4+、Sox17+、GATA4，6+、Gsc+、FoxA2+)。定形内胚层是可形成其他内胚层谱系的前体细胞类型。

图7表明在hESC确定成分培养基配方(a)中使用accutase酶传代的BG02hESCs。为了DE分化，在～18-24小时后，替换为分化培养基(a)，存在或不存在Wnt3a(25ng/ml)。指定时间从培养基制备RNA，进行T、MixL1、GSC、Sox17和CXCR4转录的QRT-PCR分析。Q-PCR反应标准化为GAPDH对照。′所需实验(Assays on demand)′QRT-PCR反应来自AppliedBiosystems公司，并且之前已有描述(McLean等人，2007)。

图8表明发生定形内胚层分化而排除其他的细胞谱系。BG02 hESCs置于确定条件(a)中，在18小时后，培养基换为含有Wnt3a(25ng/ml)的分化培养基(a)，首先孵育24小时。时程进行96小时。在24、48、72和96小时，收集分化培养基(a)中的未处理hESCs(96小时)或细胞，用于QRT-PCR分析。′所需实验′QRT-PCR反应来自Applied Biosystems公司，并且之前已有描述(McLean等人，2007)。

图9表明BG02hESCs如图8中接种并分化。指定时间(UT，未处理；在分化培养基中[a]24、48、72、96小时)，固定细胞并通过与识别T(R&D Systems)和Sox17的抗体孵育进行免疫细胞化学(ICC)实验(D′Amour等人，2005)。使用DAPI进行DNA染色，并显示合并的DAPI、T和Sox17染色。放大20倍。

图10表明nanog阳性细胞在分化期间减少。BG02hESCs如图8、9中接种并分化。指定时间(UT，未处理；在分化培养基中[a]24、48、72、96小时)，固定细胞并通过与识别Nanog的抗体一起孵育进行免疫细胞化学(ICC)实验。使用DAPI进行DNA染色，并显示合并的DAPI和Nanog染色。放大20倍。

图11表示在分化培养基(a)中分化96小时，并用识别DE细胞表面标记物CXCR4的抗体染色的BG02hESCs。未处理的hESC培养物(BG02)仅有非常少量的CXCR4+细胞(＜3％)，但＞93％的处理细胞(BG02 d4-DE)为CXCR4阳性。

图12表示BG02 hESCs的明场照片。在确定条件下制备的DE。DE经过4天的时间制备。放大10倍。

图13表明在确定成分培养基条件下，使用RA处理DE后，与PE形成相关的转录的QRT-PCR分析。BG02 hESCs经4天分化成为DE，在指定时间在包含视黄酸和Fgf10的培养基中分裂并分化。QRT-PCR数据表示为标准化为GAPDH对照后的数据。时间点指DE形成后的时间(天)。

图14表明在确定条件下，从hESC-衍生的DE制备的PE培养物的ICC。如在图13图例中所描述的进行细胞分化。细胞用4％多聚甲醛固定，之后在用RA和Fgf10处理后的2、6、12天用Triton X-100进行渗透化处理，之后用山羊抗-人Pdx1抗体或TCF2抗体(R&D Systems)和DAPI(DNA)染色。放大20倍。

图15表明hESC’s至胰内胚层细胞的分化。在确定条件下，这些细胞如上所述在步骤1(激活蛋白A、低P13激酶或P13激酶抑制剂)分化3-5天，随后8-10天(步骤2)，时间在图中指明，并且Ngn3和Pdx1mRNAs的水平使用TaqMan探针进行Q-PCR评价。

发明简述

本发明涉及胰内胚层细胞(PE)，通过在包含有效量的胎牛血清(FCS-优选约10％的基础培养基加血清)中，将定形内胚层细胞暴露于有效浓度的视黄酸(至少约0.05-0.1μg/ml，优选约0.1-25μg/ml，更优选约0.1-2.0μg/ml)至少约2天，优选至少约4天，并且更优选约4天，随后将步骤1获得的细胞暴露于无视黄酸的基础培养基中的FCS(优选约10％)至少1天，优选至少约2天，从定形内胚层细胞获得所述胰内胚层细胞。这种方法优选导致在处理样品中至少约35-50％并且优选至少约70-80+％的细胞表达胰腺内胚层标记物，Pdx1和Isl1。

使用上述本发明的方法从定形内胚层细胞制备的细胞群PE标记物Pdx1和Isl1的纯度高达70-80％。使用本发明的方法，在人定形内胚层细胞(DE)处理后，通常观察到Pdx1mRNA增加从70倍至几百倍。这种制备的有效性是出人意料的。在现有技术方法中，从DE制备PE(Pdx1+和Isl1+)的有效性通常在约10-20％的范围内。

在其它实施方案中，可以使用与上述胰内胚层细胞相同的制备方法，定形内胚层(DE)细胞分化成为肝内胚层细胞，但在此方法中，用有效量10ng/ml-100ng/ml(优选，约50ng/ml)的Fgf10代替视黄酸。

尽管在本发明中可使用任何定形内胚层(DE)，但优选的内胚层是使用PI3K抑制剂LY 294002从人胚胎干细胞获得的。在用于从hESC获得DE的方法中，在基础培养基中hESC’s暴露于LY 294002约4-5天，以获得优选用于制备表达生物标记物的胰腺内胚层的定形内胚层。

DE是人细胞型，具有分化成包括肝、肺、胰腺、胸腺、肠、胃和甲状腺的细胞的能力。在本发明中，用我们方法已能够制备胰腺内胚层(PE)细胞，从而最终高效率地、持续地提供胰岛β细胞。本方法建立了定形内胚层分化成为胰腺内胚层(PE)的方便的方法。胰腺内胚层是具有分化成为包括β细胞的多种胰腺谱系能力，但不再具有分化成为非-胰腺谱系细胞的能力的细胞。

一方面，本发明涉及具有高达70-80+％胰腺内胚层标记物Pdx1和/或Isl1的细胞群。在本发明中，人胚胎干细胞(hESCs)经过下列处理以形成定形内胚层(DE)细胞，在任选包含胎牛血清(FCS)的基础培养基中，定形内胚层细胞暴露于有效浓度的视黄酸至少约2天，优选至少4天，并且更优选约4天，随后使步骤1中的分化细胞接触没有视黄酸的基础培养基(优选包含有效量的FCS)至少一天，优选至少约2天。此方法优选导致至少约50％和优选至少约70-80+％的被处理的样品中的细胞表达胰腺内胚层标记物Pdx1和/或Isl1。

除了上述优选的用于制备起始的定形内胚层细胞的方法，在本发明中，定形内胚层细胞可通过任何本领域已知的方法制备，包括例如在美国申请出版物20060003446中G.Keller等人；20060003313中K.D’Amour等人、20050158853中K.D’Amour等人和20050260749中Jon Odorico等人建立的方法，相关部分在此引用作为参考。

在其它实施方案中，本发明涉及改善hESCs分化成为DE，和之后成为成为PE的方法和条件，其使用确定成分培养基，所述培养基不使用不确定成分，例如胎牛血清或血清补充物例如KSR培养基。DE制备的有效性和培养系统的稳固性与之前的报道相比显著增大。

在这些其它实施方案中，本发明涉及在无饲养细胞条件下，从哺乳动物胚胎干细胞，优选人胚胎干细胞，产生定形内胚层细胞的方法，包括使用生长基质或如本文所述的方法，将接种的胚胎干细胞暴露于确定成分培养基或MEF条件培养基，并且之后将干细胞暴露于为确定成分的培养基的分化培养基(没有胎牛血清或KSR类型血清成分并且无IGF和胰岛素)，所述培养基包含有效量的SMAD通路激动剂，例如TGFβ超家族成员(浓度为从1ng/ml至100ng/ml，优选约25-50ng/ml)，例如激活蛋白A、nodal、TGFβ或其他TGF成分，并且任选的包含PI3激酶信号抑制剂(如本文所述)。任选的，包括有效量的牛血清白蛋白(约0.5-3％，优选约2％)以提供蛋白质源。优选的，确定成分培养基包含P13K信号抑制剂。优选的，包括有效量的Wnt3a(1ng/ml至约100ng/ml，优选约25ng/ml)。优选的，生长基质如本文所述为基质胶。

在此方面，本发明提供了通过将干细胞暴露于包括促进分化成为定形内胚层细胞成分的，无血清或因子(IGF或胰岛素)或促机PI3激酶活性的成分的确定成分培养基(使用有效量的激活蛋白A、nodal或TGFβ或如本文所述的其他物质)，从人胚胎干细胞(生长在任何培养基中，优选确定成分培养基中)提供高水平定形内胚层细胞的方法。在约3-6天之后，优选4-5天后获得的定形内胚层细胞可暴露于在确定成分培养基(优选包含Wnt3a和BSA)中有效浓度的视黄酸(至少约0.1-0.2μg/ml，优选至少约1μg/ml，约2-25μg/ml，更优选约10μg/ml，并且任选的有效量的Fgf10(浓度约1ng/ml至约100ng/ml，优选浓度约50ng/ml)约5-12天，优选约8-10天，以制备表达Pdx1和Isl1标记物的胰腺内胚层(PE)细胞，所述细胞可再暴露于相同培养基几天(约1-5天)以制备表达Ngn3和Nkx6.1标记物的内分泌胰腺细胞。

本发明适用于在多种无饲养层条件下生长的hESCs的培养，条件包括但不限制于细胞生长在：

1.在基质上例如基质胶上MEF条件培养基，其包含分化试剂；

2.确定成分培养基制剂，其不使用条件培养基、FCS或KSR型血清补充物。

如本文所述的方法，代替基质胶使用BD Cell-Tak^TM Cell和TissueAdhesive、BD^TM FIBROGEN Human Recombinant Collagen I、BD^TMFIBROGEN Human Recombinant Collagen III、BD Matrigel^TM BasementMembrane Matrix、BD Matrigel^TM Basement Membrane Matrix HighConcentration(HC)、BD^TM PuraMatrix^TM Peptide Hydrogel、Collagen I、CollagenI High Concentration(HC)、Collagen II(Bovine)、Collagen III、Collagen IV、Collagen V和Collagen VI等，其包括有效量的层粘连蛋白、牛腱蛋白、血小板反应蛋白、胶元、纤连蛋白、vibronectin、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸及其混合物中的一种或多种。

本发明还涉及从胚胎干细胞优选人胚胎干细胞制备定形内胚层细胞的方法，该方法包括无饲养细胞将胚胎干细胞暴露于分化培养基，所述培养基包含较高水平的激活蛋白A、nodal或TNFβ，并且任选的包含PI3激酶信号抑制剂，其中分化培养基是确定成分培养基，无胎牛血清或KSR类型血清成分。

在本发明的一方面，从胚胎干细胞制备至少约90％的定形内胚层细胞。

在本发明的每个实施方案中定形内胚层细胞或其他本领域可用的细胞可进一步分化为胰内胚层细胞。

发明详述

下列术语用于描述本发明：

除非另有说明，根据相关领域普通技术人员的常规用法理解本文使用的术语。除了下面提供的术语的定义外，分子生物学中的常用术语的定义可见Rieger等人，1991 Glossary of genetics：classical and molecular，第5版，柏林：Springer-Verlag；和Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人，Eds.，Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley& Sons，Inc.，(1998 Supplement)联合出版。应当理解如在说明书和权利要求书中所使用的″a″或″an″可表示一种或多种，这依赖于所使用之处的上下文。因此，例如″a细胞″可指至少一种细胞。

参照下列本发明优选的实施方案和本文包含的实施例的详细说明，可更容易地理解本发明。然而，在公开和描述本发明的组合物和方法前，应当理解本发明不限制于特定的条件，或特定的方法等，当然本发明的改变和多种修改和变更对于本领域技术人员是明显的。

对于生长细胞、分离细胞和相关克隆、DNA分离、扩增和纯化，对于酶反应(包括DNA链接酶、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等)的标准技术，和各种分离技术对于本领域技术人员是已知的并且是常用的。许多标准技术描述于Sambrook等人，1989 Molecular Cloning第二版，冷泉港实验室，Plainview，纽约；Maniatis等人，1982 Molecular Cloning，冷泉港实验室，Plainview，纽约；Wu(Ed.)1993 Meth.Enzymol.218，第I部分；Wu(Ed.)1979Meth.Enzymol.68；Wu等人，(Eds.)1983 Meth.Enzymol.100和101；Grossman和Moldave(Eds.)1980 Meth.Enzymol.65；Miller(ed.)1972Experiments in Molecular genetics，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Old和Primrose，1981 Principles of Gene Manipulation，California Press大学，Berkeley；Schleif和Wensink，1982 Practical Methods in Molecular Biology；Glover(Ed.)1985 DNA Cloning，卷I和II，IRL Press，牛津，英国；Hames和Higgins(Eds.)1985 Nucleic Acid Hybridization，IRL Press，牛津，英国；以及Setlow和Hollaender 1979基因tic Engineering：Principles and Methods，卷1-4，PlenumPress，纽约。使用的缩写和术语认为在本领域中是标准的并且在专业杂志，例如本文引用的杂志中是常用的。

如本文所用，术语“分化试剂”指诱导细胞例如hESC’s或定形内胚层细胞部分或最终分化的任何化合物或分子，其中所述分化是至少部分由于PI3-激酶通路(用于定形内胚层细胞的形成)信号的抑制，包括有效量的视黄酸以形成胰内胚层细胞或包括有效量的成纤维细胞生长因子，例如成纤维细胞生长因子10(Fgf10)以形成肝内胚层细胞。分化试剂为如下描述，但此术语并不限制于此。本文使用的术语″分化试剂″包括表现相似生物活性的天然或合成分子的范围内。

如本文所用，术语“PI3-激酶通路抑制剂”指在接触抑制剂的细胞中，降低PI3-激酶活性或PI3-激酶下游的至少一种分子的任何分子或化合物。这些抑制剂是用于制备定形内胚层细胞的优选的抑制剂，所述定形内胚层细胞是本发明中使用的原料细胞。术语包括，例如PI3-激酶拮抗剂，PI3-激酶信号转导级联的拮抗剂，降低内源性PI3-激酶的合成或表达的化合物，降低内源性PI3-激酶释放的化合物，和抑制PI3-激酶活性激动剂的化合物。在上述的一些实施方案中，抑制剂选自雷帕霉素、LY 294002、渥曼青霉素、氯化锂、Akt抑制剂I、Akt抑制剂II(SH-5)、Akt抑制剂III(SH-6)、NL-71-101，和上述混合物。Akt抑制剂I、II、Akt III和NL-71-101在Calbiochem公司有售。在其他实施方案中，抑制剂选自雷帕霉素和LY 294002。在其他优选的实施方案中，抑制剂包括LY 294002。在另一个实施方案中，抑制剂包括Akt1-II。应当理解可使用抑制剂的组合，以产生所需的分化效果。最终的结果为制备大量的定形内胚层细胞，根据本发明作为起始细胞株用于制备胰内胚层细胞和/或肝内胚层细胞。

在一个优选的实施方案中，多能hESC细胞与有效量的PI3-激酶通路抑制剂接触(优选LY 294002，也称为[2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮，Calbiochem有售，许多其他的生物化学制造厂家有售)，以制备定形内胚层细胞，并且由此制备的定形内胚层细胞与有效量的视黄酸(约0.005-25μg/ml，更优选约0.1-2.0μg/ml，更优选约0.2-2.0μg/ml)，在包含胎牛血清(约1.0％至约20％，优选约10％的胎牛血清)的基础培养基中接触。定形内胚层细胞暴露于包含视黄酸的培养基至少约2天，优选至少约4天，更优选约4天，此后将细胞暴露于包含FCS(优选约10％)的无视黄酸的基础培养基至少1天，优选至少约2天。优选将细胞在每步分离，但可不分离而简单进行。这种方法优选导致在处理样品中至少约30％、至少40％、至少50％、至少60％和优选至少约70-80+％的细胞表达胰腺内胚层标记物Pdx1和/或Isl1。

使用上述本发明的方法从定形内胚层细胞制备PE标记物Pdx1和Isl1纯度高达70-80％的细胞群。使用本发明的方法，处理人胚胎干细胞(hESCs)后，通常观察到Pdx1mRNA表达增加70-倍至几百倍。并且Isl1也显著增加。制备的有效性是出人意料的结果。在现有技术方法中，从hESC’s的PE(Pdx1+和Isl1+)制备的有效性在约10-20％的范围内。

在其它实施方案中，通过下列相同的方法，定形内胚层(DE)细胞可分化为肝内胚层(LE)细胞，所述方法使用上述胰内胚层细胞的制备方法，但使用有效量的成纤维细胞生长因子，优选Fgf10代替视黄酸，所述量优选约10ng/ml-100ng/ml，优选约25ng/ml-75ng/ml，更优选约50ng/ml。在此方法中，定形内胚层细胞在基础培养基中，优选包含FCS(在基础培养基中约1％至约20％，优选约10％的FCS)，暴露于一种多种的成纤维细胞生长因子，优选Fgf10，至少1天，优选至少约2天，甚至更优选至少约4天或更长，或者优选约4天，随后来自步骤1的细胞暴露于基础细胞培养基，该培养基任选地包含有效量的胎牛血清(约1％至约20％，优选约10％FCS)并且无成纤维细胞生长因子，至少1天，并且优选至少约2天，或者优选约2天。

在其它实施方案中，本发明涉及用于改善使用确定成分培养基使hESCs分化成为DE和之后成为PE的方法和条件，所述确定成分培养基不使用不确定的成分，例如胎牛血清或血清补充物，例如KSR培养基。DE制备的有效性和培养系统的稳固性与之前的报道相比显著增加。

在这些其它实施方案中，本发明涉及在无饲养细胞条件下，从哺乳动物胚胎干细胞，优选人胚胎干细胞制备定形内胚层细胞的方法，包括使用生长基质或如本文所述的方法，将接种的胚胎干细胞暴露于确定成分培养基或MEF条件培养基，并且之后将干细胞暴露于为确定成分培养基的分化培养基(无胎牛血清或KSR-型血清成分，并且无IGF和胰岛素)，该培养基包含有效量的SMAD通路激动剂，例如TGFβ超家族成员(浓度1ng/ml至100ng/ml，优选约25-50ng/ml)，例如激活蛋白A、nodal、TGFβ或其他TGF成分，和任选的PI3激酶信号抑制剂(如本文所述)。任选地，包含有效量的牛血清白蛋白(约0.5-3％，优选约2％)，以提供蛋白质源。优选的，确定成分培养基包含P13K信号抑制剂。优选的，包含有效量的Wnt3a(1ng/ml至约100ng/ml，优选约25ng/ml)。优选的，生长基质如本文所述为基质胶。

此方面，本发明的方法提供了通过将干细胞暴露于包含促进分化为定形内胚层细胞的成分(使用有效量的激活蛋白A、nodal或TGFβ或如本文所述)的，无血清或因子(IGF或胰岛素)或促进PI3激酶活性的成分的确定成分的培养基，从人胚胎干细胞(生长在任何培养基中，优选确定成分的培养基)得到高水平的定形内胚层。在约3-6天后优选4-5天后获得定形内胚层细胞，之后可暴露于在确定成分的培养基中(优选包含Wnt3a和BSA)有效浓度的视黄酸(至少约0.1-0.2μg/ml，优选至少约1μg/ml，约2-25μg/ml，更优选约10μg/ml，并且任选的有效量的Fgf10(浓度约1ng/ml至约100ng/ml，优选浓度约50ng/ml)8-10天，以制备表达Pdx1和Isl1标记物的胰腺内胚层(PE)细胞，所述细胞再暴露于相同的培养基几天(约1-5天)，以制备表达Ngn3和Nkx6.1标记物的内分泌胰腺细胞。

在上述每种方法中，细胞可通过用胰蛋白酶或accutase或相似试剂传代而分离，游离并进行本发明的方法，或任选的，并且优选的，来自每步的层制备的细胞不用进一步分离进行下个步骤。细胞也可在使用前离心并吹打，从而限制细胞样品的大小，从而形成单细胞或包含较少细胞的细胞簇。

如本文所用，术语“有效量”指在本发明中任何用于制备目的结果的成分或材料的量和浓度。术语可应用于P13-激酶抑制剂例如LY294002，可有利地用于制备定形内胚层细胞，可应用于视黄酸，作为分化试剂使用以从定形内胚层细胞制备胰内胚层细胞，或应用于成纤维细胞生长因子，作为分化试剂使用以从定形内胚层细胞制备肝内胚层细胞等。

术语“视黄酸”指全反式视黄酸。

术语Fgf成纤维细胞生长因子指生长因子，用于在无视黄酸的本发明的方法中使用，以制备肝内胚层细胞。尽管一种或多种的各种成纤维细胞生长因子可在本发明的方法中使用，优选的成纤维细胞生长因子是成纤维细胞生长因子10(Fgf10)。

术语“基础细胞培养基”、“基础细胞培养基”或“基础培养基”或“细胞分化培养基”或“稳定培养基”用于描述细胞生长培养基，在培养基中制备定形内胚层细胞，或任选的，定形内胚层细胞分化成为胰腺内胚层(PE)细胞或肝内胚层(PE)细胞，或分化后稳定。基础细胞培养基在本领域是众所周知的，并且包含至少最小量的培养基，和任选的成分例如生长因子，包括成纤维细胞生长因子、视黄酸、葡萄糖、非必需氨基酸、盐(包括微量元素)、谷氨酰胺、胰岛素(标明，并不排除)、转铁蛋白、β巯基乙醇和其他本领域已知的试剂和如本文所述的试剂。优选的培养基包括基础细胞培养基，其包含2％至20％(优选，约10％)的胎牛血清，或无胎牛血清和KSR但包含牛血清白蛋白的确定成分培养基。包含10％FCS的DMEM/F12是特别优选的基础细胞培养基。在本发明中使用的基础细胞培养基是市售的，并可用市售成分补充，在许多商业来源中Invitrogen Corp.(GIBCO)、Cell Applications Inc.和Biological Industries、Beth HaEmek以色列有售。在优选的实施方案中，将至少一种分化试剂例如视黄酸、成纤维细胞生长因子或LY294002加入至细胞培养基，干细胞或前体细胞生长在培养基中从而进行干细胞至前体细胞前体细胞至胰内胚层细胞或肝细胞或干细胞至胰内胚层细胞或肝细胞的分化。本领域普通技术人员将能够容易地改变细胞培养基，以根据本发明制备前体或胰腺/肝细胞。细胞分化培养基基本上与基础细胞培养基同义，但在本文中用于分化过程，并且包含细胞分化试剂，以分化细胞至其他细胞。稳定培养基是在分化步骤前或后使用的基础细胞培养基，以稳定细胞株以备后用。一般而言，如本文所用，细胞分化培养基和稳定培养基可包含基本相似的基础细胞培养基的成分，但在不同的地方使用，并且可包含不同的成分从而影响培养基使用的目的结果。

在优选的在确定成分的培养基中(“确定成分的培养基”)形成胰内胚层细胞的案例中，培养基是确定的最低标准培养基(优选来自Gibco的DMEM/F12 50∶50)，其排除了胎牛血清或KSR(基因敲除代血清)、胰岛素和IGF，但包括SMAD通路激动剂，例如TGFβ超家族成员(浓度1ng/ml至100ng/ml，优选约25-50ng/ml)，例如激活蛋白A、nodal、TGFβ或其他TGF成分，和任选的有效量的PI3激酶信号抑制剂(如本文所述)。任选的包括有效量的牛血清白蛋白(约0.5-3％，优选约2％)以提供蛋白质源。优选确定成分培养基包含P13K信号抑制剂。优选包含有效量的Wnt3a(1ng/ml至约100ng/ml，优选约25ng/ml。优选生长基质如本文所述为基质胶。

细胞优选生长在细胞支持物上。在本发明中，基质胶作为细胞支持物使用是优选的。细胞支持物优选包含至少一种分化蛋白。术语“分化蛋白”用于描述使细胞促进胚胎干细胞或定形内胚层细胞分化的蛋白(也优选attachment)。本发明中使用的优选的分化蛋白包括，例如细胞外基质蛋白，其是在细胞外基质中发现的蛋白，例如层粘连蛋白、生腱蛋白、血小板反应蛋白和其混合物，促进生长并包含表皮生长因子(EGF)的同源性结构域，表现出生长促进和分化活性。可在本发明中使用的其他分化蛋白包括例如胶元、纤连蛋白、vibronectin、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸和其混合物。此外，也可可使用包含有效浓度的一种或多种胚胎干细胞分化蛋白的凝胶和其他材料。包括这些分化蛋白的示例的胚胎干细胞分化蛋白或材料包括，例如BD Cell-Tak^TM Cell和Tissue Adhesive、BD^TM FIBROGEN Human RecombinantI、BD^TM FIBROGEN Human Recombinant Collagen III、BD Matrigel^TMBasement Membrane Matrix、BD Matrigel^TM Basement Membrane Marix HighConcentration(HC)、BD^TM PuraMatrix^TM Peptide Hydrogel、Collagen I、CollagenI High Concentration(HC)、Collagen II(牛)、Collagen III、Collagen IV、CollagenV和Collagen VI等。用于本发明的优选的分化蛋白材料包括Matrigel^TM材料。

包含一种或多种分化蛋白的优选的组合物/材料是BD Matrigel^TMBasement Membrane Matrix。它是可溶的基底膜制备物，其从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取，所述肉瘤是ECM蛋白丰富的肿瘤。其主要成分是层粘连蛋白，其次是胶元IV、硫酸乙酰肝素、蛋白聚糖类、触觉蛋白(entactin)和巢蛋白(nidogen)。

如本文所用，术语“激活”指Pdx1或Isl1表达的增加，或Pdx1，Isl1或肝标记物活性的上调。

如本文所用，当涉及细胞、细胞株、细胞培养物或细胞群，术语“游离的”指从细胞的自然来源大体上分离，从而使细胞、细胞株、细胞培养物或细胞群可在体外培养。此外，术语“游离”指从两个或多个细胞群物理选择(physical selection)出一种或多种细胞，其中的选择根据细胞形态和/或各种标记物的表达。

如本文所用，术语“表达”指在细胞中多聚核苷酸的转录或多肽的翻译，从而使表达分子的细胞的分子水平显著高于不表达分子的细胞。测量分子表达的方法对于本领域普通技术人员是众所周知的，并且包括并不限制于Northern杂交、RT-PCT、原位杂交、蛋白免疫印迹和免疫染色。

如本文所用，术语″接触″(即定形内胚层细胞与化合物接触)为了在体外共同孵育化合物和细胞(例如，在培养物中的细胞中加入化合物)。术语″接触″并不包括细胞在体内暴露于视黄酸、成纤维细胞生长因子或其他分化试剂，例如受试者自然制备的PI3-激酶通路抑制剂(即，可能是自然的生理过程导致的暴露)。可用任何合适的方式使细胞接触视黄酸或成纤维细胞生长因子，或PI3-激酶通路抑制剂例如LY294002制备定形内胚层细胞。例如，细胞可贴壁培养或悬浮培养。应当理解的是接触分化试剂的细胞可进一步用其他的细胞分化环境处理，以稳定细胞，或进一步分化细胞，例如制备胰岛细胞。

申请人已表证在基础细胞培养基中用视黄酸的定形内胚层细胞的培养制备分化的细胞，如胰腺或肝内胚层细胞，其中细胞比自发分化的细胞具有更大的均一性。

本发明涉及包含游离的分化的哺乳动物细胞群，优选人胰内胚层细胞的组合物，其中在体外细胞从多能或定形内胚层细胞分化，其中大于约30％的细胞表达Pdx1和/或Isl1。在本发明的一个实施方案中，大于约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、67％、70％、72％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或甚至80％的细胞表达Pdx1和/或Isl1。优选的，在包括细胞群的组合物中，至少50％表达Pdx1和/或Isl1的细胞，高达70-80％或更多。

本发明还涉及包含游离的肝内胚层细胞的同源细胞群的组合物，其中细胞在体外分化培养，其中大于约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、67％、70％、72％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或甚至80％的细胞是肝内胚层细胞。

本发明还包括分化多能哺乳动物细胞，优选人多能细胞，成为胰腺内胚层细胞的方法，包括：(a)提供多能哺乳动物细胞，和(b)将多能哺乳动物细胞与有效量的PI3-激酶信号通路抑制剂接触，以至少部分的分化多能细胞为定形内胚层谱系的细胞，并且之后使用视黄酸作为分化试剂在包含有效量的FCS(优选约10％)的基础培养基中(优选DMEM/F12)，分化定形内胚层细胞为胰内胚层细胞。内胚层细胞可为游离的，但优选暴露于无视黄酸的DMEM/F12，任选的包含FCS(优选约10％)再1天或更长(优选2天)，其中胰内胚层细胞是游离的。胰内胚层细胞可进一步分化为胰腺β细胞。

在本发明任选的实施方案中，肝内胚层细胞的制备与上述步骤相同，但替代用视黄酸分化定形内胚层细胞，去除视黄酸，并且在成纤维细胞生长因子(Fgf10)存在下分化，由此制备肝内胚层细胞而不是胰内胚层细胞。

如本文所述的方法，胰内胚层细胞可进一步分化为胰腺β-细胞，并在糖尿病治疗中使用(类型I)。

考虑到通过与视黄酸接触分化定形内胚层细胞以制备胰内胚层细胞。在一个实施方案中，在基础细胞培养基中，与视黄酸接触之前，分离细胞成基本单个的细胞培养物。使用蛋白酶，例如但不限制于胰蛋白酶，分离细胞。在一个实施方案中，在接种后细胞与视黄酸接触12小时至约6天，接种后接触12小时至约48小时，或接种后接触约24小时。在一个实施方案中，细胞与视黄酸接触大于24小时、大于约48小时、或大于约72小时、大于约96小时、或约96小时。在暴露于基础细胞培养基的视黄酸后，可直接分离获得的胰内胚层细胞(胰蛋白酶作用)，并且之后任选的并且优选的暴露于无视黄酸的基础细胞培养基(任选的，包含FCS)至少12小时、至少24小时、至少48小时或48小时，或任选的，从暴露于视黄酸获得的未分离胰内胚层细胞，可再暴露于无视黄酸的基础细胞培养基。

优选的，在细胞用组合物培养大于约24小时，优选至少48小时后，视黄酸有效的引起定形内胚层细胞向胰腺内胚层谱系分化。考虑当细胞接种大于约12小时，在细胞与抑制剂接触前，或当细胞已接种约24小时，在细胞接触抑制剂前，视黄酸有效的引起多能哺乳动物细胞向内胚层谱系的分化。

在一些实施方案中，定形内胚层细胞以低于约2.5x10⁶细胞/35mm平皿的浓度接种，至少约2.5x10⁴细胞/35mm平皿，在约2.5x10⁵至约2x10⁶细胞/35mm平皿之间，在约5x10⁵至约2x10⁶细胞/35mm平皿之间，低于约2x10⁶细胞/35mm平皿，或密度大于4x10⁵细胞/35mm平皿。在一些优选方面，定形细胞以约7.5x10⁵细胞/35mm平皿的浓度接种。

在从多能细胞特别是人胚胎干细胞(hESC)制备定形内胚层细胞中，如在本发明可选的实施方案的第一步中，本发明还包括使用组合物培养细胞，包括细胞培养物培养基和分化试剂，所述分化试剂为PI3-激酶通路抑制剂，从而分化胚胎干细胞为定形内胚层细胞。在本发明一些实施方案中，抑制剂选自LY 294002、雷帕霉素、渥曼青霉素、氯化锂、Akt抑制剂I、Akt抑制剂II、Akt抑制剂III、NL-71-101，和其混合物。在一个实施方案中，抑制剂是雷帕霉素。在一些实施方案中，雷帕霉素最初浓度为约0.1nM至约500nM、约0.5nM至约250nM、约1.0nM至约150nM、或约1.5nM至约30nM。在另一个实施方案中，抑制剂是LY 294002。在一些实施方案中，LY294002最初浓度为约1μM至约500μM、约2.5μM至约400μM、约5μM至约250μM、约10μM至约200μM或约20μM至约163μM。在另一个实施方案中，抑制剂为Akt1-II。在一些实施方案中，Akt1-II最初浓度为约0.1μM至约500μM、约1μM至约250μM、约5μM至约20μM、约10μM至约100μM，或约40μM。

基础细胞培养基可还包含成纤维细胞生长因子。在一个用于制备定形内胚层细胞的实施方案中，FGF是bFGF。在实施方案中，bFGF最初浓度约0.1ng/ml至约100ng/ml、约0.5ng/ml至约50ng/ml、约1ng/ml至约25ng/ml、约1ng/ml至约12ng/ml，或最初浓度约8ng/ml。

在从定形内胚层细胞制备肝内胚层细胞的实施方案中，FGF优选FGF10，有效浓度通常在从约1ng/ml至约100ng/ml，优选约10ng/ml至约90ng/ml，优选约25至约75ng/ml，优选约50ng/ml的范围内。FGF也包含在用于制备胰内胚层细胞的基础培养基中，浓度约1至约100ng/ml，优选约10至约50ng/ml。

在另一个实施方案中，细胞培养物培养基为条件培养基。条件培养基可从饲养层(feed layer)获得。考虑饲养层可包含成纤维细胞，并且在一个实施方案中，包含胚胎成纤维细胞。当有效地制备定形内胚层细胞时，这特别相关。

在一些优选实施方案中，细胞培养物培养基是条件培养基。条件培养基可从饲养层获得。考虑当制备定形内胚层细胞时，饲养层包含成纤维细胞，并且在一个实施方案中，包含胚胎成纤维细胞。在优选的实施方案中，用于制备定形内胚层细胞的条件培养基包含DMEM/F-12(50/50)、约20％KSR、约0.1mM NEAA、约2mM L-谷氨酰胺、约50U/ml青霉素、约50μg/ml链霉素，和约8ng/ml bFGF。

在另一个实施方案中，用于制备定形内胚层细胞的细胞培养物培养基包括TGFβ家族成员。在一些实施方案中，TGFβ家族成员选自Nodal、激活蛋白A、激活蛋白B、TGF-β、BMP2和BMP4。在其他实施方案中，TGF-β家族成员是激活蛋白A或Nodal。在特定实施方案中，激活蛋白A的最初浓度为约1ng/ml至约1mg/ml、约10ng/ml至约500ng/ml、约25ng/ml至约250ng/ml、约50ng/ml至约200ng/ml、或约100ng/ml。在其他实施方案中，Nodal的最初浓度约100ng/ml至约5mg/ml、约500ng/ml至约2.5mg/ml、约800ng/ml至约1.5mg/ml，或约1mg/ml。

在优选的实施方案中，与胰内胚层细胞制备相关，条件培养基优选包含DMEM/F-12(50/50)，含有约10％FCS，约0.2μm(微摩尔)视黄酸和10-50ng/ml Fgf10。在此实施方案中，游离的定形内胚层细胞(从离心步骤吹打)重悬在上述基础细胞培养基中，并以优选约7.5x10⁵细胞/100mm的浓度接种在涂覆基质胶的组织培养皿上。培养皿在37℃/5％CO₂孵育，并且每日更换培养基。4天后，培养基换为DMEM/F12、10％FBS 1-4天(无视黄酸或Fgf)，之后可游离胰内胚层细胞，或可选的，再次进行分化，成为胰腺β细胞，所述胰腺β细胞用于治疗患有I或II型糖尿病的患者。

通过参考下列本文包括的本发明的优选的实施方案的详述和实施例，可容易的理解本发明。然而，在本组合物和方法公开和描述前，应当理解本发明不限制于特别的核酸、特别的多肽、特别的细胞类型、特别的宿主细胞、特别的条件或特别的方法等，当然其中的改变和许多修改和变化对于本领域技术人员是显而易见的。

如本文所用，术语“内胚层”包括，但不限制于定形内胚层；体壁内胚层、脏壁内胚层，和中内胚层细胞。如本文所用，术语“定形内胚层”指早期内胚层细胞，其具有分化成为任何或多种内胚层细胞类型的能力，所述内胚层细胞从胚胎中的内胚层谱系(即胰腺、肝、肺、胃、肠和甲状腺)产生。定形内胚层细胞是多能的。因此，本发明文中使用的术语“定形内胚层”指至少向内胚层细胞类型分化多于从其衍生的多能细胞的分化。并且，如本文所用，制备内胚层细胞包括制备富含内胚层细胞的细胞培养物。

如本文所用，“定形内胚层”细胞的特征在于表达特异的标记物转录，例如SOX17，伴随无标记物转录的胚胎外内胚层，例如AFP和血栓调节蛋白。此外这种细胞可表达CXCR4、GATA4、GATA4.6和GSC。此外，LY处理导致最初未分化的hES细胞表达的细胞表面CD标记物的丢失，包括但不限制于CD9、27、30、46、58和81。在一些本发明的实施方案中，定形内胚层细胞表达SOX17标记物基因水平高于SOX7的水平，SOX17为脏壁内胚层特征的标记物基因。此外，在特定的实施方案中，SOX17标记物基因的表达高于OCT4标记物基因的表达，SOX17为hESCs的特征基因。在其他本发明的实施方案中，定形内胚层细胞表达SOX17标记物基因，水平高于AFP、SPARC或血栓调节蛋白(TM)标记物基因水平。在本发明的实施方案中，通过本文描述的方法制备的定形内胚层细胞不表达Pdx1或Isl1(Pdx1-阴性或Isl1-阴性)。在另一个实施方案中，通过例如流式细胞术确定，定形内胚层细胞表现出血栓调节蛋白的低表达，相似的情况见于多能细胞群。

在特定的本发明的实施方案中，使用的定形内胚层细胞培养物基本上无表达OCT4、SOX7、AFP、SPARC、TM、ZIC1或BRACH标记物基因的细胞。在其他实施方案中，使用的定形内胚层细胞培养物基本上无表达SOX7、AFP、SPARC、TM、ZIC1或BRACH标记物基因的细胞。对于在细胞培养物中的细胞，术语“基本上无”指特别的细胞类型以低于细胞总数的5％的量出现在细胞培养物中。

术语“胰腺内胚层”指衍生自定形内胚层细胞的内胚层细胞，所述定形内胚层细胞暴露于单独的有效量的视黄酸，或和其他生长因子，例如成纤维细胞生长因子(例如Fgf10)组合，并且表达标记物Pdx1和Isl1标记物，并可进一步分化为胰腺β细胞。

术语“肝内胚层”指衍生自定形内胚层细胞的内胚层细胞，使定形内胚层细胞暴露于生长因子，例如成纤维细胞生长因子(例如Fgf10)，无视黄酸。

如本文所用，术语“分化”指细胞类型的制备，分化的细胞类型多于从其衍生的细胞类型。因此术语包括部分和最终分化的细胞类型。

在特定的本发明的实施方案中，术语“富含”指细胞培养物包含多于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的所需的细胞谱系，这依赖于细胞类型和使用的方法。

使用本发明制备的从胚胎干细胞在接触PI3-激酶通路抑制剂后分化的定形内胚层细胞类型可根据本发明用于制备胰内胚层细胞或肝内胚层细胞。

根据本发明制备的细胞在多种研究领域和开发中有多种用途，包括但不限制于药物发现、药物开发以及检测、毒理学、治疗目的的细胞的制备和移植、以及基础科学研究。这些细胞类型表达在大范围研究领域中关注的分子。这包括各种细胞类型发挥功能所需的已知分子，如标准的参考文献中所述。这些分子包括，但不限制于细胞因子、生长因子、细胞因子受体、细胞外基质、转录因子、分泌多肽(激素)和其他分子，以及生长因子受体。

在优选的实施方案中，定形内胚层细胞是人细胞，且胰腺内胚层和/或肝内胚层细胞是人细胞。这些细胞是根据本发明的方法使用多能人细胞衍生的。

如本文所用，术语“多能(pluripotent)人细胞”或“人胚胎干细胞”包括获得自人胚胎、胎儿或成人组织的多能细胞。在一个优选的实施方案中，多能人细胞为人多能胚胎干细胞(hESC)。在另一个实施方案中，多能人细胞为人多能胎儿干细胞，例如原始干细胞。在另一个实施方案中，多能人细胞为人多能成人干细胞。如本文所用，术语“多能”指细胞能够至少发育成为外胚层、内胚层和中胚层的细胞。如本文所用术语“多能”指全能和多能的细胞。如本文所用，术语″全能(totipotent)细胞″指能够发育成为所有的细胞谱系的细胞。术语“多能的(multipotent)”指最终分化的细胞。也如本文所用，术语“多能的(multipotent)”指没有处理(即，核转移或去分化诱导)的细胞，且不能从所有三个胚层形(中胚层，外胚层和内胚层)衍生，形成分化的细胞类型，或者换言之为部分分化的细胞。多能人细胞可选自人胚胎干(ES)细胞；人内细胞团(ICM)/上胚层细胞；人原始外胚层细胞，例如早期原始外胚层细胞(EPL)；人原始胚(EG)细胞；和人畸胎癌(EC)细胞。可使用任何本领域技术人员已知的方法，衍生本发明的人多能细胞。例如，可使用去分化和核转移方法制备人多能细胞。此外，本发明使用的人ICM/上胚层细胞或原始外胚层细胞在体内或体外衍生。EPL细胞在贴壁培养中制备，或作为细胞聚集物在悬浮培养中制备，如WO 99/53021中所描述。此外，可使用本领域技术人员已知的方法传代人多能细胞，包括手动传代方法和批量(bulk)传代方法，例如抗体选择和蛋白酶传代。

在特定的实施方案中，本发明的胚胎干细胞具有正常核型，而在另一个实施方案中，胚胎干细胞具有非正常核型。在一个实施方案中，大部分胚胎干细胞具有非正常核型。考虑大于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或大于95％的检测的中期细胞表现出非正常核型。在一些实施方案中，当细胞培养大于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，或20代后，非正常核型很明显。在一个实施方案中，非正常核型包括至少一个常染色体的三倍体，其中常染色体选自染色体1、7、8、12、14、和17。在另一个实施方案中，非正常核型包括多于一种常染色体的三倍体，其中多于一种的常染色体中的至少一种选自染色体1、7、8、12、14和17。在一个实施方案中，常染色体是染色体12或17。在另一个实施方案中，非正常核型包括另外的性染色体。在一个实施方案中，核型包括两个X染色体和一个Y染色体。考虑可能发生的染色体的易位，并且术语“非正常核型”包括这种易位。本发明还包括上述染色体异常的组合。

如上文所述的方法，在特定的实施方案中，本发明包括如第一步，多能哺乳动物细胞的分化方法，包括：(a)提供多能哺乳动物细胞，和(b)多能哺乳动物细胞与有效量的PI3-激酶信号通路抑制剂接触，以使至少部分分化的多能细胞成为内胚层谱系细胞。在一个实施方案中，步骤(b)包括细胞分化环境的使用。在另一个实施方案中，在步骤(b)后，细胞可与细胞分化环境接触。根据本发明其他的步骤包括将定形内胚层细胞在细胞分化环境中(例如基础细胞培养基)暴露于视黄酸，以制备胰内胚层细胞。或者，定形内胚层细胞可在没有视黄酸的细胞分化环境中(例如基础细胞培养基)暴露于成纤维细胞生长因子(例如Fgf10)，以制备肝内胚层细胞。

如本文所用，术语“细胞分化环境”指细胞培养条件(例如通常为基础细胞培养基)，其中诱导多能细胞分化，或诱导成为在富含分化细胞的人细胞培养物。优选的，由生长因子诱导的分化细胞谱系本身是均一的。术语“均一的”指包含大于约50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的所需细胞谱系的细胞群。可直接从分化过程获得均一谱系，无需进一步的细胞纯化，或者，流式细胞术和其他技术可用于纯化细胞，特别是胰内胚层细胞或肝内胚层细胞。

在一个实施方案中，诱导多能细胞分化成为定形内胚层谱系的细胞，所述细胞可进一步分化以制备胰内胚层细胞或肝内胚层细胞。优选的，诱导多能细胞分化成为包含大于约50％的定形内胚层细胞的细胞。在另一个实施方案中，细胞群包括大于约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的定形内胚层谱系。可分离内胚层细胞或直接使用，无需分离或纯化，以制备胰腺内胚层或肝内胚层细胞。

分化培养基或环境(通常为基础细胞培养基)可用于分化本发明的多能细胞，可在多能细胞接触PI3-激酶抑制剂之前、期间或之后。在制备胰内胚层细胞时，分化试剂为有效量的视黄酸，可在定形内胚层细胞接触分化培养基(基础细胞培养基，如本文所述)之前、期间或之后使用。

根据本发明，以形成定形胰腺或肝内胚层细胞的细胞分化培养基(基础细胞培养基)可包括各种如上述成分，包括例如KODMEM培养基(敲除Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基)、DMEM、Ham’s F12培养基(特别是DMEM/F12 50∶50)、FBS或FCS(胚胎牛血清或胎牛血清)、成纤维细胞生长因子包括FGF2(成纤维细胞生长因子2)、FGF 8、FGF 10(特别用于胰腺或肝内胚层细胞)、KSR或hLIF(人白血病抑制因子)。细胞分化培养基还可包括补充物例如L-谷氨酰胺、NEAA(非必需氨基酸)、P/S(青霉素/链霉素)、N2和β-巯基乙醇(β-ME)。考虑细胞分化环境可加入其他的因子，包括但不限制于纤连蛋白、层粘连蛋白、肝素、硫酸肝素、视黄酸、表皮生长因子家族(EGFs)成员、成纤维细胞生长因子家族成员(FGFs)包括FGF2、FGF8和/或FGF10、血小板衍生的生长因子家族(PDGFs)成员、转化生长因子(TGF)/骨形态生成蛋白(BMP)/生长和分化因子(GDF)家族拮抗剂包括但不限制于头蛋白、促滤泡素抑制素、脊索发生素、gremlin、cerberus/DAN家族蛋白、ventropin、高剂量激活蛋白和amnionless。也可以TGF/BMP/GDF受体-Fc嵌合体形式加入TGF/BMP/GDF拮抗剂。可加入的其他因子包括可通过Notch受体家族激活或失活信号的分子，包括但不限制于δ样和Jagged家族蛋白和Notch加工或裂解抑制剂。其他生长因子可包括胰岛素样生长因子家族(IGF)成员、胰岛素、wingless相关(WNT)因子家族，和hedgehog因子家族。可加入其他因子以促进定形内胚层干/前体增殖和存活，以及这些前体衍生物的存活和分化。

在其他的实施方案中，方法包括接种贴壁培养细胞。如本文所用，术语“接种(plated)”和“接种(plating)”指任何使细胞在贴壁培养物中生长的过程。如本文所用，术语“贴壁培养”指细胞在固体表面上培养的细胞培养系统，固体表面可顺序包被固体物质，固体物质可顺序包被另一种包被材料，例如下列材料，或任何其他的使培养的细胞增殖活稳定的化学或生物材料。细胞可以或不能紧贴固体表面或底物。在一个实施方案种，优选细胞接种在基质胶包被的培养板上。用于贴壁培养的底物可包括一种下述物质或下述物质的组合：多聚鸟氨酸、层粘连蛋白、多聚赖氨酸、纯化的胶元、明胶、细胞外基质、纤连蛋白、生腱蛋白、玻连蛋白、巢蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖类、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)和饲养层，例如但不限制于原始成纤维细胞或成纤维细胞细胞株。此外，贴壁培养底物可包括细胞外基质，覆盖饲养层、覆盖多能人细胞或细胞培养物或覆盖定形内胚层细胞或细胞培养物。

本发明的方法考虑细胞可用饲养细胞或饲养层培养。术语“饲养细胞”用于描述与靶细胞共同培养的细胞，在当前分化状态稳定靶细胞。饲养层包括在培养物中有多于一种的饲养细胞。在上述方法的一个实施方案中，条件培养基从稳定靶细胞当前分化状态的饲养细胞获得。可使用本领域技术人员已知的常规方法游离并特征化稳定靶细胞当前分化状态的饲养细胞制备的任何和全部因子。这些因子可用于替代饲养层，或可用于补充饲养层。

如本文所用，术语″稳定″指细胞的分化状态。当细胞或细胞群被稳定时，其经过多次传代在培养物中持续增殖，并且优选在培养物中无限增殖；此外，优选每种在培养物中的细胞为相同的分化状态，并且当和细胞分开，通常产生相同类型的细胞或产生相同分化状态的细胞。优选的，若细胞培养条件没有改变，稳定的细胞或细胞群不再分化或去分化，并且细胞持续传代并且无过度生长。优选的，稳定的细胞能够在稳定状态中无限增殖，或至少多于2次传代。优选的，稳定多于5代、多于10代、多于15代、多于20代、多于25代，或最优选的，稳定多于30代。在特定的实施方案中，细胞稳定多于1年的持续培养。

在一个实施方案中，将分化为定形内胚层细胞的干细胞(多能细胞)通过常规方法以多能状态在培养物中维持，直至细胞分化为所需定形内胚层。在一些实施方案中，TGFβ家族成员联合PI3-激酶通路抑制剂给予多能细胞。如本文所用，术语“TGF-β家族成员”指通常本领域技术人员认为特征性的属于TGF-β家族的生长因子，特征在于与已知TGF-β家族成员相同，或由于与已知TGF-β家族成员功能相似。在一些实施方案中，TGF-β家族成员选自Nodal、激活蛋白A、激活蛋白B、TGF-β、BMP2和BMP4。在一个实施方案中，TGF-β家族成员为激活蛋白A。此外，生长因子Wnt3a用于制备定形内胚层细胞。在特定的本发明的实施方案中，使用上述任何生长因子的组合。无需向细胞同时加入这些成分。

在至少一个实施方案中，通过传代在培养物中维持定形内胚层细胞直至理想地分化成为胰腺内胚层或肝内胚层。在一些实施方案中，FGF家族成员(例如，优选FGF 10)联合分化试剂视黄酸给予定形内胚层细胞，以制备胰腺内胚层或肝内胚层细胞。

本文描述的分化方法的一些实施方案中，向细胞提供上述生长因子，从而使生长因子以足以促进至少部分的干细胞分化成定形内胚层和/或定形内胚层细胞分化成胰内胚层细胞或肝内胚层细胞的浓度存在。在本发明的一些实施方案中，上述生长因子在细胞培养物中以至少约0.5ng/ml、至少1ng/ml、至少10ng/ml、至少约25ng/ml、至少约50ng/ml、至少约75ng/ml、至少约100ng/ml、至少约200ng/ml、至少约300ng/ml、至少约400ng/ml、至少约500ng/ml、或至少约1000ng/ml的浓度出现。

在本发明一些实施方案中，上述生长因子在加入细胞培养物后再去除。例如，可在生长因子加入约1天，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约8天，约9天或约10天后去除。在优选的实施方案中，生长因子在加入后约4天去除。

定形内胚层细胞、胰内胚层细胞或肝内胚层细胞的培养物可在包含减少的血清或无血清的培养基中生长。在特定的本发明的实施方案中，血清浓度在约0.1％至约20％(v/v)的范围内。在一些实施方案中，定形内胚层细胞用血清补充物培养。在其他实施方案中，定形内胚层细胞在B27存在的条件下生长。在这些实施方案中，B27补充物的浓度可在约0.2％至约20％(v/v)的范围内或大于约20％(v/v)。任选的，加入的B27补充物的浓度可按市售的多种强度的B27储备液测定。例如，B27的50X储备液在Invitrogen(Carlsbad，CA)有售。向充足体积的生长培养基中加入充足量的这种储备液可制备补充了所需量的B27的培养基。例如，向90ml的生长培养基加入10ml的50X B27储备液可制备补充5X B27的生长培养基。在培养基中B27补充物的浓度可为约0.1X、约0.2X、约0.3X、约0.4X、约0.5X、约0.6X、约0.7X、约0.8X、约0.9X、约1X、约1.1X、约1.2X、约1.3X、约1.4X、约1.5X、约1.6X、约1.7X、约1.8X、约1.9X、约2X、约2.5X、约3X、约3.5X、约4X、约4.5X、约5X、约6X、约7X、约8X、约9X、约10X、约11X、约12X、约13X、约14X、约15X、约16X、约17X、约18X、约19X、约20X和大于约20X。在优选的实施方案中，胰内胚层细胞和肝内胚层细胞都优选在包含约1％至约20％(体积)胎牛血清，更优选约10％的胎牛血清的基础细胞培养基中生长。

从hESC培养物至定形内胚层或从定形内胚层至胰腺内胚层或肝内胚层的过程可通过定量这些细胞特征性的标记物基因的表达和hESCs、定形内胚层细胞(为胰腺或肝内胚层细胞)和其他细胞类型特征性的标记物基因的表达缺失，进行检测。这些标记物基因的基因表达的定量方法可通过使用定量PCR(Q-PCR)。进行Q-PCR的方法是本领域已知的。其他本领域已知的方法也可用于定量标记物基因表达。标记物基因表达可通过使用感兴趣的标记物基因的特异抗体检测。

使用本文描述的方法，可制备组合物，其包含定形内胚层细胞、胰内胚层细胞或肝内胚层细胞，所述细胞基本没有其他的细胞类型。或者，制备的组合物包含hESCs和定形内胚层，或定形内胚层细胞和胰内胚层细胞或肝内胚层细胞的混合物。例如，制备的组合物中包含每95个hESCs至少5个定形内胚层细胞，或每95个定形内胚层细胞至少5个胰内胚层细胞或肝内胚层细胞。在另一个实施方案中，组合物中包含每5个hESCs至少95个定形内胚层细胞，或每5个定形内胚层细胞高达80或更多的胰腺或肝内胚层细胞。此外，考虑了组合物，其包含定形内胚层细胞和hESCs或胰腺内胚层或肝内胚层细胞和定形内胚层细胞。

在一些本发明的实施方案中，可通过这种细胞特异性的亲合标记物游离定形内胚层细胞、胰内胚层细胞或肝内胚层细胞。对定形内胚层细胞、胰内胚层细胞或肝内胚层细胞特异的亲和标记物的一个实例是特异于标记物多肽的抗体，所述多肽存在于需要纯化的内胚层细胞表面上，但基本不出现在如本文所述的方法制备的细胞培养物中发现的其他类型细胞上。

考虑到在包被PI3-激酶信号通路抑制剂或视黄酸(任选的，包括FGF例如FGF 10)之前，作为材料使用的多能细胞或定形内胚层细胞可解离为基本单个的细胞培养物，以制备肝内胚层细胞。如本文所用，“基本单个的细胞培养物”是在传代期间的细胞培养物，所需生长的细胞彼此分离，从而使大部分细胞为单个细胞，或两个细胞相连(双联体)。优选，所需成为培养物的细胞中大于40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的细胞为单体或双联体。该术语包括任何现在已知方法的使用，或之后开发的能够制备基本的单个细胞培养物的方法的使用。这些方法的非限制性实例包括使用细胞分散缓冲液、和使用蛋白酶，例如胰蛋白酶、胶原酶、分散酶和accutase。这些蛋白酶和一些蛋白酶的组合是市售的。本发明考虑在传代期间的任意点，细胞培养物可解离成基本单个的细胞培养物，并且无需在传代期间接触抑制剂前立即解离细胞。解离可在一或更多代中发生。或者，可离心样品解离细胞培养物。

使用本发明的方法制备的细胞具有多种用途。特别的，细胞可作为核转移技术的核材料源使用，并可用于制备用于移植的器官的细胞、组织或成分。例如，若制备胰腺内胚层细胞或肝内胚层细胞，可在人细胞治疗或人基因治疗中使用，以治疗疾病，例如1型糖尿病、肝病和任何其他影响胰腺或肝的疾病。在一个上述的实施方案中，胰腺内胚层细胞用于治疗糖尿病或进一步分化制备胰腺β细胞，在糖尿病治疗中使用。此外，细胞可用于毒性或药物筛选。

在整个申请中，参考了多个出版物。所有这些出版物的公开内容和出版物中引用的参考文献，在此申请中全部引用，从而更全面地描述本发明所属技术领域的状态。

实施例

实施例1

人ES细胞的培养

人ES细胞的常规培养

在此项工作中可使用人胚胎干细胞株BG01(BresaGen，Inc.，雅典，GA)。BG01细胞生长在hES培养基中，培养基由补充20％敲除血清替代物(knockout serum replacer)(KSR；Invitrogen)的DMEM/F-12(50/50)、0.1mMMEM非必需氨基酸(NEAA；Invitrogen)、2mM的L-谷氨酰胺(Invitrogen)、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素(Invitrogen)、4ng/ml bFGF(Sigma)和0.1mM的β-巯基乙醇(Sigma)组成。细胞在小鼠原代胚胎成纤维饲养层上生长，饲养层用丝裂霉素c有丝分裂灭活。饲养细胞以每35mm平皿1.2x10⁶细胞接种。BG01细胞使用胶原酶/胰酶方法传代。简言之，培养基从平皿去除，加入1ml的200U/ml的IV型胶原酶(GibcoBRL)，并且细胞在37℃孵育1-2分钟。去除胶原酶，并使用1ml的0.05％胰酶/0.53mMEDTA(GIBCO)。细胞在37℃孵育30秒，之后从饲养层清洗，胰酶在含10％胎牛血清(FBS；Hyclone)的DMEM/F-12中失活。细胞以每35mm平皿100,000-300,000细胞的密度重新接种在饲养层上，并且每3天传代。

BG01细胞在无饲养层条件中的生长

丝裂霉素处理的MEFs用hES培养基(25mls)过夜处理，所述MEFs以56,000细胞/cm²的密度接种在75cm²培养瓶中。MEFs使用达1周，每24小时使用条件培养基(CM)收集。CM在使用前再补充8ng/ml的hbFGF。通过稀释生长因子减少的(Growth Factor Reduced)BD基质胶基质(BDBiosciences)至在冰冷DMEM/F-12中终浓度1∶30而制备基质胶包被的平皿。在室温，将1ml/35mm平皿用于包被平皿1-2小时或至少4℃过夜。培养板在4℃储存长至1周。在临用前去除基质胶溶液。

胚状体形成

使用上述胶原酶/胰酶方法解聚(disaggregate)BG01细胞。约10,000细胞悬浮在50μl的补充10％FBS(Atlanta Biolabs)、0.1mM NEAA、2mM L-谷氨酰胺、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的EB培养基中(DMEM(Cellgro))，并用p200的枪头滴于100mm Petri皿盖(Petri dish lid)中。约每个盖滴约50滴。将盖置于平皿上，并在平皿中放置10ml的PBS。在第3和第5天，从盖上清洗EBs，在室温用胰酶孵育5分钟，并用拉长的玻璃吸管解聚。细胞在1xPBS中清洗一次，在室温用2％PFA/2％蔗糖固定10分钟。之后细胞在PBS中清洗两次，并储存在1％BSA/PBS中，以备抗体染色使用。

实施例2

用PI3-激酶抑制剂处理HES细胞导致HES细胞分化

抑制剂/分化试剂处理干细胞

使用胶原酶/胰酶方法从饲养物中传代BG01细胞，并在条件培养基(CM；MEF条件培养基加8ng/ml bFGF)中以1x10⁵细胞/35mm平皿的密度接种于基质胶包被的平皿上。约24小时后，用新鲜CM、带有抑制剂的CM(在EtOH中重悬)、带有EtOH的CM、或用自然分化培养基(SpontaneousDifferentiation medium)(hES培养基减去bFGF)替换培养基。

在其他方法中，在接触CM、带有抑制剂的CM和带有EtOH的CM之前，以不同浓度接种BG01细胞，细胞以下列浓度接种：约5x10⁴细胞/35mm平皿、约1x10⁵细胞/35mm平皿、约2x10⁵细胞/35mm平皿、约4x10⁵细胞/35mm平皿和约6x10⁵细胞/35mm平皿。

优选使用浓度在约20-163μM范围的抑制剂LY 294002(Biomol)，并且抑制剂雷帕霉素(Calbiochem)在约1.5-30nM的浓度范围内使用。LY294002通过结合至ATP停靠位点(docking site)p110，抑制PI3-激酶通路。雷帕霉素通过抑制mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶点)抑制一系列PI3-激酶通路。

细胞在此条件生长约72小时，每24小时更换培养基。使用胶原酶/胰酶方法收集细胞用于流式细胞术和RT-PCR分析，并且刮掉细胞用于生物化学分析。

使用标准的显微镜，通过观察细胞，注意到当LY 294002或雷帕霉素存在时，BG01细胞经历的形态学的改变。这种形态学的改变与自然分化经历的细胞改变显著不同。在未分化的培养物中，单个细胞不容易辨认，细胞相对小、不规则并且没有清晰的较高密度的细胞连接。然而，在用LY 294002处理后，细胞经历了显著的扩散和明显的上皮样骰状形态。在较高密度，由于在相邻细胞之间的分离的细胞连接很清楚，单个细胞也更容易辨认。

此外，细胞以低于约2x10⁵细胞/35mm平皿的密度接种，当包被LY294002或雷帕霉素接触时表现出形态学改变。细胞以约4x10⁵细胞/35mm平皿或更高的密度接种，当接触LY 294002或雷帕霉素时不表现出相同的形态学改变。

实施例3

用PI3-激酶抑制剂处理的细胞的特性

抑制剂研究如实施例2所描述进行。

流式细胞术

对于流式细胞术，在室温BG01细胞用1xPBS清洗，并用2％多聚甲醛/1xPBS固定10分钟。之后细胞用1xPBS清洗，约2x10⁵细胞与一抗孵育，一抗用1％BSA/1xPBS稀释。使用的一抗是抗CD9和抗血栓调节蛋白抗体(Cymbus Biotechnology)，连接FITC的小鼠单克隆抗体，1∶10稀释。细胞4℃孵育30分钟，之后用1xPBS清洗两次。合适时，将细胞重悬在二抗中，抗小鼠Alexa-488(Molecular Probes)，在1％BSA/PBS中以1∶1000稀释，在4℃孵育30分钟，并且之后用1xPBS中清洗两次。细胞重悬在1％BSA/1xPBS中，并使用Beckman Coulter FC500分析表面表达。

RNA分离和RT-PCR分析

总RNA使用TRIzol试剂(GibcoBRL)分离。RNA在1％的包含溴化乙锭的琼脂糖凝胶上电泳，并使用AlphaImagerTM 2200记录和分析系统观察以保证RNA完整性。10μg的RNA用DNase(Ambion)处理，使用DNase失活试剂(Ambion)去除DNase。cDNA使用Superscript II逆转录酶试剂盒(Invitrogen)使用oligo(dT)引物用500ng总RNA制备。PCR反应在1μl的cDNA上进行。PCR产物在包含溴化乙锭的2％的琼脂糖凝胶上电泳，并使用AlphaImagerTM 2200记录和分析系统观察。使用的PCR引物组合为GATA4、Mix1、Msx1、AFP、HNF4alpha、eHAND、Nanog、AFP和GAPDH.

生物化学分析

PI3-激酶信号通路的激活可通过蛋白印迹分析评价。简言之，去污剂提取物由未处理和处理的细胞培养物制备，通过SDS-PAGE分离，在硝酸纤维素膜上形成印迹。之后PI3-激酶细胞内靶分子PKB/Akt、S6激酶和S6蛋白的活性形式表达通过结合每种蛋白磷酸化形式的合适抗体在硝酸纤维素膜上形成的印迹确定。通常，每个样品检测30μg的总蛋白，一抗1∶1000稀释孵育，通过标准的基于ECL的方法学检测各个情况下的结合。

Q-PCR基因表达实验

通过Q-PCR在多个时间点对多个标记物基因的进行实时定量分析。评价理想的和非理想的细胞类型的标记物基因特征以获得对细胞群的全部动力学的更好的理解。Q-PCR分析优点(strength)包括其高度敏感性和开发必须标记物的相对容易性，因为基因组序列是容易获得的。此外，Q-PCR的极高度的敏感性允许来自在相当大的群中的相对少量的细胞的基因表达的检测。此外，检测非常低的基因表达水平的能力可提供群中的“分化偏性(differentiation bias)”指征。在细胞表型明显的分化之前，使用免疫化学技术很可能不能识别向特殊的分化通路的偏性。因此，Q-PCR提供了补充用于筛选成功分化处理的免疫细胞化学技术的分析方法。此工具提供了评价我们的分化流程的方法，成功用于半高通量分析的定量形式。

通常使用SYBR Green chemistry在RotorGene 3000仪器(CorbettResearch)和两步RT-PCR形式进行此方法的相对定量。设计引物处于外显子-外显子边界，或当可能时跨越至少800bp的内含子，这可减少污染的(contaminating)基因组DNA的扩增。当使用不包含内含子的标记基因时，或标记基因含有假基因(pseudogenes)时，可用DNase I处理的RNA样品。与hESC分化早期相关的标记物(特别是外胚层、中胚层、定形内胚层和胚胎外内胚层)，和验证的引物提供在表1中。也表明了这些引物的人特异性。这很重要因为hESCs经常在小鼠饲养层上生长。通常，在各条件下，采用三份样品，重复独立分析以评价每个定量测定相关的生物变异性。

使用RNeasy(Qiagen)分离总RNA，并使用RiboGreen(Molecular Probes)定量。使用iScript逆转录酶试剂盒(BioRad)从350-500ng总RNA逆转录，试剂盒包括oligo-dT和随机引物的混合物。随后每个20μL的反应稀释至100μL总体积，并且在每个10μL的Q-PCR反应物中使用3μL，反应物包括400nM的正和反引物和5μL 2X SYBR Green master mix(Qiagen)。两步循环参数：在85-94℃变性5秒(特别根据每个引物对的扩增子的熔解温度选择)，随后在60℃退火/延伸45秒。每个延伸相的最后15秒收集荧光数据。三点、10-倍稀释以制备每个循环的标准曲线，根据标准曲线，起始循环阈值(Ct’s)转换为定量值。每个样品的定量值对看家基因标准化，之后计算三份样品的均值和标准差。PCR循环后，进行熔解曲线分析，以确定反应特异性。在适合PCR扩增子的T_m处的单峰说明单个的特异性产物。此外，进行的不含逆转录酶的反应可作为阴性对照，并且没有扩增。

使用环孢素G(Cyclophilin G)和GUS对所有样品计算标准化因子。多个HGs的使用同时减少标准化过程本身的变异性，并增加相对基因表达值的可靠性(Vandesompele，等人，2002，Genome Biol.，3：RESEARCH0034)。

使用Q-PCR确定许多接受不同实验处理的交叉样品的标记基因的相对的基因表达水平。使用标记基因，因为标记基因在早期胚胎层代表性的特异群中富集，并且特别集中于基因集合(sets of genes)中，所述基因集合在定形内胚层细胞中表达不同。这些基因和其相对富集的情况在表1中显示。它们有助于分离和表征定形内胚层、胰腺内胚层或肝内胚层细胞的形成。

表1

胚层	基因	表达区域
胚层	基因	表达区域
内胚层胚胎外	SOX17MIXL1GATA4HNF3bGSCCerebrusSOX7AFPSPARCTM	定形的脏壁(visceral)和壁(parietal)内胚层内胚层和中胚层定形内胚层和原始内胚层定形内胚层和原始内胚层、中胚层、神经板中内胚层和定形内胚层原始和定形内胚层脏壁内胚层脏壁内胚层、肝壁内胚层壁内胚层/营养外胚层

外胚层中胚层

NODALZIC1SOX1BRACHFOXF1

上胚层和前脏壁内胚层神经管、神经前体(progenitors)神经前体新生中胚层(nascent mesoderm)

免疫组织化学

SOX17抗体

SOX17在整个定形内胚层表达，在原肠胚形成期间形成，并且它在肠管内维持表达(尽管表达水平沿A-P轴改变)，直至大约开始器官形成。SOX17也在一组胚胎外内胚层细胞表达。在中胚层或外胚层中没有观察到这种蛋白的表达。因此，SOX17是定形内胚层谱系合适的标记物，当与标记物缀合使用时以排除胚胎外谱系。

SOX17抗体可如2003年12月23日提交的标题为“定形内胚层”美国临时申请No.60/532,004中所述生产，在此全部引入作为参考。简言之，人SOX17部分cDNA对应SOX17蛋白羧基末端氨基酸172-414，所述人SOX17部分cDNA用于在抗体生产公司GENOVAC(Freiberg，Germany)，根据开发的流程，通过基因免疫大鼠用于生产SOX17抗体。基因免疫的流程可见美国专利Nos.5,830,876、5,817,637、6,165,993、6,261,281和国际出版物No.WO99/13915，其公开在此全部引用作为参考。通过蛋白免疫印迹和ICC在hSOX17cDNA转染的细胞株上确定抗体对SOX17的特异性。

免疫染色的细胞可在细胞培养玻片上生长，并用1XPBS清洗一次，并在室温在4％PFA/4％蔗糖的pH 7.4的PBS中固定10分钟。之后在1XPBS中清洗3次，之后在室温用3％山羊血清和0.1％Triton-X100的PBS溶液封闭1小时。一抗在3％山羊血清的PBS溶液稀释，并且在4℃过夜该溶液。使用的一抗是兔抗-人AFP(Zymed)，1∶50稀释，和大鼠抗-人SOX17(购自Cythera，Inc.)，1∶1000稀释使用。细胞用更换3次的1XPBS清洗1小时。在室温使用二抗2小时。使用的二抗为山羊抗-兔Alexa Fluor 488和山羊抗-大鼠Alexa Fluor 594(Molecular Probes)，均以1∶1000在3％山羊血清的1XPBS中稀释。细胞用更换3次的1XPBS清洗1小时。去除小室，用带有DAPI的(Vector)VectaShield包埋培养基包埋载玻片。

结果

使用流式细胞术，值得注意的是CD9的表达在LY 294002或雷帕霉素处理的BG01细胞中的降低显著快于贴壁培养的自然分化细胞或胚状体。此外，之前通过其他观察得知CD9的表达影响细胞增殖、运动和粘附。

通过RT-PCR分析，值得注意的是在用LY 294002和雷帕霉素处理的细胞中可检测到早期分化指征的大量标记物。值得注意的是，当PI3-激酶信号阻断时，检测到的标记物可能不同于自然分化的贴壁BG01细胞培养物中所检测到标记物。例如，和与自然分化分化培养物相比，阻断PI3-激酶可导致HNF4α、GATA4、Mix1、和Msx1表达的增加，AFP水平的下降。

此外，PCR数据支持随多能(pluripotent)细胞密度改变而显现的细胞形态上的不同。在一些情况下用LY 294002或雷帕霉素处理的作用可依赖于细胞密度。

生物化学分析，值得注意的是LY 294002在细胞中的保持出现抑制了Akt、S6激酶和S6的激活。相似的，雷帕霉素的出现消除S6激酶和S6的活性。

所有的观察表明当这些抑制药物出现时，至mTOR的PI3-激酶信号在BG01细胞中下调。S6(在此信号通路中的远端靶信号)的激活在经历自然分化的贴壁培养的BG01细胞中减少，但在抑制剂处理的细胞中消除。

实施例4

从人胚胎干细胞制备胰内胚层细胞

方法

基质胶培养物：

来自mef饲养培养板的人ES细胞，细胞60-90％汇合，用1X PBS清洗，并向每个100mm组织培养板加入5ml的在DMEM/F12中的200-400U/ml的胶原酶IV，在37℃/5％CO₂孵育30-120分钟，直至克隆从培养板表面取出。通过轻柔研磨收集细胞，置于15ml的锥形管中，并以200Xg离心5分钟。从细胞沉淀(pellet)中吸出培养基并在带有8ng/ml bFGF的10ml 20％KSR的条件培养基(CM20K)中重悬。将所述细胞种于之前准备好的基质胶培养板上(1∶30稀释的基质胶的DMEM/F12溶液)，该细胞用带有8ng/ml bFGF的CM20K以1∶1至1∶6稀释。

定形内胚层分化：

在基质胶上的人ES细胞培养物用PBS清洗2X。加入2-3ml胰酶/EDTA溶液，研磨细胞并在15ml锥形管中收集细胞。加入带有10％FBS的DMEM/F12以终止胰酶消化，并且细胞以200Xg离心5分钟。细胞沉淀，现在大部分为单细胞，具有2-4个细胞簇的小细胞群，在带有8ng/ml bFGF的CM20K中重悬，4.5x10⁵细胞/100mm接种在基质胶包被的组织培养板上。培养板在37℃/5％CO₂孵育16-24小时。孵育后，培养基更换为带有8ng/mlbFGF、50ng/ml激活蛋白A和25ug/ml LY294002的CM20K。培养基每日更换，共4-6天。

胰腺内胚层分化：

定形内胚层细胞(来自上述处理)使用PBS清洗2X。加入2-3ml胰酶/EDTA溶液，研磨细胞，并在15ml锥形管中收集。加入带有10％FBS的DMEM/F12以终止胰酶消化，并且细胞以200Xg离心5分钟。细胞沉淀，现在大部分为单细胞，具有2-4个细胞簇的小细胞群，在DMEM/F12、10％FBS、2uM全反式视黄酸和10-50ng/ml FGF10中重悬。将细胞以7.5x10⁵细胞/100mm接种在基质胶包被的组织培养板上。培养板在37℃/5％CO₂孵育，每天更换培养基。在4天后，培养基替换为DMEM/F12、10％FBS，共1-4天。

在肝内胚层分化时，如果使用上述胰腺内胚层分化条件，除了不包含视黄酸并且增加FGF 10的量(替代不包含的视黄酸)外，以上述相同条件制备肝内胚层。

其他实施例

第一个实施例涉及处理定形内胚层后，表达胚胎肝标记物的甲胎蛋白(AFP)的细胞的制备。加入LY 294002(50μM)后，BG01 hESCs分化成为定形内胚层4天。培养基换为DMEM/F12、10％FCS，并且细胞生长至多再6天(up to six more days)。未处理：未处理hESCs。AFP转录水平通过QRT-PCR分析，一式三份，在对GAPDH的参照转录标准化后，转录水平表示为相对未处理样本(hESCs)的增加倍数。注意：尽管在加入Fgf10后可见AFP诱导，但此结果可在无Fgf10(in the presence of absence of Fgf10)时实现，图1。

第二个实施例观察RA处理后，Pdx1转录诱导的时程。BG01hESCs用LY294002(50μM)处理4天，之后更换为包含DMEM/F12、10％FCS、50ng/ml Fgf10和2μM视黄酸的培养基至多4天。未处理-未处理hESCs。转录水平通过QRT-PCR分析，一式三份，在对GAPDH的参照转录标准化后，转录水平表示为相对未处理样本(hESCs)的增加倍数。表示除Pdx1转录水平的倍数诱导。实验结果见图2。

第三个实施例观察RA处理后，Pdx1和Isl1转录诱导的时程。BG01hESCs使用LY 294002(50μM)处理4天，之后更换由DMEM/F12、10％FCS、50ng/ml Fgf10和2μM视黄酸组成的培养基至多4天。未处理：未处理hESCs。转录水平通过QRT-PCR分析，一式三份，在对GAPDH的参照转录标准化后，转录水平表示为相对未处理样本(hESCs)的增加倍数。此实验结果见图3。

第四个实施例观察对不同培养条件对应的Sox17、AFP和Pdx1的表达。未处理：未处理BG01hESCs在MEF-CM、Fgf2、20％KSR存在的基质胶上培养。LYA：hESCs生长在MEF-CM和Fgf2和基质胶上，用LY 294002处理4天。F106d：用LY 294002处理hESCs 4天，换为包含Fgf10(50ng/ml)，10％FCS的培养基再6天。RA4d/2d：使用LY 294002处理hESCs 4天，更换为包含Fgf10(50ng/ml)、2μM RA、10％FCS的培养基(DMEM/F12)再4天。之后在无RA和Fgf10的相同培养基中再培养2天。Sox17、AFP和Pdx1转录通过QRT-PCR分析，一式三份，在对GAPDH的参照转录标准化后，转录水平表示为相对未处理样本(hESCs)的增加倍数。图4表示Sox17、AFP和Pdx1对不同培养条件的反应。

第五个实施例表明处理RA后Pdx1+细胞的水平。在此实验中，在加入LY 294002(50μM)后，BG01hESCs分化成为定形内胚层4天。培养基更换为DMEM/F12，10％FCS，并且细胞生长至多再5天。用LY 294002处理hESCs 4天，更换含Fgf10(50ng/ml)、2μM RA、10％FCS的培养基(DMEM/F12)再5天。处理和未处理(hESCs)在LabTec细胞培养玻片生长，使用4％多聚甲醛固定，孵育兔抗-人Pdx1抗体(Chemicon，1∶1,000)，随后孵育AlexaFluor(594nm)标记的山羊抗-兔二抗(红色)。细胞包埋在包含DAPI的培养基中，所述DAPI用于观察核DNA(蓝色)。图5表明用RA处理的Pdx1+细胞免疫荧光染色。

hESCs的培养：

方法：hESCs优选在MEF-CM(详细内容见之前的文档)或确定成分培养基使用基质胶(1∶200稀释)(例如)作为生长基质中生长细胞，手动或通过使用酶方法例如胶原酶或accutase传代，并通常以1x10⁶每60mm平皿在hESC培养基中接种12-24小时，之后培养基换为促进DE分化(见如下′分化培养基′)培养基。在分化期间，每日更换′分化培养基′。

两个用于hESC培养的确定成分培养基的实施例如下所述：

(a)DMEM：F12(Gibco)、2％BSA(Seriologicals、#82-047-3)、1x Pen/Strep(Gibco)、1x非必需氨基酸(Gibco)、1x微量元素A、B和C(Cellgro；#99-182-C1、#99-176-C1、#99-175-C1)、50ug/ml抗坏血酸(Sigma、#A4034)、10ug/ml转铁蛋白(Gibco、##11107-018)、0.1nM β-巯基乙醇、8ng/ml Fgf2(Sigma、#F0291)、200ng/ml LR-IGF(JRH Biosciences、#85580)、10ng/ml激活蛋白A(R&D Systems、#338-AC)、10ng/ml Heregulin β(Peprotech；#100-03)。

(b)第二种确定成分培养基包括DMEM/F12、1xPen/Strep、1x非必需氨基酸(Gibco)、Fgf2(10ng/ml)、IGF1(或LR-IGF；10ng/ml)、激活蛋白A(10ng/ml)、牛血清白蛋白(片段V或相似)、转铁蛋白(10μg/ml、Gibco)、1x微量元素(Cellgro)、β-巯基乙醇。

其他的确定成分培养基在Ludwig等人，2006；Nature Biotech，249(2)，185-187，2006中描述。

生长在无饲养层条件下的细胞通过更换成包含不支持高PI3K信号的升高含量的(至少约5ng/ml、至少约5-10ng/ml、至少约15ng/ml、至少约25ng/ml、至少约50ng/ml、约50-100ng/ml)激活蛋白A、nodal、TNFβ或来自TNF家族的其他因子的确定成分培养基(无胎牛血清或KSR-型血清补充物)。在正常情况下，需要因子通过促进PI3K活性促进hESCs的自我更新。之前已表明(McLean等人，2007)通过减少KSR或FCS或通过加入抑制剂的PI3K的抑制使激活蛋白A、nodal、TNFβ或其他成分的条件可以促进DE分化。

例如，分化培养基不应具有促进PI3K信号的高水平的胰岛素、IGF或EGF家族成员(如heregulin)。

这种DE分化培养基的实施例是：

(a)DMEM：F12(Gibco)、2％BSA(Seriologicals、#82-047-3)、1x Pen/Strep(Gibco)、1x非必需氨基酸(Gibco)、1x微量元素A、B和C(Cellgro；#99-182-C1、#99-176-C1、#99-175-C1)、50ug/ml抗坏血酸(Sigma、#A4034)、10μg/ml转铁蛋白(Gibco、##11107-018)、0.1nM β-巯基乙醇、8ng/ml Fgf2(Sigma、#F0291)、100ng/ml激活蛋白A(R&D Systems、#338-AC)、Wnt3a(25ng/ml、R&D Systems)。

(b)第二种确定的分化培养基包含DMEM/F12、Fgf2(10ng/ml；Sigma、#F0291)、Wnt3a(25ng/ml、R&D Systems)、激活蛋白A(100ng/ml、R&DSystems)、牛血清白蛋白(2％、Seriologicals、#82-047-3)、转铁蛋白(10μg/ml、Gibco、##11107-018)、微量元素、β-巯基乙醇也作为基础培养基使用，之后可加入特异信号。

最佳的，在更换分化培养基后最初24-36小时包含Wnt3a。

分化实验：如每个之前的文档和McLean等人，2007(Stem cell)所述。

结果描述：

为了表明真正的定形内胚层从hESCs的制备，表明没有制备胚外谱系是十分重要的，因为细胞类型例如胚外谱系也表达用于鉴别DE的几种标记物(例如Sox17、GATA4，6、FoxA2)。分化的特征为在经过成为中内胚层的中间期细胞转变后形成分化。这种细胞类型通常表达T、MixL1和Wnt3a，重要的是通过T+状态表明预定的DE形成，如McLean等人2007和D′Amour等人2005所述。

在此申请中，我们表明在无饲养层条件下在确定成分培养基中可有效分化hESCs成为CXCR4+Sox17+DE。图7表明T mRNA水平在12小时增加，到24小时表现出最大水平(相对未处理hESCs～70-倍诱导)。MixL1转录峰在48小时((＞400-倍诱导)。DE相关转录例如Sox17、Gsc和CXCR4增加直至处理的72小时，分别表现出高达800、230和200倍增加。在Wnt3a存在或无Wnt3a时进行平行实验，表明+Wnt3a条件促进处理72小时后CXCR4mRNA的量，但并不重要(not essential)。

图8表明标记物转录的Q-PCR分析以评价是否制备胚外(AFP，THBD)或中胚层(FoxF1)。分析表明在处理96小时后无胚外内胚层标记物(AFP，THBD)的增加，表明Sox17表达与DE形成相关。当DE转录增加，例如Sox17(～400-倍)、CXCR4(～275-倍)、Gsc(～260-倍)、GATA4(～90-倍)Nanog水平(ESC标记物)减少。中内胚层转录水平增加(T，MixL1)在24-48小时的DE转录增加之前，与向DE转变的通过中内胚层的细胞群转变一致。

通过免疫细胞化学，分别使用Sox17和T抗体评价分析分化成为DE和中内胚层的细胞％(图9)。在24和48小时，更换为分化培养基之后，几乎100％的细胞用T抗体染色为阳性，表明在这些时间点出现接近均一群的中内胚层。到处理的48小时，Sox17阳性细胞的％开始增加，并且检测到许多Sox17-T双阳性细胞(～20％)。到72小时，培养物由～＞95％Sox17+细胞组成，＜5％的细胞T+。96小时后，在这些培养物中＞95％的细胞Sox17染色阳性，没有可检测的T染色。在整个分化的最初24小时，Nanog染色维持高水平，但从24小时至96小时显著暴跌(图10)。

为了确认在这些培养物中DE的高百分率，我们进行了流式细胞术分析CXCR4染色的细胞(图6)。通过文档中描述的方法，我们始终获得包含＞93％CXCR4阳性细胞的培养物。这优于至今任何其他报告的方法。表示出了在我们的条件下的hESCs的明场图片和制备的DE(图11)。

我们开发了从hESCs制备DE的改进方法。此方法与之前的方法相比具有几个优点，包括更稳固、可重复的培养系统，此系统更适于细胞治疗的开发。

图8表明通常的用于分化hESCs成为DE和之后成为后肠/胰腺内胚层(Pdx1+细胞)的策略。肠管标记物Tcf2和胰腺内胚层/后侧前肠(posteriorforegut)标记物Pdx1的增加在DE重接种于包含RA和Fgf10的培养基后的12天表现出(图13)。通过QRT-PCR检测转录。Tcf2转录峰在～第6天，比hESCs中增加～60-倍，并且Pdx1转录峰～第10天，表现出与hESCs中相比几乎2,000倍的增加。之后在接种的DE上进行ICC，RA和Fgf10存在2、6和12天(图14)。Tcf2阳性细胞在处理2天后检测(～25％阳性)但到6天增加到100％，到12天稍微降低到50％。在第2和第6天没有检测到Pdx1阳性细胞，但在第12天培养物＞80％。

*这些通常的方法对所有检测的细胞株有效，包括BG01、BG02、H7、H9。

从定形内胚层制备胰腺内胚层的方法

一旦通过上述一种方法制备CXCR4+DE，细胞使用accutase或胶原酶(或相似的)传代，并接种在基质胶上(1∶200；或相似基质)。DE通常以0.5x10⁶/60mm平皿在PE分化培养基中接种长达12天(见下)。

胰腺内胚层分化培养基：

(a)DMEM：F12(Gibco)、2％BSA(Seriologicals、#82-047-3)、1xPen/Strep(Gibco)、1x非必需氨基酸(Gibco)、1x微量元素A、B和C(Cellgro；#99-182-C1、#99-176-C1、#99-175-C1)、50ug/ml抗坏血酸(Sigma、#A4034)、10μg/ml转铁蛋白(Gibco、##11107-018)、0.1nM β-巯基乙醇、10ng/ml激活蛋白A(R&D Systems、#338-AC)、10ng/ml Heregulin β(Peprotech；#100-03)、200ng/ml LR-IGF(JRH Biosciences、#85580)、全反式视黄酸(0.2-2.0μM；Sigma-Aldrich)、50ng/ml重组人Fgf10(R&D Systems)。

当补充有效量的视黄酸和Fgf10时，其他确定成分培养基制剂的用途(见上述人ESC确定成分培养基)可用于分化步骤。

实施例：

为了促进(高效的/可控的/特异的结果)hESCs的分化，包括特异谱系的制备，包括内胚层谱系，包括但不限制于定形内胚层或胰腺内胚层。

用于治疗和非治疗目的。

与上述相同，但为应用其他(即成人)干细胞或前体。

当肿瘤细胞去分化时、当癌症细胞为干-细胞样时，和当癌症细胞不发生分化时，为在癌症申请。

在各种疾病状态下在前体或部分定型的细胞分化失败的情况下。

可直接向HESC培养基加入本发明使用，或存在低浓度的血清或联合其他生长因子使用，例如细胞因子，其他因子包括TGF和超家族成员。

当需要制备特殊细胞类型时，作为药物筛选的一部分。

Claims

1.从定形内胚层细胞制备人胰内胚层细胞的方法，其包括：

a.在细胞分化培养基中，将人定形内胚层细胞暴露于有效量的视黄酸至少一天的时间；并且

b.通过将所述细胞暴露于不含视黄酸的稳定培养基而稳定由步骤a获得的分化细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述定形内胚层细胞从暴露于P13K抑制剂的人胚胎干细胞获得。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞分化培养基包含浓度约0.05μg/ml至约25μg/ml的视黄酸。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞分化培养基包含浓度约0.1μg/ml至约2μg/ml的视黄酸。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述细胞分化培养基还包含成纤维细胞生长因子。

6.根据权利要求1或4所述的方法，其中所述细胞分化培养基还包含浓度约2μg/ml至约100μg/ml的成纤维细胞生长因子10。

7.根据权利要求1或4所述的方法，其中所述细胞分化培养基还包含浓度约2μg/ml至约100μg/ml的成纤维细胞生长因子10。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述细胞分化培养基为包含约2％至约20％胎牛血清的基础细胞培养基。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述细胞分化培养基包含约10％胎牛血清。

10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述稳定培养基为包含约2％至约20％胎牛血清的基础细胞培养基。

11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述稳定培养基为包含约10％胎牛血清的基础细胞培养基。

12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述暴露步骤发生至少约2天的时间。

13.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述暴露步骤发生至少约4天的时间。

14.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述暴露步骤发生至少约4天的时间。

15.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述稳定步骤发生至少约1天的时间。

16.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述稳定步骤发生至少约2天的时间。

17.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述基础细胞培养基是DMEM和F12的混合物。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述基础细胞培养基是DMEM和F12以50∶50混合的混合物。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，在定形内胚层细胞或所述分化细胞在包含分化蛋白的支持物上生长期间，发生所述暴露步骤或所述稳定步骤。

20.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，在定形内胚层细胞或所述分化细胞在包含基质胶的支持物上生长期间，发生所述暴露步骤或所述稳定步骤。

21.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，在所述定形内胚层细胞或所述分化细胞在包含分化蛋白的支持物上生长期间，发生所述暴露步骤和所述稳定步骤。

22.从定形内胚层细胞制备肝内胚层细胞的方法，其包括：

a.在细胞分化培养基中将定形内胚层细胞暴露于有效量的成纤维细胞生长因子至少一天的时间；并且

b.通过将所述细胞暴露于稳定培养基，稳定由步骤a获得的分化细胞。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述成纤维细胞生长因子是成纤维细胞生长因子10。

24.制备胰内胚层细胞的方法，其包括：

a.将通过将人胚胎干细胞暴露于包含有效量的作为分化试剂的P13K抑制剂的基础细胞培养基，从人胚胎干细胞制备定形内胚层细胞；

b.稳定所述的来自步骤a的定形内胚层细胞；

c.在步骤b后，在细胞分化培养基中将定形内胚层细胞暴露于有效量的视黄酸至少一天；并且

d.通过将所述细胞暴露于无视黄酸的稳定培养基，稳定从步骤a获得的分化细胞。

25.在无饲养细胞条件下，从胚胎干细胞制备定形内胚层细胞的方法，包括使用生长基质将接种的胚胎干细胞暴露于确定成分培养基或MEF条件培养基，并且之后将干细胞暴露于分化培养基，所述分化培养基为确定成分培养基，其包含有效量的激活蛋白A、nodal、TGFβ或其他TGF成分，并且任选的包含PI3激酶信号抑制剂。

26.根据权利要求24所述的方法，其中确定成分培养基包括PI3K信号抑制剂。

27.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述生长基质为基质胶。

28.从胚胎干细胞制备定形内胚层细胞的方法，包括将无饲养细胞的所述干细胞暴露于包含升高浓度的激活蛋白A、nodal或TNFβ和任选的PI3激酶信号抑制剂的分化培养基，其中所述分化培养基是不含胎牛血清或KSR-型血清成分的确定成分培养基。

29.根据权利要求24-27中任一项所述的方法，其中，所述定形内胚层细胞以至少约90％的水平从所述胚胎干细胞制备。

30.根据权利要求24-28中任一项所述的方法，其中所述定形内胚层细胞进一步分化为胰内胚层细胞。

31.根据权利要求24-29所述的方法，其中所述细胞是人细胞。

32.一种从人胚胎干细胞制备胰内胚层细胞的方法，所述方法包括在无饲养细胞条件下，从胚胎干细胞制备定形内胚层细胞，包括使用生长基质将胚胎干细胞暴露于确定成分培养基或MEF条件培养基中，并且之后将所述干细胞暴露于分化培养基至少约3-6天的时间，所述分化培养基为确定成分培养基，该培养基包含有效量的SMAD通路激动剂，和任选的PI3激酶信号抑制剂，以制备定形内胚层细胞，并且之后再将所述定形内胚层细胞暴露于包含有效量的视黄酸和任选的有效量的FGF10的确定成分培养基约5-12天，优选8-10天，以制备胰内胚层细胞。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述SMAD通路激动剂选自激活蛋白A、nodal、TGFβ、TGF成分或其混合物。

34.根据权利要求32或33所述的方法，其中所述培养基还包括有效量的wnt3a。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述生长基质为基质胶。