KR101836855B1 - 만능 줄기 세포의 분화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인슐린 생성 세포로의 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 췌장 내분비 전구 세포의 집단을 생성하기 위하여 CYP26A 억제제를 이용하는 방법을 제공한다.

Description

만능 줄기 세포의 분화{DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT STEM CELLS}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 모든 목적을 위하여 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는, 2010년 8월 31일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/378,480호의 이익을 주장한다.
본 발명은 인슐린 생성 세포로의 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 췌장 내분비 전구 세포의 집단을 생성하기 위하여 CYP26A 억제제를 이용하는 방법을 제공한다.
제I형 진성 당뇨병 및 이식가능한 랑게르한스섬의 부족에 대한 세포-대체 치료법에서의 진전에서는 생착(engraftment)에 적절한 인슐린 생성 세포, 또는 β 세포의 공급원을 개발하는 데 관심이 집중되었다. 한 가지 접근법은 예를 들어 배아 줄기 세포와 같은 만능 줄기 세포로부터의 기능성 β 세포의 생성이다.
척추동물 배아 발생에서, 만능성 세포는 낭배형성 (gastrulation)으로 알려진 과정에서 삼배엽층(외배엽, 중배엽, 및 내배엽)을 포함하는 세포군을 생성한다. 예를 들어, 갑상선, 흉선, 췌장, 소화관, 및 간과 같은 조직은 중간 단계를 통해 내배엽으로부터 발생할 것이다. 이 과정에서 중간 단계는 완성 내배엽 (definitive endoderm)의 형성이다. 완성 내배엽 세포는 HNF3 베타, GATA4, MIXL1, CXCR4 및 SOX17과 같은 많은 마커를 발현한다.
췌장의 형성은 완성 내배엽의 췌장 내배엽으로의 분화로부터 생긴다. 췌장 내배엽의 세포는 췌장-십이지장 호메오박스(homeobox) 유전자, Pdx1을 발현한다. Pdx1의 부재 하에서는, 췌장은 복측 원기(ventral bud) 및 배측 원기(dorsal bud)의 형성 이상으로는 발달하지 못한다. 따라서, Pdx1 발현이 췌장 기관형성에서 중요한 단계를 특징짓는다. 성숙한 췌장은 다른 세포형 중에서도 외분비 조직 및 내분비 조직을 포함한다. 외분비 및 내분비 조직은 췌장 내배엽의 분화로부터 생긴다.
생체 내에서의 췌장 발생은 적어도 부분적으로는 기관 선구체의 장(organ progenitor field)을 특정하는 시그널의 적절한 조절에 의존한다. 킨켈(Kinkel) 등 (문헌[PNAS May 12, 2009 vol. 106 no. 19 7864-7869])은 "췌장 세포의 운명은 레틴산(RA)에 의해 특정되며, 췌장의 장(pancreatic field)의 적당한 크기 및 위치화는 RA 시그널링의 엄격한 제어에 의존적이다. 여기서 우리는 RA 분해 Cyp26 효소가 췌장의 장의 정상적인 전방 한계를 규정함에 있어서 결정적인 역할을 함을 보여준다"고 진술하고 있다.
췌도 세포의 특징을 지닌 세포가 생쥐의 배아 세포로부터 유도된 것으로 보고되었다. 예를 들어, 루멜스키(Lumelsky) 등 (문헌[Science 292:1389, 2001])은 생쥐 배아 줄기 세포가 췌도와 유사한 인슐린 분비 구조로 분화한 것을 보고하고 있다. 소리아(Soria) 등 (문헌[Diabetes 49:157, 2000])은 생쥐 배아 줄기 세포로부터 유도된 인슐린 분비 세포가 스트렙토조토신 유도된 당뇨 생쥐에서 혈당을 정상화시킴을 보고하고 있다.
하나의 예에서, 호리(Hori) 등 (문헌[PNAS 99: 16105, 2002])은 생쥐 배아 줄기 세포를 포스포이노시티드 3-키나아제의 억제제(LY294002)로 처리하여 β 세포와 닮은 세포를 생성하였음을 개시하였다.
다른 예에서, 블리츠주크(Blyszczuk) 등 (문헌[PNAS 100:998, 2003])은 구성적으로 Pax4를 발현하는 생쥐 배아 줄기 세포로부터 인슐린 생성 세포를 생성하는 것을 보고하고 있다.
미칼레프( Micallef ) 등은 PDX1 양성 췌장 내배엽이 형성되게 하는 배아 줄기 세포의 책무(commitment)를 레틴산이 조절할 수 있음을 보고하고 있다. 레틴산은 배아에서 낭배형성의 마지막에 해당하는 기간 동안 배아 줄기 세포 분화의 4일째에 배양물에 첨가될 때 Pdx1 발현을 유도하는 데 가장 효과적이다 (문헌[Diabetes 54:301, 2005]).
미야자키( Miyazaki ) 등은 Pdx1을 과다 발현하는 생쥐 배아 줄기 세포주를 보고하고 있다. 그들의 결과는 외인성 Pdx1 발현이 생성된 분화된 세포에서 인슐린, 소마토스타틴, 글루코키나아제, 뉴로제닌3, p48, Pax6, 및 Hnf6 유전자의 발현을 명확히 향상시켰음을 보여준다(문헌[Diabetes 53: 1030, 2004]).
스쿠디(Skoudy) 등은 액티빈 A (TGF-β 수퍼패밀리의 구성원)가 생쥐 배아 줄기 세포에서 외분비 췌장 유전자(p48 및 아밀라아제) 및 내분비 유전자(Pdx1, 인슐린 및 글루카곤)의 발현을 상향조절함을 보고하고 있다. 최대 효과는 1 nM 액티빈 A를 사용하여 관찰되었다. 그들은 또한 인슐린 및 Pdx1 mRNA의 발현 수준이 레틴산에 의해 영향을 받지 않지만; 3 nM FGF7 처리가 Pdx1의 전사체의 수준을 증가시킴을 관찰하였다(문헌[Biochem. J. 379: 749, 2004]).
쉬라키(Shiraki) 등은 배아 줄기 세포의 Pdx1 양성 세포로의 분화를 특이적으로 향상시키는 성장 인자들의 효과를 연구하였다. 이들은 TGF-β2가 재현가능하게 더 높은 비율의 Pdx1 양성 세포를 생성함을 관찰하였다 (문헌[Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16.]).
고든( Gordon ) 등은 Wnt 시그널링 억제제와 함께 액티빈의 존재 하에 그리고 혈청의 부재 하에, 생쥐 배아 줄기 세포로부터 브라키어리(brachyury) [양성]/HNF3 베타 [양성] 내배엽 세포의 유도를 보여주었다 (미국 특허 공개 제2006/0003446A1호).
고든 등 (문헌[PNAS, Vol 103, page 16806, 2006])은 "Wnt 및 TGF-베타/ 노달(nodal)/ 액티빈 시그널링은 전방 원시선(anterior primitive streak)의 생성에 동시에 필요하였다"라고 진술한다.
그러나, 배아 줄기 세포 발생의 생쥐 모델은 예를 들어, 인간과 같은 고등 포유류에서의 발생 프로그램을 정확하게 모방하지 않을 수 있다.
톰슨(Thomson) 등은 인간 배반포로부터 배아 줄기 세포를 단리하였다(문헌[Science 282:114, 1998]). 동시에, 기어하트(Gearhart)와 동료들은 태아 생식선 조직으로부터 인간 배아 생식 세포(human embryonic germ; hEG) 세포주를 유도하였다 (문헌[Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998]). 백혈병 억제 인자(LIF)와 함께 배양함으로써 간단하게 분화를 방지할 수 있는 생쥐 배아 줄기 세포와는 달리, 인간 배아 줄기 세포는 매우 특별한 조건 하에서 유지되어야 한다 (미국 특허 제6,200,806호; 국제특허 공개 WO 99/20741호; 국제특허 공개 WO 01/51616호).
드'아무르(D'Amour) 등은 고농도의 액티빈과 저 혈청의 존재 하에서 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽의 농축 배양물의 생성을 개시한다 (문헌[Nature Biotechnology 2005]). 생쥐의 신장 피막 하에 이들 세포를 이식하면 일부 내배엽 기관의 특징을 가진 보다 성숙한 세포로의 분화가 야기되었다. 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽 세포는 FGF-10의 첨가 후에 Pdx1 양성 세포로 추가로 분화될 수 있다 (미국 특허 공개 제2005/0266554A1호).
드'아무르(D'Amour) 등 (문헌[Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401 (2006)])은 "우리는 인간 배아 줄기(hES) 세포를 췌장 호르몬 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩티드 및 그렐린을 합성할 수 있는 내분비 세포로 전환시키는 분화 방법을 개발하였다. 이 과정은 도중에 완성 내배엽, 창자관 내배엽, 췌장 내배엽, 및 내분비 전구체를 닮은 단계들을 통해 세포를 내분비 호르몬 발현 세포가 되도록 함으로써 생체내(in vivo) 췌장 기관형성을 모방한다"고 밝혔다.
다른 예에서, 피스크(Fisk) 등은 인간 배아 줄기 세포로부터 췌도 세포를 생성하는 시스템을 보고한다 (미국 특허 공개 제2006/0040387A1호). 이 경우에, 분화 경로를 세 단계로 나누었다. 인간 배아 줄기 세포를 먼저 부티르산나트륨 및 액티빈 A의 조합을 사용하여 내배엽으로 분화시켰다. 그 다음, 세포를 EGF 또는 베타셀룰린과 조합된 TGF-β 길항제, 예컨대 노긴(Noggin)과 함께 배양하여, PDX1 양성 세포를 생성하였다. 마지막 분화는 니코틴아미드에 의해 유도되었다.
따라서 β 세포와 더욱 밀접하게 닮은 기능성 인슐린 발현 세포를 생성하기 위한 시험관 내 방법을 개발하는 것이 여전히 상당히 필요하다. 본 발명은 레틴산을 분해시키는 제제를 이용하여 췌장 전구 세포의 집단을 생성함으로써 만능 줄기 세포를 인슐린 발현 세포를 향해 분화시키는 효율을 향상시키는 대안적인 접근법을 취한다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 췌장 내분비 전구 세포의 집단을 생성하기 위하여 CYP26A 억제제를 이용하는 방법을 제공한다.
일 실시 형태에서, 췌장 내분비 전구 세포의 집단의 형성은 단계적 분화 프로토콜을 이용하여 성취되며, 여기서 만능 줄기 세포의 집단은 먼저 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화된다. 다음, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 그 후 원시 장관(primitive gut tube) 세포의 집단으로 분화된다. 다음, 원시 장관 세포의 집단은 그 후 후방 전장(posterior foregut) 세포의 집단으로 분화된다. 다음, 후방 전장 세포의 집단은 그 후 후방 전장 세포의 집단을 CYP26A 억제제가 보충된 배지로 처리함으로써 내분비 전구 세포의 집단으로 분화된다.
일 실시 형태에서, 내분비 전구 세포의 집단은 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화된다.
<도 1>
도 1은 a) PAX4, b) NGN3, c) PDX1, d) NEUROD, e) NKX6.1, f) CDX2, 및 g) 알부민에 있어서, 실시예 1에 약술된 프로토콜의, III기 내지 IV기의 세포로부터 수득된 샘플들로부터 수득된 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. y축은 미분화 H1 세포에 대한 발현 배수이다. 패널 h는 IV기의 CYP26A 처리 배양물 및 대조군에 있어서의 NGN3 면역염색을 나타낸다.
<도 2>
도 2는 a) NGN3, b) NEUROD, c) CDX2, d) NKX6.1 및 e) PDX1에 있어서, 실시예 2에 약술된 프로토콜의, III기 내지 IV기의 세포로부터 수득된 샘플들로부터 수득된 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. y축은 미분화 H1 세포에 대한 발현 배수이다.
<도 3>
도 3은 실시예 3에 약술된 프로토콜의 I기 내지 VI기의 세포의 위상 영상을 나타낸다.
<도 4>
도 4는 실시예 3에 약술된 프로토콜의 IV기 내지 VII기의 세포에서의 NKX6.1의 발현에 있어서의 FACS 플롯을 나타낸다.
<도 5>
도 5는 실시예 3에 약술된 프로토콜의 V기 및 VII기의 세포에서의 PDX1, NKX6.1 및 CDX2에 있어서의 면역염색 영상을 나타낸다.
개시내용을 분명하게 하고 제한되지 않기 위해, 본 발명의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 본 발명의 소정의 특징, 실시 형태 또는 응용을 기재 또는 예시하는 하기 세부 항목으로 나뉘어진다.
정의
줄기 세포는 단일 세포 레벨에서 자가 재생하고 분화하여 자가 재생 선구 세포, 비재생 선구 세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포(progeny cell)를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서(in vitro) 분화하는 그의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직이 생기게 하며 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니라 하더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.
줄기 세포는 그들의 발생 능력에 의해 분류된다: (1) 모든 배아 및 배자외 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (2) 모든 배아 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 만능성; (3) 세포 계통의 하위집단이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 하위집단이 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성(예를 들어, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC(자가-재생), 혈구 세포 제한된 소기능성(oligopotent) 전구세포 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소(예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (4) 다능 줄기 세포보다 더 제한된 하위집단의 세포 계통이 될 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계통 (예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단일기능성.
분화는 특화되지 않은("미결된") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화-유도된 세포는 세포의 계통 내에서 보다 특화된 ("결정된(committed)") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 통상적인 환경 하에서 특정 세포형 또는 세포형의 서브세트로 계속 분화할 것이며, 통상적인 환경 하에서 다른 세포형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. 탈분화(De-differentiation)는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특화된(또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포의 계통은 세포의 유전, 즉 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포가 생성되게 할 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통 특이적 마커는 관심있는 계통의 세포의 표현형과 특이적으로 관련되며 미결정 세포가 관심있는 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 "완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포", 또는 "1기 세포" 또는 "1기"는 하기 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질(Mix-like homeobox protein), FGF4 CD48, 에오메소더민(eomesodermin, EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 또는 OTX2. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포, 원시선 세포, 중내배엽 세포 및 완성 내배엽 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기의 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: PDX1, NKX6.1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HNF4 알파, SOX9, HB9 또는 PROX1. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포, 원시 장관 세포, 및 후방 전장 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽"은 낭배의 외피(epiblast)로 인한 세포의 특징을 갖고 위장관로 및 그의 유도체를 형성하는 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커들을 발현한다: HNF3 베타, GATA4, SOX17, 세르베루스(Cerberus), OTX2, 구스코이드, C-Kit, CD99 및 MIXL1.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "마커"는 관심있는 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차등 발현은 양성 마커의 수준 증가 및 음성 마커의 수준 감소를 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 레벨은 다른 세포에 비하여 대상 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 대상 세포가 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 확인되어 구별될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 전구 세포"는 하기의 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: NGN3, NEUROD 또는 NKX2.2.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "후방 전장 세포"는 하기의 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: PDX1 또는 HNF6.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "미성숙 췌장 호르몬 발현 세포"는 하기의 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, MAFB, PDX1, ARX, NKX6.1, NKX2.2, 또는 NEUROD.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "원시 장관 세포"는 하기의 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: HNF1 베타 또는 HNF4 알파.
본 명세서에서 사용되는 "췌장 내분비 세포", 또는 "췌장 호르몬 발현 세포", 또는 "췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기의 호르몬 중 하나 이상을 발현할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴 및 췌장 폴리펩티드.
만능 줄기 세포의 단리, 확장 및 배양
만능 줄기 세포의 특성화
만능 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원(stage-specific embryonic antigen, SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다 (문헌[Thomson et al., Science 282:1145, 1998]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra1-60, 및 Tra1-81 발현(존재하는 경우)의 소실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼리성 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사 (미국 캘리포니아주 벌링게임 소재의 벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories))가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드를 이용하여 발색시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화된 만능 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출할 때, OCT4 및 TERT를 발현한다.
번식된 만능 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽층의 세포, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 조직으로 분화하는 잠재력이다. 만능 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 세포를 중증 복합형 면역결핍증(severe combined immunodeficient, SCID) 생쥐내로 주사하고, 형성되는 기형종을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하고, 이어서 삼배엽층으로부터의 세포 유형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 다능성은 배양체 (embryoid body)를 형성하고, 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배양체를 평가함으로써 결정될 수 있다.
번식된 만능 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다.
만능 줄기 세포의 공급원
사용될 수 있는 만능 줄기 세포의 유형은 임신 후 형성된 조직으로부터 유도되는 구축된 만능 세포주를 포함하고, 이러한 조직에는 전-배아 조직 (예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 전형적으로 본질적으로는 대략 10 내지 12주의 임신 전이 아닌 임신 동안의 임의의 때에 취해진 태아 조직이 포함된다. 비제한적인 예로는 수립된 인간 배아 줄기 세포주 또는 인간 배아 생식 세포주, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H1, H7, 및 H9 (WiCell)가 있다. 이러한 세포의 초기 수립 또는 안정화 시에 본 명세서의 조성물의 사용도 고려되며, 이 경우에는 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취한 일차 다능성 세포일 것이다. 영양 세포의 부재 하에서 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 돌연변이 인간 배아 줄기 세포주, 예를 들어, BG01v (미국 조지아주 애선스 소재의 브레사겐(BresaGen))가 또한 적합하다.
일 실시 형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 톰슨(Thomson) 등에 의해 기재된 바와 같이 제조된다 (미국 특허 제5,843,780호; 문헌[Science 282:1145, 1998]; 문헌[Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998]; 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995]).
만능 줄기 세포의 배양
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 다양한 방식으로 만능 줄기 세포를 지지하는 피더 세포층 상에서 배양된다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 본질적으로 영양 세포가 없지만, 그럼에도 불구하고 실질적인 분화를 거치지 않고 만능 줄기 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템에서 배양된다. 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지를 이용하여 지지된다. 대안적으로, 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 화학적 규명 배지를 이용하여 지지된다.
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 문헌[Reubinoff et al, Nature Biotechnology 18: 399 - 404 (2000)]에 개시된 방법에 따라 생쥐 배아 섬유아세포 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Thompson et al, Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145 - 1147]에 개시된 방법에 따라 생쥐 배아 섬유아세포 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Richards et al, Stem Cells 21: 546-556, 2003]에 개시된 영양 세포층들 중 임의의 하나 상에서 배양될 수 있다.
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 문헌[Wang et al, Stem Cells 23: 1221-1227, 2005]에 개시된 방법에 따라 인간 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다. 대안적인 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 문헌[Stojkovic et al, Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005]에 개시된 인간 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Miyamoto et al, Stem Cells 22: 433-440, 2004]에 개시된 인간 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Amit et al, Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003]에 개시된 인간 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Inzunza et al, Stem Cells 23: 544-549, 2005]에 개시된 인간 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다.
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 미국 특허 공개 제20020072117호에 개시된 방법에 따라 유도된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 제6642048호에 개시된 방법에 따라 유도된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 국제특허 공개 WO2005014799호에 개시된 방법에 따라 유래된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Xu et al, Stem Cells 22: 972-980, 2004]에 개시된 방법에 따라 유도된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 공개 제20070010011호에 개시된 방법에 따라 유도된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 공개 제20050233446호에 개시된 방법에 따라 유도된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 제6800480호에 개시된 방법에 따라 유도된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 국제특허 공개 WO2005065354호에 개시된 방법에 따라 유래된 배양 배지에서 배양할 수 있다.
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 문헌[Cheon et al, BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005]에 개시된 방법에 따라 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Levenstein et al, Stem Cells 24: 568-574, 2006]에 개시된 방법에 따라 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 공개 제20050148070호에 개시된 방법에 따라 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 공개 제20050244962호에 개시된 방법에 따라 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 국제특허 공개 WO2005086845호에 개시된 방법에 따라 배양할 수 있다.
만능 줄기 세포는 적합한 배양 기재 상에 도말될 수 있다. 일 실시 형태에서, 적합한 배양 기재는 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어, 기저막으로부터 유래된 것들, 또는 부착 분자 수용체-리간드 커플링의 일부를 형성할 수 있는 것들이다. 하나의 실시 형태에서, 적합한 배양 기질은 매트리겔(MATRIGEL)(등록상표) (벡튼 디켄슨(Becton Dickenson))이다. 매트리겔(등록상표)은 실온에서 겔화하여 재구성된 기저막을 형성하는 엔젤브레스-홈-스왐(Engelbreth-Holm Swarm) 종양 세포 유래의 용해성 제제이다.
다른 세포외 매트릭스 성분 및 성분 혼합물이 대안으로서 적합하다. 증식되는 세포 유형에 따라, 이것은 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 헤파란 설페이트 등을 단독으로 또는 다양한 조합으로 포함할 수 있다.
만능 줄기 세포는 적합한 분포로 그리고 세포 생존, 번식, 및 바람직한 특징의 보유를 촉진하는 배지의 존재 하에서 기재상에 도말될 수 있다. 모든 이들 특성은 시딩 분포에 세심한 주의를 기울여 이익을 얻으며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
적합한 배양 배지는 하기의 성분, 예컨대 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM), 깁코(Gibco) 번호 11965-092; 넉아웃 둘베코 변형 이글 배지 (KO DMEM), 깁코 번호 10829-018; 햄 (Ham's) F12/50% DMEM 기본 배지; 200 mM L-글루타민, 깁코 번호 15039-027; 비필수 아미노산 용액, 깁코 11140-050; β-머캅토에탄올, 시그마(Sigma) 번호 M7522; 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor; bFGF), 깁코 번호 13256-029로부터 제조할 수 있다.
만능 줄기 세포로부터의 췌장 내분비 전구 세포의 형성
본 발명은 만능 줄기 세포의 집단으로부터 췌장 전구 세포의 집단을 형성하는 방법을 제공한다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 췌장 내분비 전구 세포를 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화시키는 방법을 제공한다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 췌장 전구 세포를 생성하는 방법을 제공하며, 이는
a. 만능 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계;
b. 만능 줄기 세포의 집단을 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계;
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 원시 장관 세포의 집단으로 분화시키는 단계;
d. 원시 장관 세포의 집단을 후방 전장 세포의 집단으로 분화시키는 단계; 및
e. 후방 전장 세포의 집단을 CYP26A 억제제가 보충된 배지로 처리함으로써 후방 전장 세포의 집단을 췌장 내분비 전구 세포의 집단으로 분화시키는 단계를 포함한다.
췌장 내분비 전구 세포의 집단은 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 형성하도록 추가로 처리될 수 있다.
분화 효율은 원하는 세포 유형의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄반응(RT-PCR), 노던 블롯, 원위치(in situ) 혼성화(예컨대, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역검정법, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석(FACS) (예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
만능 줄기 세포의 특징은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 만능 줄기 세포의 추가의 특징은 계속 확인되고 있다. 만능 줄기 세포 마커는 예를 들어 ABCG2, 크립토(cripto), FOXD3, 커넥신(CONNEXIN)43, 커넥신45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81 중 하나 이상의 발현을 포함한다.
다능성 줄기 세포를 본 발명의 방법으로 처리한 후, 분화된 세포는 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포에 의해 발현된 CXCR4와 같은 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시켜 정제할 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적절한 만능 줄기 세포는 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H9 (NIH 코드: WA09), 인간 배아 줄기 세포주 H1 (NIH 코드: WA01), 인간 배아 줄기 세포주 H7(NIH 코드: WA07) 및 인간 배아 줄기 세포주 SA002(스웨덴 소재의 셀라르티스(Cellartis))를 포함한다. 또한, 만능 세포의 특징적인 하기의 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적절하다: ABCG2, 크립토(cripto), CD9, FOXD3, 커넥신43, 커넥신45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, 및 Tra 1-81.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질, FGF4, CD48, 에오메소더민 (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 대안적 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 다른 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.
췌장 내배엽 계통(이는 원시 장관 세포 및 후방 전장 세포를 포함함)의 특징적인 마커는 PDX1, NKX6.1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HNF4 알파, SOX9, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, NGN3, 및 PTF-1 알파로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내분비 세포는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴 및 췌장 폴리펩티드. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 대안적으로, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 세포는 β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포이다. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 PDXI 및 하기 전사 인자 중 적어도 하나를 발현한다: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 베타, MAFA, PAX4, 및 PAX6. 본 발명의 일 태양에서, β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포이다.
만능 줄기 세포로부터의 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 당업계의 임의의 방법에 의해 만능 줄기 세포의 집단으로부터 형성될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포의 집단은 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포의 집단은 문헌[Shinozaki et al, Development 131, 1651 - 1662 (2004)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포의 집단은 문헌[McLean et al, Stem Cells 25, 29 - 38 (2007)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포의 집단은 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포의 집단은 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포의 집단은 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포의 집단은 미국 특허 출원 제12/493,741호에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포의 집단은 미국 특허 출원 제12/494,789호에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포, 원시 장관 세포, 및 후방 전장 세포를 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 형성된, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 본 기술 분야의 임의의 방법에 의해 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득된, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득된, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
췌장 내분비 전구 세포의 집단의 형성
일 실시 형태에서, 본 발명은 췌장 전구 세포를 생성하는 방법을 제공하며, 이는
a. 만능 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계;
b. 만능 줄기 세포의 집단을 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계;
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 원시 장관 세포의 집단으로 분화시키는 단계;
d. 원시 장관 세포의 집단을 후방 전장 세포의 집단으로 분화시키는 단계; 및
e. 후방 전장 세포의 집단을 CYP26A 억제제가 보충된 배지로 처리함으로써 후방 전장 세포의 집단을 췌장 내분비 전구 세포의 집단으로 분화시키는 단계를 포함한다.
CYP26A 억제제는 약 1 nM 내지 약 1000 nM의 농도로 사용될 수 있다. 대안적으로, CYP26A 억제제는 약 10 nM 내지 약 100 nM의 농도로 사용될 수 있다.
임의의 CYP26A 억제제가 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, CYP26A 억제제는 미국 특허 제7,468,391호에 개시된 화합물들로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, CYP26A 억제제는 미국 특허 공개 제2005/0187298A1호에 개시된 화합물들로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, CYP26A 억제제는 미국 특허 공개 제2004/0106216A1호에 개시된 화합물들로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, CYP26A 억제제는 국제특허 공개 WO2005058301A1호에 개시된 화합물들로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, CYP26A 억제제는 문헌[PNAS May 12, 2009 vol. 106 no. 19 7864-7869]에 개시된 화합물들로부터 선택될 수 있다. 일 실시 형태에서, CYP26A 억제제는 N-{4-[2-에틸-1-(1H-1,2,4-트라이아졸-1-일)부틸]페닐}-1,3-벤조티아졸-2-아민이다. 하기 화학식 1을 참조하라.
Figure 112013025674136-pct00001
일 실시 형태에서, CYP26A 억제제가 보충된 배지에는 BMP를 억제할 수 있는 인자, TGFβ 수용체 시그널링 억제제, 비타민 A 및 PKC 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 인자가 추가로 보충된다.
일 실시 형태에서, BMP를 억제할 수 있는 인자는 노긴이다. 노긴은 약 50 ng/ml 내지 약 500 ㎍/ml의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 노긴은 100 ng/ml의 농도로 사용된다.
일 실시 형태에서, TGFβ 수용체 시그널링 억제제는 ALK5의 억제제이다. 일 실시 형태에서, ALK5의 억제제는 ALK5 억제제 II이다. ALK5 억제제 II는 약 0.1 ㅅM 내지 약 10 ㅅM의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, ALK5 억제제 II는 1 μM의 농도로 사용된다.
일 실시 형태에서, PKC 활성화제는 (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에모일아미노) 벤조락탐, 인도락탐 V(ILV), 포볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA), 및 포볼-12,13-다이부티레이트(PDBu)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 단백질 키나아제 C 활성화제는 (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에모일아미노) 벤조락탐이다. (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에모일아미노) 벤조락탐은 약 20 nM 내지 약 500 nM의 농도로 사용될 수 있다. (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에모일아미노) 벤조락탐은 본 명세서에서 "TPB"로 칭해진다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
일 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 췌장 내분비 전구체 세포의 집단은 본 기술 분야의 임의의 방법에 의해 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화된다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 미국 특허 출원 제60/953,178호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 미국 특허 출원 제60/990,529호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 이에 의해 제한되지는 않는다.
실시예
실시예 1
FBS 가 결여되고 CYP26A 의 억제제를 함유하는 세포 배양 배지에서의 인간 배아 줄기 세포주 H1 의 세포의 췌장 내분비 전구 세포로의 분화
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포(p40-p50)를 매트리겔(등록상표)-코팅된 디쉬 (1:30 희석) (비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences); 카탈로그 번호: 356231)에서, MEF-CM(생쥐 배아 섬유아세포 조절 배지(mouse embryonic fibroblast conditioned medium))에서 콜로니로서 배양하고, 하기와 같이 췌장 내분비 전구 세포로 분화시켰다:
a. I기 (완성 내배엽): 인간 배아 줄기 세포를 2% 무지방산 BSA (카탈로그 번호: 68700, 미국 아이오와주 소재의 프롤리언트(Proliant)), 및 100 ng/ml의 액티빈 A(미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈(R&D Systems)) + 20 ng/ml의 WNT-3a (카탈로그 번호: 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈) + 8 ng/ml의 bFGF (카탈로그 번호: 100-18B, 미국 뉴저지주 소재의 페프로테크(PeproTech))가 보충된 RPMI 배지에서 1일 동안 배양하고, 이어서 2% BSA 및 100 ng/ml의 액티빈 A + 8 ng/ml의 bFGF가 보충된 RPMI 배지로 추가로 2일 동안 처리하고, 그 후
b. II기 (원시 장관): 세포를 RPMI + 2% 무지방산 BSA 및 50 ng/ml FGF7로 2일 동안 처리하고, 그 후
c. III기 (후방 전장): 세포를 ITS-X (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐(Invitrogen))의 1:200의 희석물, 0.1% BSA (지질 풍부) (인비트로겐, 카탈로그 번호: 11021-045), 50 ng/ml의 FGF7, 0.25 μM의 SANT-1, 2 μM의 레틴산 (RA) (미국 미주리주 소재의 시그마), 100 ng/ml의 노긴 (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈), 2.5 μM의 4-[4-(4-플루오로페닐)-1-(3-페닐프로필)-5-피리딘-4-일-1H-이미다졸-2-일]부트-3-인-1-올 (미국 특허 제6,521,655호에 개시된 P38 억제제), 및 20 ng/ml의 액티빈 A가 보충된 DMEM/고 글루코스로 5일 동안 처리하고, 그 후
d. IV기 (췌장 내분비 전구체): 세포를 ITS-X (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)의 1:200 희석물 및 0.1% BSA (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐), 100 ng/ml의 노긴, 1 μM의 ALK5 억제제 (SD-208, 문헌[Molecular Pharmacology 2007 72:152-161]에 개시됨), 500 nM의 TPB (α-아밀로이드 전구체 단백질 조정제) (카탈로그 번호: 565740, 미국 캘리포니아주 소재의 이엠디(EMD))), 및 10-100 nM의 CYP26A 억제제 N-{4-[2-에틸-1-(1H-1, 2, 4-트라이아졸-1-일)부틸]페닐}-1, 3-벤조티아졸-2-아민, 및 10-100 nM의 비타민 A (카탈로그 번호: R7632, 미국 미주리주 소재의 시그마)가 보충된 DMEM/고 글루코스로 4일 동안 처리하거나, 또는
배양물들 중 일부에서, IV기를 6일까지 확장시켰다. mRNA를 췌장 관련 유전자의 실시간 PCR 분석을 위하여 III기 및 IV기에서 단리하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, IV기에서의 CYP26A 억제제의 첨가는 췌장 내배엽 마커 NKX6.1과 함께 내분비 전구체 마커(NGN3, Pax4, NeuroD)의 발현을 용량 의존적인 방식으로 유의하게 증대시켰다. 비타민 A를 CYP26A 억제제와 함께 첨가하는 것은 췌장 내배엽 또는 내분비 전구체 마커의 발현을 유의하게 변경시키지 못하였다. 더욱이, IV기에서의 CYP26A 억제제의 첨가는 CDX2(장 마커(intestinal marker)) 및 알부민(간 마커)의 발현을 감소시켰다. IV기에서의 NGN3 (카탈로그 번호: AF3444, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)에 대한 면역염색은 100 nM의 CYP26A 억제제로 처리한 배양물에 있어서 NGN3의 발현의 유의한 증대를 명백하게 보여주었다.
실시예 2
FBS가 결여되고 CYP26A의 억제제를 함유하는 세포 배양 배지에서 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 췌장 내분비 전구 세포로 분화시키는 대안적인 방법
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포(p40-p52)를 단일 세포로서 100000개의 세포/㎠의 밀도로 매트리겔(등록상표)-코팅된 디쉬 (1:30의 희석) (비디 바이오사이언시즈; 카탈로그 번호: 356231)에 16 ng/ml의 FGF2 (카탈로그 번호: 100-18B, 미국 뉴저지주 소재의 페프로테크) 및 10 μM의 Y27632 (Rock 억제제, 카탈로그 번호: Y0503, 미국 미주리주 소재의 시그마)가 보충된 MEF-CM(생쥐 배아 섬유아세포 조절 배지) 중에 접종하였다. 접종한지 72시간 후에, 배양물들을 하기와 같이 완성 내배엽(DE)으로 분화시켰다:
a. I기 (완성 내배엽): 인간 배아 줄기 세포를 2% 무지방산 BSA (카탈로그 번호: 68700, 미국 아이오와주 소재의 프롤리언트), 0.0025 g/ml의 중탄산나트륨 (카탈로그 번호: S3187, 미국 미주리주 소재의 시그마), 1X 글루타맥스(GlutaMax)™ (카탈로그 번호: 35050-079, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) 및 100 ng/ml의 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈) + 20 ng/ml의 WNT-3a (카탈로그 번호: 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)가 보충된 MCDB-131 (카탈로그 번호: 10372-019, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) 배지로 1일 동안 처리하고, 이어서 2% BSA, 중탄산나트륨, 글루타맥스, 및 100 ng/ml의 액티빈 A가 보충된 MCDB-131 배지로 추가로 3일 동안 처리하고, 그 후
b. II기 (원시 장관): 세포를 MCDB-131 + 2% 무지방산 BSA 및 50 ng/ml FGF7로 3일 동안 처리하고, 그 후
c. III기 (후방 전장): 세포를 ITS-X (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)의 1:200 희석물, 1X 글루타맥스™ (카탈로그 번호: 35050-079, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐), 0.0025 g/ml의 중탄산나트륨 (카탈로그 번호: S3187, 미국 미주리주 소재의 시그마), 0.1% BSA (지질 풍부) (인비트로겐, 카탈로그 번호: 11021-045), 50 ng/ml의 FGF7, 0.25 μM의 SANT-1, 2 μM의 레틴산(RA) (미국 미주리주 소재의 시그마), 2.5 μM의 4-[4-(4-플루오로페닐)-1-(3-페닐프로필)-5-피리딘-4-일-1H-이미다졸-2-일]부트-3-인-1-올 (p38 억제제, 미국 특허 제6,521,655호에 개시됨), 100 nM의 LDN-193189 (BMP 수용체 억제제, 카탈로그 번호: 04-0019, 미국 캘리포니아주 소재의 스템겐트(Stemgent)), 500 nM의 CYP26A 억제제 N-{4-[2-에틸-1-(1H-1, 2, 4-트라이아졸-1-일)부틸]페닐}-1, 3-벤조티아졸-2-아민, 및 20 ng/ml의 액티빈 A가 보충된 MCDB-131/고 글루코스 (25 mM의 글루코스)로 4일 동안 처리하고, 그 후
d. IV기 (췌장 내분비 전구체): 세포를 ITS-X (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)의 1:200 희석물 및 0.1% BSA (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐), 1X 글루타맥스™ (카탈로그 번호: 35050-079, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐), 0.0025 g/ml의 중탄산나트륨 (카탈로그 번호: S3187, 미국 미주리주 소재의 시그마), 1 μM의 ALK5 억제제 (SD-208, 문헌[Molecular Pharmacology 2007 72:152-161]에 개시됨), 500 nM의 PDBu (PKC 활성화제) (카탈로그 번호: P1269, 미국 미주리주 소재의 시그마), 100 nM의 LDN-193189 (BMP 수용체 억제제, 카탈로그 번호: 04-0019, 미국 캘리포니아주 소재의 스템겐트), 0.25 μM의 SANT-1 (#S4572, 미국 미주리주 소재의 시그마), 및 500 nM의 CYP26A 억제제 N-{4-[2-에틸-1-(1H-1, 2, 4-트라이아졸-1-일)부틸]페닐}-1, 3-벤조티아졸-2-아민이 보충된 MCDB-131/고 글루코스 (25 mM의 글루코스)로 7일 동안 처리하거나, 또는
e. IV기 (췌장 내분비 전구체): 세포를 ITS-X (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)의 1:200 희석물 및 0.1% BSA (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐), 1X 글루타맥스™ (카탈로그 번호: 35050-079, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐), 0.0025 g/ml의 중탄산나트륨 (카탈로그 번호: S3187, 미국 미주리주 소재의 시그마), 1 μM의 ALK5 억제제 (SD-208, 문헌[Molecular Pharmacology 2007 72:152-161]에 개시됨), 500 nM의 PDBu (PKC 활성화제) (카탈로그 번호: P1269, 미국 미주리주 소재의 시그마), 100 nM의 LDN-193189 (BMP 수용체 억제제, 카탈로그 번호: 04-0019, 미국 캘리포니아주 소재의 스템겐트), 0.25 μM의 SANT-1 (#S4572, 미국 미주리주 소재의 시그마)이 보충된 MCDB-131/고 글루코스 (25 mM의 글루코스)로 7일 동안 처리하였다.
mRNA를 췌장 관련 유전자의 실시간 PCR 분석을 위하여 III기 및 IV기에서 단리하였다. 상기 실시예 1에서 관찰된 결과와 유사하게, IV기에의 CYP26A 억제제의 첨가는 NGN3 및 NeuroD와 같은 췌장 내분비 전구체 마커의 발현을 향상시켰다. (도 2 참조). III기 및 IV기 둘 모두에의 상기 억제제의 첨가는 NGN3 및 NeuroD의 발현을 추가로 향상시켰다. 놀랍게도, (레틴산의 존재 하에서의) III기에의 CYP26A 억제제의 첨가는 CDX2의 발현을 향상시키면서 PDX-1 및 NKX6.1을 유의하게 하향조절하였다. 이들 결과는 CYP26A 억제제의 첨가에 최적인 시기가 IV기임을 시사한다.
실시예 3
FBS가 결여되고 CYP26A의 억제제를 함유하는 세포 배양 배지에서 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 췌장 내분비 세포로 분화시키는 대안적인 방법
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포(p40-p52)를 단일 세포로서 100000개의 세포/㎠의 밀도로 매트리겔(등록상표)-코팅된 디쉬 (1:30의 희석) (비디 바이오사이언시즈; 카탈로그 번호: 356231)에 16 ng/ml의 FGF2 (카탈로그 번호: 100-18B, 미국 뉴저지주 소재의 페프로테크) 및 10 μM의 Y27632 (Rock 억제제, 카탈로그 번호: Y0503, 미국 미주리주 소재의 시그마)가 보충된 MEF-CM(생쥐 배아 섬유아세포 조절 배지) 중에 접종하였다. 접종한지 72시간 후에, 배양물들을 하기와 같이 완성 내배엽(DE)으로 분화시켰다:
a. I기 (완성 내배엽): 매트리겔-코팅된 디쉬에서 단일 세포로 배양한 인간 배아 줄기 세포를 2% 무지방산 BSA (카탈로그 번호: 68700, 미국 아이오와주 소재의 프롤리언트), 0.0025 g/ml의 중탄산나트륨 (카탈로그 번호: S3187, 미국 미주리주 소재의 시그마), 1X 글루타맥스™ (카탈로그 번호: 35050-079, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) 및 100 ng/ml의 GDF-8 (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈) + 2.5 μM의 GSK3B 억제제 14-프로프-2-엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온이 보충된 MCDB-131 (카탈로그 번호: 10372-019, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) 배지로 1일 동안 처리하고, 이어서 2% BSA, 중탄산나트륨, 글루타맥스, 및 100 ng/ml의 GDF-8이 보충된 MCDB-131 배지로 처리하고, 그 후
b. II기 (원시 장관): 세포를 MCDB-131 + 2% 무지방산 BSA 및 50 ng/ml FGF7로 2일 동안 처리하고, 그 후
c. III기 (후방 전장): 세포를 ITS-X (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)의 1:200 희석물, 1X 글루타맥스™ (카탈로그 번호: 35050-079, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐), 0.0025 g/ml의 중탄산나트륨 (카탈로그 번호: S3187, 미국 미주리주 소재의 시그마), 0.1% BSA (지질 풍부) (인비트로겐, 카탈로그 번호: 11021-045), 50 ng/ml의 FGF7, 0.25 μM의 SANT-1, 2 μM의 레틴산(RA) (미국 미주리주 소재의 시그마), 2.5 μM의 4-[4-(4-플루오로페닐)-1-(3-페닐프로필)-5-피리딘-4-일-1H-이미다졸-2-일]부트-3-인-1-올 , 100 nM의 LDN-193189 (BMP 수용체 억제제, 카탈로그 번호: 04-0019, 미국 캘리포니아주 소재의 스템겐트(Stemgent)), 및 20 ng/ml의 액티빈 A가 보충된 MCDB131/고 글루코스 (25 mM의 글루코스)로 4일 동안 처리하고, 그 후
d. IV기 (췌장 전구체): 세포를 ITS-X (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)의 1:200 희석물 및 0.1% BSA (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐), 1X 글루타맥스™ (카탈로그 번호: 35050-079, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐), 0.0025 g/ml의 중탄산나트륨 (카탈로그 번호: S3187, 미국 미주리주 소재의 시그마), 100 nM의 LDN-193189 (BMP 수용체 억제제, 카탈로그 번호: 04-0019, 미국 캘리포니아주 소재의 스템겐트), 50 nM의 PDBu (PKC 활성화제) (카탈로그 번호: P1269, 미국 미주리주 소재의 시그마), 0.25 μM의 SANT-1 (#S4572, 미국 미주리주 소재의 시그마), 및 100 nM의 CYP26A 억제제 N-{4-[2-에틸-1-(1H-1, 2, 4-트라이아졸-1-일)부틸]페닐}-1, 3-벤조티아졸-2-아민이 보충된 MCDB131/고 글루코스 (25 mM의 글루코스)로 3일 동안 처리하고, 그 후
e. V기 (췌장 내분비 전구체): 세포를 ITS-X (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)의 1:200 희석물 및 0.1% BSA (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐), 1X 글루타맥스™ (카탈로그 번호: 35050-079, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐), 0.0025 g/ml의 중탄산나트륨 (카탈로그 번호: S3187, 미국 미주리주 소재의 시그마), 100 nM의 LDN-193189 (BMP 수용체 억제제, 카탈로그 번호: 04-0019, 미국 캘리포니아주 소재의 스템겐트), 0.25 μM의 SANT-1 (#S4572, 미국 미주리주 소재의 시그마), 2 μM의 ALK5 억제제 (SD-208, 문헌[Molecular Pharmacology 2007 72:152-161]에 개시됨) 및 100 nM의 CYP26A 억제제 N-{4-[2-에틸-1-(1H-1, 2, 4-트라이아졸-1-일)부틸]페닐}-1, 3-벤조티아졸-2-아민이 보충된 MCDB131/고 글루코스 (25 mM의 글루코스)로 3일 동안 처리하고, 그 후
f. VI기 (미성숙 췌장 호르몬 발현 세포): 세포를 ITS-X (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)의 1:200 희석물 및 0.1% BSA (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐), 1X 글루타맥스™ (카탈로그 번호: 35050-079, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐), 0.0025 g/ml의 중탄산나트륨 (카탈로그 번호: S3187, 미국 미주리주 소재의 시그마), 100 nM의 LDN-193189 (BMP 수용체 억제제, 카탈로그 번호: 04-0019, 미국 캘리포니아주 소재의 스템겐트), 및 2 μM의 ALK5 억제제 (SD-208, 문헌[Molecular Pharmacology 2007 72:152-161]에 개시됨)가 보충된 MCDB131/고 글루코스 (25 mM의 글루코스)로 3일 동안 처리하고, 그 후
g. VII기 (췌장 호르몬 발현 세포): 세포를 ITS-X (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐)의 1:200 희석물 및 0.1% BSA (미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐), 1X 글루타맥스™ (카탈로그 번호: 35050-079, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐), 0.0025 g/ml의 중탄산나트륨 (카탈로그 번호: S3187, 미국 미주리주 소재의 시그마), 100 nM의 LDN-193189 (BMP 수용체 억제제, 카탈로그 번호: 04-0019, 미국 캘리포니아주 소재의 스템겐트), 2 μM의 ALK5 억제제 (SD-208, 문헌[Molecular Pharmacology 2007 72:152-161]에 개시됨) 및 100 nM의 비타민 A (카탈로그 번호: R7632, 미국 미주리주 소재의 시그마)가 보충된 MCDB131/고 글루코스 (25 mM의 글루코스)로 3일 동안 처리하였다.
배양물들 중 일부에서, VII기를 18일까지 확장시켰다. 샘플들을 V기, VI기에, 그리고 실시간 PCR 분석, 면역 형광(immune fluorescence; IF) 염색 및 FACS 분석을 위하여 수집하였다. FACS 및 면역형광(IF) 염색 둘 모두에 있어서, NKX6.1 항체를 유니버시티 오브 아이오와 하이브리도마 은행(University of Iowa hybridoma bank; 카탈로그 번호: F55A12)으로부터 획득하고, CDX2 항체를 압캄(Abcam; 카탈로그 번호: ab76541, 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)으로부터 획득하고, PDX-1 항체를 압캄(카탈로그 번호: ab47267)으로부터 구매하였다. 도 3에서는 다양한 시기의 분화에서의 배양물들의 형태가 강조되어 있다. II기 이후, 배양물들은 III기 내지 VI기 전체에 걸쳐 균질한 형태를 나타냈다. 도 4에는 다양한 시기의 분화에 있어서 FACS에 의해 측정한 NKX6.1의 발현이 도시되어 있다. 이 도면에서는 실시예 3에서 개시한 프로토콜이 후기의 분화 내내 NKX6.1의 높은 발현을 유지할 수 있음이 강조되어 있다. 도 5는 상기 프로토콜의 V기 및 VII기에 있어서의 PDX1, NKX6.1, 및 CDX2 발현에 대한 IF 염색을 나타낸다. NKX6.1 양성 세포 중 90% 초과가 또한 PDX1 양성인 반면, 상기 세포 중 10% 미만은 CDX2에 대하여 양성으로 염색되었다.
본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 태양은 실시예 및 바람직한 실시 형태를 참조로 하여 상기 예시되었지만, 본 발명의 범주는 전술한 설명에 의해서가 아니라 특허법의 원칙 하에 적절하게 해석되는 하기 특허청구범위에 의해 규정되는 것으로 인식될 것이다.

Claims (25)

  1. a. 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 세포의 집단으로 분화시키는 단계;
    b. 완성 내배엽 세포의 집단을 원시 장관(primitive gut tube) 세포의 집단으로 분화시키는 단계;
    c. 원시 장관 세포의 집단을 후방 전장(posterior foregut) 세포의 집단으로 분화시키는 단계; 및
    d. 후방 전장 세포의 집단을 CYP26A 억제제가 보충된 배지로 처리하여 후방 전장 세포의 집단을 췌장 내분비 전구 세포의 집단으로 분화시키는 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포로부터 췌장 내분비 전구 세포의 집단을 유도하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 a, b 및 c에서의 분화가 CYP26A 억제제가 결여된 배지에서의 처리를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, CYP26A 억제제가 1 nM 내지 1000 nM의 농도로 사용되는 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, CYP26A 억제제가 10 nM 내지 100 nM의 농도로 사용되는 것인 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, CYP26A 억제제가 N-{4-[2-에틸-1-(1H-1,2,4-트라이아졸-1-일)부틸]페닐}-1,3-벤조티아졸-2-아민인 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 처리가 내분비 전구 마커 NGN3, Pax 및 NEUROD의 발현을 증가하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 처리가 CDX2와 알부민의 발현을 감소하는 것인 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, CYP26A 억제제가 보충된 배지가 BMP를 억제할 수 있는 인자, TGFβ 수용체 시그널링 억제제, 및 PKC 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 추가 보충되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, BMP를 억제할 수 있는 인자가 노긴(noggin)을 포함하는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, TGFβ 수용체 시그널링 억제제가 ALK5의 억제제를 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, ALK5의 억제제가 ALK5 억제제 II인 것인 방법.
  12. 제8항에 있어서, PKC 활성화제가 (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에모일아미노) 벤조락탐, 인도락탐 V(ILV), 포볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA), 및 포볼-12,13-다이부티레이트(PDBu)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 세포의 집단으로 분화시키는 단계가 만능 줄기 세포를 액티빈 A가 보충된 배지에서 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 세포의 집단으로 분화시키는 단계가 만능 줄기 세포를 GDF-8 및 GSK3B 억제제가 보충된 배지에서 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, GSK3B 억제제가 14-프로프-2-엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온인 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 만능 줄기 세포가 인간 만능 줄기 세포인 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 완성 내배엽 세포의 집단을 원시 장관 세포의 집단으로 분화시키는 단계가 완성 내배엽 세포를 FGF7이 보충된 배지에서 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 원시 장관 세포의 집단을 후방 전장 세포의 집단으로 분화하는 단계가 원시 장관 세포의 집단을 레틴산과 P38 억제제가 보충된 배지에서 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  19. 후방 전장 세포의 집단을 CYP26A 억제제가 보충된 배지로 처리하여 후방 전장 세포의 집단을 췌장 내분비 전구 세포의 집단으로 분화시키는 단계를 포함하는, 췌장 내분비 전구 세포의 집단을 유도하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, CYP26A 억제제가 보충된 배지가 BMP를 억제할 수 있는 인자, TGFβ 수용체 시그널링 억제제, 및 PKC 활성화제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자로 추가 보충되는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, BMP를 억제할 수 있는 인자가 노긴(noggin)을 포함하는 것인 방법.
  22. 제20항에 있어서, TGFβ 수용체 시그널링 억제제가 ALK5의 억제제를 포함하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, ALK5의 억제제가 ALK5 억제제 II인 것인 방법.
  24. 제20항에 있어서, PKC 활성화제가 (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에모일아미노) 벤조락탐, 인도락탐 V(ILV), 포볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA), 및 포볼-12,13-다이부티레이트(PDBu)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  25. 제19항 또는 제20항에 있어서, CYP26A 억제제가 N-{4-[2-에틸-1-(1H-1,2,4-트라이아졸-1-일)부틸]페닐}-1,3-벤조티아졸-2-아민인 것인 방법.
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