KR101836850B1 - 인간 배아 줄기 세포의 분화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인슐린 생성 세포로의 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 집단 내의 세포 중 85% 초과가 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 생성하는 방법을 제공한다.

Description

인간 배아 줄기 세포의 분화{DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 모든 목적을 위하여 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는, 2010년 8월 31일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/378,472호의 이익을 주장한다.
본 발명은 인슐린 생성 세포로의 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 집단 내의 세포 중 85% 초과가 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 생성하는 방법을 제공한다.
제I형 진성 당뇨병 및 이식가능한 랑게르한스섬의 부족에 대한 세포-대체 치료법에서의 진전에서는 생착(engraftment)에 적절한 인슐린 생성 세포, 또는 β 세포의 공급원을 개발하는 데 관심이 집중되었다. 한 가지 접근법은 예를 들어 배아 줄기 세포와 같은 만능 줄기 세포로부터의 기능성 β 세포의 생성이다.
척추동물 배아 발생에서, 만능성 세포는 낭배형성 (gastrulation)으로 알려진 과정에서 삼배엽층(외배엽, 중배엽, 및 내배엽)을 포함하는 세포군을 생성한다. 예를 들어, 갑상선, 흉선, 췌장, 소화관, 및 간과 같은 조직은 중간 단계를 통해 내배엽으로부터 발생할 것이다. 이 과정에서 중간 단계는 완성 내배엽 (definitive endoderm)의 형성이다. 완성 내배엽 세포는 HNF3 베타, GATA4, MIXL1, CXCR4 및 SOX17과 같은 많은 마커를 발현한다.
췌장의 형성은 완성 내배엽의 췌장 내배엽으로의 분화로부터 생긴다. 췌장 내배엽의 세포는 췌장-십이지장 호메오박스(homeobox) 유전자, Pdx1을 발현한다. Pdx1의 부재 하에서는, 췌장은 복측 원기(ventral bud) 및 배측 원기(dorsal bud)의 형성 이상으로는 발달하지 못한다. 따라서, Pdx1 발현이 췌장 기관형성에서 중요한 단계를 특징짓는다. 성숙한 췌장은 다른 세포형 중에서도 외분비 조직 및 내분비 조직을 포함한다. 외분비 및 내분비 조직은 췌장 내배엽의 분화로부터 생긴다.
췌도 세포의 특징을 지닌 세포가 생쥐의 배아 세포로부터 유도된 것으로 보고되었다. 예를 들어, 루멜스키(Lumelsky) 등 (문헌[Science 292:1389, 2001])은 생쥐 배아 줄기 세포가 췌도와 유사한 인슐린 분비 구조로 분화한 것을 보고하고 있다. 소리아(Soria) 등 (문헌[Diabetes 49:157, 2000])은 생쥐 배아 줄기 세포로부터 유도된 인슐린 분비 세포가 스트렙토조토신 유도된 당뇨 생쥐에서 혈당을 정상화시킴을 보고하고 있다.
하나의 예에서, 호리(Hori) 등 (문헌[PNAS 99: 16105, 2002])은 생쥐 배아 줄기 세포를 포스포이노시티드 3-키나아제의 억제제(LY294002)로 처리하여 β 세포와 닮은 세포를 생성하였음을 개시하였다.
다른 예에서, 블리츠주크(Blyszczuk) 등 (문헌[PNAS 100:998, 2003])은 구성적으로 Pax4를 발현하는 생쥐 배아 줄기 세포로부터 인슐린 생성 세포를 생성하는 것을 보고하고 있다.
미칼레프( Micallef ) 등은 PDX1 양성 췌장 내배엽이 형성되게 하는 배아 줄기 세포의 책무(commitment)를 레틴산이 조절할 수 있음을 보고하고 있다. 레틴산은 배아에서 낭배형성의 마지막에 해당하는 기간 동안 배아 줄기 세포 분화의 4일째에 배양물에 첨가될 때 Pdx1 발현을 유도하는 데 가장 효과적이다 (문헌[Diabetes 54:301, 2005]).
미야자키( Miyazaki ) 등은 Pdx1을 과다 발현하는 생쥐 배아 줄기 세포주를 보고하고 있다. 그들의 결과는 외인성 Pdx1 발현이 생성된 분화된 세포에서 인슐린, 소마토스타틴, 글루코키나아제, 뉴로제닌3, p48, Pax6, 및 Hnf6 유전자의 발현을 명확히 향상시켰음을 보여준다(문헌[Diabetes 53: 1030, 2004]).
스쿠디(Skoudy) 등은 액티빈 A (TGF-β 수퍼패밀리의 구성원)가 생쥐 배아 줄기 세포에서 외분비 췌장 유전자(p48 및 아밀라아제) 및 내분비 유전자(Pdx1, 인슐린 및 글루카곤)의 발현을 상향조절함을 보고하고 있다. 최대 효과는 1 nM 액티빈 A를 사용하여 관찰되었다. 그들은 또한 인슐린 및 Pdx1 mRNA의 발현 수준이 레틴산에 의해 영향을 받지 않지만; 3 nM FGF7 처리가 Pdx1의 전사체의 수준을 증가시킴을 관찰하였다(문헌[Biochem. J. 379: 749, 2004]).
쉬라키(Shiraki) 등은 배아 줄기 세포의 Pdx1 양성 세포로의 분화를 특이적으로 향상시키는 성장 인자들의 효과를 연구하였다. 이들은 TGF-β2가 재현가능하게 더 높은 비율의 Pdx1 양성 세포를 생성함을 관찰하였다 (문헌[Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16.]).
고든( Gordon ) 등은 Wnt 시그널링 억제제와 함께 액티빈의 존재 하에 그리고 혈청의 부재 하에, 생쥐 배아 줄기 세포로부터 브라키어리(brachyury) [양성]/HNF3 베타 [양성] 내배엽 세포의 유도를 보여주었다 (미국 특허 공개 제2006/0003446A1호).
고든 등 (문헌[PNAS, Vol 103, page 16806, 2006])은 "Wnt 및 TGF-베타/ 노달(nodal)/ 액티빈 시그널링은 전방 원시선(anterior primitive streak)의 생성에 동시에 필요하였다"라고 진술한다.
그러나, 배아 줄기 세포 발생의 생쥐 모델은 예를 들어, 인간과 같은 고등 포유류에서의 발생 프로그램을 정확하게 모방하지 않을 수 있다.
톰슨(Thomson) 등은 인간 배반포로부터 배아 줄기 세포를 단리하였다(문헌[Science 282:114, 1998]). 동시에, 기어하트(Gearhart)와 동료들은 태아 생식선 조직으로부터 인간 배아 생식 세포(human embryonic germ; hEG) 세포주를 유도하였다 (문헌[Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998]). 백혈병 억제 인자(LIF)와 함께 배양함으로써 간단하게 분화를 방지할 수 있는 생쥐 배아 줄기 세포와는 달리, 인간 배아 줄기 세포는 매우 특별한 조건 하에서 유지되어야 한다 (미국 특허 제6,200,806호; 국제특허 공개 WO 99/20741호; WO 01/51616호).
드'아무르(D'Amour) 등은 고농도의 액티빈과 저 혈청의 존재 하에서 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽의 농축 배양물의 생성을 개시한다 (문헌[Nature Biotechnology 2005]). 생쥐의 신장 피막하에 이들 세포를 이식하면 일부 내배엽 기관의 특징을 가진 보다 성숙한 세포로의 분화가 야기되었다. 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽 세포는 FGF-10의 첨가 후에 Pdx1 양성 세포로 추가로 분화될 수 있다 (미국 특허 공개 제2005/0266554A1호).
드'아무르(D'Amour) 등 (문헌[Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401 (2006)])은 "우리는 인간 배아 줄기(hES) 세포를 췌장 호르몬 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩티드 및 그렐린을 합성할 수 있는 내분비 세포로 전환시키는 분화 방법을 개발하였다. 이 과정은 도중에 완성 내배엽, 창자관 내배엽, 췌장 내배엽, 및 내분비 전구체를 닮은 단계들을 통해 세포를 내분비 호르몬 발현 세포가 되도록 함으로써 생체내(in vivo) 췌장 기관형성을 모방한다"고 밝혔다.
다른 예에서, 피스크(Fisk) 등은 인간 배아 줄기 세포로부터 췌도 세포를 생성하는 시스템을 보고한다 (미국 특허 공개 제2006/0040387A1호). 이 경우에, 분화 경로를 세 단계로 나누었다. 인간 배아 줄기 세포를 먼저 부티르산나트륨 및 액티빈 A의 조합을 사용하여 내배엽으로 분화시켰다. 그 다음, 세포를 EGF 또는 베타셀룰린과 조합된 TGF-β 길항제, 예컨대 노긴(Noggin)과 함께 배양하여, PDX1 양성 세포를 생성하였다. 마지막 분화는 니코틴아미드에 의해 유도되었다.
따라서 β 세포와 더욱 밀접하게 닮은 기능성 인슐린 발현 세포를 생성하기 위한 시험관 내 방법을 개발하는 것이 여전히 상당히 필요하다. 본 발명은 집단 내의 세포 중 85% 초과가 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 생성함으로써 인간 배아 줄기 세포를 인슐린 발현 세포를 향해 분화시키는 효율을 향상시키는 대안적인 접근법을 취한다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 집단 내의 세포 중 85% 초과가 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 제공한다.
실시 형태에서, 만능 줄기 세포의 집단은 인슐린 및 IGF-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 인자와 BSA가 보충된 배지에서 만능 줄기 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시킨다. 일 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 향한 만능 줄기 세포의 집단의 분화는 액티빈 A 및 Wnt 리간드로 만능 줄기 세포를 처리함으로써 성취된다.
일 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 향한 만능 줄기 세포의 집단의 분화는 만능 줄기 세포를 GDF-8로 처리함으로써 성취되며, 적어도 하나의 다른 인자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 아닐린-피리디노트라이아진, 사이클릭 아닐린-피리디노트라이아진, N-{[1-(페닐메틸)아제판-4-일]메틸}-2-피리딘-3-일아세트아미드, 4-{[4-(4-{[2-(피리딘-2-일아미노)에틸]아미노}-1,3,5-트라이아진-2-일)피리딘-2-일]옥시}부탄-1-올, 3-({3-[4-({2-[메틸(피리딘-2-일)아미노]에틸}아미노)-1,3,5-트라이아진-2-일]피리딘-2-일}아미노)프로판-1-올, N~4~-[2-(3-플루오로페닐)에틸]-N~2~-[3-(4-메틸피페라진-1-일)프로필]피리도[2,3-d]피리미딘-2,4-다이아민, 1-메틸-N-[(4-피리딘-3-일-2-{[3-(트라이플루오로메틸)페닐]아미노}-1,3-티아졸-5-일)메틸]피페리딘-4-카르복스아미드, 1,1-다이메틸에틸 {2-[4-({5-[3-(3-하이드록시프로필)페닐]-4H-1,2,4-트라이아졸-3-일}아미노)페닐]에틸}카르바메이트, 1,1-다이메틸에틸 {[3-({5-[5-(3-하이드록시프로필)-2-(메틸옥시)페닐]-1,3-옥사졸-2-일}아미노)페닐]메틸}카르바메이트, 1-({5-[6-({4-[(4-메틸피페라진-1-일)설포닐]페닐}아미노)피라진-2-일]티오펜-2-일}메틸)피페리딘-4-올, 1-({4-[6-({4-[(4-메틸피페라진-1-일)설포닐]페닐}아미노)피라진-2-일]티오펜-2-일}메틸)피페리딘-4-카르복스아미드 및 2-{[4-(1-메틸에틸)페닐]아미노}-N-(2-티오펜-2-일에틸)-7,8-다이하이드로피리도[4,3-d]피리미딘-6(5H)-카르복스아미드.
<도 1>
도 1은 실시예 1에 개시된 방법에 따라 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 지시된 유전자들의 발현의 실시간 PCR 분석을 나타낸다.
<도 2>
도 2는 실시예 1에 개시된 방법에 따라 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 지시된 단백질들의 발현의 FACS 분석을 나타낸다.
<도 3>
도 3은 실시예 2에 개시된 방법에 따라 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 지시된 유전자들의 발현의 실시간 PCR 분석을 나타낸다.
<도 4>
도 4는 실시예 2에 개시된 방법에 따라 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 면역형광을 통한 SOX17의 발현을 나타낸다.
<도 5>
도 5는 실시예 2에 개시된 방법에 따라 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 지시된 단백질들의 발현의 FACS 분석을 나타낸다.
<도 6>
도 6은 실시예 3에 개시된 방법에 따라 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 지시된 유전자들의 발현의 실시간 PCR 분석을 나타낸다.
<도 7>
도 7은 실시예 3에 개시된 방법에 따라 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 면역형광을 통한 SOX17의 발현을 나타낸다.
<도 8>
도 8은 실시예 3에 개시된 방법에 따라 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 면역형광을 통한 SOX17의 발현을 나타낸다.
<도 9>
도 9는 실시예 5에 개시된 방법에 따라 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포에서의 지시된 유전자들의 발현의 실시간 PCR 분석을 나타낸다.
개시내용을 분명하게 하고 제한되지 않기 위해, 본 발명의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 본 발명의 소정의 특징, 실시 형태 또는 응용을 기재 또는 예시하는 하기 세부 항목으로 나뉘어진다.
정의
줄기 세포는 단일 세포 레벨에서 자가 재생하고 분화하여 자가 재생 선구 세포, 비재생 선구 세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포(progeny cell)를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서(in vitro) 분화하는 그의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직이 생기게 하며 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니라 하더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.
줄기 세포는 그들의 발생 능력에 의해 분류된다: (1) 모든 배아 및 배자외 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (2) 모든 배아 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 만능성; (3) 세포 계통의 하위집단이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 하위집단이 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성(예를 들어, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC(자가-재생), 혈구 세포 제한된 소기능성(oligopotent) 전구세포 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소(예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (4) 다능 줄기 세포보다 더 제한된 하위집단의 세포 계통이 될 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계통 (예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단일기능성.
분화는 특화되지 않은("미결된") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화-유도된 세포는 세포의 계통 내에서 보다 특화된 ("결정된(committed)") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 통상적인 환경 하에서 특정 세포형 또는 세포형의 서브세트로 계속 분화할 것이며, 통상적인 환경 하에서 다른 세포형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. 탈분화(De-differentiation)는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특화된(또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포의 계통은 세포의 유전, 즉 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포가 생성되게 할 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통 특이적 마커는 관심있는 계통의 세포의 표현형과 특이적으로 관련되며 미결정 세포가 관심있는 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 "완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포", 또는 "1기 세포" 또는 "1기"는 하기 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질(Mix-like homeobox protein), FGF4 CD48, 에오메소더민(eomesodermin, EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 또는 OTX2. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포, 원시선 세포, 중내배엽 세포 및 완성 내배엽 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기의 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: PDX1, NKX6.1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HNF4 알파, SOX9, HB9 또는 PROX1. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포, 원시 장관(primitive gut tube) 세포, 및 후방 전장(posterior foregut) 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽"은 낭배의 외피(epiblast)로 인한 세포의 특징을 갖고 위장관로 및 그의 유도체를 형성하는 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커들을 발현한다: HNF3 베타, GATA4, SOX17, 세르베루스(Cerberus), OTX2, 구스코이드, C-Kit, CD99 및 MIXL1.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "마커"는 관심있는 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차등 발현은 양성 마커의 수준 증가 및 음성 마커의 수준 감소를 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 레벨은 다른 세포에 비하여 대상 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 대상 세포가 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 확인되어 구별될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "췌장 내분비 세포", 또는 "췌장 호르몬 발현 세포", 또는 "췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기의 호르몬 중 하나 이상을 발현할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.
만능 줄기 세포의 단리, 확장 및 배양
만능 줄기 세포의 특성화
만능 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원(stage-specific embryonic antigen, SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다 (문헌[Thomson et al., Science 282:1145, 1998]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra1-60, 및 Tra1-81 발현(존재하는 경우)의 소실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼리성 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사 (미국 캘리포니아주 벌링게임 소재의 벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories))가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드를 이용하여 발색시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화된 만능 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출할 때, OCT4 및 TERT를 발현한다.
번식된 만능 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽층의 세포, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 조직으로 분화하는 잠재력이다. 만능 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 세포를 중증 복합형 면역결핍증(severe combined immunodeficient, SCID) 생쥐내로 주사하고, 형성되는 기형종을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하고, 이어서 삼배엽층으로부터의 세포 유형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 다능성은 배양체 (embryoid body)를 형성하고, 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배양체를 평가함으로써 결정될 수 있다.
번식된 만능 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다.
만능 줄기 세포의 공급원
사용될 수 있는 만능 줄기 세포의 유형은 임신 후 형성된 조직으로부터 유도되는 구축된 만능 세포주를 포함하고, 이러한 조직에는 전-배아 조직 (예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 전형적으로 본질적으로는 대략 10 내지 12주의 임신 전이 아닌 임신 동안의 임의의 때에 취해진 태아 조직이 포함된다. 비제한적인 예로는 수립된 인간 배아 줄기 세포주 또는 인간 배아 생식 세포주, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H1, H7, 및 H9 (WiCell)가 있다. 이러한 세포의 초기 수립 또는 안정화 시에 본 명세서의 조성물의 사용도 고려되며, 이 경우에는 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취한 일차 다능성 세포일 것이다. 영양 세포의 부재 하에서 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 돌연변이 인간 배아 줄기 세포주, 예를 들어, BG01v (미국 조지아주 애선스 소재의 브레사겐(BresaGen))가 또한 적합하다.
일 실시 형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 톰슨(Thomson) 등에 의해 기재된 바와 같이 제조된다 (미국 특허 제5,843,780호; 문헌[Science 282:1145, 1998]; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998]; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995]).
만능 줄기 세포의 배양
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 다양한 방식으로 만능 줄기 세포를 지지하는 피더 세포층 상에서 배양된다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 본질적으로 영양 세포가 없지만, 그럼에도 불구하고 실질적인 분화를 거치지 않고 만능 줄기 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템에서 배양된다. 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지를 이용하여 지지된다. 대안적으로, 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 화학적 규명 배지를 이용하여 지지된다.
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 문헌[Reubinoff et al, Nature Biotechnology 18: 399 - 404 (2000)]에 개시된 방법에 따라 생쥐 배아 섬유아세포 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Thompson et al, Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145 - 1147])에 개시된 방법에 따라 생쥐 배아 섬유아세포 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Richards et al, Stem Cells 21: 546-556, 2003]에 개시된 영양 세포층들 중 임의의 하나 상에서 배양될 수 있다.
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 문헌[Wang et al, Stem Cells 23: 1221-1227, 2005]에 개시된 방법에 따라 인간 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다. 대안적인 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 문헌[Stojkovic et al, Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005]에 개시된 인간 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Miyamoto et al, Stem Cells 22: 433-440, 2004]에 개시된 인간 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Amit et al, Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003]에 개시된 인간 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Inzunza et al, Stem Cells 23: 544-549, 2005]에 개시된 인간 영양 세포층 상에서 배양될 수 있다.
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 미국 특허 공개 제20020072117호에 개시된 방법에 따라 유도된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 제6642048호에 개시된 방법에 따라 유도된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 국제특허 공개 WO2005014799호에 개시된 방법에 따라 유래된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Xu et al, Stem Cells 22: 972-980, 2004]에 개시된 방법에 따라 유도된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 공개 제20070010011호에 개시된 방법에 따라 유도된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 공개 제20050233446호에 개시된 방법에 따라 유도된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 제6800480호에 개시된 방법에 따라 유도된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 국제특허 공개 WO2005065354호에 개시된 방법에 따라 유래된 배양 배지에서 배양할 수 있다.
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 문헌[Cheon et al, BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005]에 개시된 방법에 따라 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Levenstein et al, Stem Cells 24: 568-574, 2006]에 개시된 방법에 따라 배양할 수 있다). 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 공개 제20050148070호에 개시된 방법에 따라 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 공개 제20050244962호에 개시된 방법에 따라 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 국제특허 공개 WO2005086845호에 개시된 방법에 따라 배양할 수 있다.
만능 줄기 세포는 적합한 배양 기재 상에 도말될 수 있다. 일 실시 형태에서, 적합한 배양 기재는 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어, 기저막으로부터 유래된 것들, 또는 부착 분자 수용체-리간드 커플링의 일부를 형성할 수 있는 것들이다. 하나의 실시 형태에서, 적합한 배양 기질은 매트리겔(MATRIGEL)(등록상표) (벡튼 디켄슨(Becton Dickenson))이다. 매트리겔(등록상표)은 실온에서 겔화하여 재구성된 기저막을 형성하는 엔젤브레스-홈-스왐(Engelbreth-Holm Swarm) 종양 세포 유래의 용해성 제제이다.
다른 세포외 매트릭스 성분 및 성분 혼합물이 대안으로서 적합하다. 증식되는 세포 유형에 따라, 이것은 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 헤파란 설페이트 등을 단독으로 또는 다양한 조합으로 포함할 수 있다.
만능 줄기 세포는 적합한 분포로 그리고 세포 생존, 번식, 및 바람직한 특징의 보유를 촉진하는 배지의 존재 하에서 기재상에 도말될 수 있다. 모든 이들 특성은 시딩 분포에 세심한 주의를 기울여 이익을 얻으며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
적합한 배양 배지는 하기의 성분, 예컨대 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM), 깁코(Gibco) 번호 11965-092; 넉아웃 둘베코 변형 이글 배지 (KO DMEM), 깁코 번호 10829-018; 햄 (Ham's) F12/50% DMEM 기본 배지; 200 mM L-글루타민, 깁코 번호 15039-027; 비필수 아미노산 용액, 깁코 11140-050; β-머캅토에탄올, 시그마 (Sigma) 번호 M7522; 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor; bFGF), 깁코 번호 13256-029로부터 제조할 수 있다.
만능 줄기 세포로부터의 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
본 발명은 만능 줄기 세포의 집단으로부터 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 형성하는 방법을 제공한다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 계통의 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화시키는 방법을 제공한다. 일 실시 형태에서, 이는 단계적 분화 프로토콜을 이용하여 성취되며, 여기서 만능 줄기 세포의 집단은 먼저 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화된다. 다음, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 그 후 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화된다. 다음, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 그 후 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화된다.
본 발명은 세포 중 85% 초과가 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 제공한다. 상기 세포의 집단은 추가로 처리되어 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 형성할 수 있다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 추가로 처리되어 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 형성할 수 있다.
분화 효율은 원하는 세포 유형의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄반응(RT-PCR), 노던 블롯, 원위치(in situ) 혼성화(예컨대, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역검정법, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석(FACS) (예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
만능 줄기 세포의 특징은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 만능 줄기 세포의 추가의 특징은 계속 확인되고 있다. 만능 줄기 세포 마커는 예를 들어, ABCG2, cripto, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81 중 하나 이상의 발현을 포함한다.
다능성 줄기 세포를 본 발명의 방법으로 처리한 후, 분화된 세포는 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포에 의해 발현된 CXCR4와 같은 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시켜 정제할 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적절한 만능 줄기 세포는 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H9 (NIH 코드: WA09), 인간 배아 줄기 세포주 H1 (NIH 코드: WA01), 인간 배아 줄기 세포주 H7(NIH 코드: WA07) 및 인간 배아 줄기 세포주 SA002(스웨덴 소재의 셀라르티스(Cellartis))를 포함한다. 또한, 만능 세포의 특징적인 하기의 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적절하다: ABCG2, 크립토(cripto), CD9, FOXD3, 커넥신(CONNEXIN)43, 커넥신45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, 및 Tra 1-81.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질, FGF4, CD48, 에오메소더민 (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 대안적 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 다른 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 PDX1, NKX6.1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HNF4 알파, SOX9, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, NGN3, 및 PTF1 알파로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내분비 세포는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 대안적으로, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 세포는 β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포이다. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 PDX1 및 하기 전사 인자 중 적어도 하나를 발현한다: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 베타, MAFA, PAX4 및 PAX6. 본 발명의 일 태양에서, β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포이다.
만능 줄기 세포로부터의 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
본 발명의 일 태양에서, 만능 줄기 세포의 집단은 혈청이 결여되고 인슐린 및 IGF-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 인자와 BSA가 보충된 배지에서 만능 줄기 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화될 수 있다. 일 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 향한 만능 줄기 세포의 집단의 분화는 액티빈 A 및 Wnt 리간드로 만능 줄기 세포를 처리함으로써 성취된다.
다른 실시 형태에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 향한 만능 줄기 세포의 집단의 분화는 만능 줄기 세포를 GDF-8로 처리함으로써 성취되며, 적어도 하나의 다른 인자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 아닐린-피리디노트라이아진, 사이클릭 아닐린-피리디노트라이아진, N-{[1-(페닐메틸)아제판-4-일]메틸}-2-피리딘-3-일아세트아미드, 4-{[4-(4-{[2-(피리딘-2-일아미노)에틸]아미노}-1,3,5-트라이아진-2-일)피리딘-2-일]옥시}부탄-1-올, 3-({3-[4-({2-[메틸(피리딘-2-일)아미노]에틸}아미노)-1,3,5-트라이아진-2-일]피리딘-2-일}아미노)프로판-1-올, N~4~-[2-(3-플루오로페닐)에틸]-N~2~-[3-(4-메틸피페라진-1-일)프로필]피리도[2,3-d]피리미딘-2,4-다이아민, 1-메틸-N-[(4-피리딘-3-일-2-{[3-(트라이플루오로메틸)페닐]아미노}-1,3-티아졸-5-일)메틸]피페리딘-4-카르복스아미드, 1,1-다이메틸에틸 {2-[4-({5-[3-(3-하이드록시프로필)페닐]-4H-1,2,4-트라이아졸-3-일}아미노)페닐]에틸}카르바메이트, 1,1-다이메틸에틸 {[3-({5-[5-(3-하이드록시프로필)-2-(메틸옥시)페닐]-1,3-옥사졸-2-일}아미노)페닐]메틸}카르바메이트, 1-({5-[6-({4-[(4-메틸피페라진-1-일)설포닐]페닐}아미노)피라진-2-일]티오펜-2-일}메틸)피페리딘-4-올, 1-({4-[6-({4-[(4-메틸피페라진-1-일)설포닐]페닐}아미노)피라진-2-일]티오펜-2-일}메틸)피페리딘-4-카르복스아미드 및 2-{[4-(1-메틸에틸)페닐]아미노}-N-(2-티오펜-2-일에틸)-7,8-다이하이드로피리도[4,3-d]피리미딘-6(5H)-카르복스아미드. 사용에 적합한 인자의 예는 미국 특허 출원 제12/494,789호에서 찾아볼 수 있다. 일 실시 형태에서, 상기 적어도 하나의 다른 인자는 14-프로프-2-엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온이다.
만능 줄기 세포의 집단은 혈청이 결여되고 인슐린 및 IGF-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 인자와 BSA가 보충된 배지에서 약 1일 내지 약 7일 동안 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포의 집단은 혈청이 결여되고 인슐린 및 IGF-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 인자와 BSA가 보충된 배지에서 약 1일 내지 약 6일 동안 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포의 집단은 혈청이 결여되고 인슐린 및 IGF-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 인자와 BSA가 보충된 배지에서 약 1일 내지 약 5일 동안 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포의 집단은 혈청이 결여되고 인슐린 및 IGF-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 인자와 BSA가 보충된 배지에서 약 1일 내지 약 4일 동안 배양될 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포의 집단은 혈청이 결여되고 인슐린 및 IGF-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 인자와 BSA가 보충된 배지에서 약 4일 동안 배양될 수 있다.
일 실시 형태에서, GDF-8은 약 5 ng/mL 내지 약 500 ng/mL의 농도로 사용된다. 대안적 실시 형태에서, GDF-8은 약 5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL의 농도로 사용된다. 대안적 실시 형태에서, GDF-8은 약 5 ng/mL 내지 약 25 ng/mL의 농도로 사용된다. 대안적 실시 형태에서, GDF-8은 약 25 ng/mL의 농도로 사용된다.
액티빈 A는 약 1 pg/mL 내지 약 100 ㎍/mL의 농도로 사용될 수 있다. 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 1 pg/ml 내지 약 1 ㎍/ml일 수 있다. 다른 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 1 pg/ml 내지 약 100 ng/ml일 수 있다. 다른 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 50 ng/ml 내지 약 100 ng/ml일 수 있다. 다른 대안적 실시 형태에서, 상기 농도는 약 100 ng/ml일 수 있다.
Wnt 리간드는 Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-5a 및 Wnt-7a로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시 형태에서, Wnt 리간드는 Wnt-1이다. 대안적 실시 형태에서, Wnt 리간드는 Wnt-3a이다.
Wnt 리간드는 약 1 ng/mL 내지 약 1000 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다. 다른 실시 형태에서, Wnt 리간드는 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, Wnt 리간드의 농도는 약 20 ng/mL이다.
일 실시 형태에서, 인슐린은 약 1 ng/ml 내지 약 100 ng/ml의 농도로 사용된다.
일 실시 형태에서, IGF-1은 약 1 ng/ml 내지 약 200 ng/ml의 농도로 사용된다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
일 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 형성된, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 본 기술 분야의 임의의 방법에 의해 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화된다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득된, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득된, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
일 실시 형태에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 당업계의 임의의 방법에 의해 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화된다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 미국 특허 출원 제60/953,178호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 미국 특허 출원 제60/990,529호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 이에 의해 제한되지는 않는다.
실시예
실시예 1
인간 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 데 있어서의 인슐린의 역할: 클러스터(Cluster) 접종
이전 연구에 의하면 고농도의 FBS가 배아 줄기 세포로부터의 완성 내배엽(DE)의 형성에 유해함이 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌[D'Amour et al., Nature Biotechnology, 2005]을 참조하는데, 여기서 인간 배아 줄기 세포로부터의 완성 내배엽의 유도는 FBS 농도를 10%의 FBS로부터 0.5-2%의 FBS로 감소시킬 때 유의하게 증가하였다. 유사한 관찰이 보고되었으며, 여기서 25 ng/ml의 IGF 또는 200 ng/ml의 인슐린을 2% FBS에 첨가한 것을 MEF-CM(생쥐 배아 섬유아세포 조절 배지; mouse embryonic fibroblast conditioned media)에서 배양한 ES 세포에 첨가하면 SOX17의 발현이 액티빈 A를 이용한 처리 후 대략 70%만큼 감소되었다. 문헌[McLean et al, Stem Cells 25:29-38, 2007]을 참조하라.
관찰된 억제 효과는 FBS 중 인슐린 또는 IGF의 존재로 인하여 가능하였는데, 이는 포스파티딜이노시톨 3-키나아제 경로를 트리거링(triggering)하였다. 문헌[McLean et al, Stem Cells 25:29-38, 2007]을 참조하라. PI-3 키나아제 신호전달 경로의 차단은 MEF-CM(생쥐 배아 섬유아세포 조절 배지)에서 배양한 인간 ES 세포에서 Sox17 양성 세포의 백분율을 증가시켰다. 문헌[McLean et al, Stem Cells 25:29-38, 2007]을 참조하라.
이들 데이터는 액티빈 A 및 저농도의 FBS(0.5-2%의 FBS)를 함유하는 배지에 25 ng/ml의 IGF 또는 200 ng/ml의 인슐린만큼 적은 양의 것을 첨가하면 완성 내배엽의 형성이 차단될 것으로 예상됨을 시사한다. FBS 중 IGF 및 인슐린의 전형적인 농도는 각각 대략 70 ng/ml (문헌[J. Clin. Invest. 76:4, 1985]) 및 대략 60 ng/ml (문헌[In Vitro Cell Dev Biol. 32:8-12, 1996]이다. 이는 2% FBS 중 대략 1.4 ng/ml의 IGF 및 대략 1.2 ng/ml의 인슐린으로 변환된다.
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포(p40-p52)를 매트리겔(등록상표)(1:30 희석) (비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences); 카탈로그 번호: 356231)-코팅된 디쉬에서, 16 ng/ml의 FGF2 (카탈로그 번호: 100-18B, 미국 뉴저지주 소재의 페프로테크(PeproTech))가 보충된 MEF-CM(생쥐 배아 섬유아세포 조절 배지)에서 배양하고, 하기와 같이 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시켰다:
a. 1일 동안 2% 무지방산 BSA (카탈로그 번호: 68700, 미국 아이오와주 소재의 프롤리언트(Proliant)), 및 100 ng/ml의 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈(R&D Systems)) + 20 ng/ml의 WNT-3a (카탈로그 번호: 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)가 보충된 RPMI 배지, 그 후
b. 추가로 3일 동안 2% BSA 및 100 ng/ml의 액티빈 A가 보충된 RPMI 배지.
배양물 중 일부에서, 세포를 ITS-X (카탈로그 번호: 51500-056, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐(Invitrogen))의 하기 희석물로 처리하였다: 0, 1:106, 1:5 × 105, 1:105, 1:104. ITS-X는 1 mg/ml의 인슐린, 0.55 mg/ml의 트랜스페린, 0.00067 mg/ml의 아셀렌산나트륨, 및 0.2 mg/ml의 에탄올아민으로 이루어진 것이 보충된 혈청 대체물이다. ITS-X의 희석 범위는 0, 1 ng/ml, 2 ng/ml, 10 ng/ml, 및 100 ng/ml의 인슐린에 상응한다. 대조군으로서, 0.2%의 FBS (카탈로그 번호: SH30070.03, 미국 유타주 소재의 하이클론(Hyclone))를 분화 1일에 사용하고, 2일에 0.5%의 FBS를 사용하고, 2%의 FBS를 3-4일에 사용하였다. FBS 처리 배양물에는 ITS-X를 보충하지 않았다.
4일에, 샘플들을 FACS 및 실시간 PCR을 이용한 유전자 발현 분석용으로 수집하였다. 놀랍게도, 도 1에 나타낸 바와 같이, 세포 분화에 사용한 배지에의 1-100 ng/ml의 인슐린의 첨가는 완성 내배엽과 결부된 마커(FOXA2, SOX17, 및 CXCR4), 간엽 조직과 결부된 마커(T, 브라치로도 공지됨), 또는 배자외 마커(SOX7, AFP)의 발현에 유의하게 영향을 주지 못하였다. 더욱이, 2% BSA가 보충된 배지로 처리한 배양물은 0.5-2% FBS가 보충된 배지로 처리한 배양물보다 유의하게 더 높은, 완성 내배엽과 결부된 마커의 발현을 나타냈다.
이들 관찰은 다양한 처리에 있어서 FACS에 의해 결정되는 바와 같이 CXCR4 및 CD9의 발현에 의해 추가로 지지되었다 도 2를 참조하라. 세포 표면 수용체 CXCR4는 이전에 완성 내배엽의 마커인 것으로 밝혀졌다. CD9는 미분화 ES 세포에 대한 마커이다. 그 결과, 세포의 집단에 있어서의 CXCR4의 발현의 증가 및 CD9의 발현의 감소는 완성 내배엽의 형성을 나타낸다. 표 I에 요약된 바와 같이, CXCR4, 또는 CD9의 발현의 유의한 변화는 시험된 인슐린의 임의의 농도에서 BSA가 보충된 배지로 처리한 세포에서 전혀 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 인슐린이 이들 연구에서 이용한 배양 배지에서 시험한 농도에서 억제성이 아님을 시사한다.
[표 I]
Figure 112013025652817-pct00001
실시예 2
인간 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 데 있어서의 인슐린의 역할: 단일 세포 접종
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포(p40-p52)를 단일 세포로서 100000개의 세포/㎠의 밀도로 매트리겔(등록상표) (1:30의; 희석) (비디 바이오사이언시즈; 카탈로그 번호: 356231)-코팅된 디쉬에 16 ng/ml의 FGF2 (카탈로그 번호: 100-18B, 미국 뉴저지주 소재의 페프로테크) 및 10 μM의 Y27632 (Rock 억제제, 카탈로그 번호: Y0503, 미국 미주리주 소재의 시그마)가 보충된 MEF-CM(생쥐 배아 섬유아세포 조절 배지) 중에 접종하였다. 접종한지 72시간 후에, 배양물들을 하기와 같이 완성 내배엽(DE)으로 분화시켰다:
a. 1일 동안 2% 무지방산 BSA (카탈로그 번호: 68700, 미국 아이오와주 소재의 프롤리언트), 0.0025 g/ml의 중탄산나트륨 (카탈로그 번호: S3187, 미국 미주리주 소재의 시그마), 1X 글루타맥스(GlutaMax)™ (카탈로그 번호: 35050-079, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) 및 100 ng/ml의 액티빈 A (미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈) + 20 ng/ml WNT-3a (카탈로그 번호: 1324-WN-002, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)가 보충된 MCDB-131 (카탈로그 번호: 10372-019, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) 배지, 그 후
b. 추가로 3일 동안 2% BSA, 중탄산나트륨, 글루타맥스 및 100 ng/ml의 액티빈 A로 보충된 MCDB-131 배지.
배양물들 중 일부에 있어서, 세포를 하기 농도의 인슐린(카탈로그 번호: I9278, 미국 미주리주 소재의 시그마)으로 처리하였다: 0, 1, 10, 100, 1000, 또는 10000 ng/ml. 4일에, 샘플들을 FACS 및 실시간 PCR을 이용한 유전자 발현 분석용으로 수집하였다.
세포 분화에 사용한 배지에의 1-100 ng/ml의 인슐린의 첨가는 완성 내배엽과 결부된 마커(FOXA2, SOX17, CER1, 및 CXCR4)의 발현에 유의하게 영향을 주지 못하였다. 이와 유사하게, 배아 마커(NANOG), 또는 배자외 마커(SOX7, AFP)의 발현은 영향을 받지 않았다. 도 3을 참조하라 그러나, 1-10 ㎍/ml의 인슐린의 첨가는 NANOG의 발현을 증가시켰다. 이들 데이터는 완성 내배엽 마커 SOX17(카탈로그 번호:AF1924, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)에 대한 면역 형광(IF) 염색에 의해 추가로 지지되었다 (도 4).
도 5는 FACS 분석에 의해 측정되는 바와 같이 다양한 처리의 CXCR4 및 CD9의 발현 프로파일을 도시한다. 표 II에 요약된 바와 같이, 인슐린의 생리학적 농도 초과의 농도(super physiological concentration; 1-10 ㎍/ml)에서만 CXCR4+CD9- 세포의 백분율 감소 및 CXCR4-CD9+ 분획물의 발현 증가가 있었다. 이들 데이터는 이 연구에서의 조건에서, 단지 생리학적 농도 초과의 농도의 인슐린이 완성 내배엽의 형성을 억제함을 시사한다.
[표 II]
Figure 112013025652817-pct00002
실시예 3
인간 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 데 있어서의 IGF의 역할: 단일 세포 접종
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포(p40-p52)를 단일 세포로서 100000개의 세포/㎠의 밀도로 매트리겔(등록상표) (1:30의; 희석) (비디 바이오사이언시즈; 카탈로그 번호: 356231)-코팅된 디쉬에 16 ng/ml의 FGF2 (카탈로그 번호: 100-18B, 미국 뉴저지주 소재의 페프로테크) 및 10 μM의 Y27632 (Rock 억제제, 카탈로그 번호: Y0503, 미국 미주리주 소재의 시그마)가 보충된 MEF-CM(생쥐 배아 섬유아세포 조절 배지) 중에 접종하였다. 접종한지 72시간 후에, 배양물들을 하기와 같이 완성 내배엽(DE)으로 분화시켰다:
a. 1일 동안 2% 무지방산 BSA(카탈로그 번호: 68700, 미국 아이오와주 소재의 프롤리언트), 0.0025 g/ml의 중탄산나트륨(카탈로그 번호: S3187, 미국 미주리주 소재의 시그마), 1X 글루타맥스™ (카탈로그 번호: 35050-079, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) 및 100 ng/ml의 GDF8(카탈로그 번호: 120-00, 미국 뉴저지주 소재의 페프로테크) + 2.5 μM의 GSK3B 억제제 14-프로프-2-엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온이 보충된 MCDB-131(카탈로그 번호: 10372-019, 미국 캘리포니아주 인비트로겐) 배지, 그 후
b. 추가로 3일 동안 2% BSA, 중탄산나트륨, 글루타맥스 및 100 ng/ml의 GDF-8이 보충된 MCDB-131 배지.
배양물들 중 일부에 있어서, 세포를 하기 농도의 IGF(카탈로그 번호: AF100, 미국 뉴저지주 소재의 페프로테크)로 처리하였다: 0, 1, 10, 50, 또는 200 ng/ml. 대조군으로서, BSA 대신 0.2%의 FBS (카탈로그 번호: SH30070.03, 미국 유타주 소재의 하이클론)를 분화 1일에 사용하고, 2%의 FBS를 2-4일에 사용하였다. FBS 처리 배양물들 중 일부를 다양한 농도의 IGF로 또한 처리하였다.
4일에, 샘플들을 FACS 및 실시간 PCR을 이용한 유전자 발현 분석용으로 수집하였다.
놀랍게도, BSA 처리 배양물에의 1-200 ng/ml의 IGF의 첨가는 IGF로 처리하지 않은 대조 샘플들과 비교할 때, 완성 내배엽과 결부된 마커(FOXA2, SOX17,CER1, 및 CXCR4)의 발현에 유의하게 영향을 주지 못하였다 (도 6). 유사한 결과가 배자외 마커(SOX7, AFP)에서 관찰되었다. 50-200 ng/ml의 IGF의 첨가는 배아 마커 NANOG의 발현을 증가시켰다.
FBS가 보충된 배지로 처리한 배양물들은 IGF의 억제 효과에 대하여 훨씬 더 민감하였다. 이들 배양물에서, SOX17, HNF3B 및 CXCR4의 발현은 IGF의 농도가 증가함에 따라 감소하였다. 이들 관찰은 DE 마커 SOX17(카탈로그 번호:AF1924, 미국 미네소타주 소재의 알앤디 시스템즈)에 대한 면역 형광(IF) 염색에 의해 추가로 지지되었다 (도 8 내지 도 9).
표 III에 요약된 바와 같이, BSA 처리 배양물 중 IGF의 생리학적 농도 초과의 농도(50-200 ng/ml)에서만 CXCR4+CD9- 세포의 발현 하락 및 CXCR4-CD9+ 분획물의 발현 증가가 있었다. 그러나, IGF 용량을 증가시키면, FBS 처리 배양물은 BSA 처리 배양물과 비교하여 CXCr4+CD9- 분획물의 발현의 더욱 유의한 하락을 나타냈다. 상기 실시예는 FBS의 부재 하에, 생리학적 농도의 IGF 또는 인슐린이 DE 마커의 유도에 대하여 억제성이 아님을 총괄적으로 나타낸다.
[표 III]
Figure 112013025652817-pct00003
실시예 4
다양한 로트의 FBS 중 IGF의 농도
IGF-1 키트를 다이아그노스틱 시스템즈 래보러토리즈(Diagnostic Systems Laboratories; DSL) (카탈로그 번호: DSL-10-2800)로부터 구매하고, 이를 검출에 사용하였다. 20 마이크로리터(㎕)의 혈청(듀플리케이트)을 전처리하고, 그 후 20 ㎕의 희석 샘플을 분석에 사용하였다. 배지 샘플에 있어서, 20 ㎕의 샘플을 분석에 직접적으로 사용하였다. 키트에 의해 제공된 설명서에 따라 분석을 실시하였다. 이 키트는 인간 및 소 IGF-1 둘 모두를 검출할 수 있으며, 그 이유는 키트에 사용된 2가지의 단클론 항체가 상동 펩티드 서열들에 대한 것이기 때문이다.
시험 샘플: 하기 시험 샘플들을 사용하였다:
4A/5A: 하이클론 신생 송아지 혈청; 로트: AKM12868
4B/5B: NIH-FBS (-20 C의 분취물로부터의 것)
4C/5C: 하이클론 FBS, 로트: ATK33398
4D/5D: 하이클론 FBS, 로트: AUK 54924
4E/5E: 인간 혈청, 로트: A70184, 밸리 바이오메디칼 인크.(Valley Biomedical Inc.)
4F/5F: 넉아웃 혈청; 인비트로겐, 로트: 557914
4F/5F: F12 DMEM, 인비트로겐, 로트: 692281
4H/5H: MEF 조절 배지, 로트: 011410 (5일)
대조 샘플: 하기 대조 샘플들을 사용하였다:
배경: "0"의 IGF-1 (음성 대조군, 키트로부터의 것); 상기 목록에 언급된 F12 샘플은 또한 음성 대조군으로서의 역할을 함.
2가지의 양성 대조군(127 ng/ml 및 241 ng/ml; 키트로부터의 것).
결과: 혈청에 대한 분석의 민감성은 10 ng/ml 초과였으며; 배지에 대한 것은 0.1 ng/ml 초과였다.
Figure 112013025652817-pct00004
Figure 112013025652817-pct00005
실시예 5
인간 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 데 있어서의 인슐린/ IGF 및 FBS의 역할: 단일 세포 접종
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포(p40-p52)를 단일 세포로서 100000개의 세포/㎠의 밀도로 매트리겔(등록상표) (1:30의; 희석) (비디 바이오사이언시즈; 카탈로그 번호: 356231 )-코팅된 디쉬에 16 ng/ml의 FGF2 (카탈로그 번호: 100-18B, 미국 뉴저지주 소재의 페프로테크) 및 10 μM의 Y27632 (Rock 억제제, 카탈로그 번호: Y0503, 미국 미주리주 소재의 시그마)가 보충된 MEF-CM(생쥐 배아 섬유아세포 조절 배지) 중에 접종하였다. 접종한지 72시간 후에, 배양물들을 하기와 같이 완성 내배엽(DE)으로 분화시켰다:
a. 1일 동안 0.2% FBS(카탈로그 번호: SH30070.03, 미국 유타주 소재의 하이클론), 0.0025 g/ml의 중탄산나트륨(카탈로그 번호: S3187, 미국 미주리주 소재의 시그마), 1X 글루타맥스™ (카탈로그 번호: 35050-079, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) 및 100 ng/ml의 GDF8(카탈로그 번호: 120-00, 미국 뉴저지주 소재의 페프로테크) + 2.5 μM의 GSK3B 억제제 14-프로프-2-엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온이 보충된 MCDB-131(카탈로그 번호: 10372-019, 미국 캘리포니아주 소재의 인비트로겐) 배지, 그 후
b. 추가로 3일 동안 FBS, 중탄산나트륨, 글루타맥스 및 100 ng/ml의 GDF8이 보충된 MCDB-131 배지.
0.5% FBS를 2일에 사용하고, 2% FBS를 3-4일에 사용하였다. 보통의 FBS 외에, 열처리된 FBS(카탈로그 번호: F4135, 미국 미주리주 소재의 시그마) 및 목탄 스트립핑된(stripped) 처리된 FBS(카탈로그 번호: F6765, 미국 미주리주 소재의 시그마)를 또한 시험하였다. FBS 처리 배양물들 중 일부를 다양한 농도의 IGF (10-100 ng/ml) 또는 인슐린 (10-100 ng/ml)으로 또한 처리하였다.
4일에, 샘플들을 FACS 및 실시간 PCR에 의한 분석용으로 수집하였다. FBS의 존재 하에서 BSA 처리된 배양물들과는 대조적으로 (이전의 실시예를 참조) 인슐린 또는 IGF의 첨가는 완성 내배엽과 결부된 마커, 예를 들어 SOX17 및 CXCR4를 용량 의존적으로 하향조절하였다. 도 9를 참조하라. 또한 만능성 마커 NANOG의 발현이 상향조절되었다.
본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 태양은 실시예 및 바람직한 실시 형태를 참조로 하여 상기 예시되었지만, 본 발명의 범주는 전술한 설명에 의해서가 아니라 특허법의 원칙 하에 적절하게 해석되는 하기 특허청구범위에 의해 규정되는 것으로 인식될 것이다.

Claims (23)

  1. a. 만능 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계; 및
    b. 혈청이 결여되고, (ⅰ) BSA, (ⅱ) 인슐린 및 IGF-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 인자, 및 (ⅲ) (1) 액티빈 A 및 Wnt 리간드, 또는 (2) GDF-8 및 14-프로프-2-엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온이 보충된 배지에서 상기 만능 줄기 세포의 집단을 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화하는 단계를 포함하며,
    상기 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질(Mix-like homeobox protein), FGF4, CD48, 에오메소더민(eomesodermin, EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 및 OTX2로 구성된 그룹 중에서 선택되는,
    완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 만능 줄기 세포의 집단을 배지에서 적어도 6일의 기간 동안 분화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 만능 줄기 세포의 집단을 배지에서 적어도 7일의 기간 동안 분화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 배지가 인슐린으로 보충된 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 배지가 1 ng/ml 내지 100 ng/ml의 인슐린으로 보충된 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 배지가 IGF-1으로 보충된 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 배지가 1 ng/ml 내지 50 ng/ml의 IGF-1으로 보충된 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포가 완성 내배엽 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 액티빈 A 및 Wnt 리간드로 보충된 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, Wnt 리간드가 Wnt-3A인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 GDF-8 및 14-프로프-2-엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온으로 보충된 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 만능 줄기 세포가 인간 만능 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 만능 줄기 세포를, 혈청이 결여되고, (ⅰ) BSA, (ⅱ) 인슐린 및 IGF-1으로 이루어진 군으로부터 선택된 인자, 및 (ⅲ) (1) 액티빈 A 및 Wnt 리간드, 또는 (2) GDF-8 및 14-프로프-2-엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온이 보충된 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 세포로 분화하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 배지가 인슐린으로 보충된 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 배지가 IGF-1으로 보충된 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 액티빈 A 및 Wnt 리간드로 보충된 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, Wnt 리간드가 Wnt-3A인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 GDF-8 및 14-프로프-2-엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온으로 보충된 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 만능 줄기 세포가 인간 만능 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
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