RU2627168C2 - Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека - Google Patents

Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека Download PDF

Info

Publication number
RU2627168C2
RU2627168C2 RU2013114375A RU2013114375A RU2627168C2 RU 2627168 C2 RU2627168 C2 RU 2627168C2 RU 2013114375 A RU2013114375 A RU 2013114375A RU 2013114375 A RU2013114375 A RU 2013114375A RU 2627168 C2 RU2627168 C2 RU 2627168C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cells
insulin
line
igf
stem cells
Prior art date
Application number
RU2013114375A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2013114375A (ru
Inventor
Алиреза РЕЗАНИА
Original Assignee
Янссен Байотек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Янссен Байотек, Инк. filed Critical Янссен Байотек, Инк.
Publication of RU2013114375A publication Critical patent/RU2013114375A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2627168C2 publication Critical patent/RU2627168C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C12N5/0678—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0613—Cells from endocrine organs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/19—Growth and differentiation factors [GDF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способам получения популяции клеток, в которой более 85% клеток экспрессируют маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы. Указанную популяцию клеток получают путем дифференцирования популяции человеческих эмбриональных стволовых клеток линии H1. Дифференцирование происходит в бессывороточной среде с добавлением: (а) БСА, (b) либо (i) GDF-8 и 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазотетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-она, либо (ii) активина А и лиганда Wnt; и (с) фактора, выбранного из инсулина и IGF-1. Изобретение обеспечивает высокую эффективность дифференцирования эмбриональных стволовых клеток. 3 н. и 17 з.п. ф-лы, 9 ил., 5 табл., 5 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка притязает на приоритет предварительной патентной заявки серийный номер 61/378472, поданной 31 августа 2010 г, которая включена в настоящий документ посредством ссылки.
Область применения изобретения
В данном изобретении описываются способы содействия дифференциации плюрипотентных стволовых клеток в клетки, вырабатывающие инсулин. В частности, настоящее изобретение относится к способу получения популяции клеток, в которой более 85% клеток экспрессирует маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1 типа и нехватка островков Лангерганса для трансплантации заставили обратить внимание на разработку источников инсулин-продуцирующих клеток, или β-клеток, подходящих для трансплантации. Одним из подходов является формирование функциональных β-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.
При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентные клетки дают начало группе клеток, формирующих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и эндодерму) в ходе процесса, именуемого гаструляцией. Такие ткани, как, например, щитовидная железа, тимус, поджелудочная железа, кишечник и печень, будут развиваться из эндодермы через промежуточную стадию. Промежуточной стадией данного процесса является образование сформированной эндодермы. Клетки сформированной эндодермы экспрессируют ряд маркеров, как например, HNF3 beta, GATA4, MIXL1, CXCR4 и SOX17.
Формирование поджелудочной железы происходит при дифференцировании сформированной эндодермы в панкреатическую эндодерму. Клетки панкреатической эндодермы экспрессируют ген панкреатическо-дуоденального гомеобокса, Pdx1. При отсутствии Pdx1 развитие поджелудочной железы не идет дальше формирования вентрального и дорзального зачатков. Таким образом, экспрессия PDX1 характеризует критическую стадию органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит, помимо других типов клеток, экзокринную ткань и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются при дифференцировании панкреатической эндодермы.
По имеющимся данным, клетки, обладающие свойствами островковых клеток, были получены из эмбриональных клеток мыши. Например, Lumelsky et al. описывают дифференцирование мышиных эмбриональных стволовых клеток в инсулин-секретирующие структуры, аналогичные островкам поджелудочной железы. Soria et al. (Diabetes 49:157, 2000) описывают инсулин-секретирующие клетки, производные мышиных эмбриональных стволовых клеток, которые нормализуют гликемию у мышей с диабетом, индуцированным стрептозотоцином.
В одном примере, Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002) описывается, что обработка мышиных эмбриональных стволовых клеток ингибиторами фосфоинозитид-3-киназы (LY294002) приводила к получению клеток, подобных β-клеткам.
В другом примере, Blyszczuk et al. (PNAS 100:998, 2003) сообщают о получении инсулин-продуцирующих клеток из мышиных эмбриональных стволовых клеток с конститутивной экспрессией Pax4.
В публикации Micallef et al. сообщается, что ретиноевая кислота может регулировать способность эмбриональных стволовых клеток формировать Pdx1-положительную панкреатическую эндодерму. Ретиноевая кислота с наибольшей эффективностью индуцирует экспрессию Pdx1 при добавлении в культуру на 4 день дифференцирования эмбриональных стволовых клеток в течение периода, соответствующего концу гаструляции эмбриона (Diabetes 54:301, 2005).
В публикации Miyazaki et al. сообщается о линии мышиных эмбриональных стволовых клеток со сверхэкспрессией Pdx1. Результаты показывают, что экспрессия экзогенного Pdx1 очевидно повышает экспрессию генов инсулина, соматостатина, глюкокиназы, нейрогенина 3, p48, Pax6 и HNF6 в образующихся дифференцированных клетках (Diabetes 53: 1030, 2004).
В публикации Skoudy et al. сообщается, что активин A (входящий в суперсемейство TGF-β) повышает экспрессию экзокринных панкреатических генов (p48 и амилаза) и эндокринных генов (Pdx1, инсулин и глюкагон) в эмбриональных стволовых клетках мыши. Максимальный эффект наблюдался при использовании 1 нМ активина A. Кроме того, авторы отметили, что экспрессия инсулина и Pdx1 мРНК не изменялась под действием ретиноевой кислоты; Однако, лечение с использованием 3nM FGF7 привело к повышению уровня транскрипта для Pdx1 (Biochem. J. 379: 749, 2004).
В работе Shiraki et al. изучались эффекты факторов роста, специфически ускоряющих дифференцирование эмбриональных стволовых клеток в Pdx1-положительные клетки. Эти авторы наблюдали, что TGF-β2 приводил к воспроизводимому увеличению доли Pdx1-положительных клеток (Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16.).
В работе Gordon et al. показана индукция образования брахиурических [положительных]/HNF3 бета [положительных] эндодермальных клеток из эмбриональных стволовых клеток мыши в отсутствие сыворотки и в присутствии активина в сочетании с ингибитором сигнального каскада Wnt (патент США № 2006/0003446A1).
Gordon et al. (PNAS, т. 103, с. 16806, 2006) утверждают: «Для образования примитивной первичной полоски одновременно требовались сигнальные пути Wnt и TGF-бета/nodal/активин».
Однако модель развития эмбриональных стволовых клеток на мышах может не имитировать в точности программу развития у высших млекопитающих, например у человека.
В работе Thomson et al. эмбриональные стволовые клетки выделяли из человеческих бластоцист (Science 282:114, 1998). Параллельно, Gearhart и соавторы получили клеточные линии эмбриональных зародышевых клеток человека (hEG) из ткани половых желез эмбриона (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). В отличие от эмбриональных стволовых клеток мыши, воспрепятствовать дифференцированию которых можно путем простого культивирования с фактором, ингибирующим лейкемию (LIF), эмбриональные стволовые клетки человека необходимо культивировать в крайне специфических условиях (патент США № 6200806; WO 99/20741, WO 01/51616).
D’Amour et al. описывают производство обогащенных культур сформированной эндодермы, производной от человеческих эмбриональных стволовых клеток, в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology 2005). Трансплантация этих клеток под почечную капсулу мышей привела к их дифференцированию в более зрелые клетки, обладающие характерными особенностями некоторых эндодермальных органов. Клетки сформированной эндодермы, производные от эмбриональных стволовых клеток человека, могут подвергаться дальнейшему дифференцированию в Pdx1-положительные клетки после добавления FGF-10 (US 2005/0266554A1).
D’Amour et al. (Nature Biotechnology -24, 1392-1401 (2006)) утверждают: “Мы разработали процесс дифференцировки, преобразующий эмбриональные клетки человека (hES) в эндокринные клетки, способные синтезировать гормоны поджелудочной железы: инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид и грелин. Данный процесс имитирует органогенез поджелудочной железы in vivo, проводя клетки через фазы, напоминающие образование сформированной эндодермы, эндодермы кишечной трубки, панкреатической эндодермы и превращение предшественников эндокринных клеток в клетки, экспрессирующие эндокринные гормоны”.
В другом примере, в публикации Fisk et al., сообщается о системе для производства островковых клеток поджелудочной железы из эмбриональных стволовых клеток человека (US2006/0040387A1). В данном случае процесс дифференцирования был разделен на три стадии. Человеческие эмбриональные стволовые клетки были впервые дифференцированы до эндодермы с помощью сочетания бутирата натрия и активина A. Затем клетки культивировали с антагонистами ФНО-β, например, Noggin, в сочетании с EGF или бетацеллюлином для получения PDX1-положительных клеток. Окончательное дифференцирование запускалось никотинамидом.
Таким образом, сохраняется значительная потребность в разработке лабораторных способов создания функциональной экспрессирующей инсулин клетки более близкой к β-клетке, in vitro. Настоящее изобретение представляет альтернативный подход к повышению эффективности дифференцирования эмбриональных стволовых клеток человека в экспрессирующие инсулин клетки путем получения популяции, в которой более 85% клеток экспрессирует маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения популяции клеток, в которой более 85% клеток экспрессирует маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.
В одном варианте осуществления изобретения популяции плюрипотентных клеток дифференцировали в популяции клеток, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток на среде с добавлением БСА и фактора, выбранного из следующей группы: инсулин и IGF-1. В одном варианте осуществления изобретения дифференциация популяции плюрипотентных стволовых клеток в направлении популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии клеток сформированной эндодермы, достигается обработкой плюрипотентных стволовых клеток активином А и лигандом Wnt.
В одном варианте осуществления изобретения дифференциация популяции плюрипотентных стволовых клеток в направлении популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, достигается обработкой плюрипотентных стволовых клеток GDF-8 и, по меньшей мере, одним из факторов, выбранных из следующей группы: анилин-пиридинотриазин, циклический анилин-пиридинотриазин, N-{[1-(фенилметил)азепан-4-ил]метил}-2-пиридин-3-илацетамид, 4-{[4-(4-{[2-(пиридин-2-иламино)этил]амино}-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-ил]окси}бутан-1-ол, 3-({3-[4-({2-[метил(пиридин-2-ил)амино]этил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-ил}амино)пропан-1-ол, N~4~-[2-(3-фторфенил)этил]-N~2~-[3-(4-метилпиперазин-1-ил)пропил]пиридо[2,3-d]пиримидин-2,4-диамин, 1-метил-N-[(4-пиридин-3-ил-2-{[3-(трифторметил)фенил]амино}-1,3-тиазол-5-ил)метил]пиперидин-4-карбоксамид, 1,1-диметилэтил {2-[4-({5-[3-(3-гидроксипропил)фенил]-4H-1,2,4-триазол-3-ил}амино)фенил]этил}карбамат, 1,1-диметилэтил {[3-({5-[5-(3-гидроксипропил)-2-(метилокси)фенил]-1,3-оксазол-2-ил}амино)фенил]метил}карбамат, 1-({5-[6-({4-[(4-метилпиперазин-1-ил)сульфонил]фенил}амино)пиразин-2-ил]тиофен-2-ил}метил)пиперидин-4-ол, 1-({4-[6-({4-[(4-метилпиперазин-1-ил)сульфонил]фенил}амино)пиразин-2-ил]тиофен-2-ил}метил)пиперидин-4-карбоксамид и 2-{[4-(1-метилэтил)фенил]амино}-N-(2-тиофен-2-илэтил)-7,8-дигидропиридо[4,3-d]пиримидин-6(5H)-карбоксамид.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 показаны результаты анализа экспрессии генов в клетках человеческой эмбриональной линии H1, дифференцированной по способу, описанному в Примере 1, методом ПЦР в реальном времени.
На фиг. 2 показаны результаты анализа экспрессии белков в клетках человеческой эмбриональной линии H1, дифференцированной по способам, описанным в Примере 1, методом флуоресцентной проточной цитометрии.
На фиг. 3 показаны результаты анализа экспрессии генов в клетках человеческой эмбриональной линии H1, дифференцированной по способу, описанному в Примере 2, методом ПЦР в реальном времени.
На фиг. 4 показаны результаты анализа экспрессии белков в SOX17 методом иммунофлуоресценции в клетках человеческой эмбриональной линии H1, дифференцированной по способам, описанным в Примере 2.
На фиг. 5 показаны результаты анализа экспрессии белков методом флуоресцентной проточной цитометрии в клетках человеческой эмбриональной линии H1, дифференцированной по способам, описанным в Примере 2.
На фиг. 6 показаны результаты анализа экспрессии генов в клетках человеческой эмбриональной линии H1, дифференцированной по способу, описанному в Примере 3, методом ПЦР в реальном времени.
На фиг. 7 показаны результаты анализа экспрессии SOX17 методом иммунофлуоресценции в клетках человеческой эмбриональной линии H1, дифференцированной по способам, описанным в Примере 3.
На фиг. 8 показаны результаты анализа экспрессии SOX17 методом иммунофлуоресценции в клетках человеческой эмбриональной линии H1, дифференцированной по способам, описанным в Примере 3.
На фиг. 9 показаны результаты анализа экспрессии генов в клетках человеческой эмбриональной линии H1, дифференцированной по способам, описанным в Примере 5, методом ПЦР в реальном времени.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для ясности описания, а не для ограничения изобретения, подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.
Определения
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцирования из нескольких зародышевых листков (эндодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от нескольких зародышевых листков, и вносить существенный вклад в формирование большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.
Стволовые клетки классифицируют по потенциалу развития: (1) тотипотентные, то есть, способные преобразоваться в любой из эмбриональных и внеэмбриональных типов клеток; (2) плюрипотентные, то есть, способные преобразоваться во все типы эмбриональных клеток; (3) мультипотентные, то есть, способные преобразоваться во множество клеточных линий, но в рамках одной ткани, органа или физиологической системы (например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) могут порождать ГСК (самообновление), олигопотентные ограниченные клетки-предшественники крови и все типы клеток и элементов (например, тромбоциты), являющиеся стандартными составляющими крови); (4) олигопотентные, то есть, способные преобразоваться в более ограниченное подмножество клеточных линий, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, то есть, способные преобразоваться в единственную клеточную линию (например, сперматогенные стволовые клетки).
Дифференцирование представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например нервной или мышечной клетки. Дифференцированная клетка или клетка с индуцированным дифференцированием представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцирования клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцирования обозначает клетку, дошедшую в ходе процесса дифференцирования до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного типа клеток или набора типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному типу. Дедифференцированием называется процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в линии дифференцирования. Используемый в настоящей заявке термин «линия дифференцирования клетки» определяет наследственность клетки, то есть определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В линии дифференцирования клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцирования. Маркером, специфичным для линии дифференцирования, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцирования, которая может использоваться для оценки дифференцирования некоммитированных клеток в клетки данной линии дифференцирования.
Используемые в настоящей заявке термины «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы», «клетки стадии 1» или «стадия 1», относятся к клеткам, экспрессирующим, по меньшей мере, один из следующих маркеров: SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 или OTX2. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, относятся клетки-предшественники первичной полоски, клетки первичной полоски, клетки мезэндодермы и клетки сформированной эндодермы.
Используемый в настоящей заявке термин «клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы» относится к клеткам с экспрессией, по меньшей мере, одного из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF1 beta, PTF1 alpha, HNF6, HNF4 alpha, SOX9, HB9 или PROX1. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, относятся клетки панкреатической эндодермы, клетки первичной кишечной трубки и клетки задней части передней кишки.
Используемый в настоящей заявке термин «сформированная эндодерма» относится к клеткам, обладающим характерными особенностями клеток, происходящих в ходе гаструляции от эпибласта, и формирующим желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки сформированной эндодермы экспрессируют следующие маркеры: HNF3 beta, GATA4, SOX17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 и MIXL1.
Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из множества известных в данной области способов.
«Панкреатической эндокринной клеткой» или «клеткой, экспрессирующей гормон поджелудочной железы» или «клеткой, экспрессирующей характеристики эндокринной линии поджелудочной железы» в настоящем документе называется клетка способная экспрессировать, по меньшей мере, один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.
Выделение, размножение и культивирование полипотентных стволовых клеток
Характеристика плюрипотентных стволовых клеток
Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или более стадийно-специфичных эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые антителами, обозначенными как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к потере экспрессии SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81 (при наличии) и к повышению экспрессии SSEA-1. В недифференцированных полипотентных стволовых клетках, как правило, активна щелочная фосфатаза, которая может быть обнаружена путем фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида, с последующим обнаружением с помощью Vector Red, применяемого в качестве субстрата, в соответствии с инструкциями производителя (Vector Laboratories, Burlingame Calif.). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, определяемые с помощью ПЦР в реальном времени.
Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных стволовых клеток является потенциал дифференцирования в клетки всех трех зародышевых листков: в эндодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Полипотентность полипотентных стволовых клеток может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида, и их гистологического исследования для получения доказательств наличия клеточных типов, происходящих от трех зародышевых листков. В качестве альтернативы плюрипотентность можно определить по созданию эмбриоидных телец и анализа их на предмет присутствия маркеров, ассоциирующихся с тремя зародышевыми листками.
Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток могут быть кариотипированы с применением стандартного способа окрашивания с использованием красителя Гимза (G-banding) и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», т.е. эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений.
Источники плюрипотентных стволовых клеток
К типам плюрипотентных стволовых клеток, которые можно использовать, относятся устойчивые линии плюрипотентных клеток, получаемые из формируемой после вынашивания плода ткани, в том числе из преэмбриональной ткани (такой как бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент в ходе вынашивания, как правило, но не обязательно, до срока приблизительно 10-12 недель беременности. Примерами, не ограничивающими настоящее изобретение, являются стабильные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток или человеческих эмбриональных зародышевых клеток, например, клеточные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, H7 и H9 (WiCell). Также возможно использование описываемых в настоящей заявке составов в ходе первоначального установления или стабилизации таких клеток, в этом случае исходными клетками являются первичные плюрипотентные клетки, взятые напрямую из тканей-источников. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки мутантных линий эмбриональных стволовых клеток человека, таких как, например, BG01v (BresaGen, Атенс, Джорджия, США).
В одном варианте осуществления человеческие эмбриональные стволовые клетки готовятся, как описано Thomson et al. патент США № 5843780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995).
Культивирование плюрипотентных стволовых клеток
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки культивируют на слое питающих клеток, которые поддерживают плюрипотентные стволовые клетки в различных отношениях. Как вариант, полипотентные стволовые клетки культивируются в культуральной системе, по существу не содержащей питающих клеток, но, тем не менее, поддерживающей пролиферацию полипотентных стволовых клеток и не допускающей существенной дифференцировки. Рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды, кондиционированной посредством предварительного культивирования клеток иного типа. В качестве альтернативы рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды с химически определенным составом.
В одном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое фибробластов эмбриона мыши в соответствии со способами, изложенными в работе Reubinoff et al (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)). В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое фибробластов эмбриона мыши в соответствии со способами, изложенными в работе Thompson et al (Science 6, ноябрь 1998 г.: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145-1147). В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на любом из слоев питающих клеток, раскрытых в работе Richards et al, (Stem Cells 21: 546-556, 2003).
В одном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое клеток человека в соответствии со способами, изложенными в работе Wang et al (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005). В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем клеток человека, описанном в работе Stojkovic et al (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005). В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое клеток человека, описанном в работе Miyamoto et al (Stem Cells 22: 433-440, 2004). В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое клеток человека, описанном в работе Amit et al (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003). В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на питающем слое клеток человека, описанном в работе Inzunza et al (Stem Cells 23: 544-549, 2005).
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20020072117. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 6642048. В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в WO2005014799. В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в работе Xu et al (Stem Cells 22: 972-980, 2004). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20070010011. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050233446. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 6800480. В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, описанными в WO2005065354.
В одном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать по способам, описанным Cheon et al (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005). В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в работе Levenstein et al (Stem Cells 24: 568-574, 2006). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050148070. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050244962. В альтернативном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, описанными в WO2005086845.
Плюрипотентные стволовые клетки могут быть высеяны на соответствующий культуральный субстрат. В одном из вариантов осуществления соответствующим культуральным субстратом является компонент внеклеточного матрикса, такой как, например, полученный из базальной мембраны или тот, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с участием молекулы адгезивного слоя. В одном из вариантов осуществления подходящим культуральным субстратом является MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® представляет собой растворимый препарат из клеток опухоли Энгельбрета-Холма-Суорма, который при комнатной температуре превращается в гель и образует восстановленную базальную мембрану.
В качестве альтернативы можно использовать другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. В зависимости от типа пролиферирующих клеток, это может быть ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.п., по отдельности или в различных сочетаниях.
Плюрипотентные стволовые клетки могут высеиваться на субстрат с соответствующим распределением по поверхности и в присутствии среды, поддерживающей выживание, размножение и сохранение требуемых характеристик клеток. Все эти характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению клеток при посеве и могут быть определены специалистом в данной области.
Подходящая культуральная среда может быть изготовлена, например, из следующих компонентов модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), Gibco № 11965-092, нокаутная модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (KO DMEM), Gibco №10829-018, базовая среда Хэма F12/50% DMEM, 200 мм L-глутамина, Gibco № 15039-027; раствор неосновных аминокислот, Gibco 11140-050; β-меркаптоэтанол, Sigma № M7522; человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF), Gibco № 13256-029.
Формирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной панкреатической эндодермы, из плюрипотентных стволовых клеток
Настоящее изобретение представляет способы получения популяций клеток, экспресирующих маркеры, характерные для сформированной клеточной линии эндодермы, из популяций плюрипотентных стволовых клеток. В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способы дальнейшей дифференциации клеток, экспрессирующих маркеры линии эндокринных клеток поджелудочной железы. В одном варианте осуществления это достигается пошаговым протоколом дифференцирования, в котором популяции плюрипотентных стволовых клеток сначала дифференцируются в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для сформированного ростка эндодермы. Далее, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, дополнительно дифференцируются в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы. Далее, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, дополнительно дифференцируются в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы.
В настоящем изобретении представлена популяция клеток, в которой более 85% клеток экспрессирует маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы. Популяция клеток может подвергаться дальнейшей обработке для получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатической эндодермы. Популяция клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, можно дополнительно обрабатывать для получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток.
Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для желательного вида клеток.
Способы оценки экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. Сюда относятся количественная ревертазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Нозерн-блот, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001, доп.)), а также способы иммунологического анализа, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для маркеров, доступных в интактных клетках, - способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. К маркерам плюрипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или нескольких следующих маркеров: ABCG2, CRIPTO, FOXD3, Connexin43, Connexin45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.
После обработки плюрипотентных стволовых клеток с применением способов, составляющих предмет настоящего изобретения, дифференцированные клетки могут быть выделены путем воздействия на популяцию клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, например CXCR4, экспрессируемый клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.
К плюрипотентным стволовым клеткам, которые могут использоваться в настоящем изобретении, относятся, например, человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H9 (код NIH: WA09), человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1 (код NIH: WA01), человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H7 (код NIH: WA07) и человеческие эмбриональные стволовые клетки линии SA002 (Cellartis, Швеция). Также для использования в рамках настоящего изобретения подходят клетки, экспрессирующие, по меньшей мере, один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, и Tra 1-81.
Маркеры характерные для сформированной линии эндодермы выбираются из группы, содержащей SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок, FGF4, CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и Otx2. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая, как минимум, один из маркеров, характерных для линии сформированной эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку-предшественник первичной полоски. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой мезэндодермальную клетку. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку сформированной эндодермы.
Маркеры характерные для линии эндодермы поджелудочной железы, выбираются из группы, содержащей PDX1, NKX6.1, HNF1 beta, PTF1 alpha, HNF6, HNF4 alpha, SOX9, HB9 и PROX1. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая, как минимум, один из маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, представляет собой клетку панкреатической эндодермы.
Маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, выбирают из группы, состоящей из NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, NGN3 и PTF1 альфа. В одном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка способна к экспрессии, по меньшей мере, одного из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид. Соответствующей целям настоящего изобретения является клетка, экспрессирующая, по меньшей мере, один из маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. Панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, экспрессирующую гормоны. В альтернативном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, секретирующую гормоны.
В одном аспекте настоящего изобретения панкреатическая эндокринная клетка представляет собой клетку с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования β-клеток. Клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии β-клеток, экспрессирует PDX1 и, по меньшей мере, один из следующих транскрипционных факторов: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 бета, MAFA, PAX4 и PAX6. В одном аспекте настоящего изобретения клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования β-клеток, представляет собой β-клетку.
Формирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной панкреатической эндодермы, из плюрипотентных стволовых клеток
В одном аспекте настоящего изобретения популяции плюрипотентных стволовых клеток могут быть дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток на среде без сыворотки с добавлением БСА и фактора, выбранного из следующей группы: инсулин или IGF-1. В одном варианте осуществления дифференциация популяции плюрипотентных стволовых клеток в направлении популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии клеток сформированной эндодермы, достигается обработкой плюрипотентных стволовых клеток активином А и лигандом Wnt.
В альтернативном варианте осуществления дифференциация популяции плюрипотентных стволовых клеток в направлении популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, достигается обработкой плюрипотентных стволовых клеток GDF-8 и, по меньшей мере, одним из факторов, выбранных из следующей группы: анилин-пиридинотриазин, циклический анилин-пиридинотриазин, N-{[1-(фенилметил)азепан-4-ил]метил}-2-пиридин-3-илацетамид, 4-{[4-(4-{[2-(пиридин-2-иламино)этил]амино}-1,3,5-триазин-2-ил)пиридин-2-ил]окси}бутан-1-ол, 3-({3-[4-({2-[метил(пиридин-2-ил)амино]этил}амино)-1,3,5-триазин-2-ил]пиридин-2-ил}амино)пропан-1-ол, N~4~-[2-(3-фторфенил)этил]-N~2~-[3-(4-метилпиперазин-1-ил)пропил]пиридо[2,3-d]пиримидин-2,4-диамин, 1-метил-N-[(4-пиридин-3-ил-2-{[3-(трифторметил)фенил]амино}-1,3-тиазол-5-ил)метил]пиперидин-4-карбоксамид, 1,1-диметилэтил {2-[4-({5-[3-(3-гидроксипропил)фенил]-4H-1,2,4-триазол-3-ил}амино)фенил]этил}карбамат, 1,1-диметилэтил {[3-({5-[5-(3-гидроксипропил)-2-(метилокси)фенил]-1,3-оксазол-2-ил}амино)фенил]метил}карбамат, 1-({5-[6-({4-[(4-метилпиперазин-1-ил)сульфонил]фенил}амино)пиразин-2-ил]тиофен-2-ил}метил)пиперидин-4-ол, 1-({4-[6-({4-[(4-метилпиперазин-1-ил)сульфонил]фенил}амино)пиразин-2-ил]тиофен-2-ил}метил)пиперидин-4-карбоксамид и 2-{[4-(1-метилэтил)фенил]амино}-N-(2-тиофен-2-илэтил)-7,8-дигидропиридо[4,3-d]пиримидин-6(5H)-карбоксамид. Примеры факторов, подходящих для использования, можно найти в патентной заявке США сер. № 12/494789. В одном варианте осуществления, по меньшей мере, один из факторов представляет собой 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-он.
Популяция плюрипотентных клеток может культивироваться в бессывороточной среде с добавлением БСА и фактора, выбранного из группы, включающей: IGF-1 от приблизительно одних суток до приблизительно семи суток. Альтернативно, популяция плюрипотентных клеток может культивироваться в бессывороточной среде с добавлением БСА и фактора, выбранного из группы, включающей: IGF-1, от приблизительно одних суток до приблизительно шести суток. Альтернативно, популяция плюрипотентных клеток может культивироваться в бессывороточной среде с добавлением БСА и фактора, выбранного из группы, включающей: IGF-1, от приблизительно одних суток до приблизительно пяти суток. Альтернативно, популяция плюрипотентных клеток может культивироваться в бессывороточной среде с добавлением БСА и фактора, выбранного из группы, включающей: IGF-1, от приблизительно одних суток до приблизительно четырех суток. Альтернативно, популяция плюрипотентных клеток может культивироваться в бессывороточной среде с добавлением БСА и фактора, выбранного из группы, включающей: инсулин и IGF-1, от приблизительно одних суток до приблизительно четырех суток.
В одном из вариантов осуществления GDF-8 используется в концентрации от приблизительно 5 нг/мл до приблизительно 500 нг/мл. В альтернативном варианте осуществления GDF-8 используется в концентрации от приблизительно 5 нг/мл до приблизительно 50 нг/мл. В альтернативном варианте осуществления GDF-8 используется в концентрации от приблизительно 5 нг/мл до приблизительно 25 нг/мл. В альтернативном варианте осуществления GDF-8 используется в концентрации приблизительно 25 нг/мл.
Активин-А может использоваться в концентрациях от приблизительно 1 пг/мл до приблизительно 100 мкг/мл. В альтернативном варианте осуществления концентрация может составлять от примерно 1 пг/мл до примерно 1 мкг/мл. В другом альтернативном варианте осуществления концентрация может составлять от примерно 1 пг/мл до примерно 100 нг/мл. В другом альтернативном варианте осуществления концентрация может составлять от приблизительно 1 пг/мл до приблизительно 100 нг/мл. В другом альтернативном варианте осуществления концентрация может составлять примерно 100 нг/мл.
Лиганд Wnt может выбираться из группы, состоящей из Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-5a и Wnt-7a. В одном варианте осуществления лиганд Wnt представляет собой Wnt-1. В альтернативном варианте осуществления лиганд Wnt представляет собой Wnt-3a.
Лиганд Wnt может использоваться в концентрации от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 1000 нг/мл. В альтернативном варианте осуществления лиганд Wnt может использоваться в концентрации от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл. В одном варианте осуществления лиганд Wnt используется в концентрации приблизительно 20 нг/мл.
В одном из вариантов осуществления инсулин используется в концентрации от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл.
В одном из вариантов осуществления IGF-1 используется в концентрации от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 200 нг/мл.
Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы
В одном варианте осуществления изобретения популяция клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, полученные методами настоящего изобретения, далее дифференцируют в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы любым известным способом.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, полученные по способам настоящего изобретения, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, представленными в работе D’ Amour et al., Nature Biotechnology, 24, 1392-1401 (2006)
Например, популяции клеток экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, полученные по способам настоящего изобретения, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, представленными в патентной заявке США сер. № 11/736908.
Создание клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток
В одном варианте осуществления популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, дополнительно дифференцируются в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, с использования любого способа, известного специалистам в данной области.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, представленными в работе D’Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, представленными в работе D’Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут далее дифференцироваться в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндокринных панкреатических клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии с методами, описанными в патентной заявке США сер. № 11/736908.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут далее дифференцироваться в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндокринных панкреатических клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, описанными в патентной заявке США сер. № 11/779311.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут далее дифференцироваться в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндокринных панкреатических клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, описанными в патентной заявке США сер. № 60/953178.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут далее дифференцироваться в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндокринных панкреатических клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, описанными в патентной заявке США сер. № 60/990529.
Настоящее изобретение далее иллюстрируется, помимо прочих, следующими примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Роль инсулина в дифференциации человеческих плюрипотентных клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы: Посев клеточных скоплений
Предыдущие исследования показали, что высокие концентрации фетальной бычьей сыворотки (ФБС) пагубны для формирования сформированной эндодермы (СЭ) из эмбриональных стволовых клеток. См., например, D’Amour et al., Nature Biotechnology, 2005, где индукция образования сформированной эндодермы из человеческих эмбриональных клеток значительно усиливалась при снижении концентрации ФБС с 10% до 0,5-2%. В других работах описаны сходные наблюдения, когда добавление 25 нг/мл IGF или 200 нг/мл инсулина к 2% ФБС при культуре эмбриональных стволовых клеток на MEF-CM (среда, кондиционированная мышиными фибробластами) уменьшало экспрессию SOX17 после обработки активином А примерно на 70%. См. McLean et al, Stem Cells 25:29-38, 2007.
Наблюдаемое ингибирующее действие, вероятно, было обусловлено присутствием инсулина или IGF в ФБС, что способствовало пути фосфатидилинозит-3-киназы. См. McLean et al, Stem Cells 25:29-38, 2007. Блокада сигнального пути PI-3 киназы увеличивает процент Sox17-положительных клеток среди человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивируемых в среде MEF-CM (среда, кондиционированная эмбриональными фибробластами мыши). См. McLean et al, Stem Cells 25:29-38, 2007.
Эти данные позволяют предположить, что добавление даже 25 нг/мл IGF или 200 нг/мл инсулина к среде, содержащей активин A и низкую концентрацию ФБС (0,5-2%), будет блокировать образование сформированной эндодермы. Типичные концентрации IGF и инсулина в ФБС - приблизительно 70 нг/мл (J. Clin. Invest. 76:4, 1985) и приблизительно 60 нг/мл (In Vitro Cell Dev Biol. 32:8-12, 1996), соответственно. Это переводится в примерно 1,4 нг/мл IGF и приблизительно 1,2 нг/мл инсулина в 2% ФБС.
Стволовые клетки человеческой эмбриональной линии H1 (p40-p52) культивировали на чашках, покрытых субстратом MATRIGEL®(разведение 1:30) (BD Biosciences; Кат. № 356231) в среде MEF-CM (седа, кондиционированная мышиными эмбриональными фибробластами) с добавлением 16 нг/мл FGF2 (кат. № 100-18B, PeproTech, NJ) и дифференцировали в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, следующим образом:
a. Среда RPMI с добавлением 2% БСА без жирных кислот (Кат. № 68700, Proliant, Айова) и 100 нг/мл активина A (R&D Systems, Миннесота)+20 нг/мл WNT-3a (Кат. № 1324-WN-002, R&D Systems, Миннесота) одни сутки, затем
b. Среда RPMI с 2% БСА и 100 нг/мл активина А еще трое суток.
В некоторых культурах клетки обрабатывали следующими разведениями ITS-X (кат № 51500-056, Invitrogen, Калифорния): 0, 1:106, 1:5×105, 1:105, 1:104. ITS-X представляет собой заменитель сыворотки, содержащий 1 мг/мл инсулина, 0,55 мг/мл трансферрина, 0,00067 мг/мл натрия селенита и 0,2 мг/мл этаноламина. Диапазон разведений ITS-X соответствовал 0, 2, 10 и 100 нг/мл инсулина. В качестве контроля использовали 0,2% ФБС (Кат. № SH30070.03, Hyclone, Юта) в первый день дифференциации, 0,5% ФБС на 2 день и 2% ФБС на 3-4 дни. В культуры с добавлением ФБС не добавляли ITS-X.
На 4 день отбирали пробы для флуоресцентной проточной цитометрии и анализа генной экспрессии методом ПЦР в реальном времени. Удивительно, см. фиг. 1, что добавление 1-100 нг/мл инсулина к среде, использовавшейся для дифференциации клеток, значительно не влияло на экспрессию маркеров сформированной эндодермы (FOXA2, SOX17 и CXCR4), маркеров мезенхимы (T, также известный как Brach) или экстраэмбриональных маркеров (SOX7, AFP). Кроме того, культуры на средах с добавлением 2% БСА значительно лучше экспрессировали маркеры, связанные со сформированной эндодермой, чем культуры на среде с добавлением 0,5-2% ФБС.
Эти наблюдения были далее подтверждены экспрессией CXCR4 и CD9 по результатам флуоресцентной проточной цитометрии на средах разного состава. См. фиг. 2. Ранее было показано, что рецептор клеточной поверхности CXCR4 является маркером сформированной эндодермы. CD9 представляет собой маркер недифференцированных эмбриональных стволовых клеток. Следовательно, усиление экспрессии CXCR4 и ослабление экспрессии CD9 в популяции клеток показательно для формирования сформированной эндодермы. Как показано в таблице I, в клетках на среде с добавлением БСА не было отмечено изменений экспрессии CXCR4 или CD9 ни при одной из исследованных концентраций инсулина. Эти данные позволяют предположить, что инсулин не обладает ингибирующим действием в исследованных концентрациях в питательных средах, использовавшихся в данном исследовании.
Таблица I
Обработка % CXCR4+CD9- % CXCR4-CD9+ % CXCR4-CD9-
ФБС 56 27 9
БСА 69 13 13
БСА+1 нг/мл инсулина 70 13 10
БСА+5 нг/мл инсулина 67 15 12
БСА+10 нг/мл инсулина 69 13 13
БСА+100 нг/мл инсулина 73 12 9
Пример 2
Роль инсулина в дифференциации человеческих плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы: Посев одиночных клеток
Стволовые клетки человеческой эмбриональной линии H1 (p40-p52) высевали поодиночке из суспензии с концентрацией 100000 кл./см2 на чашки, покрытые субстратом MATRIGEL® (разведение 1:30) (BD Biosciences; Кат. № 356231) в среду MEF-CM (среда, кондиционированная мышиными эмбриональными фибробластами) с добавлением 16 нг/мл FGF2 (Кат. № 100-18B, PeproTech, NJ) и 10 мкМ Y27632 (ингибитор Rock, Кат. № Y0503, Sigma, Миссури). Через 72 ч после посева культуры дифференцировали в сформированную эндодерму (СЭ) следующим образом:
a. Среда MCDB-131 (Кат. № 10372-019, Invitrogen, Калифорния) с 2% БСА без жирных кислот (Кат. № 68700, Proliant, Айова), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (Кат. № S3187, Sigma, Миссури), 1X ГлутаМакса™ (Кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния), 100 нг/мл активина A (RD plusSystems, Миннесота), 20 нг/мл WNT-3a (Кат. № 1324-WN-002, RD Systems, Миннесота) в течение суток, затем
b. Среда MCDB-131 с 2% БСА, бикарбонатом натрия, Глутамаксом и 100 нг/мл активина A в течение следующих 3 суток.
К некоторым культурам добавляли следующие концентрации инсулина (Кат. № I9278, Sigma, Миссури): 0, 1, 10, 100, 1000 или 10000 нг/мл На 4 день отбирали пробы для флуоресцентной проточной цитометрии и анализа генной экспрессии методом ПЦР в реальном времени.
Добавление 1-100 нг/мл инсулина к среде для дифференциации клеток значительно не влияло на экспрессию маркеров, характерных для сформированной эндодермы (FOXA2, SOX17, CER1 и CXCR4). Сходным образом, экспрессия эмбриональных маркеров (NANOG) или экстраэмбриональных маркеров (SOX7, AFP) также не изменялась. См. фиг. 3. Однако добавление 1-10 мкг/мл инсулина усиливало экспрессию NANOG. Эти данные дополнительно подтверждены иммунофлуоресцентным окрашиванием на маркер сформированной эндодермы SOX17 (кат. № AF1924, R&D systems, Миннесота) (фиг. 4).
На фиг. 5 показаны графики экспрессии CXCR4 и CD9 в средах разного состава по результатам флуоресцентной проточной цитометрии. Как показано в таблице II, только при наивысшей концентрации инсулина(1-10 мкг/мл) наблюдалось снижение процентного содержания клеток CXCR4+CD9 и усиление экспрессии фракции CXCR4-CD9. Эти данные позволяют предположить, что в условиях настоящего исследования только концентрации инсулина больше физиологических подавляют образование клеток сформированной эндодермы.
Таблица II
Обработка % CXCR4+CD9- % CXCR4-CD9+ % CXCR4-CD9-
БСА 96 1,3 0,9
БСА+1 нг/мл инсулина 96 1,5 0,7
БСА+10 нг/мл инсулина 95 1,4 0,7
БСА+100 нг/мл инсулина 90 4,1 2
БСА+1 мкг/мл инсулина 90 3,6 2,2
БСА+10 мкг/мл инсулина 84 6,6 4,7
Пример 3
Роль IGF в дифференциации человеческих плюрипотентных клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы: Посев одиночных клеток
Стволовые клетки человеческой эмбриональной линии H1 (p40-p52) высевали на среду одиночно из суспензии с концентрацией 100000 кл./см2 на чашки, покрытые субстратом MATRIGEL® (разведение 1:30) (BD Biosciences; Кат. № 356231) в среду MEF-CM (среда, кондиционированная мышиными эмбриональными фибробластами) с добавлением 16 нг/мл FGF2 (Кат. № 100-18B, PeproTech, NJ) и 10 мкМ Y27632 (ингибитор Rock, Кат. № Y0503, Sigma, Миссури). Через 72 ч после посева культуры дифференцировали в сформированную эндодерму (СЭ) следующим образом:
a. Среда MCDB-131 (Кат. № 10372-019, Invitrogen, Калифорния) с добавлением 2% БСА без жирных кислот (Кат. № 68700, Proliant, Айова), 0,0025 г/мл бикарбоната (кат. № S3187, Sigma, Миссури), 1X ГлутаМакса™ (кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния) и 100 нг/мл GDF8 (Кат. № 120-00, PeproTech, NJ)+2,5 мкМ ингибитора GSK3B 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-он в течение суток, затем
b. Среда MCDB-131 с добавлением 2% БСА, натрия бикарбоната, Глутамакса и 10 нг/мл GDF-8 еще трое суток.
К некоторым культурам добавляли следующие концентрации IGF (Кат. № AF100, PeproTech Нью Джерси): 0, 1, 10, 50 или 200 нг/мл. В качестве контроля вместо БСА использовали 0,2 ФБС (Кат. № SH30070.03, Hyclone, Юта) в первые сутки дифференциации и 2% ФБС на 2-4 сутки. К некоторым культурам с ФБС также добавляли разные концентрации IGF.
На 4 день отбирали пробы для флуоресцентной проточной цитометрии и анализа генной экспрессии методом ПЦР в реальном времени.
Удивительно, что добавление 1-200 нг/мл IGF к культурам с БСА незначительно не влияло на экспрессию маркеров сформированной эндодермы (FOXA2, SOX17, CER1 и CXCR4) при сравнении с контрольными образцами без добавления IGF (Фиг. 6). Сходные результаты наблюдались с экстраэмбриональными маркерами (SOX7, AFP). Добавление 50-200 нг/мл IGF не усиливало экспрессию эмбрионального маркера NANOG.
Культуры на средах с добавлением ФБС были намного чувствительнее к ингибирующему действию IGF. В этих культурах экспрессия SOX17, HNF3B и CXCR4 уменьшалась с повышением концентрации IGF. Эти наблюдения дополнительно подтверждены иммунофлуоресцентным окрашиванием на маркер сформированной эндодермы SOX17 (кат № AF1924, R&D systems, Миннесота) (Фиг. 8-9).
Как кратко представлено в таблице III, только концентрации IGF, превышающие физиологические (50-200 нг/мл) в культурах с добавлением БСА, вызывали снижение экспрессии CXCR4+CD9- и повышение экспрессии фракции CXCR4-CD9+. Однако с повышением доз IGF в культурах с добавлением ФБС показано более значительное падение экспрессии CXCr4+CD9- по сравнению с культурами с добавлением БСА. Все вышеописанные примеры показывают, что в отсутствии ФБС физиологические концентрации IGF или инсулина не оказывают ингибирующего действия на индукцию маркеров СЭ.
Таблица III
Обработка % CXCR4+CD9- % CXCR4-CD9+ % CXCR4-CD9-
БСА 92 0,9 2,6
ФБС 93 2,7 5,9
БСА+1 нг/мл IGF 92 0,8 3
ФБС+1 нг/мл IGF 89 3 3,6
БСА+10 нг/мл IGF 90 1,3 5,3
ФБС+10 нг/мл IGF 87 6,4 3,3
БСА+50 нг/мл IGF 87 6 3,5
ФБС+50 нг/мл IGF 78 6,8 13,2
БСА+200 нг/мл IGF 79 10 8
ФБС+200 нг/мл IGF 70 13,4 12,9
Пример 4
Концентрации IGF в разных партиях ФБС
Исследование проводили с помощью набора для определения IGF-1 производства Diagnostic Systems Laboratories (DSL) (кат. № DSL-10-2800). Для исследования брали 20 мкл предварительно обработанной сыворотки (в двух повторностях). Для анализа среды использовали 20 μл пробы непосредственно. Исследование проводили по инструкции к набору. Набор позволяет обнаруживать и человеческий, и бычий IGF-1, так как содержит 2 моноклональных антитела к гомологичным пептидным последовательностям.
Опытные образцы. Использовали следующие образцы:
4А/5А; Сыворотка новорожденных телят Hyclone; Партия AKM12868;
4B/5B:ФБС NIH (из аликвот, хранившихся при -20°С)
4/5C: Сыворотка новорожденных телят Hyclone, партия:
ATK33398: 4D/5D: Сыворотка новорожденных телят Hyclone, партия:
AUK 54924
4Е/5Е: Человеческая сыворотка, лот:.
A70184, производства Valley Biomedical Inc.
4F/5F: Нокаутная сыворотка: Invitrogen, партия:
557914 4F/5F: F12 DMEM, инвиторген, партия:
692281: 4Н/5Н: Кондиционирующая среда MEF, партия:
011410 (день 5)
Контрольные образцы: Использовались следующие контрольные образцы: Основные: 0” IGF-1 (отрицательный контроль, из набора).
Образец F12, указанный выше, также служил отрицательным контролем. 2 положительных контроля (127 нг/мл и 241 нг/мл; из набора). Результаты: Чувствительность метода анализа сыворотки была более 10 нг/мл, а для среды - более 0,1 нг/мл.
Известные положительные пробы (нг/мл) Концентрация, определенная при анализе (нг/мл) SE
127 нг/мл 126,8 8,2
241 нг/мл 233,8 4,2
Повторности Образцы IGF-1 (нг/мл) SE
4А/5А Сыворотка новорожденного теленка Hyclone; Партия AKM12868 29,78 0,41
4B/5B NIH-ФБС (аликвоты хранились при -20°C) 49,16 2,68
4C/5C ФБС Hyclone, партия: АТК 33398 80,29 5,39
4D/5D ФБС Hyclone, партия: ФГЛ 54924 76,45 1,99
4E/5E Человеческая сыворотка, партия: A70184, производства Valley Biomedical Inc. 55,65 2,28
4F/5F Сыворотка нокаутных животных; Invitrogen, партия: 557914 12,07 0,15
4G/5G F12 DMEM, Invitrogen, партия: 692281 ND* ND
4H/5H Кондиционирующая среда MEF, партия: 011410 (день 5) 1,33** 0,07
Пример 5
Роль инсулина/IGF и ФБС в дифференциации человеческих плюрипотентных клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы: Посев одиночных клеток
Стволовые клетки человеческой эмбриональной линии H1 (p40-p52) высевали одиночно из суспензии с концентрацией 100000 кл./см2 на чашки, покрытые субстратом MATRIGEL® (разведение 1:30) (BD Biosciences; Кат. № 356231) в среду MEF-CM (среда, кондиционированная мышиными эмбриональными фибробластами) с добавлением 16 нг/мл FGF2 (Кат. № 100-18B, PeproTech, NJ) и 10 μM Y27632 (ингибитор Rock, Кат. № Y0503, Sigma, Миссури). Через 72 ч после посева культуры дифференцировали в сформированную эндодерму (СЭ) следующим образом:
а. Среда MCDB-131 (кат. № 10372-019, Invitrogen, Калифорния) с добавлением 0,2% ФБС (кат. № SH30070.03, Hyclone, Юта), 0,0025 г/мл натрия бикарбоната (кат. № S3187, Sigma, Миссури), 1X ГлутаМакса™ (кат. № 35050-079, Invitrogen, Калифорния) и 100 нг/мл GDF8 (кат. № 120-00, PeproTech, Нью Джерси)+2,5 мкМ ингибитора GSK3B 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазотетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-она в течение суток, затем b.среда MCDB-131 с добавлением ФБС, натрия бикарбоната, Глутамакс и 10 нг/мл GDF8 еще трое суток.
На вторые сутки использовали 0,5% ФБС, а на 3-4 сутки 2% ФБС. Кроме обычной ФБС, также исследовали термообработанную ФБС (кат. № F4135, Sigma, Миссури) и ФБС, очищенную активированным углем (кат. № F6765, Sigma, Миссури).
К некоторым из культур с добавлением ФБС также добавляли различные концентрации IGF (10-100 нг/мл или инсулина (10-100 нг/мл). На 4 день отбирали пробы для анализа методом флуоресцентной проточной цитометрии и ПЦР в реальном времени. В отличие от культур с добавлением БСА (см. предыдущие примеры) в присутствии ФБС, добавление инсулина или IGF снижало экспрессию SOX17 и CCXR4 в зависимости от дозы. См. фиг. 9. Экспрессия маркера плюрипотентности NANOG также ингибировалась. Хотя различные аспекты изобретения иллюстрируются выше ссылками на примеры и предпочтительные варианты осуществления, подразумевается, что область изобретения ограничивается не упомянутым выше описанием, а следующими пунктами формулы изобретения, составленными в соответствии с принципами патентного законодательства.

Claims (22)

1. Способ получения популяции клеток, в которой более 85% клеток экспрессируют маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, включающий следующие стадии:
a) культивирование популяции человеческих эмбриональных стволовых клеток линии H1;
b) дифференцирование популяции человеческих эмбриональных стволовых клеток линии H1 в популяцию клеток, в которой более 85% экспрессирует маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы в бессывороточной среде с добавлением: (а) БСА, (b) либо (i) GDF-8 и 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазотетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-она, либо (ii) активина А и лиганда Wnt; и (с) фактора, выбранного из группы, состоящей из инсулина и IGF-1, где инсулин представлен в концентрации от 1 нг/мл до 100 нг/мл и IGF-1 представлен в концентрации от 1 нг/мл до 200 нг/мл.
2. Способ по п.1, в котором популяция человеческих эмбриональных стволовых клеток линии H1 дифференцируется в среде без сыворотки с добавлением БСА и фактора, выбранного из группы, состоящей из инсулина и IGF-1, не менее 6 суток.
3. Способ по п.1, в котором популяция человеческих эмбриональных стволовых клеток линии H1 дифференцируется в среде без сыворотки с добавлением БСА и фактора, выбранного из группы, содержащей инсулин и IGF-1, не менее 7 суток.
4. Способ по п.1, в котором фактором является инсулин.
5. Способ по п.1, в котором фактором является IGF-1.
6. Способ по п.1, в котором популяция человеческих эмбриональных стволовых клеток линии H1 дифференцируется в среде без сыворотки с добавлением БСА, GDF-8, 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазотетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-она и фактора, выбранного из группы, состоящей из инсулина и IGF-1.
7. Способ по п.6, в котором фактором является инсулин.
8. Способ по п.6, в котором фактором является IGF-1.
9. Способ получения популяции клеток, в которой более 85% клеток экспрессируют маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, включающий дифференцирование популяции человеческих эмбриональных стволовых клеток линии H1 в популяцию клеток, в которой более 85% экспрессирует маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в бессывороточной среде с добавлением: (а) БСА, (b) либо (i) GDF-8 и 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазотетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-она, либо (ii) активина А и лиганда Wnt; и (с) фактора, выбранного из группы, состоящей из инсулина и IGF-1, где инсулин представлен в концентрации от 1 нг/мл до 100 нг/мл и IGF-1 представлен в концентрации от 1 нг/мл до 200 нг/мл.
10. Способ по п.9, в котором фактором является инсулин.
11. Способ по п.9, в котором фактором является IGF-1.
12. Способ по п.9, в котором популяция человеческих эмбриональных стволовых клеток линии H1 дифференцируется в бессывороточной среде с добавлением БСА, GDF-8, 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазотетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-она, и фактора, выбранного из группы, состоящей из инсулина и IGF-1.
13. Способ по п.12, в котором фактором является инсулин.
14. Способ по п.12, в котором фактором является IGF-1.
15. Способ получения популяции клеток линии сформированной эндодермы, включающий культивирование популяции человеческих эмбриональных стволовых клеток линии H1 в бессывороточной среде с дополнением: (а) БСА; b) либо (i) GDF-8 и 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазотетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-она, либо (ii) активина А и лиганда Wnt; и (с) фактора, выбранного из группы, состоящей из инсулина и IGF-1.
16. Способ по п.15, в котором фактором является инсулин.
17. Способ по п.15, в котором фактором является IGF-1.
18. Способ по п.15, отличающийся тем, что способ включает культивирование популяции человеческих эмбриональных стволовых клеток линии H1 в бессывороточной среде, с дополнением БСА, GDF-8, 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазотетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-она и фактора, выбранного из группы, состоящей из инсулина и IGF-1.
19. Способ по п.18, в котором фактором является инсулин.
20. Способ по п.18, в котором фактором является IGF-1.
RU2013114375A 2010-08-31 2011-08-17 Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека RU2627168C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37847210P 2010-08-31 2010-08-31
US61/378,472 2010-08-31
PCT/US2011/048129 WO2012030539A2 (en) 2010-08-31 2011-08-17 Differentiation of human embryonic stem cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2013114375A RU2013114375A (ru) 2014-10-10
RU2627168C2 true RU2627168C2 (ru) 2017-08-03

Family

ID=45697775

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2013114375A RU2627168C2 (ru) 2010-08-31 2011-08-17 Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека

Country Status (16)

Country Link
US (2) US9528090B2 (ru)
EP (3) EP2611910B1 (ru)
JP (1) JP6218605B2 (ru)
KR (1) KR101836850B1 (ru)
CN (2) CN103154239B (ru)
AR (1) AR082820A1 (ru)
AU (1) AU2011296382B2 (ru)
BR (1) BR112013004514A2 (ru)
CA (1) CA2809303C (ru)
ES (2) ES2658146T3 (ru)
HK (1) HK1243729A1 (ru)
MX (1) MX355077B (ru)
PL (2) PL2611910T3 (ru)
RU (1) RU2627168C2 (ru)
SG (2) SG10201506852VA (ru)
WO (1) WO2012030539A2 (ru)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9080145B2 (en) 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
EP2610336A1 (en) 2007-07-31 2013-07-03 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
CA2729121C (en) 2008-06-30 2019-04-09 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
MX2011004563A (es) * 2008-10-31 2011-06-01 Centocor Ortho Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas al linaje endocrino pancreatico.
WO2011079017A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
ES2902650T3 (es) 2011-06-21 2022-03-29 Novo Nordisk As Inducción eficiente de endodermo definitivo a partir de células madre pluripotentes
CN105143446B (zh) 2011-12-22 2020-11-03 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞分化成单一激素胰岛素阳性细胞
RU2018108850A (ru) 2012-06-08 2019-02-26 Янссен Байотек, Инк. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в панкреатические эндокринные клетки
WO2014106141A1 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Janssen Biotech, Inc. Suspension and clustering of human pluripotent cells for differentiation into pancreatic endocrine cells
US10138465B2 (en) 2012-12-31 2018-11-27 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells using HB9 regulators
US10370644B2 (en) 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
EP3569694A1 (en) 2013-06-11 2019-11-20 President and Fellows of Harvard College Sc-beta cells and compositions and methods for generating the same
CA2928639A1 (en) * 2013-11-01 2015-05-07 Janssen Biotech, Inc. Suspension and clustering of human pluripotent stem cells for differentiation into pancreatic endocrine cells
EP3234110B1 (en) 2014-12-18 2024-02-28 President and Fellows of Harvard College METHODS FOR GENERATING STEM CELL-DERIVED ß CELLS AND USES THEREOF
US10443042B2 (en) 2014-12-18 2019-10-15 President And Fellows Of Harvard College Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof
CN107614678B (zh) 2014-12-18 2021-04-30 哈佛学院校长同事会 干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法
MA45479A (fr) 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
JP7428653B2 (ja) 2017-11-15 2024-02-06 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 島細胞製造組成物および使用方法
WO2019208713A1 (ja) * 2018-04-26 2019-10-31 国立大学法人東京工業大学 多能性幹細胞の分化促進方法
JP7370600B2 (ja) * 2018-08-03 2023-10-30 オリヅルセラピューティクス株式会社 細胞製造法
EP3833365A4 (en) 2018-08-10 2022-05-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated ISLE DIFFERENTIATION DERIVED FROM STEM CELLS
US20200080107A1 (en) 2018-09-07 2020-03-12 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
WO2020243663A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
CN114401752B (zh) 2019-05-31 2023-04-04 W.L.戈尔及同仁股份有限公司 具有受控氧扩散距离的细胞封装装置
CN114173837A (zh) 2019-05-31 2022-03-11 W.L.戈尔及同仁股份有限公司 生物相容性膜复合材料
WO2020243666A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
CA3150235A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Alireza Rezania UNIVERSAL DONOR CELLS
CA3150233A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Alireza Rezania UNIVERSAL DONOR CELLS
US11566230B2 (en) 2020-12-31 2023-01-31 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009012428A2 (en) * 2007-07-18 2009-01-22 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
US7510876B2 (en) * 2003-12-23 2009-03-31 Cythera, Inc. Definitive endoderm
RU2359030C1 (ru) * 2008-03-19 2009-06-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (варианты)
US20090298178A1 (en) * 2008-06-03 2009-12-03 D Amour Kevin Allen Growth factors for production of definitive endoderm
US20090304642A1 (en) * 2005-10-24 2009-12-10 Agency For Science, Technology And Research Methods of specifying mesodermal, endodermal and mesoendodermal cell fates
US20100124781A1 (en) * 2008-11-20 2010-05-20 Shelley Nelson Pluripotent Stem Cell Culture on Micro-Carriers
RU2392315C2 (ru) * 2003-10-03 2010-06-20 Кейити ФУКУДА Способ индукции дифференциации стволовых клеток в миокардиальные
WO2010096496A2 (en) * 2009-02-17 2010-08-26 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of neural conversion of human embryonic stem cells

Family Cites Families (221)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3209652A (en) 1961-03-30 1965-10-05 Burgsmueller Karl Thread whirling method
AT326803B (de) 1968-08-26 1975-12-29 Binder Fa G Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben
US3935067A (en) 1974-11-22 1976-01-27 Wyo-Ben Products, Inc. Inorganic support for culture media
CA1201400A (en) 1982-04-16 1986-03-04 Joel L. Williams Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture
US4499802A (en) 1982-09-29 1985-02-19 Container Graphics Corporation Rotary cutting die with scrap ejection
US4537773A (en) 1983-12-05 1985-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid derivatives
US4557264A (en) 1984-04-09 1985-12-10 Ethicon Inc. Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene
US5089396A (en) 1985-10-03 1992-02-18 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US5215893A (en) 1985-10-03 1993-06-01 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US4737578A (en) 1986-02-10 1988-04-12 The Salk Institute For Biological Studies Human inhibin
US5863531A (en) 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
US5804178A (en) 1986-11-20 1998-09-08 Massachusetts Institute Of Technology Implantation of cell-matrix structure adjacent mesentery, omentum or peritoneum tissue
US5567612A (en) 1986-11-20 1996-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making
CA1340581C (en) 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
NZ229354A (en) 1988-07-01 1990-09-26 Becton Dickinson Co Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface
EP0363125A3 (en) 1988-10-03 1990-08-16 Hana Biologics Inc. Proliferated pancreatic endocrine cell product and process
US5837539A (en) 1990-11-16 1998-11-17 Osiris Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells
US5449383A (en) 1992-03-18 1995-09-12 Chatelier; Ronald C. Cell growth substrates
GB9206861D0 (en) 1992-03-28 1992-05-13 Univ Manchester Wound healing and treatment of fibrotic disorders
CA2114282A1 (en) 1993-01-28 1994-07-29 Lothar Schilder Multi-layered implant
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
JP2813467B2 (ja) 1993-04-08 1998-10-22 ヒューマン・セル・カルチャーズ・インコーポレーテッド 細胞培養法および培地
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
GB9310557D0 (en) 1993-05-21 1993-07-07 Smithkline Beecham Plc Novel process and apparatus
TW257671B (ru) 1993-11-19 1995-09-21 Ciba Geigy
US6001647A (en) 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
US6703017B1 (en) 1994-04-28 2004-03-09 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US5834308A (en) 1994-04-28 1998-11-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans
US6083903A (en) 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
CN1075387C (zh) 1994-12-29 2001-11-28 中外制药株式会社 含有il－6拮抗剂的抗肿瘤剂的作用增强剂
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US5718922A (en) 1995-05-31 1998-02-17 Schepens Eye Research Institute, Inc. Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation
US5908782A (en) 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
KR100568438B1 (ko) 1997-04-24 2006-04-07 오르토-맥네일 파마슈티칼, 인코퍼레이티드 염증성 질환의 치료에 유용한 치환된 이미다졸, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
CA2294944A1 (en) 1997-07-03 1999-01-14 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells from peripheral blood
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
EP1015576B1 (en) 1997-09-16 2005-05-04 Egea Biosciences, LLC Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes
WO1999020741A1 (en) 1997-10-23 1999-04-29 Geron Corporation Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells
CO4980885A1 (es) 1997-12-29 2000-11-27 Ortho Mcneil Pharm Inc Compuestos de trifenilpropanamida utiles en el tratamiento de inflamaciones y metodos para preparar dicho compuesto
DE69929681T2 (de) 1998-03-18 2006-10-26 Osiris Therapeutics, Inc. Mesenchymale stammzellen für die prävention und behandlung von immunantworten bei transplantationen
MY132496A (en) 1998-05-11 2007-10-31 Vertex Pharma Inhibitors of p38
US6413773B1 (en) 1998-06-01 2002-07-02 The Regents Of The University Of California Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6610540B1 (en) 1998-11-18 2003-08-26 California Institute Of Technology Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells
US6413556B1 (en) 1999-01-08 2002-07-02 Sky High, Llc Aqueous anti-apoptotic compositions
US6458593B1 (en) 1999-01-21 2002-10-01 Vitro Diagnostics, Inc. Immortalized cell lines and methods of making the same
US6815203B1 (en) 1999-06-23 2004-11-09 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of making pancreatic islet cells
US6306424B1 (en) 1999-06-30 2001-10-23 Ethicon, Inc. Foam composite for the repair or regeneration of tissue
US6333029B1 (en) 1999-06-30 2001-12-25 Ethicon, Inc. Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue
EP1224259A4 (en) 1999-09-27 2005-04-27 Univ Florida INVERSION OF INSULIN DEPENDENT DIABETES BY ISOLATED STEM CELLS, PROGENITOR ISLANDIC CELLS, AND INSULAR TYPE STRUCTURES
US6685936B2 (en) 1999-10-12 2004-02-03 Osiris Therapeutics, Inc. Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation
US20030082155A1 (en) 1999-12-06 2003-05-01 Habener Joel F. Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
AU778155B2 (en) 1999-12-13 2004-11-18 Scripps Research Institute, The Markers for identification and isolation of pancreatic islet alpha and beta cell progenitors
US7005252B1 (en) 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US7439064B2 (en) 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
US6436704B1 (en) 2000-04-10 2002-08-20 Raven Biotechnologies, Inc. Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
EP1302534A4 (en) 2000-06-26 2004-06-16 Renomedix Inst Inc CELL FRACTIONS CONTAINING CELLS CAPABLE OF DIFFERENCING INTO NEURAL CELLS
EP2404603A1 (en) 2000-10-23 2012-01-11 Glaxosmithkline LLC Novel trisubstituted-8H-pyrido[2,3-d]pyrimidin-7-one compounds for the treatment of CSBP/p38 kinase mediated diseases
US6849643B2 (en) 2000-12-08 2005-02-01 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Indazolyl-substituted pyrroline compounds as kinase inhibitors
JP2004526676A (ja) 2000-12-08 2004-09-02 オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド キナーゼ阻害剤として有用な大員複素環式化合物
US6599323B2 (en) 2000-12-21 2003-07-29 Ethicon, Inc. Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use
JP2005503759A (ja) 2001-01-24 2005-02-10 アメリカ合衆国 幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化方法
EP1360189A1 (en) 2001-01-25 2003-11-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Formulation of boronic acid compounds
US6656488B2 (en) 2001-04-11 2003-12-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering
EP1379626A2 (en) 2001-04-19 2004-01-14 DeveloGen Aktiengesellschaft für entwicklungsbiologische Forschung A method for differentiating stem cells into insulin-producing cells
WO2002088335A1 (fr) 2001-04-24 2002-11-07 Ajinomoto Co., Inc. Cellules souches et procede d'extraction de ces cellules
EP1393066A4 (en) 2001-05-15 2006-01-25 Rappaport Family Inst For Res INSULIN-PRODUCING CELLS DERIVED FROM HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS
US6626950B2 (en) 2001-06-28 2003-09-30 Ethicon, Inc. Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue
KR100418195B1 (ko) 2001-07-05 2004-02-11 주식회사 우리기술 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법
GB0117583D0 (en) 2001-07-19 2001-09-12 Astrazeneca Ab Novel compounds
US7432104B2 (en) 2001-08-06 2008-10-07 Bresgen Inc. Methods for the culture of human embryonic stem cells on human feeder cells
US6617152B2 (en) 2001-09-04 2003-09-09 Corning Inc Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate
EP1298201A1 (en) 2001-09-27 2003-04-02 Cardion AG Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state
WO2003033697A1 (en) 2001-10-18 2003-04-24 Ixion Biotechnology, Inc. Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells
DE60233248D1 (de) 2001-11-15 2009-09-17 Childrens Medical Center Verfahren zur isolierung, expansion und differenzierung fötaler stammzellen aus chorionzotte, fruchtwasser und plazenta und therapeutische verwendungen davon
US7033831B2 (en) 2001-12-07 2006-04-25 Geron Corporation Islet cells from human embryonic stem cells
JP4653952B2 (ja) 2001-12-07 2011-03-16 サイトリ セラピューティクス インコーポレイテッド 処理済み脂肪吸引細胞で患者を治療するためのシステムと方法
AU2002218893A1 (en) 2001-12-21 2003-07-09 Thromb-X Nv Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability
CN1671835A (zh) 2001-12-28 2005-09-21 塞拉提斯股份公司 一种建立多能人胚泡衍生的干细胞的方法
US20030162290A1 (en) 2002-01-25 2003-08-28 Kazutomo Inoue Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells
AU2003231358A1 (en) 2002-04-17 2003-10-27 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. METHOD OF FORMING PANCREATIC Beta CELLS FROM MESENCHYMAL CELLS
US20040161419A1 (en) 2002-04-19 2004-08-19 Strom Stephen C. Placental stem cells and uses thereof
DE60319364T2 (de) 2002-05-08 2009-02-19 Janssen Pharmaceutica N.V. Substituierte pyrroline als kinase inhibitoren
US20060003446A1 (en) 2002-05-17 2006-01-05 Gordon Keller Mesoderm and definitive endoderm cell populations
CN1662643A (zh) 2002-05-28 2005-08-31 贝克顿·迪金森公司 人腺泡细胞的扩增和转分化
CA2488602A1 (en) 2002-06-05 2003-12-18 Janssen Pharmaceutica N.V. Substituted pyrrolines as kinase inhibitors
GB0212976D0 (en) 2002-06-06 2002-07-17 Tonejet Corp Pty Ltd Ejection method and apparatus
CN1171991C (zh) 2002-07-08 2004-10-20 徐如祥 人神经干细胞的培养方法
US6877147B2 (en) 2002-07-22 2005-04-05 Broadcom Corporation Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison
US7838290B2 (en) 2002-07-25 2010-11-23 The Scripps Research Institute Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith
JP2005534345A (ja) 2002-07-29 2005-11-17 エス セル インターナショナル ピーティーイー リミテッド インスリン陽性、グルコース応答性細胞の分化のための多段階方法
WO2004016747A2 (en) 2002-08-14 2004-02-26 University Of Florida Bone marrow cell differentiation
AU2003268534A1 (en) 2002-09-06 2004-03-29 Amcyte Inc. Cd56 positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells
US9969977B2 (en) 2002-09-20 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US20040062753A1 (en) 2002-09-27 2004-04-01 Alireza Rezania Composite scaffolds seeded with mammalian cells
AU2003285172A1 (en) 2002-11-08 2004-06-03 The Johns Hopkins University Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
AU2003302702B2 (en) 2002-12-05 2008-08-07 Technion Research & Development Foundation Ltd. Cultured human pancreatic islets, and uses thereof
ES2571355T3 (es) 2002-12-16 2016-05-24 Technion Res & Dev Foundation Sistema de cultivo sin células alimentadoras ni xenocontaminantes para células madre embrionarias humanas
NZ541749A (en) 2003-01-29 2009-06-26 Takeda Pharmaceutical Process for producing coated preparation comprising pioglitazone hydrochloride and a coating material
RU2359671C2 (ru) 2003-01-29 2009-06-27 Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед Способ получения препарата с покрытием
US20070155661A1 (en) 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University Methods and compositions for modulating the development of stem cells
WO2005045001A2 (en) 2003-02-14 2005-05-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Insulin-producing cells derived from stem cells
WO2004087885A2 (en) 2003-03-27 2004-10-14 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway
US20060194315A1 (en) 2003-03-31 2006-08-31 Condie Brian G Compositions and methods for the control, differentiaton and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway
US20090203141A1 (en) 2003-05-15 2009-08-13 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents
JP4950659B2 (ja) 2003-06-27 2012-06-13 エチコン、インコーポレイテッド 胎盤組織から由来最多分娩後細胞、及びそれらを作成し使用する方法。
IL161903A0 (en) 2003-07-17 2005-11-20 Gamida Cell Ltd Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs
ITRM20030395A1 (it) 2003-08-12 2005-02-13 Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero.
WO2005017117A2 (en) 2003-08-14 2005-02-24 Martin Haas Multipotent amniotic fetal stem cells (mafsc) and banking of same
US7157275B2 (en) 2003-08-15 2007-01-02 Becton, Dickinson And Company Peptides for enhanced cell attachment and growth
EP1670900A4 (en) 2003-08-27 2008-06-11 Stemcells California Inc ENHANCED PANCREATIC STEM CELL AND PRECURSOR CELL POPULATIONS AND METHOD OF IDENTIFYING, INSULATING AND ENRICHING SUCH POPULATIONS
JP2007515433A (ja) 2003-12-17 2007-06-14 アラーガン　インコーポレイテッド Ｃｙｐ２６ａおよびｃｙｐ２６ｂの選択的阻害剤を使用するレチノイド反応性障害の処置方法
US20060030042A1 (en) 2003-12-19 2006-02-09 Ali Brivanlou Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime
US7625753B2 (en) 2003-12-23 2009-12-01 Cythera, Inc. Expansion of definitive endoderm cells
CN1946838A (zh) 2003-12-23 2007-04-11 赛瑟拉公司 定形内胚层
US20050266554A1 (en) 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
TWI334443B (en) 2003-12-31 2010-12-11 Ind Tech Res Inst Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells
WO2005065354A2 (en) 2003-12-31 2005-07-21 The Burnham Institute Defined media for pluripotent stem cell culture
US7794704B2 (en) 2004-01-23 2010-09-14 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration
WO2005071066A1 (en) 2004-01-23 2005-08-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for preparing pancreatic insulin secreting cells
GB2441530B (en) 2004-02-12 2009-09-23 Univ Newcastle Stem Cells
US7964401B2 (en) 2004-02-19 2011-06-21 Kyoto University Screening method for somatic cell nuclear reprogramming substance affecting ECAT2 and ECAT3
JP2008500809A (ja) 2004-03-09 2008-01-17 ライフスキャン・インコーポレイテッド インスリン産生細胞を発生させるための方法
JP2007528226A (ja) 2004-03-10 2007-10-11 リージェンツ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ カリフォルニア 胚幹細胞の増殖用組成物および方法
WO2005097980A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 Geron Corporation New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells
JP4491014B2 (ja) 2004-04-01 2010-06-30 ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション 幹細胞の内胚葉および膵臓系統への分化
SG152273A1 (en) 2004-04-27 2009-05-29 Cythera Inc Pdx1 expressing endoderm
JP5687816B2 (ja) 2004-07-09 2015-03-25 ヴィアサイト，インコーポレイテッド 胚体内胚葉を分化させるための因子を同定する方法
WO2006020919A2 (en) 2004-08-13 2006-02-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for self-renewal and differentiation in human embryonic stem cells
WO2006026473A2 (en) 2004-08-25 2006-03-09 University Of Georgia Research Foundation, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS UTILIZING MYC AND GSK3ß TO MANIPULATE THE PLURIPOTENCY OF EMBRYONIC STEM CELLS
DE102004043256B4 (de) 2004-09-07 2013-09-19 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension
AU2005282414C1 (en) 2004-09-08 2011-04-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Culturing human embryonic stem cells
NZ553241A (en) 2004-09-08 2009-11-27 Wisconsin Alumni Res Found Medium and culture of pluripotent stem cells
EP1859026A2 (en) 2005-01-31 2007-11-28 ES Cell International Pte Ltd. Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof
ES2627419T3 (es) 2005-03-04 2017-07-28 Lifescan, Inc. Células estromales adultas derivadas del páncreas
GB0505970D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof
ATE553198T1 (de) 2005-04-15 2012-04-15 Geron Corp Behandlung von krebs durch die kombinierte hemmung der proteasom- und telomeraseaktivitäten
CN100425694C (zh) 2005-04-15 2008-10-15 北京大学 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法
US20080208351A1 (en) 2005-04-26 2008-08-28 Aarhus Universitet Biocompatible Material for Surgical Implants and Cell Guiding Tissue Culture Surfaces
AU2006257859B2 (en) 2005-06-10 2009-12-10 Irm Llc Compounds that maintain pluripotency of embryonic stem cells
WO2006138433A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 The Regents Of The University Of California Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides
EP1931764A1 (en) 2005-06-21 2008-06-18 GE Healthcare Bio-Sciences AB Method for cell culture
EP3599277A1 (en) 2005-06-22 2020-01-29 Asterias Biotherapeutics, Inc. Suspension culture of human embryonic stem cells
CN101341138B (zh) 2005-06-30 2012-11-14 詹森药业有限公司 作为gsk-3抑制剂的环状苯胺基-吡啶并三嗪类
WO2007012144A1 (en) 2005-07-29 2007-02-01 Australian Stem Cell Centre Limited Compositions and methods for growth of pluripotent cells
US20080194021A1 (en) 2005-07-29 2008-08-14 Mays Robert W Use of a Gsk-3 Inhibitor to Maintain Potency of Culture Cells
WO2007025234A2 (en) 2005-08-26 2007-03-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes
US8962318B2 (en) 2005-09-02 2015-02-24 Agency For Science, Technology And Research Method of deriving mesenchymal stem cells from ES cells using FGF2
WO2007030870A1 (en) 2005-09-12 2007-03-22 Es Cell International Pte Ltd Cardiomyocyte production
WO2008048671A1 (en) 2006-10-18 2008-04-24 University Of Illinois Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
WO2007047509A2 (en) 2005-10-14 2007-04-26 Regents Of The University Of Minnesota Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype
ES2743202T3 (es) 2005-10-27 2020-02-18 Viacyte Inc Endodermo de intestino proximal dorsal y ventral que expresa PDX1
EA014166B1 (ru) 2005-12-13 2010-10-29 Киото Юниверсити Ядерный фактор перепрограммирования
WO2007082963A1 (es) 2006-01-18 2007-07-26 Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas
CN105802904B (zh) 2006-02-23 2021-04-20 维亚赛特公司 用于培养可分化细胞的组合物和方法
NZ571427A (en) 2006-03-02 2012-07-27 Viacyte Inc Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production
US7695965B2 (en) 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
EP2021462B1 (en) 2006-04-28 2019-01-09 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
US8741643B2 (en) * 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
US8685730B2 (en) 2006-05-02 2014-04-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage
CA2650561C (en) 2006-05-02 2014-02-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage
US7964402B2 (en) 2006-05-25 2011-06-21 Sanford-Burnham Medical Research Institute Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells
CN101541953A (zh) 2006-06-02 2009-09-23 佐治亚大学研究基金会 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织
WO2007143193A1 (en) * 2006-06-02 2007-12-13 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pancreatic and liver endoderm cells and tissue by differentiation of definitive endoderm cells obtained from human embryonic stems
US8415153B2 (en) 2006-06-19 2013-04-09 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
CN100494359C (zh) 2006-06-23 2009-06-03 中日友好医院 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法
EP2046946B8 (en) 2006-06-26 2017-01-25 Lifescan, Inc. Pluripotent stem cell culture
US20080003676A1 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Millipore Corporation Growth of embryonic stem cells
US8968994B2 (en) 2006-07-06 2015-03-03 Jeremy Micah Crook Method for stem cell culture and cells derived therefrom
WO2008013664A2 (en) 2006-07-26 2008-01-31 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
KR101331510B1 (ko) * 2006-08-30 2013-11-20 재단법인서울대학교산학협력재단 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
WO2008039521A2 (en) 2006-09-26 2008-04-03 Nmt Medical, Inc. Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth
WO2008048647A1 (en) 2006-10-17 2008-04-24 Cythera, Inc. Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells
CA2667053C (en) 2006-10-17 2015-04-28 Stiefel Laboratories, Inc. Talarazole metabolites
JP5067949B2 (ja) 2006-11-09 2012-11-07 独立行政法人国立国際医療研究センター 霊長類動物胚性幹細胞の培養及び継代方法、並びにその分化誘導方法
TW200836749A (en) 2007-01-09 2008-09-16 Vioquest Pharmaceuticals Inc Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof
CN101641436A (zh) 2007-01-30 2010-02-03 佐治亚大学研究基金会 用于产生内胚层和中胚层细胞系及多能游走细胞（mmc）的早期中胚层细胞即稳定的中内胚层细胞群
GB0703188D0 (en) 2007-02-19 2007-03-28 Roger Land Building Large scale production of stem cells
WO2008148105A1 (en) 2007-05-25 2008-12-04 Medistem Laboratories, Inc. Endometrial stem cells and methods of making and using same
EP2610336A1 (en) 2007-07-31 2013-07-03 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
PL2185691T3 (pl) 2007-07-31 2018-08-31 Lifescan, Inc. Różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez zastosowanie ludzkich komórek odżywczych
CA2696622C (en) 2007-08-24 2016-07-19 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut Compositions for the treatment of neoplastic diseases
US20110151447A1 (en) 2007-11-06 2011-06-23 Children's Medical Center Corporation Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells from non-embryonic human cells
US9062290B2 (en) 2007-11-27 2015-06-23 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
SG154367A1 (en) 2008-01-31 2009-08-28 Es Cell Int Pte Ltd Method of differentiating stem cells
WO2009096049A1 (ja) 2008-02-01 2009-08-06 Kyoto University 人工多能性幹細胞由来分化細胞
US20100330677A1 (en) 2008-02-11 2010-12-30 Cambridge Enterprise Limited Improved Reprogramming of Mammalian Cells, and Cells Obtained
KR20190057164A (ko) 2008-02-21 2019-05-27 얀센 바이오테크 인코포레이티드 세포 부착, 배양 및 탈리를 위한 방법, 표면 개질 플레이트 및 조성물
EP2479260B1 (en) 2008-03-17 2016-01-06 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
EP2283117B1 (en) 2008-04-21 2013-10-23 Viacyte, Inc. Methods for purifying pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
US8338170B2 (en) 2008-04-21 2012-12-25 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
WO2009132083A2 (en) 2008-04-22 2009-10-29 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for promoting the generation of pdx1+ pancreatic cells
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
US7939322B2 (en) 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
WO2009154606A1 (en) * 2008-06-03 2009-12-23 Cythera, Inc. Growth factors for production of definitive endoderm
CA2729121C (en) 2008-06-30 2019-04-09 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
DE102008032236A1 (de) 2008-06-30 2010-04-01 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential
US20100028307A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
CA2742268C (en) 2008-10-31 2020-02-18 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage
MX2011004563A (es) 2008-10-31 2011-06-01 Centocor Ortho Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas al linaje endocrino pancreatico.
AU2008363829B2 (en) 2008-11-04 2014-11-20 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods for differentiation thereof
US8008075B2 (en) 2008-11-04 2011-08-30 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof
CN102282254B (zh) 2008-11-14 2015-12-16 维赛特公司 源于人多能干细胞的胰腺细胞的包封
EP2356218B1 (en) 2008-12-05 2017-05-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method and medium for neural differentiation of pluripotent cells
WO2011011349A2 (en) 2009-07-20 2011-01-27 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
KR102058901B1 (ko) 2009-07-20 2019-12-24 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
FI20096288A0 (fi) 2009-12-04 2009-12-04 Kristiina Rajala Formulations and methods for culturing stem cells
WO2011079017A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
US20120322152A1 (en) 2010-03-02 2012-12-20 Michael Raghunath Culture Additives To Boost Stem Cell Proliferation And Differentiation Response
CN105176930B (zh) 2010-03-31 2021-05-04 斯克里普斯研究所 重编程细胞
JP2013524836A (ja) 2010-04-25 2013-06-20 マウント・シナイ・スクール・オブ・メディスン 多能性細胞からの前部前腸内胚葉の生成
KR101903562B1 (ko) 2010-05-12 2018-10-02 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
BR112013002811A8 (pt) 2010-08-05 2020-01-28 Wisconsin Alumni Res Found meios básicos simplificados para cultura celular pluripotente de humano
US9181528B2 (en) 2010-08-31 2015-11-10 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
MY177150A (en) 2011-02-28 2020-09-08 Stempeutics Res Malaysia Sdn Bhd Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof
CN105143446B (zh) 2011-12-22 2020-11-03 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞分化成单一激素胰岛素阳性细胞
US10519422B2 (en) 2012-02-29 2019-12-31 Riken Method of producing human retinal pigment epithelial cells

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2392315C2 (ru) * 2003-10-03 2010-06-20 Кейити ФУКУДА Способ индукции дифференциации стволовых клеток в миокардиальные
US7510876B2 (en) * 2003-12-23 2009-03-31 Cythera, Inc. Definitive endoderm
US20090304642A1 (en) * 2005-10-24 2009-12-10 Agency For Science, Technology And Research Methods of specifying mesodermal, endodermal and mesoendodermal cell fates
WO2009012428A2 (en) * 2007-07-18 2009-01-22 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
RU2359030C1 (ru) * 2008-03-19 2009-06-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (варианты)
US20090298178A1 (en) * 2008-06-03 2009-12-03 D Amour Kevin Allen Growth factors for production of definitive endoderm
US20100124781A1 (en) * 2008-11-20 2010-05-20 Shelley Nelson Pluripotent Stem Cell Culture on Micro-Carriers
WO2010096496A2 (en) * 2009-02-17 2010-08-26 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of neural conversion of human embryonic stem cells

Also Published As

Publication number Publication date
RU2013114375A (ru) 2014-10-10
MX2013002406A (es) 2013-04-05
US20120052575A1 (en) 2012-03-01
AU2011296382B2 (en) 2016-04-14
WO2012030539A3 (en) 2012-05-31
WO2012030539A2 (en) 2012-03-08
SG187944A1 (en) 2013-04-30
BR112013004514A2 (pt) 2016-06-07
HK1243729A1 (zh) 2018-07-20
ES2659393T3 (es) 2018-03-15
EP2853589B1 (en) 2017-12-27
EP2611910A4 (en) 2014-03-05
AU2011296382A1 (en) 2013-03-14
PL2611910T3 (pl) 2018-06-29
US20170081634A1 (en) 2017-03-23
CA2809303C (en) 2024-04-09
JP6218605B2 (ja) 2017-10-25
EP2611910A2 (en) 2013-07-10
KR20130101028A (ko) 2013-09-12
US9528090B2 (en) 2016-12-27
AR082820A1 (es) 2013-01-09
MX355077B (es) 2018-04-03
EP3211070A1 (en) 2017-08-30
CN103154239A (zh) 2013-06-12
CN108517310A (zh) 2018-09-11
KR101836850B1 (ko) 2018-03-09
SG10201506852VA (en) 2015-10-29
PL2853589T3 (pl) 2018-05-30
CA2809303A1 (en) 2012-03-08
EP2611910B1 (en) 2018-01-17
ES2658146T3 (es) 2018-03-08
JP2013536686A (ja) 2013-09-26
EP2853589A1 (en) 2015-04-01
CN108517310B (zh) 2022-02-15
CN103154239B (zh) 2018-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2627168C2 (ru) Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека
RU2599420C2 (ru) Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток
US9951314B2 (en) Differentiation of human embryonic stem cells
RU2587634C2 (ru) Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека
KR101867369B1 (ko) 인간 배아 줄기 세포의 분화
KR102025158B1 (ko) 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 계통으로의 분화