CN100425694C - 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法。本发明的诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法，是依次利用Activin A和顺式视黄酸处理由胚胎干细胞形成的胚胎小体，使其分化得到胰腺细胞。本发明为研究胰腺β细胞的形成和分化机制提供了一种体外诱导模型，同时为I型糖尿病的细胞治疗提供了一种潜在的胰岛素阳性细胞的来源。本发明的方法对于研究人胰岛的发育机制以及I型糖尿病的细胞治疗都具有重要的意义。

Description

诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法
技术领域
本发明涉及一种诱导胚胎干细胞分化的方法，特别是涉及诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法。
背景技术
糖尿病作为最常见的代谢失调性疾病之一，影响着世界上4-5％的人口健康。据估计，到2010年，糖尿病患者可能会超过三亿五千万。I型糖尿病主要是由于胰腺中的细胞遭受自身免疫破坏所致，所以许多研究小组都在寻找各种方式试图来替换自身被破坏的产生胰岛素的细胞。目前，胰岛移植是除了注射胰岛素外唯一证明有效的可治愈I型糖尿病的方案(Serup P，Madsen OD，Mandrup-PoulsenT.Islet and stem cell transplantation for treating diabetes.BMJ2001；322：29-32)。但是，由于具有移植能力的供体胰岛很难获得而导致该项方案无法大规模应用。
由胚胎干细胞获得功能性的  细胞也许能解决供体不足的问题。胚胎干细胞已经被证明能够分化成胰岛样的集落，包括胰腺细胞(Soria B，Roche E，BernaG，et al.Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cellsnormalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice.Diabetes2000；49(2)：157-162；Lumelsky N，Blondel O，Laeng P，et al.Differentiationof embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar topancreatic islets.Science 2001；292：1389-1394；Assady S，Maor G，Amit M，et al.Insul in product ion by human embryonic stem cells.Diabetes2001；50(8)：1691-169.)。Soria等(Soria B，Roche E，Berna G，et al.Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalizeglycemia in streptozotocin-induced diabet ic mice.Diabetes2000；49(2)：157-162)通过一种“细胞捕获”的方案成功地诱导胚胎干细胞分化成胰腺细胞。不过，这种方案比较复杂，且需要一些遗传操作。Lumelsky等(Lumelsky N，Blondel O，Laeng P，et al.Differentiation of embryonic stemcells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets.Science 2001；292：1389-1394)设计了一种“五步法”，无需基因操作即可分化胚胎干细胞成细胞。Hori小组(Hori Y，Rulifson IC，Tsai BC，et al.Growthinhibitors promote differentiation of insulin-producing tissue fromembryonic stem cells.Proc Natl Acad Sci U S A 2002；99(25)：16105-16110)和Blyszczuk小组(Blyszczuk P，Czyz J，Kania G，et al.Expression of Pax4in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-positiveprogenitor and insulin-producing cells.Proc Natl Acad Sci U S A2003；100(3)：998-1003)分别通过添加生长抑制小分子LY294002和强表达基因pax4来改进Lumelsky的“五步法”。但是，所有的目前的这些诱导方案都是相当复杂的，周期很长。Hansson等(Hansson M，Tonning A，Frandsen U，et al.Artifactual Insulin Release From Differentiated Embryonic Stem Cells.Diabetes 2004；53：2603-2609)在研究“五步法”时发现胚胎干细胞在培养中可能吸收培养基中的胰岛素而使结果出现假阳性。因此，寻找一种特异的方案使胚胎干细胞迅速容易地分化成细胞很有必要。
某些因子被暗示可以促进内胚层的分化。TGF-β超家族的一个成员，Activin A，在原肠胚形成中对内胚层和中胚层有很关键的作用；高浓度下它主要诱导内胚层形成(Kumar M，Jordan N，Melton DA，et al.Signals from lateral platemesoderm instruct endoderm toward a pancreatic fate.Developmental Biology2003；259：109-122；Hill CS.TGF-βsignalling pathways in early Xenopusdevelopment.Curr Opin Genet Dev 2001；11(5)：533-540)。顺式视黄酸(All-trans retinoic acid，RA)是一种对脊椎动物前后体轴的形成以及神经外胚层和中胚层有很重要作用的信号分子(Maden M.Role and distribution ofretinoic acid during CNS development.Int Rev Cytol 2001；209：1-77)。目前的证据显示RA也参与调节胚胎内胚层发育模式特别是在胰腺原基形成过程中，也能增强胰腺细胞和INS-1细胞系中胰岛素的表达(Stafford D，Prince VE.Retinoic Acid signaling is required for a critical early step in Zebrafishpancreatic development.Current Biology 2002；12(14)：1215-1220；Blumentrath J，Neye H，Verspohl EJ.Effects of retinoids andthiazolidinediones on proliferation，insulin release，insulin mRNA，GLUT2transporter protein and mRNA of INS-1cells.Cell Biochem Funct2001；19：159-169)。在爪蟾中activin A和RA联合作用可以使本来应该发育成外胚层的区域分化成可以表达胰岛素的胰腺细胞(Moriya N，KomazakiS，Takahashi S，et al.In vitro pancreas formation from Xenopus ectodermtreated with activin and retinoic acid.Develop Growth Differ2000；42：593-602)。
发明内容
本发明的目的是提供一种诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法。
本发明所提供的诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法，是依次利用ActivinA和顺式视黄酸处理由胚胎干细胞形成的胚胎小体，使其分化得到胰腺细胞。
所述Activin A的浓度可为50-300ng/ml培养基，所述顺式视黄酸的浓度可为1×10-7-1×10-5mol/L培养基；所述Activin A的浓度优选为100ng/ml培养基，所述顺式视黄酸的浓度优选为1×10-6mol/L培养基。
为促进小的胰岛样集落结构的形成，所述方法中，在用Activin A和顺式视黄酸处理前，先将胚胎小体置于Matrigel上培养。
所述Matrigel的质量百分含量为1％。
所述依次利用Activin A和顺式视黄酸处理胚胎小体使其分化的方法为将胚胎小体在加入Activin A的培养基中培养20-28小时后，转入无Activin A的培养基中培养6-8小时，再转入加入顺式视黄酸的培养基中培养20-24小时，得到胰腺前体细胞。
所述诱导分化得到的胰腺前体细胞在含有bFGF的培养基中培养3-5天，使胰腺前体细胞扩增。
所述bFGF的浓度为8-12ng/ml；优选为10ng/ml。
将扩增得到的胰腺前体细胞用添加N2、B27血清替代物，层粘连蛋白(laminin)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和烟酰胺(nicotinamide)的培养基培养3-5天，得到成熟的胰岛β细胞。
当胚胎干细胞来源于小鼠时，所述培养基是含N2和B27血清替代物(来自Gibco-BRL公司，照说明书配制)，1ug/ml Laminin，10ng/ml bFGF以及10mmol/Lnicotinamide的DMEM/F12培养基，当胚胎干细胞来源于人时，所述培养基是含N2和B27血清替代物，1ug/ml Laminin，10ng/ml bFGF以及10mmol/Lnicotinamide的CDM/F12培养基。
当胚胎干细胞来源于小鼠时，所述胚胎小体在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养；当胚胎干细胞来源于人时，所述胚胎小体在含10％胎牛血清的CDM培养基中培养。
所述CDM培养基为：50％IMDM(Gibco)，50％F12(Gibco)，monothioglycerol(sigma)450umol/L，insulin-transferrin-seleninumA(ITS，Gibco-BRL，按说明配制)，Albumin Fraction V(Sigma)5mg/ml。
预先的研究显示，胚胎干细胞能够被特异地诱导成胰腺β细胞(Blyszczuk P，Czyz J，Kania G，et al.Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotesdifferentiation of nestin-positive progenitor and insulin-producing cells.Proc Natl Acad Sci U S A 2003；100(3)：998-1003；Hansson M，Tonning A，FrandsenU，et al.Artifactual Insulin Release From Differentiated Embryonic StemCells.Diabetes 2004；53：2603-2609)。但是，绝大多数诱导方案都需要大约一个月才能获得胰岛素阳性的细胞。本发明提供了一种新的三步法，它是基于activin A、RA和其他一些成熟因子例如matrigel、烟酰胺(nicotinamide)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的联合作用。在该三步法的最后阶段，这些诱导的细胞能够形成小的胰岛样的集落结构，同时也表达胰腺β细胞特异的标志基因，包括insulinI、pdx1、glut2、isl1和hnf3β，更重要的是，这些细胞能够被移植，达到逆转STZ处理导致的糖尿病的效果。
Activin A、RA和matrigel在本发明的诱导方案中起了十分重要的作用。首先，activin A对胚内内胚层的发育起着十分重要的作用。它是一个靠二硫键稳定的蛋白，属于TGF-β超家族。它结合到细胞表面受体后能诱导许多基因的表达，包括mixl1和goosecoid，这两个基因对早期内胚层的发育也有重要作用(Kumar M，Jordan N，Melton DA，et al.Signals from lateral plate mesoderm instructendoderm toward a pancreatic fate.Developmental Biology 2003；259：109-122；Hill CS.TGF-βsignalling pathways in early Xenopus development.Curr Opin Genet Dev 2001；11(5)：533-540)。Kubo等报导Activin A能够诱导胚胎干细胞分化成为胚胎内胚层细胞(Kubo A，Shinozaki K，Shannon JM，et al.Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.Development 2004；131：1651-1662)。另外，Activin A在培养的人胰岛中也能够增强胰岛素的表达(Florio P，Luisi S，Marchetti P，et al.Activin Astimulates insulin secretion in cultured human pancreatic islets.JEndocrinol Invest 2000；23(4)：231-234)，在糖尿病新生小鼠中能调控β细胞的发育以及再生β细胞(Lei L，Yi Z，Seno M，et al.Activin A and BetacellulinEffect on Regeneration of Pancreat ic β-Cells in NeonatalStreptozotocin-Treated Rats.Diabetes 2004；53：608-615)。Activin A的这些功能也许可以解释它为什么会在本发明的方法中起作用。第二，RA已经被报导除了在诱导外胚层和中胚层发育中起重要作用，在早期胎胰发育中也是一个重要的信号分子(Maden M.Role and distribution of retinoic acid during CNSdevelopment.Int Rev Cytol 2001；209：1-77)。在斑马鱼的发育中，RA信号上调能够诱导显著的肝胰内胚层的扩增；相反地，用小分子BMS493抑制RA，能够抑制胚胎内胚层向胰腺的发育(Stafford D，Prince VE.Retinoic Acid signalingis required for a critical early step in Zebrafish pancreatic development.Current Biology 2002；12(14)：1215-1220)。而且，Micallef等发现，在小鼠胚胎干细胞分化的第四天加入RA能诱导pdx1阳性的内胚层形成(Micallef SJ，JanesME，Knezevic K，et al.Retinoic Acid Induces Pdx1-Positive Endoderm inDifferentiating Mouse Embryonic Stem Cells.Diabetes 2004Dec 7[Epub aheadof print])。对于胰腺的成熟，RA在内分泌部分和导管分化中主要是通过旁分泌以及上调pdx1基因发挥作用的(Tulachan SS，Doi R，Kawaguchi Y，et al.All-trans retinoic acid induces differentiation of ducts and endocrinecells by mesenchymal/epithelial interactions in embryonic pancreas.Diabetes 2003；52(1)：76-84)。在背胰的发育中RA被发现通过抑制外分泌部分分化而促进内分泌部分发育(Chen Y，Pan FC，Brandes N，et al.Retinoic acidsignaling is essential for pancreas development and promotes endocrine atthe expense of exocrine cell differentiation in Xenopus.DevelopmentalBiology 2004；271：144-160)。因此，很显然RA能促进胰腺祖细胞和内分泌细胞的发育。在Activin A诱导胚胎干细胞向内胚层分化的基础上，RA可以进一步促进内胚层向胰腺方向的特化。本发明在用Activin A和RA诱导后，分化的胚胎干细胞表达许多胰腺前体细胞的标志基因，例如pdx1、hnf3和hnf4。这些数据显示，Activin A和RA的联合作用能够诱导胚胎干细胞向早期胰腺细胞的分化。本发明的结果也表明同时使用两者比只用其中一个更有效得多。第三，matrigel已经被证明在胰腺的体外分化和成熟中起着很重要得胞外基质的作用。matrigel是一种包括laminin在内的胞外基质和一些生长因子例如FGF和TGF-β的复杂混合物，对胰腺前体细胞的迁移、三维囊状结构的形成和原基突出有重要作用(Gao R，UstinovJ，Pulkkinen MA，et al.Characterization of Endocrine ProgenitorCells and Critical Factors for Their Differentiation in Human AdultPancreatic Cell Culture.Diabetes 2003；52：2007-2015)。Gittes GK等也证明matrigel中最重要的成分laminin，参与小鼠胎胰导管世系决定(Jiang FX，CramDS，DeAizpurua HJ，et al.Laminin-1promotes differentiation of fetal mousepancreatic beta cells.Diabetes 1999；48：722-730；Crisera CA，Kadison AS，Breslow GD，et al.Expression and role of laminin-1in mouse pancreaticorganogenesis.Diabetes 2000；49：936-944)。而且，培养在matrigel上的人胰腺导管上皮细胞能够形成胰岛素阳性的胰岛样集落结构(Bonner-Weir S，Taneja M，Weir GC，et al.In vitro cultivation of human islets from expandedductal tissue.Proc Natl Acad Sci U S A 2000；97：7999-8004)。本发明的结果显示matrigel对于小的胰岛样集落结构形成是必需的。如果胚胎干细胞培养在laminin或者gelatin(明胶)上，细胞集落不能很好的形成，同时分化的细胞在matrigel上似乎长得比在laminin或gelatin好。这些都显示，matrigel比laminin或gelat in能提供更多的诱导因子。
本发明提供了一种新的基于联合使用activin A、RA以及一些其他成熟因子诱导胚胎干细胞向功能性的胰岛素阳性细胞分化的方法，该方法能在仅仅两周的时间内诱导胚胎干细胞产生胰岛素。结果显示TGF-β和RA对于胰腺的发育和成熟是很关键的。表达胰岛素的这群细胞同时也表达胰腺细胞的一些特异基因，例如insulinI、pdx1、glut2、hnf3β和isl1。而且，利用胰岛素启动子后接EGFP的报告载体排除了由于胰岛素吸收而导致的假阳性。最后，证明了这群能分泌胰岛素的细胞在移植到链脲佐菌素(STZ)造成的糖尿病小鼠肾包囊部位后可以逆转糖尿病，足够使糖尿病小鼠的血糖恢复正常，并能明显改善病鼠的存活率。本发明为研究胰腺β细胞的形成和分化机制提供了一种体外诱导模型，同时为I型糖尿病的细胞治疗提供了一种潜在的胰岛素阳性细胞的来源。本发明的方法对于在体外研究人胰岛的发育机制以及I型糖尿病的细胞治疗都具有重要的意义。
附图说明
图1A为诱导小鼠ES细胞向胰岛分泌型细胞定向分化的三步培养法
图1B为小鼠ES-R1细胞形成EB集落的照片
图1C为在三步培养法的第二步来源于EB的胰腺前体细胞呈现上皮样结构的照片
图1D-图1E为在三步培养法的第三步出现的细胞团样结构
图2A为RT-PCR检测只用activin A或RA诱导的小鼠ES-R1细胞在第二步末分化的细胞表达胰腺前体细胞标记基因情况
图2B为RT-PCR检测用activin A和RA双因子诱导的小鼠ES-R1细胞在第二步末分化的细胞表达胰腺前体细胞标记基因情况
图2C为RT-PCR检测用activin A和RA双因子诱导或没有用activin A和RA诱导的小鼠ES-R1细胞在第三步末分化的细胞表达胰腺前体细胞标记基因情况
图3A为三步培养法第三步得到的成熟β细胞表达胰岛素的免疫组化检测
图3B为三步培养法第三步得到的成熟β细胞表达C-pept ide的免疫组化检测
图3C为没有经过activin A和RA诱导的小鼠ES-R1细胞在第三步末分化的细胞表达胰岛素的DTZ染色检测(200×)
图3D为经过activin A和RA诱导的小鼠ES-R1细胞在第三步末分化的细胞表达胰岛素的DTZ染色检测(200×)
图3E和图3G为转染EGFP报告载体的小鼠ES-R1细胞经三步培养法第三步得到的小细胞团的EGFP表达情况，E、G分别代表不同的结构
图3F和图3H为免疫组化分析转染EGFP报告载体的小鼠ES-R1细胞经三步培养法第三步得到的小细胞团中胰岛素的表达照片，F、H分别代表不同的结构
图4A为移植细胞的小鼠和注射PBS对照鼠的存活率比较
图4B移植细胞的小鼠和注射PBS对照鼠的血液葡萄糖浓度比较
图5A为注射PBS的小鼠肾脏胰岛素表达的组化分析(200×)
图5B为移植细胞的肾脏胰岛素表达的组化分析(200×)
图6A为三步培养法第三步得到的人ES细胞分化而来的成熟β细胞基因表达情况
图6B为CDM对照组(没有用activin A和RA诱导)中基因表达情况
图7A为诱导后的细胞中能表达C-peptide(40×)的照片
图7B为图7A的DAPI染色(40×)的照片
图7C为诱导后的细胞中表达pdx-1(40×)的照片
图7D为图7C的DAPI染色(40×)的照片
图8A为移植的人ES细胞来源的分化细胞表达C-peptide的免疫组化照片(40×)
图8B为C-peptide阳性的细胞可以染上人特异细胞核抗体的的免疫组化照片(40×)
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、诱导小鼠胚胎干细胞向胰腺细胞分化
所用的细胞系是小鼠ES-R1(Nagy A，Rossant J，Nagy R，et al.Derivat ionof completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stemcells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993；90：8424-8428)。
小鼠ES-R1的培养温度为37℃。培养基中的材料Dulbecco’s Modified EagleMedium(DMEM，Gibco-BRL)，20％胎牛血清(FBS)(Gibco-BRL)，1000U/mlleukemia inhibitory factor(LIF，Gibco-BRL)。
一、胚胎干细胞(ES cell)的培养和分化
采用activin A和RA双因子诱导的三步培养法(图1A)诱导ES细胞向胰岛分泌型细胞的定向分化，具体方法如下：
第一步，胚胎小体(Embryonic bodies，EB)的形成及分化。
小鼠ES-R1细胞用胰酶常规消化后在Petri-dish(Alpha medical instrument)的培养皿中用含有10％胎牛血清的DMEM培养基(不含LIF)悬浮培养诱导EB的形成，24至48小时后，形成EB集落(图1B)。然后转移EB至1％Matrigel铺被的培养皿中按照如下方法用activin A和RA依次诱导：收集悬浮的EB将其转移到经1％Matrigel(人工重组基底膜)(BD Biosciences)铺被的细胞培养皿中。两小时后，EB开始铺展，此时将培养基换为含有10％胎牛血清和100ng/ml activin A(Sigma)的DMEM培养基中培养24小时，然后EB转为用含10％胎牛血清的DMEM培养6-8小时使EB分化。之后，分化EB接着用含有10％胎牛血清和1×10-6mol/L RA(Sigma)的DMEM培养基继续诱导24小时，得到胰腺前体细胞。
第二步，胰岛前体细胞的扩增。
分化的EB细胞用含有10％胎牛血清和10ng/ml bFGF(Sigma)的DMEM培养3-5天，诱导来源于EB的胰腺前体细胞的扩增。在此期间，大部分贴壁的细胞呈现上皮样结构(图1C)。
第三步，胰腺β细胞(Pancreatic βcell)的成熟。
细胞转入含有N2和B27(Gibco-BRL)血清替代物(来自Gibco-BRL公司，照说明配制)，1ug/ml Laminin(Sigma)，10ng/ml bFGF以及10mmol/L nicotinamide(Sigma)的DMEM/F12培养基(Gibco-BRL)中继续培养3-5天，促进胰岛β细胞成熟(该条件参考下列引文：Lumelsky N，Blondel O，Laeng P，et al.Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structuressimilar to pancreatic islets.Science 2001；292：1389-1394)。用尼康相差显微镜(TS-100)观察细胞的形态。在此阶段，培养皿中出现许多小的细胞团结构(图1D和图1E)，得到成熟胰腺β细胞。
二、用RT-PCR检测分化的细胞基因的表达情况
为了检测上述因子是否促进了ES细胞向胰腺内分泌细胞的分化，用RT-PCR检测胰腺内分泌细胞的标记基因的表达情况，具体方法和结果如下：
用Catrimox-14RNA提取试剂盒(TaKaRa)提取分化细胞和对照细胞的总RNA。分化细胞包括步骤一中第二步得到的胰岛前体细胞，步骤一中第三步得到的成熟胰腺β细胞。对照细胞是按照步骤一的三步培养法，但只用activin A和RA两种小分子其中之一诱导的第二步得到的细胞；按照步骤一的三步培养法但不加activinA和RA第三步得到的细胞；以及成熟小鼠胰腺细胞。RNA用MMLV逆转录酶(Promega)逆转录为cDNA。PCR用Ex Taq聚合酶(TaKaRa)体系完成。PCR引物如下：
InsulinI：TAGTGACCAGCTATAATCAGAG(序列1)和ACGCCAAGGTCTGAAGGTCC(序列2)(288bp)；
hnf3β：ACCTGAGTCCGAGTCTGACC和GGCACCTTGAGAAAGCAGTC(345bp)；
pdx-1：CTTAGCGTGTCGCCACAGCCCTCCA和TCCAACAGCCGCCTTTCGTTATTCT(472bp)；
glut2：GGATAAATTCGCCTGGATGA和TTCCTTTGGTTTCTGGAACT(299bp)；
isl1：ATTTGCCACCTAGCCACAGCACC和CGCATTTGATCCCGTACAACCTG(335bp)；
β-actin：CCTGAACCCTAAGGCCAACCGTGAA和ATACCCAAGAAGGAAGGCTGGAAAA(480bp)；
hnf4α：ACACGTCCCCATCTGAAG和CTTCCTTCTTCATGCCAG(269bp)。
结果如图2A-图2C所示，图2A的上列显示只用activin A诱导，第二步末得到的细胞主要表达hnf3β和pdx-1，下列显示只用RA诱导，第二步末得到的细胞只表达hnf3β；图2B表明用activin A和RA双因子诱导，第二步末分化的细胞表达胰腺前体细胞的标记基因：pdx-1，hnf3β，insulinin和hnf4α；图2C表明在第三步末，双因子诱导的细胞主要表达insulinI，pdx-1，isl1，glut2和hnf3β(第三泳道“+”)。图2A-图2C中，-RT表示没有逆转录的阴性对照，blank表示用水代替模板作的阴性对照；图2C中，第一泳道Pancreas为成熟小鼠胰腺细胞做的阳性对照；第二泳道“-”表示没有activin A和RA诱导的小鼠ES-R1细胞在第三步末分化的细胞；“+”表示用activin A和RA双因子诱导的小鼠ES-R1细胞在第三步末分化的细胞。
这些细胞不表达其他非β细胞的胰岛细胞的基因如glucagon或somatostatin。该结果表明TGF-β和RA信号通路可能对胰腺β细胞的发育和成熟有关键作用。诱导过程对activin A和RA的依赖性很大，如果缺少二者其一则几乎没有小细胞团形成同时细胞不表达或仅微弱表达insulinI，pdx1，isll1，glut2和hnf3β(图2C中第二泳道“-”)。此外，如果培养皿用laminin或明胶铺被，在诱导的第三步不形成小细胞团。
三、免疫组化分析
为了证明诱导的胰岛素阳性细胞同时表达C-peptide，对诱导后的细胞进行了胰岛素和C-peptide的组化检测，具体方法如下：
将该诱导方案得到的成熟胰腺β细胞用4％多聚甲醛固定，PBS洗三遍后用10％正常山羊或兔血清室温封闭20分钟。弃血清，分别加胰岛素一抗(Rabbitpolyclonal IgG，1∶200，Santa Cruz)或C-peptide一抗(Linco)4℃放置12小时。接着用罗丹明抗兔二抗IgG，FITC抗兔或抗羊二抗IgG(三个二抗均为1∶200，均购自Santa Cruz)以及生物素IgG(work solution，Santa Cruz)孵育。DAB用来作为生物素二抗的显色反应底物。用奥林帕斯(Olympus IX-71)成像体系观察。结果表明该方案得到的分化细胞既表达胰岛素，又表达C-peptide(图3A和图3B)。
按照文献(Shiroi A，Yoshikawa M，Yokota H，et al.Identification ofinsulin-producing cells derived from embryonic stem cells byZinc-Chelating Dithizone.STEM CELLS 2002；20(4)：284-292)的方法用DTZ染色来检测该方案得到的成熟β细胞和按照步骤一的三步培养法，但没有经过activin A和RA两种小分子诱导的第三步得到的细胞(对照细胞)，结果表明在第三步诱导后出现了DTZ阳性的洋红色细胞团(图3D)，而对照细胞无洋红色细胞团(图3C)。这表明步骤一中第三步得到的细胞团中含有胰岛素阳性的细胞。
四、EGFP报告载体的构建以及ES细胞的转染
有证据表明ES来源的细胞能够吸收来源于培养基中的胰岛素而导致组化的假阳性(Hori Y，Rulifson IC，Tsai BC，et al.Growth inhibitors promotedifferentiation of insulin-producing tissue from embryonic stem cells.Proc Natl Acad Sci U S A 2002；99(25)：16105-16110)。为了进一步证明诱导的细胞可以自发表达胰岛素，采用EGFP报告体系来检测胰岛素的表达。将胰岛素启动子接EGFP的载体转入ESR1细胞系，再用G418筛选出阳性细胞后用activin A和RA的双因子诱导，具体方法如下。
人胰岛素启动子接EGFP的载体构建方式如下：用Xba I和Hind III从pFOXCAT-362hIns(Odagiri H，Wang JH，and German MS.Function of the HumanInsulin Promoter in Primary Cultured Islet Cells.THE JOURNAL OF BIOLOGICALCHEMISTRY 1996；271(4)：1909-1915)切下0.4kb的人胰岛素启动子片段，再将其插入CMV启动子已用AseI和HindIII切除的pCMV-EGFPN3载体(pCMV-EGFPN3购自BD Biosciences)的EGFP上游启动子区的Xba I和Hind III识别位点间。将构建好的载体用电转的方式转入小鼠ES-R1细胞中，用250ug/ml G418(Gibco-BRL)筛选。筛选出的阳性小鼠ES-R1细胞克隆，用步骤一的采用activin A和RA双因子诱导的三步培养法进行诱导培养，将第三步得到的小的细胞团进行EGFP检测，结果如图3E和图3G所示，表明在第三步得到的小的细胞团中可以检测到EGFP的表达，同时其表达模式同胰岛素相吻合(图3F和图3H，按照步骤三的免疫组化分析方法进行检测)。这些数据表明activin A和RA再结合其他促成熟的因子，能够诱导ES细胞向胰岛素分泌型细胞的定向分化。
五、ELISA检测胰岛素的分泌量
为了分析是否诱导后的细胞分泌的胰岛素能够受葡萄糖的调控，依次用含有低糖(5.5mmol/L葡萄糖)和高糖(27.7mmol/L葡萄糖)两种浓度的Krebs-Ringer缓冲液来处理该方案得到的成熟β细胞，同时用ELISA来检测其胰岛素的分泌量。具体方法如下：
将本方案诱导得到的成熟胰腺β细胞先用含2.5mM葡萄糖的Krebs-Ringer缓冲液(pH 7.4)37℃孵育90分钟，接着用含27.7mM葡萄糖的Krebs-Ringer缓冲液在37℃孵育15分钟作为样品(A)；将本方案诱导得到的成熟胰腺β细胞先用含2.5mM葡萄糖的Krebs-Ringer缓冲液37℃孵育90分钟，接着用含5.5mM葡萄糖的Krebs-Ringer缓冲液在37℃孵育15分钟作为对照(B)。收集各自的缓冲液。两份样品用Rat/Mouse Insulin ELISA试剂盒(CRYSTAL CHEM INC)检测胰岛素的分泌量。细胞总蛋白量用BCATM Protein Assay试剂盒(PIERCE)检测。结果表明细胞在高糖浓度中分泌胰岛素的量是低糖浓度的六倍左右(图3I，图3I中胰岛素的含量单位为ng胰岛素/mg细胞总蛋白；柱A为27.7mM葡萄糖诱导的细胞分泌胰岛素的水平，是柱B(5.5mM葡萄糖诱导的)的六倍)。该结果表明ES来源的胰岛素阳性细胞能够同正常胰岛类似胰岛素的分泌受葡萄糖浓度的调控。
六、移植胰岛素分泌细胞到小鼠肾包囊中
为了证明ES细胞来源的胰岛素阳性细胞是否能够逆转糖尿病小鼠，移植了诱导后的细胞到STZ诱发的糖尿病小鼠的左侧肾包囊中(9只小鼠)。具体方法如下：
糖尿病小鼠模型的制备：向6到8周129公鼠腹腔内注射50mg/kg剂量的链尿霉素(STZ，Sigma)，连续注射5天。当血糖浓度高于13.9mM时，向小鼠左侧肾包囊中注射1×106个诱导得到的分化成熟细胞。对照组(12只小鼠)注射同等体积的PBS。血糖浓度用GlucoTREND2(Roche)血糖仪测试。取经过手术的肾脏进行冰冻切片和组化分析。结果表明移植分化细胞的小鼠(n＝9，虚线)存活率为70％，而移植PBS的对照组存活率只有25％(n＝12，实线)，移植细胞的小鼠的存活率是注射PBS对照鼠的三倍(n＝12)(图4A)。并且存活的小鼠能够维持其体重。约三周后，移植细胞的小鼠(5只)的血糖降到正常值范围(低于13.9mM)而注射PBS的小鼠(3只)的血糖持续维持在16mM以上(图4B)。此外，切除移植细胞的左肾后，糖尿病小鼠的血糖回升至13.9mM以上。对进行手术的肾脏进行冰冻切片免疫组化分析，结果表明注射PBS的小鼠的肾包囊没有检测到胰岛素阳性的细胞(图5A)，移植细胞的小鼠肾包囊中检测到胰岛素阳性的细胞(图5B)。这些结果表明ES细胞来源的胰岛素阳性的细胞可以逆转糖尿病小鼠的血糖。
实施例2、诱导人胚胎干细胞向胰腺细胞分化
所用的细胞系是人ES细胞H1或H9。(Thomson JA，Itskovitz-Eldor J，ShapiroSS，et al.Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.Science1998；282：1145-1147.)。
人ES细胞的培养温度为37℃。
培养基的化学组份是确定的，即chemical defined medium(CDM)培养基：50％IMDM(Gibco)，50％F12(Gibco)，monothioglycerol(sigma)450umol/L，insulin-transferrin-seleninumA(ITS，Gibco-BRL，按说明配制)，AlbuminFraction V(Sigma)5mg/ml。首先，人ES细胞转入CDM培养系统中诱导其分化。然后分别用activin A和RA诱导人ES细胞向胰腺前体细胞的定向分化。在此基础上，胰岛成熟条件参考小鼠ES细胞的培养方案，具体方法和结果如下：
第一步，胚胎小体(Embryonic bodies，EB)的形成及分化。
人ES细胞用胰酶常规消化后在Petri-dish(Alpha medical instrument)的培养皿中用含有10％胎牛血清的CDM培养基(不含LIF)悬浮培养诱导EB的形成，24至48小时后，形成EB集落。然后转移EB至1％Matrigel铺被的培养皿中按照如下方法用activin A和RA依次诱导：收集悬浮的EB将其转移到经1％Matrigel(人工重组基底膜)(BD Biosciences)铺被的细胞培养皿中。两小时后，EB开始铺展，此时将培养基换为含有10％胎牛血清和100ng/ml activin A(Sigma)的CDM培养基中培养24小时，然后EB转为用含10％胎牛血清的CDM培养6-8小时使EB分化。之后，分化EB接着用含有10％胎牛血清和1×10-6mol/L RA(Sigma)的CDM培养基继续诱导24小时，得到胰腺前体细胞。
第二步，胰岛前体细胞的扩增。
分化的EB细胞用含有10％胎牛血清和10ng/ml bFGF(Sigma)的CDM培养3-5天，诱导来源于EB的胰腺前体细胞的扩增。在此期间，大部分贴壁的细胞呈现上皮样结构。
第三步，胰腺β细胞(Pancreatic βcell)的成熟。
细胞转入含有N2和B27(Gibco-BRL，按产品说明配制)血清替代物，1ug/mlLaminin(Sigma)，10ng/ml bFGF以及10mmol/L nicot inamide(Sigma)的CDM培养基(Gibco-BRL)中继续培养3-5天，促进胰岛β细胞成熟。用尼康相差显微镜(TS-100)观察细胞的形态。在此阶段，培养皿中出现许多小的细胞团结构，得到成熟胰腺β细胞。
二、用RT-PCR检测分化的细胞基因的表达情况
按照实施例1步骤二的方法，采用RT-PCR检测分化细胞和对照细胞(在CDM培养而不加activin A和RA诱导)中somastatin(SST)，Glut2，Amylase(Amy)，Sox17，Hnf4α，pdx-1，Insulin(INS)，Hb9，glucokinase(GCK)，IFABP等基因的表达情况。其中，分化细胞为本方案得到的成熟β细胞，对照细胞是只用activin A和RA两种小分子其中之一诱导得到的细胞。
PCR引物如下：
Gapd：GTCATTGAGAGCAATGCCAG和GTGTTCCTACCCCCAATGTG(200bp)
Insulin：GAGGCCATCAAGCACCATCAC和GGCTGCGTCTAGTTGCAGTA(373bp)；
pdx-1：ACCAAAGCTCACGCGTGGAAA和TGATGTGTCTCTCGGTCAAGTT(200bp)；
glut2：GCTACCGACAGCCTATTCTA和CAAGTCCACTGACATGAAG(267bp)；
SST：GATGCTGTCCTGCCGCCTCC和TGCCATAGCCGGGTTTGA(292bp)；
Amy：CTGACAACTTCAAAGCAAA和TACAGCATCCACATAAATACGA(358bp)；
hnf4α：ATCAGAAGGCACCAACCTCAAC和TGTCTTTGTCCACCACGCACT(197bp)
Sox17：CAGTGACGACCAGAGCCAGACC和CCACGACTTGCCCAGCATCTT(292bp)；
Hb9：CCTAAGATGCCCGACTTCAACTCCC和GCCCTTCTGTTTCTCCGCTTCCTG(276bp)
GCK：AGGGAATGCTTGCCGACTC和CACTGGCCTCTTCATGGGT(375bp)；
IFABP：GGCGTTTGACAGCACTTGGA和CTCGGACAGTATTCAGTTCGTTTC(320bp)。
结果如图6A和图6B所示，表明人ES细胞分化后能够表达胰腺β细胞的标记基因如Insulin，pdx-1，glucokinase和glut2(图6A)。而不加activin A和RA只在CDM中培养的对照组基本上不表达上述胰腺细胞特异的基因(图6B)。
三、免疫组化分析
为了证明诱导的胰岛素阳性细胞同时表达C-peptide，对诱导后的细胞进行了pdx-1和C-peptide的组化检测，具体方法如下：
将本方案得到的成熟β细胞用甲醇固定，PBS洗三遍后用10％正常山羊或兔血清4℃封闭60分钟。弃血清，分别加C-peptide一抗(Linco)或pdx-1一抗(goatpolyclonal IgG，1∶200，Santa Cruz)4℃放置12小时。接着用罗丹明抗兔二抗IgG，FITC抗兔或抗羊二抗IgG(三个二抗均为1∶200，均购自Santa Cruz)以及生物素IgG(work solution，Santa Cruz)孵育。DAB用来作为生物素二抗的显色反应底物。并结合DAPI染色。用奥林帕斯(Olympus IX-71)成像体系观察。结果表明该方案得到的分化成熟细胞既表达胰岛素，又表达C-peptide和pdx-1(图7A-图7D)。
四、移植胰岛素分泌细胞到小鼠肾包囊中
为了证明ES细胞来源的胰岛素阳性细胞是否能够在体内环境下行使表达胰岛素的功能，移植了诱导后的细胞到STZ诱发的糖尿病小鼠的左侧肾包囊中(n＝12)。
具体方法如下：
糖尿病小鼠模型的制备：向6到8周的裸鼠腹腔内注射50mg/kg剂量的链尿霉素(STZ，Sigma)，连续注射5天。当血糖浓度高于13.9mM时，向小鼠左侧肾包囊中注射1×106个本方案诱导得到的分化成熟β细胞。对照组注射同等体积的PBS。30天后，用C-peptide和人细胞核特异性抗体(mouse anti-human nucleimonoclonal antibody，CHEMICON International)检测在肾包囊中人ES细胞来源的C-peptide的表达。对进行手术的肾脏进行冰冻切片免疫组化分析，结果表明注射PBS的小鼠的肾包囊没有检测到胰岛素阳性的细胞；而移植细胞的结果如图8A和图8B所示，图8A表明移植的人ES细胞来源的分化细胞表达C-peptide；图8B表明这些C-peptide阳性的细胞可以染上人特异细胞核抗体，表明其来源于人的ES细胞。
本实施例采用三步诱导法来诱导人ES细胞向功能性的胰岛素阳性细胞的定向分化。该诱导方法基于在成分明确的培养体系(CDM)中结合activin A，RA和其他成熟因子的作用，模拟体内胰腺的发育模式对人的ES细胞进行定向的诱导。经RT-PCR检测，人ES细胞分化后能够表达胰腺β细胞的标记基因如insulin，pdx1，glucokinase和glut2(图6A和图6B)。这些细胞同时也可以表达C-peptide(图7A-图7D)。将细胞移植到裸鼠的肾包囊中，仍然可以检测到C-peptide的表达，证明这些细胞在体内是有功能的(图8A和图8D)。该诱导方法对于在体外研究人胰岛的发育机制以及I型糖尿病的细胞治疗都具有重要的意义。
序列表
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acgccaaggt ctgaaggtcc       20

Claims (11)

1、诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法，是先将由胚胎干细胞形成的胚胎小体置于Matrigel上培养，再依次利用Activin A和顺式视黄酸处理所述胚胎小体，使其分化得到胰腺细胞。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Activin A的浓度为50-300ng/ml培养基，所述顺式视黄酸的浓度为1×10-7-1×10-5mol/L培养基。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述Activin A的浓度为100ng/ml培养基，所述顺式视黄酸的浓度为1×10-6mol/L培养基。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Matrigel的质量百分含量为1％。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述依次利用Activin A和顺式视黄酸处理胚胎小体使其分化的方法为将胚胎小体在加入Activin A的培养基中培养20-28小时后，转入无Activin A的培养基中培养6-8小时，再转入加入顺式视黄酸的培养基中培养20-24小时，得到胰腺前体细胞。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述诱导分化得到的胰腺前体细胞在含有碱性成纤维细胞生长因子的培养基中培养3-5天，使胰腺前体细胞扩增。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8-12ng/ml。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml。
9、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：将扩增得到的胰腺前体细胞用添加N2、B27血清替代物，层粘连蛋白，碱性成纤维细胞生长因子和烟酰胺的培养基培养3-5天，得到成熟的胰岛β细胞。
10、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述培养基是含N2和B27血清替代物，1μg/ml层粘连蛋白，10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子以及10mmol/L烟酰胺的DMEM/F12培养基或CDM/F12培养基。
11、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，当胚胎干细胞来源于小鼠时，所述胚胎小体在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养。
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