CN103266082A - 一种体外诱导胚胎干细胞分化为神经元的方法 - Google Patents
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Abstract
一种体外诱导胚胎干细胞分化为神经元的方法，包括如下步骤：分离，通过差速贴壁法将MEF与ES进行分离；EB悬浮，加入EB形成液重悬细胞，每10cm细菌培养皿接种浓度为2-3×106，培养2-4d，每1-2d进行换液；RA神经元诱导，使用浓度为1-5×10-7M的RA进行诱导2-4d，每2d进行换液；EB贴壁培养，使用PLL包被培养板，将EB接种于包被的培养板上，加入适量的EB形成液，培养1-2d；后期神经元诱导，使用神经元培养液培养。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种诱导分化细胞的方法。具体涉及一种胚胎干细胞体外诱导分化为神经元的方法。
背景技术
自从1998年Thomson等报道了人胚胎干细胞(embryonicstem cell，ESC)建株以来，ESC的研究引起了本领域研究人员的关注。由于ESC是从早期哺乳动物胚胎或原始生殖细胞中分离的具有自我复制能力和发育全能性的多潜能细胞系，在一定条件下可定向诱导分化为几乎所有种类的细胞。
诱导细胞分化的方法主要有3种：加细胞因子干预、共培养和转基因。以外源因子激活干细胞中某些组织特异的沉默基因，使细胞内的信号传导网络发生改变，或通过转基因强化某些基因的表达并抑制另一些基因的表达来形成某个单一谱系所特有的基因表达型式，从而诱导干细胞向特定类型组织细胞定向分化。然而，由于目前对ESC诱导分化过程中基因激活与沉默的机制以及胚层、组织和细胞间的信息网络所知甚少，因此，寻找新的有效诱导分化剂和诱导方法，建立优化的诱导体系使ESC向肝细胞定向分化实属必要。
ESC定向诱导分化的研究成为该领域的热点和难点课题。目前关于ES诱导成神经元的研发比较多，大部分是形成拟胚体（EB），再通过诱导因子如DMSO、维甲酸等进行诱导，但是对于EB的形成、培养及后期维持还是有相应的难度，对于诱导形成的神经元的诱导率也比较低，所以研发的难度也是一定的。
小鼠胚胎干细胞定向诱导成神经元一般使用的诱导因子有DMSO、RA等，但是具体的使用量和诱导时间没有明确的数据；流程上大部分是形成拟胚体（EB），再通过诱导因子如维甲酸等进行诱导，但是对于EB的形成、培养及后期维持还是有相应的难度，诱导形成神经元的细胞量较少，诱导率低也是一个难点。
发明内容
本发明的目的在于，为小鼠胚胎干细胞在体外定向诱导的研究提供一个低成本和高效率的操作方法，提高诱导成神经元的诱导率。
用于解决问题的方案
为了实现上述目的，本发明创造提供一种体外诱导胚胎干细胞分化为神经元的方法，包括如下步骤：
步骤A，分离，通过差速贴壁法将MEF与ES进行分离；
步骤B，EB悬浮，加入EB形成液重悬细胞，每个10cm细菌培养皿接种浓度为2-3×106Cells，培养2-4d，每1-2d进行换液；
步骤C，RA神经元诱导，使用浓度为1-5×10-7M的RA进行诱导2-4d，每1-2d进行换液；
步骤D，EB液贴壁培养，使用PLL包被培养板，将EB接种于包被的培养板上，加入适量的EB形成液，培养1-2d；
步骤E，后期神经元诱导，使用EB形成液和神经元培养液培养。
优选地，步骤A，通过差速贴壁法将MEF与ES进行分离，将胚胎干细胞接种于已用0.1%明胶包被过的细胞培养皿中，35℃-37℃培养30-45分钟，重复1-3次，进行ES和MEF分离。
优选地，步骤C，RA神经元诱导，使用浓度为5×10-7M的RA进行诱导2-4d，每1-2d进行换液。
优选地，步骤D，EB液培贴壁养，使用PLL包被培养板，将EB接种于包被的培养板上，加入适量的EB形成液，培养温度37℃，5%CO2培养1-2d。
更优选地，步骤A，通过差速贴壁法将MEF与ES进行分离，将胚胎干细胞接种于已用0.1%明胶包被过的细胞培养皿中，37℃培养40分钟，重复1-3次，进行ES和MEF分离。
优选地，步骤E，后期神经元诱导，使用EB形成液和神经元培养液培养，每天进行半数换液，一共6天。
本发明提供的方法，所述EB形成液为EB形成培养基（Cyagen），所述神经元培养液为神经元完全培养基（Cyagen），所述RA为前期诱导液，由EB形成培养基含5×10-7M的维甲酸形成。
本发明为小鼠胚胎干细胞在体外定向诱导的研究提供一个低成本和高效率的操作方法；明确诱导因子的使用浓度，提供了达到诱导最佳效果的RA浓度；达到提高有效的EB制备流程，提高诱导成神经元的诱导率，将一般的诱导率30-50%提高到80%以上。
附图说明
图1是本发明诱导方法流程图；
图2是本发明后期诱导8天（100x）图；
图3是本发明后期诱导8天（400x）图；
图4是本发明免疫荧光细胞核染色图；
图5是本发明免疫荧光Tubulin表达染色图。
具体实施方式
下面将结合本发明创造实施例中的附图，对本发明创造实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明创造部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明创造中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明创造保护的范围。
如图1所示，一种体外诱导胚胎干细胞分化为神经元的方法流程图。
实施例1
将ES和MEF进行分离：利用差数贴壁法，接种于已用0.1％明胶包被过的细胞培养皿中，37℃培养45分钟，收集上清离心，可重复1-3次，进行ES和MEF分离。
EB形成：加入EB形成液重悬细胞，接种2-3×106Cells于10cm细菌培养皿中，37℃，5％CO2培养4天，每2天进行换液。
RA神经元诱导：准备神经诱导液：配制RA进行诱导：1-5×10-7M进行诱导4天，每2天进行换液。
贴壁培养神经诱导的EB：使用PLL包被培养板，将EB接种于包被的培养板上，加入适量的EB形成液，37℃，5％CO2培养2天。
后期神经元诱导：2天后，使用EB形成液和神经元培养液培养，每天进行半数换液，一共6天，分不同培养天数进行免疫组化检测（抗体指标：Mouse β tubulin Ⅲ）。
实施例2
将ES和MEF进行分离：利用差数贴壁法，接种于已用0.1％明胶包被过的细胞培养皿中，37℃培养30分钟，重复2次，进行ES和MEF分离。
EB形成：加入EB形成液重悬细胞，接种2-3×106Cells于10cm细菌培养皿中，37℃，5％CO2培养4天，每2天进行换液。
RA神经元诱导：准备神经诱导液：配制RA进行诱导：4×10-7M进行诱导4天，每2天进行换液。其余步骤与实施例1相同。
实施例3
将ES和MEF进行分离：利用差数贴壁法，接种于已用0.1％明胶包被过的细胞培养皿中，37℃培养45分钟，收集上清离心，重复1次，进行ES和MEF分离。
EB形成：加入EB形成液重悬细胞，接种2-3×106Cells于10cm细菌培养皿中，37℃，5％CO2培养3天，每2天进行换液。
RA神经元诱导：准备神经诱导液：配制RA进行诱导：5×10-7M进行诱导4天，每2天进行换液。
贴壁培养神经诱导的EB：使用PLL包被培养板，将EB接种于包被的培养板上，加入适量的EB形成液，37℃，5％CO2培养2天。
后期神经元诱导：2天后，使用EB形成液和神经元培养液培养，每天进行半数换液，一共8天，分不同培养天数进行免疫组化检测（抗体指标：Mouse β tubulin Ⅲ）。
实施例4
将ES和MEF进行分离：利用差数贴壁法，接种于已用0.1％明胶包被过的细胞培养皿中，37℃培养40分钟，收集上清离心，重复分离1次，，进行ES和MEF分离。
EB形成：加入EB形成液重悬细胞，接种2-3×106Cells于10cm细菌培养皿中，37℃，5％CO2培养3天，每2天进行换液。
RA神经元诱导：准备神经诱导液：配制RA进行诱导：5×10-7M进行诱导3天，每2天进行换液。
贴壁培养神经诱导的EB：使用PLL包被培养板，将EB接种于包被的培养板上，加入适量的EB形成液，37℃，5％CO2培养2天。
后期神经元诱导：2天后，使用EB形成液和神经元培养液培养，每天进行半数换液，一共6天，分不同培养天数进行免疫组化检测（抗体指标：Mouse β tubulin Ⅲ）。
对比例
采用现有常规技术培养分化的神经元，将ES和MEF进行分离：利用差数贴壁法，接种于已用0.1％明胶包被过的细胞培养皿中，37℃培养45分钟，收集上清离心，进行ES和MEF分离。
EB形成：加入EB形成液重悬细胞，接种1×106Cells于10cm细菌培养皿中，37℃，5％CO2培养3天，每2天进行换液。
RA神经元诱导：准备神经诱导液：配制RA进行诱导：1×10-8M进行诱导2天，每2天进行换液。
后期神经元诱导：将EB接种于培养板上，加入适量的EB形成液体培养8-10天后，进行免疫组化检测（抗体指标：Mouse β tubulin Ⅲ）。
免疫组化检测结果如下表：
由此可见，本发明可以提高诱导成神经元的诱导率，将一般的诱导率30-50%提高到80%以上
以上所述，仅为本发明创造的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。因此，本发明创造的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种体外诱导胚胎干细胞分化为神经元的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A，分离，通过差速贴壁法将MEF与ES进行分离；
步骤B，EB悬浮，加入EB形成液重悬细胞，每个10cm细菌培养皿接种浓度为2-3×106Cells，培养2-4d，每1-2d进行换液；
步骤C，RA神经元诱导，使用浓度为1-5×10-7M的RA进行诱导2-4d，每1-2d进行换液；
步骤D，EB贴壁培养，使用PLL包被培养板，将EB接种于包被的培养板上，加入适量的EB形成液，培养1-2d；
步骤E，后期神经元诱导，使用EB形成液和神经元培养液培养。
2.根据权利要求1所述的体外诱导胚胎干细胞分化为神经元的方法，其特征在于，
步骤A，通过差速贴壁法将MEF与ES进行分离，将胚胎干细胞接种于已用0.1%明胶包被过的细胞培养皿中，35℃-37℃培养30-45分钟，重复1-3次，进行ES和MEF分离。
3.根据权利要求2所述的体外诱导胚胎干细胞分化为神经元的方法，其特征在于，
步骤D，EB贴壁培养，使用PLL包被培养板，将EB接种于包被的培养板上，加入适量的EB形成液，培养温度37℃，5%CO2培养1-2d。
4.根据权利要求3所述的体外诱导胚胎干细胞分化为神经元的方法，其特征在于，
步骤A，通过差速贴壁法将MEF与ES进行分离，将胚胎干细胞接种于已用0.1%明胶包被过的细胞培养皿中，37℃培养40分钟，重复1-3次，进行ES和MEF分离。
5.根据权利要求4所述的体外诱导胚胎干细胞分化为神经元的方法，其特征在于，
步骤C，RA神经元诱导，使用浓度为5×10-7M的RA进行诱导2-4d，每1-2d进行换液。
6.根据权利要求5所述的体外诱导胚胎干细胞分化为神经元的方法，其特征在于，
步骤E，后期神经元诱导，使用EB形成液和神经元培养液培养，每天进行半数换液，一共6天。
7.根据权利要求1-6任一所述的体外诱导胚胎干细胞分化为神经元的方法，其特征在于，
所述EB形成液为EB形成培养基，
所述神经元培养液为神经元完全培养基，
所述RA为前期诱导液，由EB形成培养基含5×10-7M的维甲酸形成。
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