CN101892265A - 稳定指示细胞自噬活动的表达载体及其建立和应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域，旨在提供一种稳定指示细胞自噬活动的表达载体及其建立和应用方法。本发明通过构建含有EGFP-LC3自噬报告基因的慢病毒表达质粒，采用四质粒系统，建立能够使细胞稳定表达EGFP-LC3基因的慢病毒表达载体。使用该表达载体感染宿主细胞，可将EGFP-LC3基因稳定整合入宿主细胞基因组，使宿主细胞稳定高效表达EGFP-LC3，指示细胞自噬变化。应用该表达载体可建立稳定的自噬指示细胞，并采用基于Top-hat算子和形态滤波的图像分析方法快速定量分析细胞自噬改变。本发明具有自噬指示稳定可靠、实时灵敏、自噬定量快速准确、操作简便等特点，极大地方便了自噬观察分析，可广泛应用于自噬相关研究。

Description

稳定指示细胞自噬活动的表达载体及其建立和应用方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种稳定指示细胞自噬活动的表达载体及其建立和应用方法。

背景技术

自噬是一种细胞自我降解消化的过程，是细胞的一种重要生命活动。在正常生理情况下，细胞依靠自噬清除衰老或受损的细胞器、更新某些重要蛋白；在细胞处于应激状态时，自噬激活增强，通过循环利用细胞内成份，维持能量和代谢稳态，清除受损蛋白质和细胞器，限制氧化损伤等，是维持细胞自我稳态和生存的重要机制。因其与人类许多疾病关系密切，特别是在肿瘤等重大疾病的发生发展中起重要作用，近年来成为研究热点，相关研究与日俱增。

自噬研究需要良好的自噬观察方法，理想的自噬观察方法应能够实时动态观察自噬变化，并能够快速定量分析自噬改变，使用应简单便捷、观察稳定可靠，可重复性良好。传统的自噬观察方法是使用透射电镜直接观察或通过吖啶橙染色荧光显微镜间接观察自噬体，以及通过Western blot检测自噬关键分子LC3的改变，推测自噬之改变。由于这些观察方法是对某个时间点的细胞内的自噬体或相关关键蛋白分子进行观察分析，因此无法实现实时动态观察，此外，这些方法还存在其它不足：①透射电镜法：为最早应用的经典方法，观察结果可靠，但是需要依赖透射电镜和精通自噬的技术人员完成图像观察分析和结果判定，而透射电镜和技术人员在国内配置稀缺，实验室通常不具备，观察往往需要预约等待，加上其观察样本制作过程繁琐，造成观察十分不便。同时由于电镜下观察视野有限和自噬体判断分析不易，在进行定量分析(所需细胞数量级至少10³)时往往由于工作量极大而无法实现，因此该方法目前仅用于进行定性观察，辅助分析自噬改变；②吖啶橙染色荧光显微镜法：利用自噬体对吖啶橙染料的染色差异实现自噬的检测(吖啶橙将自噬体染成亮红色，同时将细胞核和胞浆染成亮绿色)。但是吖啶橙对细胞外环境(如pH值)十分敏感，染色特异性差，易于出现假阳性结果或假阴性结果，可重复性差，稳定性不足，兼之操作要求高，应用已日益减少；③Western blot检测：为目前普遍运用的方法。该方法利用自噬的关键分子LC3在自噬发生过程中由LC3I变为LC3II，通过对LC3的改变检测自噬。这种方法虽然相对有效可靠，但是使用十分不便，操作繁琐，检测步骤多、时程长，对技术及设备要求较高，并只能进行半定量分析，此外，检测用抗体等试剂依赖进口、价格昂贵，以上种种因素，使其难以成为一种简便易用的观察手段，在需要进行大量自噬观察分析(如进行多作用因素、多作用水平对自噬影响的研究)时往往工作量极大，这在很大程度限制了其实际使用。

使用GFP荧光蛋白标记LC3形成GFP-LC3自噬报告基因标记细胞使细胞指示自噬，借助荧光显微镜观察自噬活动，是近年来出现的一项新技术。这项技术使得实时动态、迅速便捷地观察自噬成为可能。该方法利用自噬发生过程中自噬关键分子LC3由LC3I变为LC3II，LC3在细胞内的分布发生改变(由LC3I的细胞胞浆内弥散分布变为LC3II的富集于自噬体上)，以GFP(绿色荧光蛋白)标记LC3分子，通过荧光分布的改变(由GFP-LC3I弥散分布于细胞质之弥散绿色荧光变为GFP-LC3II富集于自噬体上形成绿色荧光亮点)及变化程度来观察分析自噬的发生和发生强度。理论上，该方法具有实时动态观察、简便快捷等诸多优势，但在实际工作中却不易实现。其主要问题在于缺乏能够高效稳定地将GFP-LC3自噬报告基因导入细胞并使之稳定表达的表达载体，以及快速可靠的自噬定量分析等应用方法。表达载体是将目的基因导入宿主细胞并使之表达的关键。目前广泛应用的表达载体是携带GFP-LC3基因的重组表达质粒，通过脂质体转染方法(瞬间转染)转入细胞内并使其在细胞内表达。这一方法存在诸多不足(特别是对于自噬研究尤为显著)：①转染效率低下：对于自噬研究的对象细胞(肿瘤细胞、神经元、心肌细胞等)，大多数转染效率低下(转染率一般不超过30％)；②不能稳定表达GFP-LC3基因：瞬间转染通常不能将目的基因整合入基因组，目的基因通常在细胞传代后表达即丧失，即使在瞬转后使用抗性进行筛选纯化后也不能获得稳定表达的细胞株，多次传代后即丧失表达。以上两点使稳定表达GFP-LC3，能够扩增传代的细胞难以建立。稳定表达GFP-LC3基因的自噬指示细胞难以建立将导致研究所需的足够数量级的细胞难以获得，将由于分析细胞数量不足等原因导致自噬定量分析无法实现，同时实验时将需要不断重复转染工作以获得研究所需细胞；③作用细胞类型有限：对于一些难转染的细胞，如干细胞等、某些肿瘤细胞、间质细胞等，几乎无法实现转染。这使得表达质粒的应用范围非常有限，很多细胞无法应用该方法进行自噬研究；④转染试剂具有细胞毒性和自噬诱导作用：转染试剂的毒性对细胞活力有很大影响(如细胞活力下降等)，并可诱发自噬发生，这对于自噬研究至关重要。转染试剂的毒性作用本身会诱发自噬，造成本底背景自噬很高，并在转染试剂去除后仍维持较长时间，在背景自噬高的情况下，将难以准确判断自噬的发生及改变，转染试剂的毒性和自噬诱导往往使该方法之应用陷入两难境地：因为转染效率和表达效率低下，为获得高转染效率和高表达，需要增加剂量，而剂量增加又导致细胞毒性作用和自噬诱导显著增加；⑤目前广泛应用的GFP-LC3质粒的LC3是采用大鼠源性LC3序列，尽管大鼠LC3与人LC3有很高的同源性，但是两者仍存在较大差别。目前绝大多数自噬研究在人源性细胞进行，继续沿用大鼠LC3将影响研究的可信性。传统表达载体及相应方法的种种不足促使新表达载体及方法的出现。慢病毒表达载体是近年来逐渐发展起来的一种新型表达载体，具有转染效率高(几乎所有的晡乳动物细胞，接近100％的转染效率)，高效稳定持久的目的基因表达(目的基因经逆转录后整合入宿主基因组)等优点，可克服传统表达载体及相应转染方法的诸多不足。但是，尽管慢病毒载体系统克服了传统载体及转染方法的很多不足，但是目前研究报道采用的慢病毒表达载体相对于自噬研究这一特殊领域仍然存在不足。其不足主要表现在表达载体的表达质粒功能欠缺以及快捷有效的定量分析等应用方法缺乏：①表达载体的表达质粒采用CMV启动子：实际应用显示CMV启动子活性对于GFP-LC3表达过高，易于表达过量，过量表达GFP-LC3一方面对于自噬研究，由于形成过强荧光背景，导致荧光斑点观察失真，影响自噬指示和定量分析，另一方面对于细胞，持续过高表达GFP-LC3基因形成高细胞内压力(stress)，导致较高程度的细胞毒性，影响细胞生长，细胞在传代后易于死亡，筛选稳定株及扩增不易；此外，CMV启动子可能增加被转染细胞与母细胞的生物学特性差异。CMV的这些不足需要相对温和的启动子；②标记蛋白常采用GFP：GFP荧光相对弱，为获得清晰的图像和良好的观察，通常需要加大病毒/细胞比，加大的病毒量导致细胞死亡增加，未死亡的细胞则因为遭受过多病毒攻击而细胞活力受到较大影响，背景自噬水平增高，影响自噬判断；③缺乏相应的稳定指示指示细胞系的建立方法：不同的细胞类型对于慢病毒表达载体的反应差异很大，而不同的慢病毒表达载体有其应用的特殊性，特别地对于建立自噬研究使用的细胞系，需要在建立细胞系时需要将对细胞自噬指示的影响降至最低，这些需要提供与表达载体对应的细胞系建立方法；④缺乏快速有效的自噬定量分析方法：传统的自噬定量方法为人工肉眼计数GFP-LC3自噬荧光亮点，再人工计数细胞，计算获得平均荧光亮点数/细胞。人工计数工作量很大(每一个处理组总计数细胞量通常在200以上，总荧光亮点计数量通常在1000以上)，尤其是在多因素、大样本量实验时工作非常繁重，计数者易于视疲劳计数出错，可靠性较差，同时人工计数主观随意性大，定量分析结果因缺乏足够客观性而可信度有限。

总之，目前的表达载体及相关应用方法不能满足自噬研究所需，迫切需要能够克服当前表达载体及方法不足的新型表达载体及其应用方法，该表达载体应能稳定高效指示细胞自噬活动，能以之建立稳定可靠的自噬指示细胞系并能够快速便捷地定量分析自噬变化，从而能够对细胞自噬活性进行实时动态观察分析，使研究工作能够快速、顺利进行。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够稳定指示细胞自噬活动的表达载体，同时提供表达载体的建立方法及其应用方法(包括应用该表达载体建立能够稳定指示自噬的自噬指示细胞的方法和定量分析细胞自噬的方法)。

本发明的技术方案如下：

一种稳定指示细胞自噬活动的表达载体，其方案是：所述的表达载体采用慢病毒表达载体，由慢病毒表达质粒pLV-UbC-EGFP-LC3和包装质粒pRsv-REV，pMD1g-pRRE，pMD2G四质粒组成，其中慢病毒表达质粒pLV-UbC-EGFP-LC3含有EGFP-LC3自噬报告基因。所述EGFP-LC3自噬报告基因为融合基因，由EGFP标记蛋白和人的LC3序列组成，采用Ubiquitin作为EGFP-LC3的启动子。EGFP标记蛋白是传统GFP标记蛋白的荧光增强改进产物(亮度35倍于传统野生型GFP)，克服了传统GFP的不足，拥有更佳的荧光观察效果和更小的表达载体(慢病毒)需求量。以人的LC3序列替代了目前广泛应用的大鼠源性LC3序列，避免了种属差异。Ubiquitin启动子较之传统的CMV启动子，启动作用温和，表达目的蛋白不易过量，对细胞影响小，避免了传统CMV启动子的不足。应用所述的表达载体感染宿主细胞后可将EGFP-LC3基因整合至其基因组，使宿主细胞稳定持久表达EGFP-LC3，利用EGFP-LC3自噬指示功能，稳定指示细胞自噬改变。

一种建立稳定指示细胞自噬活动的表达载体的方法，其方案是：采用慢病毒表达载体构建方法构建，步骤如下：(1)表达质粒构建：①NCBI获得LC3基因序列信息，人工合成人LC3基因；②EcoR V酶切pUC57质粒及合成LC3基因，将LC3基因片段插入pUC57载体，构建成pUC57-LC3；③转化感受态细胞，筛选克隆，提取质粒电泳及KpnI、HindIII双酶切鉴定，并测序确认插入产物；测序无误的克隆再接种扩增，进行质粒抽提；④用Nhe I和Age I对pUC57-LC3进行双酶切，酶切产物电泳后再做胶回收384bp的LC3基因片段；用Nhe I和Age I对pLV-UbC-EGFP-3FLAG表达质粒进行酶切，酶切产物电泳后做胶回收；⑤将LC3基因连接入表达质粒，构建成pLV-UbC-EGFP-LC3表达质粒；⑥转化感受态细胞，鉴定阳性克隆，接种阳性克隆，保种并分装送测序；测序无误的克隆再接种扩增，进行质粒抽提；(2)表达载体(慢病毒)包装、浓缩及滴度测定：①选择生长旺盛期293T细胞铺板，细胞密度为3×10⁶细胞/皿；②将无内毒素包装质粒pRsv-REV，pMD1g-pRRE，pMD2G和CaCl₂溶液混合后逐滴加入等体积的2×HBS中，加入混合溶液轻轻加入培养皿中并混匀后常规培养；③转染约8小时后用完全培养基进行换液；换液后24小时，在生物安全柜中收取上清病毒液，并加入含2％FBS的低血清培养基，24h后第二次收毒后，丢掉细胞；④振荡混匀后4℃以10,000g高速离心30min，吸干上清后加入适量OMEM溶解沉淀；⑤浓缩病毒后以PCR法检测每基因组整合的病毒拷贝数，于293T细胞测定滴度；慢病毒感染性滴度达1.0×10⁸TU/ml者冻存于-80度冰箱。

一种应用权利要求1所述的一种稳定指示细胞自噬活动的表达载体的方法，其方案是：应用表达载体建立稳定指示自噬活动的自噬指示细胞，并采用基于Top-hat算子和形态滤波的图像分析方法定量分析自噬改变，其方法步骤如下：(1)应用表达载体建立稳定指示自噬活动的自噬指示细胞：①确定表达载体感染细胞最佳感染复数(MOI)：感染复数(Multiplicityof Infection，MOI)是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI值越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高，但是病毒对于细胞有一定的毒性，病毒量增加细胞毒性增加。不同细胞的差异很大，对于分裂活跃的细胞(如Hela、293T细胞)，MOI＝2-5已经足够，而对于非分裂细胞，比如干细胞，则需要很高的MOI值。因此对于每一株细胞，需要从感染率、表达率、自噬指示功能及细胞毒性等几个方面综合考量，选择确定最佳MOI值。取被测细胞以24板均匀铺板×2，培养至30％融合，然后加入病毒培养液混合物，病毒的浓度按照梯度加入，感染复数分别取2.5，5，10，20，40，80，160，320，每个感染复数设三个复孔，感染后36-48h换液，感染后72h荧光显微镜观察拍照，统计感染率和表达率，继续培养至80％融合，其中一块24孔板的细胞以EBSS或Rapamycin诱导自噬发生，观察EGFP-LC3荧光亮点形成，统计亮点数，计算平均亮点/细胞值，另外一块24孔板的细胞以MTT法检测细胞活力及增殖力；按照感染率和表达率＞95％、表达强度高(1-2s曝光清晰成像)，自噬指示灵敏(荧光亮点成像清晰，与背景荧光分界清晰)，以及细胞活力及增殖良好的原则，取符合以上要求之最小MOI值为最佳感染MOI值；②表达载体(慢病毒)感染细胞：常规培养细胞，取对数生长期，30％融合，根据细胞量及最佳MOI值计算所需病毒，病毒稀释于培养液内，加入polybrene，混匀后作用对象细胞，感染后36-48h换液，72h荧光显微镜下观察确认后继续培养扩增；③分选筛选：以488nm光激发，使用配有高级荧光活性细胞分选器的流式细胞仪(如BD公司的FACSaria II)，根据荧光有无和荧光强弱，在无菌条件下分选出表达荧光强度在荧光强度均值以上的细胞；④培养扩增：分选纯化后的细胞常规培养，扩增，获得稳定指示自噬活动的自噬指示细胞，备研究使用。所建立的自噬指示细胞具有如下特性：稳定表达EGFP-LC3，表达率100％，自噬活动指示灵敏，可在激发波长为488nm、发射波长为510nm的条件下用荧光显微镜进行观察，荧光稳定不淬灭；EGFP-LC3基因整合入染色体基因组，传代不丢失，表达稳定，重复性好，其荧光强度不随肝癌细胞的连续传代而丢失；无自噬或低自噬活动时候本底背景自噬低；细胞活力良好，稳定传代，死亡率低，受病毒影响小，各细胞均可在常规条件下进行细胞传代；生物学特性与其母细胞基本一致，荧光基因的整合和表达基本不影响母细胞的主要生物学行为；(2)应用基于Top-hat算子和形态滤波的图像分析方法定量分析自噬改变：细胞内的自噬体数目代表细胞自噬活性程度，自噬体经表达载体指示为荧光亮点后，荧光亮点数等于自噬体数目，计数荧光亮点数目即可明确细胞自噬活性程度。自噬荧光亮点具有显著的图形特征(孤立于弥散分布的绿色荧光背景中的圆形亮点，具有相对高的亮度，较周围的组织密度大，与周围组织的灰度对比度大，轮廓明显等)，根据自噬荧光亮点的这些特征，以Top-hat算子结合disk型结构元素对图像处理，提取荧光亮点。再进一步利用自噬荧光亮点固有的形态特征(一定的面积大小的圆形，不同细胞类型大小不同)，设置形状及大小参数过滤，进行形态滤波处理进一步去除残留的混杂少量干扰目标，最终完成自噬荧光亮点的提取。荧光亮点提取后，以点计数计算或人工计数荧光亮点数。如果在Top-hat运算处理之前对图像进行对比增强等处理，则可以获得更好的提取和计数效果。以上图像运算处理通过专业生物图像分析软件的计算模块实现，可执行分析的专业生物图像分析软件包括MetaMorph、Image-Pro Plus等。Top-hat运算通过Top-hat滤器(filter)实现，如Image-Pro Plus的filters中的Top-hat滤器，MetaMorph的Top Hat algorithm等；形态滤波计算通过软件的形态滤器实现，如Image-Pro Plus的计数功能中的measurements模块设置形态参数过滤；点计数计算通过点计数模块实现，如Image-Pro Plus的计数模块；图像对比增强可通过对比增强模块或锐化filter等实现，如Image-Pro Plus的filters的Sharpen EnhancementFilter。自噬定量分析的具体步骤如下：①以自噬研究相关细胞处理因素处理前述已建立的自噬指示细胞；②采用荧光显微镜于同一条件(相同曝光时间，背景灰度，放大倍数、视野数等)下摄片获得荧光图像，每个处理组随机取至少五个视野，使受分析细胞总数＞500；③以专业生物图像分析软件之Top-hat模块、形态滤波模块实现以下图像运算分析，提取EGFP-LC3自噬荧光亮点：以Top-hat算子结合disk结构元素运算抑制去除荧光背景，进一步根据被研究细胞的大小不同，测量自噬荧光亮点之最大径和最小径，以大小一定的圆形设置形态滤波过滤去除假阳性干扰目标，提取出EGFP-LC3自噬荧光亮点；④以专业生物图像分析软件之点自动计数模块计数提取出的EGFP-LC3自噬荧光亮点获得总荧光亮点数；⑤以专业生物图像分析软件之细胞计数模块或人工计数受分析细胞数；⑥计算每个细胞的荧光亮点数，获得平均荧光亮点数/细胞，重复以上步骤，数据输入SPSS统计软件，通过SPSS以“平均荧光亮点数/细胞”为变量，对比各组差异，分析细胞自噬改变。

本发明的优点：本发明所述的表达载体克服了传统质粒及相应转染方法的不足，具有转染效率高、作用细胞类型广泛、表达稳定高效、能够整合入基因组实现稳定表达传代、荧光亮度高、自噬指示灵敏可靠、细胞毒性小，使用安全、操作简便等优点；使用该表达载体感染宿主细胞可建立能够稳定指示细胞自噬活动的自噬指示细胞，所建立的细胞稳定表达EGFP-LC3自噬报告基因，自噬指示灵敏，荧光稳定不淬灭，细胞活力良好，本底背景自噬低(指示真实可靠)，EGFP-LC3基因染色体整合度高、遗传性状稳定，传代后表达不减弱丢失，细胞生物学行为与其相应的母细胞一致；本发明给出的基于Top-hat算子和形态滤波图像分析方法的自噬定量分析方法，消除了人工计数分析的弊端，实现了自噬的半自动化定量分析，大大减轻了自噬分析的工作量，实现了自噬的快速可靠定量。

本发明的有益效果：本发明所述的稳定指示细胞自噬活动的表达载体及应用表达载体感染宿主细胞建立的自噬指示高效、稳定、灵敏迅捷、真实可靠、操作简便易用、对研究条件设备、人员技术要求低(具备普通荧光显微镜即可开展工作)，相应的自噬定量分析方法简单易用、快速准确、可靠便捷。这些可极大地方便自噬的相关研究(尤其在工作量大的自噬研究中具有重要意义)，缩短研究所需时间，节省研究者的精力，加速自噬研究的进程。

本发明的应用价值：本发明可广泛应用于自噬的相关研究，具有广阔的应用前景和潜在的社会与经济价值。例如：①自噬分子机制研究的有力工具：自噬的分子机制如上游调节机制等目前并未完全明了，本发明是自噬分子生物学研究的有力工具，可方便自噬的分子机制等研究，有助于对自噬的深入了解和其分子机制的进一步阐明。特别地，因本发明建立的自噬指示灵敏、迅速、并可快速定量分析，可以快速观察分析上游调节系统改变对下游的调节作用，特别有利于分子调节机制的研究；②自噬在肿瘤等疾病发生发展中的作用的相关研究：自噬与肿瘤等疾病的发生发展密切相关，疾病的形成和进展是一个动态的过程，本发明能够实时稳定指示自噬，是实时动态观察自噬在疾病发生发展过程中改变的有力工具，对观察了解自噬在疾病形成进展过程中的作用具有重要应用价值。如自噬在恶性肿瘤侵袭转移中的作用，可以通过本发明建立稳定指示自噬的自噬指示细胞系，再以自噬指示细胞建立体外及体内侵袭转移模型，观察自噬在侵袭转移过程中的作用；③自噬诱导剂及抑制剂的选择和工作浓度的快速确定：自噬诱导及抑制(药物及RNAi)在自噬研究中具有非常重要的作用。自噬相关研究结论需要通过自噬诱导/抑制剂进行验证，而自噬诱导/抑制剂对于不同的研究对象细胞其作用浓度(工作浓度)差别很大，因此进行自噬研究必须先行针对性地确定被研究细胞的自噬诱导/抑制剂的药物种类和药物工作浓度。应用本发明表达载体建立之自噬指示细胞系，通过设置对照，横向比较不同药物和不同工作浓度的诱导/抑制效果，可以快速选择合适的自噬诱导/抑制剂并确定其工作浓度；④自噬相关药物研发：由于自噬在疾病发生发展中的重要作用，自噬已经成为疾病治疗的一个重要靶点。自噬相关药物作为潜在的治疗药物开发正成为研究热点。药物的研发，无论是新药还是经典药物的改进，都涉及到大量的药物诱导或抑制自噬作用效果观察，本发明建立的自噬指示简捷迅速、稳定可靠，可胜任该工作。例如，肿瘤化疗耐药与自噬高度相关，抑制自噬可以减弱肿瘤耐药，寻找高效安全的自噬抑制剂是相关研究的关键，本发明可应用于自噬抑制剂之快速筛选(可建立稳定自噬指示细胞系，再建立体外及体内模型，实时观察并定量分析不同自噬抑制剂对化疗药物耐药性之影响，完成药物的快速筛选)；⑤应用于传统方法难以转染的细胞的研究：本发明采用的是慢病毒表载体，具有转染效率高，作用细胞范围广泛特点，对于传统方法难以转染的细胞如原代细胞，干细胞等都可以建立稳定指示自噬的的相应细胞系，从而使得这类细胞能够得以研究并可能籍此产生新的发现；⑥用于模式生物等特别应用：由于利用本发明之表达载体建立的细胞能够发出绿色荧光，可以在自噬指示同时于体外和体内示踪所研究细胞，结合模式生物等可为研究提供极大的便利。例如：在斑马鱼体内，可方便地跟踪研究对象细胞并同时观察细胞自噬之改变；在肿瘤细胞裸鼠种植瘤体内，可示踪肿瘤细胞转移，应用冰冻切片共聚焦扫描原位荧光观察技术，可同时观察细胞的自噬改变，使得体内原位研究成为可能。

附图说明

图1组成本发明所述的表达载体的慢病毒四质粒系统(表达质粒pLV-UbC-EGFP-LC3，包装质粒pRsv-REV，pMD1g-pRRE，pMD2G)的结构示意图

图2表达载体自噬指示功能检测

图3定量分析细胞自噬

图4表达载体感染难转染细胞(HCCLM3肝癌细胞，Caco-2结肠癌细胞及NIH3T3成纤维细胞)建立相应的稳定自噬指示细胞系

图5应用本发明快速检测标准血药浓度的不同化疗药物对HCCLM3肝癌细胞自噬的影响

图6应用表达载体建立的自噬指示细胞系快速筛选确定自噬抑制剂的工作浓度

图7应用本发明之表达载体建立HCCLM3肝癌自噬指示细胞观察细胞在脱离ECM状态下自噬改变

具体实施方式

实施例1：本实施例用以说明稳定指示细胞自噬活动的表达载体的构建过程，以及应用表达载体建立自噬指示细胞和定量分析应用；

(1)表达载体构建：①表达质粒构建：NCBI获得LC3基因序列信息，人工合成LC3基因。EcoR V酶切pUC57质粒及合成LC3基因，将LC3基因片段插入pUC57载体，构建成pUC57-LC3。转化感受态细胞，筛选克隆，提取质粒电泳及KpnI、HindIII双酶切鉴定，并测序确认插入产物。测序无误的克隆再接种扩增，进行质粒抽提。用Nhe I和Age I对pUC57-LC3进行双酶切，酶切产物电泳后再做胶回收384bp的LC3基因片段。用Nhe I和Age I对pLV-UbC-EGFP-3FLAG表达质粒进行酶切，酶切产物电泳后做胶回收。将LC3基因连接入表达质粒，构建成pLV-UbC-EGFP-LC3表达质粒(图1)。转化感受态细胞，鉴定阳性克隆(用菌落PCR鉴定转化子)，接种阳性克隆，保种并分装送测序。测序无误的克隆再接种扩增，进行质粒抽提；②表达载体(慢病毒)包装、浓缩及滴度测定：选择生长旺盛期293T细胞铺板，细胞密度为3×10⁶细胞/皿。将无内毒素包装质粒pRsv-REV，pMD1g-pRRE，pMD2G(图1)和CaCl₂溶液混合后逐滴加入等体积的2×HBS中，加入混合溶液轻轻加入培养皿中并混匀后常规培养。转染约8小时后用完全培养基进行换液。换液后24小时，在生物安全柜中收取上清，并加入含2％FBS的低血清培养基，24h后第二次收毒后，丢掉细胞。振荡混匀后高速离心(10,000g，30min，4℃)，吸干上清后加入适量OMEM溶解沉淀，浓缩病毒后以PCR法检测每基因组整合的病毒拷贝数，于293T细胞测定滴度。慢病毒感染性滴度达1.0×10⁸TU/ml者冻存于-80度冰箱；

(2)应用表达载体建立肝癌细胞SMMC7721自噬指示细胞：①确定表达载体感染细胞最佳感染复数(MOI)：取肝癌细胞SMMC7721以24板均匀铺板×2，培养至30％融合，然后加入病毒培养液混合物，病毒的浓度按照梯度加入，感染复数分别取2.5，5，10，20，40，80，160，320，每个感染复数设三个复孔，感染后36-48h换液，感染后72h荧光显微镜观察拍照(图2-1，2)，统计感染率和表达率，继续培养至80％融合，其中一块24孔板的细胞以Rapamycin(200nM作用6h)诱导自噬发生，观察EGFP-LC3荧光亮点形成(图2-3，4)，统计亮点数，计算平均亮点/细胞值，另外一块24孔板的细胞以MTT法检测细胞活力及增殖力；按照感染率和表达率＞95％、1-2s曝光清晰成像，自噬荧光亮点与背景荧光分界清晰，以及细胞活力及增殖力良好，取符合以上要求之最小感染复数，确定MOI＝40为最佳感染感染复数；②表达载体感染细胞：常规培养SMMC7721细胞于六孔板，取对数生长期，30％融合，以MOI＝40根据细胞量计算所需病毒，病毒稀释于2ml培养液内，加入polybrene(1ul/2ml)，混匀后作用对象细胞，感染后36-48h换液，72h荧光显微镜下观察确认后继续培养扩增，部分细胞设置自噬诱导复行检测自噬指示功能。图2-1和图2-2低倍镜图像示高效转染和表达(转染效率＞99％)，图2-3和图2-4高倍镜图像示自噬诱导试验证实自噬指示功能良好(图2-3为诱导前荧光呈弥散分布，图2-4为诱导自噬后细胞的胞浆内出现荧光亮点)；③分选筛选：以488nm光激发，使用配有高级荧光活性细胞分选器的流式细胞仪(BD公司的FACSaria II)，在无菌条件下分选出表达荧光强度在荧光强度均值以上的细胞；④培养扩增：分选纯化后的细胞常规培养，扩增，一部分细胞持续传代，25代后重复以上功能检测(图2-5，6，7，8)，可见细胞在转染效率，表达强度，自噬指示功能等方面保持稳定，无明显衰减；⑤实验应用或冻存保种：获得的SMMC7721自噬指示细胞实验应用或冻存保种；

(3)应用基于Top-hat算子和形态滤波的自噬定量分析方法分析细胞自噬改变：SMMC7721自噬指示细胞以Rapamycin(200nM作用6h)诱导自噬，设置空白对照，采用最常见的实验室配置(普通荧光显微镜和Image-Pro Plus图像分析软件)定量分析自噬改变。首先以同一条件参数拍摄不同处理的细胞图片(曝光时间为1.5s)(图3-1)，随机选取拍摄至少五个观察视野。细胞图片导入Image-Pro Plus图像分析软件，以Top hat滤镜过滤图像除去背景荧光获得EGFP-LC3自噬荧光亮点(图3-2)，以计数模块中的形态滤波进一步标记过滤去除干扰点(图3-3)，然后对自噬荧光亮点进行自动计数(图3-3，4)获得总的荧光亮点数，以计数模块再计数细胞数量，总的荧光亮点数除以细胞数获得每个观察视野的平均荧光亮点数(荧光亮点数/细胞)，每组至少计数五个视野图片，各图片获得之平均荧光亮点数导入SPSS统计软件进行统计分析。

实施例2至5用以进一步说明本发明的具体应用

实施例2

应用本发明所述的表达载体感染难转染细胞建立相应的自噬指示细胞系

某些细胞株是普通转染方法(如脂质体法)难以转染的细胞株，转染率通常仅有不到10％，如果细胞株同时对转染试剂的毒性敏感则转染成功细胞量更少，难以进行后继实验。同时传统转染方法的背景自噬程度高(图4-左侧)。本例以HCCLM3肝癌细胞，Caco-2结肠癌细胞及NIH3T3成纤维细胞三株难转染细胞为代表，使用本发明的表达载体建立对应的自噬指示细胞(同时设置传统的质粒脂质体瞬间转染为对照)。首先以发明内容中所述的确定表达载体感染宿主细胞的最佳感染复数的方法步骤确定HCCLM3，Caco-2及NIH3T3各细胞株的最佳感染复数为20，40和160，然后分别使用表达载体以各自最佳感染复数感染各细胞，36-48h后更换培养液，72h后荧光显微镜下观察。继续培养扩增至10⁷数量级，以BD公司FACSariaII流式细胞分选仪于无菌条件下按照荧光强度在细胞群荧光强度均值以上分选细胞，继续培养扩增，建立各自稳定指示自噬的自噬指示细胞系(图4-右侧)，所获得的细胞100％表达，荧光表达强度高(1s曝光清晰成像)，细胞毒性小，背景自噬低(几乎不诱发细胞自噬发生)。取部分细胞以梯度浓度的Rapamycin(50，100，200，400，800，1600nM)作用6h行自噬诱导，验证自噬指示功能灵敏有效。取新建自噬指示细胞的各自母细胞为对照，检测细胞增殖能力，设置移动侵袭试验检测两组肿瘤细胞的移动侵袭能力，比较两组的生物学行为(生长、增殖，肿瘤细胞的侵袭转移等)，表明两种细胞生物学行为一致无显著差别。继续培养，传代至25代，重复检测荧光表达强度，重复诱导自噬验证自噬功能，证实细胞在感染率、表达率、表达强度，自噬指示灵敏度，以及细胞活力等各方面均无明显减弱。

实施例3

应用本发明进行肝癌细胞化疗耐药性与自噬相关研究

肿瘤对化疗药物的耐受是肿瘤治疗的重要障碍，其相关研究一直是热点。近年来的研究显示自噬是肿瘤细胞化疗耐药的重要机制，抑制自噬化疗敏感性增加。肿瘤耐药的体外研究需要对不同细胞株在不同化疗药物及不同药物剂量作用下自噬的改变分别进行检测，以常规的Western blot、透射电镜等方法等进行检测工作量非常庞大，应用本发明可使工作量大大减少，完成快速筛选。本例检测标准血药浓度水平的8种不同化疗药物对HCCLM3肝癌细胞自噬的影响。取对数生长期的自噬指示HCCLM3肝癌细胞铺24孔板，设3复孔，细胞长至60％融合，设置空白对照，化疗药物处理组加入含有标准血药浓度的化疗药物的培养液，6h后，荧光显微镜下观察自噬改变并定量分析，可见各化疗药物诱导肝癌细胞的能力不同(图5-1，2，3，4，5，6，7，8分别为Sorafenib，Doxorubicin，Paclitaxel，Rapamycin，Cisplatin，Velcade，Oxaliplatin及5-FU)。较之传统的western blot方法，本方法工作量大大降低，同时无论是细胞还是其他研究因素的齐性均得到良好保证，增加研究结果的可靠性。

实施例4

应用本发明快速筛选确定自噬抑制剂工作浓度

自噬抑制剂是自噬研究之必不可少的研究工具。绝大多数自噬相关研究需要通过自噬抑制剂进行验证，而自噬抑制剂对于不同的细胞其有效作用浓度(工作浓度)差别很大，因此进行自噬研究前必须先行针对性地确定被研究细胞的自噬抑制剂的工作浓度。传统的方法是通过Western blot、透射电镜等完成，工作量大，步骤繁多，耗时长，应用本表达载体建立之细胞系可以快速确定自噬抑制剂工作浓度。方法如下(以HCCLM3肝癌细胞及自噬抑制剂3-MA为例)：以表达载体感染并建立HCCLM3自噬指示细胞，对数生长期铺于24孔板，取3复孔，细胞长至40-60％融合，以梯度浓度(0，10，20，40，60，120，240，480μmol/L)加入自噬抑制剂3-MA，然后以自噬诱导剂(Rapamycin)诱导自噬，显微镜下观察自噬，定量分析平均荧光亮点数/细胞，作自噬抑制曲线，统计分析被抑制程度，计算确定工作浓度。图6示应用表达载体建立HCCLM3自噬指示细胞快速筛选确定自噬抑制剂3-MA的工作浓度。图6-1为自噬诱导阳性对照(Rapamycin 200nM浓度诱导自噬，3-MA浓度为0)，图6-2至图6-6为细胞与浓度逐渐增高的自噬抑制剂3-MA共培养，然后进行自噬诱导，分析自噬抑制程度，图6-6对应浓度为所需工作浓度。

实施例5

应用本发明进行肝癌细胞失巢凋亡与自噬相关研究

自噬与肝癌细胞的失巢凋亡耐受关系密切。失巢凋亡(anoikis)的体外研究需要使用poly-HEMA覆盖的培养皿培养细胞以模拟细胞脱离基底膜的生长状态(失巢状态)。常规实验条件下，在自行铺设poly-HEMA时，由于要尽量做到poly-HEMA面水平，防止培养皿面积小的情况下胶面因分子张力形成弧形面而导致细胞发生接触团集(细胞在poly-HEMA上生长为非贴壁生长状态，如果呈弧面，细胞将聚集于皿中央，导致细胞间接触团集，影响研究结果)，通常需要大或较大面积的培养皿(如10cm直径)。使用大面积的培养皿决定了研究细胞的需求量很大。这种情况下通过使用传统的脂质体瞬间转染和抗性筛选方法难以获取大量目的细胞(瞬转稳筛获得的细胞量有限，并且在扩增传代过程中EGFP-LC3表达减弱或丧失)。使用本发明之表达载体构建的自噬指示细胞系可以克服该问题而获得大量稳定高效表达EGFP-LC3的细胞，使该研究得以开展。本实例显示应用本发明建立自噬指示肝癌细胞观察细胞在失巢状态下细胞的自噬改变：以实施例1所述方法感染HCCLM3肝癌细胞建立自噬指示细胞HCCLM3-ATG，常规培养扩增至所需数量级(2×10⁶/皿)。取常规10cm直径培养皿及poly-HEMA覆盖的10cm直径培养皿，以2×10⁶/皿密度铺于培养皿内，常规培养，激光共聚焦显微镜观察细胞在贴壁和脱壁生长0h，24及48小时后细胞自噬的改变(图7)，使用Volocity图像分析软件进行定量统计分析。

Claims (3)

1.稳定指示细胞自噬活动的表达载体，其特征是：所述的表达载体采用慢病毒表达载体，由慢病毒表达质粒pLV-UbC-EGFP-LC3和包装质粒pRsv-REV，pMD1g-pRRE，pMD2G四质粒组成，其中慢病毒表达质粒pLV-UbC-EGFP-LC3含有EGFP-LC3自噬报告基因；所述EGFP-LC3自噬报告基因为融合基因，由EGFP标记蛋白和人的LC3序列组成，采用Ubiquitin作为EGFP-LC3的启动子；应用表达载体感染宿主细胞后将EGFP-LC3基因整合至其基因组，使宿主细胞稳定持久表达EGFP-LC3，利用EGFP-LC3自噬指示功能，稳定指示细胞自噬改变。

2.一种建立权利要求1所述的稳定指示细胞自噬活动的表达载体的方法，其特征是：采用慢病毒表达载体构建方法构建，步骤如下：

(1)表达质粒构建：

①NCBI获得LC3基因序列信息，人工合成人LC3基因；

②EcoR V酶切pUC57质粒及合成LC3基因，将LC3基因片段插入pUC57载体，构建成pUC57-LC3；

③转化感受态细胞，筛选克隆，提取质粒电泳及KpnI、HindIII双酶切鉴定，并测序确认插入产物；测序无误的克隆再接种扩增，进行质粒抽提；

④用Nhe I和Age I对pUC57-LC3进行双酶切，酶切产物电泳后再做胶回收384bp的LC3基因片段；用Nhe I和Age I对pLV-UbC-EGFP-3FLAG表达质粒进行酶切，酶切产物电泳后做胶回收；

⑤将LC3基因连接入表达质粒，构建成pLV-UbC-EGFP-LC3表达质粒；

⑥转化感受态细胞，鉴定阳性克隆，接种阳性克隆，保种并分装送测序；测序无误的克隆再接种扩增，进行质粒抽提；

(2)表达载体(慢病毒)包装、浓缩及滴度测定：

①选择生长旺盛期293T细胞铺板，细胞密度为3×10⁶细胞/皿；

②将无内毒素包装质粒pRsv-REV，pMD1g-pRRE，pMD2G和CaCl₂溶液混合后逐滴加入等体积的2×HBS中，加入混合溶液轻轻加入培养皿中并混匀后常规培养；

③转染约8小时后用完全培养基进行换液；换液后24小时，在生物安全柜中收取上清病毒液，并加入含2％FBS的低血清培养基，24h后第二次收毒后，丢掉细胞；

④振荡混匀后4℃以10,000g高速离心30min，吸干上清后加入适量OMEM溶解沉淀；

⑤浓缩病毒后以PCR法检测每基因组整合的病毒拷贝数，于293T细胞测定滴度；慢病毒感染性滴度达1.0×10⁸TU/ml者冻存于-80度冰箱。

3.一种应用权利要求1所述的稳定指示细胞自噬活动的表达载体的方法，其特征是：应用表达载体建立稳定指示自噬活动的自噬指示细胞，并采用基于Top-hat算子和形态滤波的图像分析方法定量分析自噬改变，其具体步骤如下：

(1)应用表达载体建立稳定指示自噬活动的自噬指示细胞：

①确定表达载体感染细胞最佳感染复数：取被测细胞以24板均匀铺板×2，培养至30％融合，然后加入病毒培养液混合物，病毒的浓度按照梯度加入，感染复数分别取2.5，5，10，20，40，80，160，320，每个感染复数设三个复孔，感染后36-48h换液，感染后72h荧光显微镜观察拍照，统计感染率和表达率，继续培养至80％融合，其中一块24孔板的细胞以EBSS或Rapamycin诱导自噬发生，观察EGFP-LC3荧光亮点形成，统计亮点数，计算平均亮点/细胞值，另外一块24孔板的细胞以MTT法检测细胞活力及增殖力；按照感染率和表达率＞95％、1-2s曝光清晰成像，自噬荧光亮点与背景荧光分界清晰，以及细胞活力及增殖力良好，取符合以上要求之最小感染复数为最佳感染感染复数；

②表达载体感染细胞：常规培养细胞，取对数生长期，30％融合，根据细胞量及最佳MOI值计算所需病毒，病毒稀释于培养液内，加入polybrene，混匀后作用对象细胞，感染后36-48h换液，72h荧光显微镜下观察确认后继续培养扩增；

③分选筛选：以488nm光激发，使用配有高级荧光活性细胞分选器的流式细胞仪，根据荧光有无和荧光强弱，在无菌条件下分选出表达荧光强度在荧光强度均值以上的细胞；

④培养扩增：分选纯化后的细胞常规培养，扩增，获得稳定指示自噬活动的自噬指示细胞，备研究使用；

(2)应用基于Top-hat算子和形态滤波的图像分析方法定量分析自噬改变：

①以自噬研究相关细胞处理因素处理上述自噬指示细胞；

②采用荧光显微镜于同一条件下摄片获得荧光图像，每个处理组随机取至少五个视野，使受分析细胞总数＞500；

③以专业生物图像分析软件之Top-hat模块、形态滤波模块实现以下图像运算分析，提取EGFP-LC3自噬荧光亮点：以Top-hat算子结合disk结构元素运算抑制去除荧光背景，进一步以大小一定的圆形设置形态滤波过滤去除假阳性干扰目标，提取出EGFP-LC3自噬荧光亮点；

④以专业生物图像分析软件之点自动计数模块计数提取出的EGFP-LC3自噬荧光亮点获得总荧光亮点数；

⑤以专业生物图像分析软件之细胞计数模块或人工计数受分析细胞数；

⑥计算每个细胞的荧光亮点数，获得平均荧光亮点数/细胞，重复以上步骤，数据输入SPSS统计软件，统计分析。

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