CN113403340A - 一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法和应用，通过构建可用于活体检测心肌细胞自噬以及自噬流的转基因斑马鱼模型，并建立相关药物处理后对心肌细胞自噬水平以及自噬流变化的检测方法。该方法不仅可以快速检测各类药物对调节心肌细胞自噬的作用，还可用于心肌细胞自噬相关药物的筛选、自噬在心脏各类疾病中的作用以及不同分子通路在心肌细胞自噬调节中的机制研究等。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，尤其是涉及一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法和应用。
背景技术
自噬是调节细胞稳态的重要通路，目前多项研究工作表明心肌细胞的自噬在心脏发育、心脏疾病的发生和治疗中有重要作用。相关研究表明调节心肌细胞自噬从而减少心肌细胞凋亡的是缓解各类心脏疾病的重要途径之一。
自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡(自噬小体)，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，以实现细胞稳态和细胞器更新。细胞可以通过自噬途径降解自身的非必需成分来提供能量和营养，也可以降解一些毒性成分以阻止细胞损伤和凋亡。目前的自噬检测主要是通过观察膜状结构的自噬体以及检测自噬标志物LC3，且由于LC3检测的便利性更常见的是检测自噬标志物LC3来指针自噬水平。通过荧光蛋白融合LC3可通过荧光信号聚集点来统计自噬小体的数量和密度从而分析自噬发生的水平。
以往检测动物模型中心肌细胞的自噬水平是处死动物获取心脏组织并通过切片后生化或对特定分子的染色后来检测，这样往往需要较多实验环节和周期，成本较大，同样也不能检测自噬调节的动态过程，且无法快速以及较大规模的检测各类药物或不同分子途径在调节心肌细胞自噬中的作用。
中国专利CN 112322661 A公开了一种精确定量检测自噬流的方法，步骤如下：(1)构建EGFP/LC3HIBIT共表达载体，EGFP和LC3HIBIT分别用于独立的启动子，互不影响；(2)通过瞬转或筛选单克隆的方法，获得EGFP和LC3-HIBIT蛋白的共同表达的细胞；(3)筛选单克隆稳转细胞后，可在此细胞的基础上进行与自噬相关的各种遗传操作，及筛选自噬相关药物等；(4)在多功能酶标仪上设置程序分别测定发光和荧光读值，以EGFP为该实验中的内参，校准因细胞差异导致的HIBIT读值，从而准确反映细胞的自噬程度。但是该专利技术方案是非活体检测，应用局限性较大。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种可快速大规模检测各类药物或不同分子途径在调节心肌细胞自噬中的作用的指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
提供一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法，包括以下步骤：
构建特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼，该特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼中能够共表达EGFP-LC3；
构建特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼，该特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼中能够共表达mRFP-EGFP-LC3。
进一步地，利用tol2转座子系统构建特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼，或构建特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼。
进一步地，构建荧光蛋白EGFP和自噬相关蛋白LC3共表达的载体，然后基于该载体获得特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼。
进一步地，构建荧光蛋白EGFP、荧光蛋白mRFP和自噬相关蛋白LC3共表达的载体，然后基于该载体获得特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼。
进一步地，使用斑马鱼myl7启动子在斑马鱼心肌细胞中表达荧光蛋白EGFP和自噬相关蛋白LC3；或，
使用斑马鱼myl7启动子在斑马鱼心肌细胞中表达荧光蛋白EGFP、荧光蛋白mRFP和自噬相关蛋白LC3。
进一步地，特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼中，EGFP融合自噬相关蛋白LC3标记自噬小体；
特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼中，mRFP融合EGFP-LC3标记自噬小体和自噬溶酶体。
本发明还提供基于上述构建方法获得的指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的应用，所述指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型在自噬相关的心脏病机制研究、药物测试或治疗方法筛选中的应用。
进一步地，利用所述指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型，活体检测斑马鱼心肌细胞自噬水平和自噬流情况，包括以下步骤：
(1)构建特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼，以及构建特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼，
(2)斑马鱼幼鱼药物处理及心脏停跳后成像统计分析
使用不同药物处理特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼或特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼幼鱼；
将心脏做停跳处理后进行精细荧光成像，根据荧光成像结果来统计分析心肌细胞的自噬水平或自噬流的情况。
进一步地，使用EGFP和mRFP的激光通道对心脏组织进行单层或多层成像；成像图片分别统计自噬小体的数量、密度；或统计自噬小体与自噬溶酶体比率。
进一步地，通过统计mRFP、EGFP共表达的信号指示自噬小体的数量和密度，而仅mRFP阳性的信号指示自噬溶酶体的数量和密度，且比较自噬小体和自噬溶酶体的比例分析自噬流进展情况。
本发明还提供一种活体检测斑马鱼心肌细胞自噬水平和自噬流情况的方法，该方法包括以下步骤：
(1)特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼，或者特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼：
利用tol2转座子系统构建斑马鱼转基因品系；使用斑马鱼myl7启动子特异在心肌细胞中表达基因；EGFP融合自噬相关蛋白LC3标记自噬小体；mRFP融合EGFP-LC3标记自噬小体和自噬溶酶体；
(2)斑马鱼幼鱼药物处理及心脏停跳
使用不同药物处理斑马鱼幼鱼，并使用PTU抑制色素形成；成像前使用4％PFA固定幼鱼或BDM停跳心脏后立即使用20倍、40倍或60倍物镜成像；
(3)斑马鱼心肌细胞自噬活体成像
使用EGFP和mRFP的激光通道对心脏组织进行单层或多层成像；
(4)图像分析统计心肌细胞自噬水平或自噬流
成像图片分别统计自噬小体的数量、密度；或统计自噬小体与自噬溶酶体比率。
步骤(1)所述利用tol2转座子系统构建斑马鱼转基因品系具体方法是：构建转基因质粒时将tol2的5’和3’元件分别加在需转入斑马鱼基因组的片段两侧，同时在体外合成转座酶的mRNA，在斑马鱼受精卵中通过显微注射同时导入该转基因质粒和转座酶的mRNA各25pg，将注射过的胚胎养至成年，外交后通过荧光信号和PCR方法筛选转基因子代。
步骤(2)不同药物处理斑马鱼幼鱼是指将待测试药物根据实际处理效果使用不同的有效浓度，目前测试的药物浓度的大体范围在1μM到100mM之内，浸泡斑马鱼幼鱼。斑马鱼幼鱼为2～7天大的斑马鱼；
所述的使用PTU抑制色素形成是指为防止斑马鱼色素细胞影响心肌细胞自噬的成像，在斑马鱼胚胎受精的22-24小时内加入PTU(终浓度0.003％)来抑制色素细胞的生成，并每天换液直至成像实验。
本发明还提供一种活体检测斑马鱼心肌细胞自噬水平和自噬流情况的方法在自噬相关的心脏病机制研究、药物测和治疗中的应用。
荧光蛋白EGFP具有酸敏感性，其在酸性条件下荧光强度显著降低，而荧光蛋白mRFP则对酸的敏感度不高。在自噬发生过程中，当自噬小体与溶酶体结合形成自噬溶酶体后，其酸性环境显著增强，从而在自噬溶酶体中EGFP的强度显著降低，而mRFP则变化不大。因此，可通过mRFP、EGFP和LC3融合后，通过统计mRFP、EGFP共表达的信号指示自噬小体的数量和密度，而仅mRFP阳性的信号指示自噬溶酶体的数量和密度，且可比较自噬小体和自噬溶酶体的比例分析自噬流进展情况。在生理状态下，斑马鱼心脏持续跳动，可将心脏做停跳处理(后期可恢复心跳)进行精细荧光成像，可根据荧光成像结果来统计分析心肌细胞的自噬水平或自噬流的情况。
斑马鱼幼鱼模型具有体外受精、个体体积小、成像透明的优点，非常便于活体观察和成像，且其药物处理的操作也极为简单，因此构建可活体检测心肌细胞自噬水平的斑马鱼模型对于该领域的研究和药物测试筛选意义重大。
本发明正是基于此建立活体小动物模型来快速检测心肌细胞自噬水平或自噬流情况，可用于研究心肌细胞自噬相关心脏病的机制以及药物和治疗方法测试。
本发明通过构建可用于活体检测心肌细胞自噬以及自噬流的转基因斑马鱼模型，并建立相关药物处理后对心肌细胞自噬水平以及自噬流变化的检测方法。该方法不仅可以快速检测各类药物对调节心肌细胞自噬的作用，还可用于心肌细胞自噬相关药物的筛选、自噬在心脏各类疾病中的作用以及不同分子通路在心肌细胞自噬调节中的机制研究等。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明建立活体检测心肌细胞自噬水平或自噬流的转基因斑马鱼模型。通过在斑马鱼心肌细胞中特异表达荧光蛋白融合自噬标记物LC3，通过自噬相关药物测试表明该模型可以很好得指针心肌细胞的自噬水平。
2)可靠性：通过重复多次试验以及不同的药物测试发现，斑马鱼中检测心肌细胞自噬可稳定地指针不同药物对心肌细胞自噬的调控情况。
3)推广前景：目前尚未有斑马鱼模型用于快速检测心肌细胞自噬或自噬流的模型和相应方法的相关报道。因此，本发明开发的方法对于自噬相关的心脏病的研究以及可调节心肌细胞的自噬的药物以及治疗方法的筛选和测试至关重要。
附图说明
图1为检测心肌细胞自噬的斑马鱼品系建立和验证；其中：a)转基因质粒结构示意图；b)转基因品系显示斑马鱼心脏表达EGFP；c)PCR鉴定基因型；d)实施例1中共聚焦显微镜对斑马鱼心脏明场成像图；e)实施例1中使用激光共聚焦显微镜对CQ组和control组的幼鱼心脏部位的成像结果；
图2为检测心肌细胞自噬体和自噬溶酶体的斑马鱼品系建立和验证；其中a)转基因质粒结构示意图；b)PCR鉴定基因型；c)实施例2中使用共聚焦显微镜对心脏成像明场成像图；其中，d为对照组，e为加药诱导组；
图3为实施例3中不同药物处理后24小时后斑马鱼心脏的共聚焦显微镜成像图；
图4为实施例4中斑马鱼MIRI模型中检测心肌细胞自噬体流情况；
a)为MIRI组和control组的斑马鱼心脏共聚焦显微镜成像图；b)图片统计的自噬小体和自噬溶酶体的密度数据。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
检测心肌细胞自噬的斑马鱼品系建立和验证，如图1所述，具体方法如下：
(1)特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼：
利用tol2转座子系统构建斑马鱼转基因品系，包括从斑马鱼基因组中克隆斑马鱼myl7启动子用来特异在心肌细胞中表达基因；从斑马鱼cDNA模板中克隆LC3自噬相关蛋白，并通过PCR融合将EGFP融合于LC3的N端用以标记自噬小体；将myl7启动子以及EGFP-LC3次序连接与含有tol2元件的载体中构建转基因质粒(如图1a展示了转基因质粒结构示意图，图1b展示转基因品系显示斑马鱼心脏表达EGFP)；提取构建好的质粒并与转座酶mRNA混合注射各25pg于斑马鱼受精卵中；养殖注射的斑马鱼胚胎至成年；与野生型斑马鱼外交得到子代斑马鱼幼鱼，并在受精后2-3天通过荧光和PCR鉴定稳定的转基因品系(如图1c所示)；将正确的转基因斑马鱼受精后2天大的幼鱼浸泡氯喹(CQ)20μM，24小时后使用4％的多聚甲醛固定，作为CQ组；以不加药物组作为control组，并立即使用共聚焦显微镜对CQ组和control组的幼鱼心脏成像，确认品系是否可显示自噬小体，如图1d所示，可以看出，在本实施例中明场成像显示转基因品系的整体发育和心脏发育正常；
(2)斑马鱼幼鱼药物处理及心脏停跳
使用不同药物处理斑马鱼幼鱼，并使用PTU抑制色素形成；成像前使用4％PFA固定幼鱼或BDM停跳心脏后立即使用20倍、40倍或60倍物镜成像；
不同药物处理斑马鱼幼鱼(不同药物的具体浓度根据实际情况，以不影响斑马鱼幼鱼发育的整体形态为标准)，浸泡斑马鱼幼鱼；其中，CQ组表示幼鱼浸泡氯喹(CQ)20μM，control组表示不加药物组。斑马鱼幼鱼为2～7天大的斑马鱼；
使用PTU抑制色素形成是指斑马鱼胚胎在受精后22-24小时内加入PTU处理(终浓度为0.003％)，每天换液一次至成像点。
(3)斑马鱼心肌细胞自噬活体成像
使用EGFP的激光通道对CQ组和control组的幼鱼心脏组织进行单层或多层成像；将需要成像的斑马鱼幼鱼心脏停跳后立即使用激光共聚焦显微镜对心脏部位成像，通道选取488纳米波长的激光，设置图像分辨率为1024X1024像素点，可选择20倍、40倍或60倍物镜以及放大成像区域(ZOOM)1-4倍来对单层或多层进行成像。
(4)图像分析统计心肌细胞自噬水平
成像图片分别统计自噬小体的数量、密度。成像图片使用ImageJ软件打开，统计荧光小点(如图1e所示)的数量，并可同时选取心脏组织的整体区域，使用软件自带的功能统计面积，并根据荧光小点数量除以面积得到自噬小体的密度。从图1e可以看出，诱导自噬后，心肌细胞中自噬体数量显著增加(箭头所示)。
实施例2
检测心肌细胞自噬体和自噬溶酶体的斑马鱼品系建立和验证，如图2所述，具体方法如下：
(1)特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼：
利用tol2转座子系统构建斑马鱼转基因品系，包括从斑马鱼基因组中克隆斑马鱼myl7启动子用来特异在心肌细胞中表达基因；从斑马鱼cDNA模板中克隆LC3自噬相关蛋白，并通过PCR融合将mRFP以及EGFP按顺序融合于LC3的N端用以标记自噬小体；将myl7启动子以及mRFP-EGFP-LC3次序连接与含有tol2元件的载体中构建转基因质粒(如图2a所示)；提取构建好的质粒并与转座酶mRNA混合注射各25pg与斑马鱼受精卵中；养殖注射的斑马鱼胚胎至成年；与野生型斑马鱼外交得到子代斑马鱼幼鱼，并在受精后2-3天通过荧光和PCR鉴定稳定的转基因品系(如图2b所示)；将正确的转基因斑马鱼受精后2天大的幼鱼浸泡氯喹(CQ)20μM，24小时后使用4％的多聚甲醛固定，并立即使用共聚焦显微镜对心脏成像，确认品系是否可显示自噬小体和自噬溶酶体，如图2c所示，可以看出，在本实施例中明场成像显示转基因品系的整体发育和心脏发育正常；
(2)斑马鱼幼鱼药物处理及心脏停跳
不同药物处理斑马鱼幼鱼(不同药物的具体浓度根据实际情况，以不影响斑马鱼幼鱼发育的整体形态为标准)，浸泡斑马鱼幼鱼；其中，CQ组表示幼鱼浸泡氯喹(CQ)20μM，control组表示不加药物组，斑马鱼幼鱼为2～7天大的斑马鱼；
使用PTU抑制色素形成是指斑马鱼胚胎在受精后22-24小时内加入PTU处理(终浓度为0.003％)，每天换液一次至成像点；
(3)斑马鱼心肌细胞自噬活体成像
使用EGFP和mRFP的激光通道对心脏组织进行单层或多层成像；将需要成像的斑马鱼幼鱼心脏停跳后立即使用激光共聚焦显微镜对心脏部位成像，通道选取488和595纳米波长的激光，设置图像分辨率为1024X1024像素点，可选择20倍、40倍或60倍物镜以及放大成像区域(ZOOM)1-4倍来对单层或多层进行成像。
(4)图像分析统计心肌细胞自噬水平和自噬流
成像图片分别统计自噬小体的数量、密度；或统计自噬小体与自噬溶酶体比率。
成像图片使用ImageJ软件打开，统计荧光小点(如图d-e所示，诱导自噬后，心肌细胞中自噬体(灰色箭头所示)和自噬溶酶体(白色箭头所示)数量显著增加)的数量，包括mRFP和EGFP共定位的小点(灰色箭头所示)和只有mRFP标记的小点(白色箭头所示)，并可同时选取心脏组织的整体区域，使用软件自带的功能统计面积，并根据mRFP和EGFP共定位的荧光小点数量除以面积得到自噬小体的密度，以及仅mRFP标记的小点数量除以面积得到自噬溶酶体体的密度，自噬小体的密度和自噬溶酶体的密度间的比值用于统计自噬流的水平。
实施例3
不同药物对心肌细胞自噬的调节实验，结果如图3所示。
药物测试方法如实施例1中的CQ处理方法，其中control组为不加药物组，麝香使用DMSO溶成饱和溶液后1：16000稀释使用；阿托伐他汀钙使用DMSO溶成饱和溶液后1:8000稀释使用；左卡尼汀注射液1:20稀释使用；二丁酰环磷腺苷钙注射液1:200稀释使用；盐酸曲美他嗪使用水溶成饱和溶液后1:500稀释使用；酒石酸美托诺尔使用水溶成饱和溶液后1:2000稀释使用；缬沙坦使用DMSO溶成饱和溶液后1:8000稀释使用；阿司匹林使用DMSO溶成饱和溶液后1:4000稀释使用。药物处理后24小时使用共聚焦显微镜成像，发现这些药物可显著增加心肌细胞自噬小体的数量(如图3中荧光小点)。
实施例4
斑马鱼MIRI模型中检测心肌细胞自噬体流情况：使用40μM的BDM处理受精后3天大的幼鱼时其心脏停跳，3个小时后洗脱BDM使心跳恢复以建立MIRI模型组，作为MIRI组，而对照组正常养殖，无任何其它处理过程，作为control组。24小时后使用4％PFA固定并立即对心脏成像(如实施例2中方法)，结果如图4所示，根据图片统计自噬小体的密度和自噬溶酶体的密度，发现MIRI模型中自噬小体和自噬溶酶体的密度相对于对照显著上升。进一步使用自噬溶酶体的密度除以自噬小体的密度，并与对照比较发现MIRI组中自噬流的进展显著降低。
从图4可以看出，MIRI中斑马鱼心肌细胞自噬体和自噬溶酶体显著上升，但自噬流的进展显著下降。
Claims (10)
1.一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
构建特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼，该特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼中能够共表达EGFP-LC3；
构建特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼，该特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼中能够共表达mRFP-EGFP-LC3。
2.根据权利要求1所述的一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，利用tol2转座子系统构建特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼，或构建特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼。
3.根据权利要求1或2所述的一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，构建荧光蛋白EGFP和自噬相关蛋白LC3共表达的载体，然后基于该载体获得特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼。
4.根据权利要求1或2所述的一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，构建荧光蛋白EGFP、荧光蛋白mRFP和自噬相关蛋白LC3共表达的载体，然后基于该载体获得特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼。
5.根据权利要求1或2所述的一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，使用斑马鱼myl7启动子在斑马鱼心肌细胞中表达荧光蛋白EGFP和自噬相关蛋白LC3；或，
使用斑马鱼myl7启动子在斑马鱼心肌细胞中表达荧光蛋白EGFP、荧光蛋白mRFP和自噬相关蛋白LC3。
6.根据权利要求1所述的一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼中，EGFP融合自噬相关蛋白LC3标记自噬小体；
特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼中，mRFP融合EGFP-LC3标记自噬小体和自噬溶酶体。
7.基于权利要求1所述构建方法获得的指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的应用，其特征在于，所述指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型在自噬相关的心脏病机制研究、药物测试或治疗方法筛选中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，利用所述指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型，活体检测斑马鱼心肌细胞自噬水平和自噬流情况，包括以下步骤：
(1)构建特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼，以及构建特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼，
(2)斑马鱼幼鱼药物处理及心脏停跳后成像统计分析
使用不同药物处理特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼或特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼幼鱼；
将心脏做停跳处理后进行精细荧光成像，根据荧光成像结果来统计分析心肌细胞的自噬水平或自噬流的情况。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，使用EGFP和mRFP的激光通道对心脏组织进行单层或多层成像；成像图片分别统计自噬小体的数量、密度；或统计自噬小体与自噬溶酶体比率。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，通过统计mRFP、EGFP共表达的信号指示自噬小体的数量和密度，而仅mRFP阳性的信号指示自噬溶酶体的数量和密度，且比较自噬小体和自噬溶酶体的比例分析自噬流进展情况。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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Application publication date: 20210917 Assignee: Shanghai lanque biomedical Co.,Ltd. Assignor: ZHONGSHAN HOSPITAL, FUDAN University Contract record no.: X2022980023577 Denomination of invention: Construction and application of a transgenic zebrafish model indicating autophagy or autophagic flow of myocardial cells License type: Exclusive License Record date: 20221124 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210917 |