CN105424666B - 一种快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的方法，该方法采用血管特异表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼，通过直接在斑马鱼培养用水中加入待测药物，检测斑马鱼尾静脉网的相对面积，建立了一种快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进的方法，以用于药物筛选。在斑马鱼实验中，本发明首次将尾静脉网相对面积作为血管生成作用的评价新指标，分析待测物是否具有促进血管生成作用，更加科学、客观，提高了结果的准确性。

Description

一种快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的 方法
技术领域
本发明涉及一种快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的方法，具体是一种通过检测血管特异表达绿色荧光的转基因斑马鱼的尾静脉网的相对面积来快速评价外源性药物或环境异物对斑马鱼血管生成的促进作用的方法，属于药物筛选领域。
背景技术
血管生成与多种疾病相关。血管生成不仅存在于胚胎发育时期，在整个生命周期均有重要的生理、病理意义。在成人，其涉及肿瘤、炎症、缺血性疾病、糖尿病视网膜病、创伤愈合等诸多病理过程而成为研究的重点。血管生成是连续、复杂的过程，是细胞-细胞(内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、纤维细胞)之间，细胞和细胞因子之间在不同时空协同作用的结果。
治疗性血管生成的概念，最早由Hockel于1993年提出，与传统的治疗手段(血管搭桥)不同，它是利用成血管诱导因子或内皮祖细胞，模拟体内血管生成的机制，达到促血管新生，改善侧支循环的目的，即通过刺激和诱导新生血管的形成来治疗和预防以局部缺血为特征的临床各类疾病。实际上就是指以增加新生血管、改善血运为主要措施来治疗临床上缺血性及其相关疾病的方法的总称。现已经广泛应用于缺血性及其相关疾病：心脏缺血、肢体缺血、皮瓣愈合、周围神经损伤、伤口愈合等。
目前研究血管生成的动物模型主要有：大鼠模型、鸡胚尿囊膜模型和斑马鱼模型。研究表明，斑马鱼与人类在血管发育过程中的基因、信号通路具有高度同源性，其结构、生理、分子水平等方面与人类都很接近，而且与大鼠、鸡胚尿囊膜模型相比，斑马鱼具有成本低、饲养条件要求低、个体小适合于高通量筛选、幼鱼身体透明易于观察血管发育的特点，具有明显的优势，因此，采用斑马鱼进行血管生成的研究具有凸显的优势。
在斑马鱼评价血管生成促进作用的实验中，目前使用指标主要是节间血管、肠下静脉，利用节间血管或肠下静脉的数量、长度、棘突数量等作为评价依据。但是在实际的实验过程中各自存在不足之处；1、利用节间血管作为指标的方法中，需要事先加入血管生成抑制剂损伤节间血管，再观察药物的促进再生作用。受试药物的作用体现受制于血管生成抑制剂的作用，受试药物逆转的是采用的抑制剂的作用靶点和通路，筛选的范围受抑制剂选择的局限。2、以肠下静脉为指标的方法中，由于肠下静脉本身为篮球网状结构，对其拍照非常困难，斑马鱼拍摄时的体位严重影响肠下静脉的成像，进而影响结果的计算和统计。
中国专利文献CN101179935公开了一种缺血性视网膜组织的血管再生和为此目的的筛选方法，该筛选方法使用小鼠为模型，以潜在治疗剂向所述小鼠的眼给药；使所述小鼠安乐死并从给予所述推定治疗剂的所述眼中取出基本上整个视网膜；对给予了所述推定治疗剂的所述眼的所述视网膜血管系统进行染色并制备显微图像，图像显示所述染色视网膜中血管闭塞面积和视网膜前新生血管丛面积；同时做对照试验，并将所述染色视网膜中的视网膜前新血管丛面积与小鼠对照眼的染色视网膜中可观察到的视网膜前血管丛面积进行比较，该方法受试药物的作用体现受制于血管生成抑制剂的作用，受试药物逆转的是采用的抑制剂的作用靶点和通路，筛选的范围受抑制剂选择的局限，且步骤繁琐。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的方法，该方法采用血管特异表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼，通过直接在斑马鱼培养用水中加入待测药物，检测斑马鱼尾静脉网的相对面积，成功地建立了一种快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进的方法，具有操作简单、快速、稳定可靠和重复性好的优点。
术语说明：
尾静脉(tPCV)网面积：指的是斑马鱼躯干泄殖孔至尾尖区域的静脉丛构成的面积，特指血管转基因斑马鱼的tPCV外围轮廓范围内的面积，图1中虚线圈定的范围为尾静脉(tPCV)网面积。
尾静脉网对应的节间血管(ISV)区域面积：是指沿泄殖孔画垂直后主动脉(DA)的直线，直线尾尖侧的部分中，以DA为界，腹侧为tPCV网，背侧为ISV区，图1中实线圈定的范围为节间血管(ISV)区域面积。
hpf(hours post fertilization)：生物学专用术语，指受精后的时间，如24hpf指受精后24小时的胚胎。
本发明的技术方案如下：
一种快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的方法，包括步骤如下：
(1)将受精后21～24h的发育正常斑马鱼胚胎移入培养孔中，对培养孔中的斑马鱼胚胎连续给药孵育，记为待测化合物组；同时在相同条件下以不给药孵育设置对照，记为对照组；
(2)麻醉孵育后对照组、待测化合物组的每条斑马鱼，采集每条斑马鱼的荧光显微图像，记录斑马鱼尾部血管荧光情况，测量每组斑马鱼的尾静脉(tPCV)网面积以及尾静脉网对应的节间血管(ISV)区域面积，按照如下公式计算tPCV网相对面积：
tPCV网相对面积＝tPCV网面积/对应的节间血管(ISV)区域面积；
(3)定量分析
计算得到的每组斑马鱼tPCV网相对面积以表示，分析比较对照组、待测化合物组之间差异的显著性；
当待测化合物组斑马鱼的大于对照组斑马鱼的且达到统计学上的显著性水平(P<0.05)，待测化合物组斑马鱼的节间血管(ISV)无缺失，说明待测药物对斑马鱼的血管生成具有促进作用。
根据本发明优选的，所述斑马鱼胚胎为血管荧光标记的转基因斑马鱼胚胎。血管荧光标记的转基因斑马鱼胚胎可采用本领域普通市售产品，如血管荧光转基因斑马鱼Tg(VEGFR2:GFP)，山东省科学院斑马鱼药物筛选中心提供。
根据本发明优选的，步骤(1)中，斑马鱼胚胎为21-24hpf的斑马鱼胚胎，最为优选的，斑马鱼胚胎为24hpf的斑马鱼胚胎。21-24hpf的斑马鱼胚胎鱼尾部血管网尚未形成，为最理想的给药时间，48hpf的斑马鱼胚胎及以后观察结果，斑马鱼48hpf tPCV网的面积在经过数据处理之后，与药物或环境异物对新生血管的促进作用具有一定相关性。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述的给药方式为将斑马鱼胚胎不间断浸泡在药液中，直至观察结果。
根据本发明优选的，待测化合物组、对照组每组斑马鱼胚胎总数不少于8枚，孵育温度为26～30℃，避光孵育，优选的，孵育温度为28℃，孵育时间为1天～1天23h。
根据本发明优选的，步骤(2)中斑马鱼的麻醉为采用质量浓度为0.3‰的三卡因浸泡40～90s进行麻醉。
根据本发明优选的，步骤(2)中采集图像为将斑马鱼胚胎固定侧面体位固定，在荧光显微镜下观察、拍照，获得斑马鱼胚胎的侧位图像。
进一步优选的，步骤(2)中，采集的图像是在同一的放大倍数下获得的，图像格式为jpg格式。
根据本发明优选的，步骤(2)中测量面积为利用图像处理软件Image J对采集的图像进行测量，测量前先校准标尺，得到准确的面积。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中的定量分析，是在待测化合物组斑马鱼的节间血管(ISV)无缺失条件下进行。
也就是说，本发明采用tPCV网的相对面积进行评价促进血管生成的作用，首要条件是节间血管(ISV)没有缺失，或者说是在节间血管(ISV)没有缺失的条件下，48hpf斑马鱼tPCV网的相对面积可作为促进血管生成的作用的评价新指标。
48hpf斑马鱼tPCV网的相对面积与药物或环境异物促进血管生成的作用呈正相关。与tPCV网面积相比，tPCV网相对面积具有新颖的、实际的意义，能够用于反映血管生成的作用的促进作用以及作用强弱。tPCV网相对面积克服了单纯tPCV网面积的不足，避免了斑马鱼体长、个体发育、药物其他作用干扰等因素，更加准确。
在正常发育的48hpf斑马鱼胚胎，其尾静脉(泄殖孔至尾部的静脉丛，tPCV)形成一个网状结构。发明人意外发现，这个区域的tPCV当受到外界药物或环境异物刺激时，会发生变化。正常的斑马鱼的tPCV网的腹部下缘基本呈平滑状，但是有药物或环境异物刺激时，会出现空穴、棘突等出现。正常的斑马鱼的tPCV网从泄殖孔开始朝向尾尖逐渐收窄，但是当药物或环境异物刺激时，会出现凸出或膨大。正常的斑马鱼的tPCV网分布在后主动脉(DA)下方，上缘紧挨DA呈直线状，但是当药物或环境异物刺激时，会出现弯曲等现象。在经过仔细的筛选和验证后，发明人惊喜地发现，48hpf斑马鱼tPCV网的面积在经过数据处理之后，与药物或环境异物对新生血管的促进作用具有一定相关性。
ISV是斑马鱼血管生成的评价指标，可以推测药物对血管生成的影响，当药物具有抑制血管生成作用时，ISV会出现数量缺失、长度缩短、发育畸形、排列紊乱等现象。如果在药物处理24h后，ISV出现了缺失，即意味着药物具有的作用是血管生成的抑制作用。换言之，当ISV出现缺失，即使PCV网的面积出现变化，依然不能判定药物或环境异物是否具有血管生成的促进作用。本发明采用tPCV网的相对面积进行评价促进血管生成的作用，首要条件是节间血管(ISV)没有缺失，将斑马鱼尾静脉网(tPCV网)相对面积作为斑马鱼血管生成评价的检测指标，更加科学、客观，提高了结果的准确性。
本发明的优点
1、本发明将斑马鱼尾静脉网(tPCV网)相对面积作为斑马鱼血管生成评价的检测指标，更加科学、客观，提高了结果的准确性。建立的斑马鱼血管生成作用的评价体系和方法具有操作简单、快速、稳定可靠和重复性好的优点。
2、斑马鱼尾静脉网面积大，利用其轮廓计算面积，实施方便、简单。
3、斑马鱼尾静脉网在斑马鱼自然侧躺的状态下，即能够比较理想地呈现，不需要严格的侧位摆放操作，图像采集时受体位摆放因素影响小，令操作更加简单。
4、本发明建立的方法可用外源性药物或环境异物的血管生成作用的活性和毒性评价，适用范围广。
附图说明
图1为正常斑马鱼tPCV网及节间血管区域的荧光照片；图中，虚线圈定的范围为尾静脉(tPCV)网面积，实线圈定的范围为节间血管(ISV)区域面积；
图2为实施例1丹红注射液对斑马鱼血管生成的促进作用的荧光照片；
图中：a为对照组斑马鱼tPCV网及节间血管区域的荧光照片；b为丹红注射液处理组斑马鱼tPCV网及节间血管区域的荧光照片；
图3为对比小分子药物(PTK787)对PCV网形成的荧光照片；
图中：a为对照组斑马鱼tPCV网及节间血管区域的荧光照片；b为小分子药物(PTK787)处理组斑马鱼tPCV网及节间血管区域的荧光照片。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明的技术方案作进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实验动物：采用血管荧光标记的转基因斑马鱼(Tg(VEGFR2：GFP))，购自山东省科学院斑马鱼药物筛选中心。雌雄斑马鱼在照明14h/黑暗10h、28℃标准条件下分开饲养，定时喂以颗粒状饵料和丰年虾。用卵时，取健康性成熟的斑马鱼，按雌雄1/1或1/2的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，半小时后将成鱼捞出，使排卵时间控制在半小时内，次日9～10时获得受精卵，收集受精卵。
实施例中所用其他原料均为常规市购产品，其中：中药丹红注射液为原液；丹参素分子量为198.17，CAS号为76822-21-4，纯度在95％以上，用二甲基亚枫溶解配制；小分子药物(PTK787)购自sigma公司，CAS号为212141-51-0，用二甲基亚砜(DMSO)溶解配制。
实施例1快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的方法
1、将收集的受精卵，对受精卵进行消毒和清洗，移入斑马鱼胚胎培养用水中，28℃下控光培养。将受精后24h的发育正常斑马鱼胚胎在体视显微镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，移入24孔培养板中，每孔10枚，吸取60μL中药丹红注射液至培养孔中，然后用培养水加至2mL。然后加盖，置于光照培养箱(28℃)让胚胎继续发育1天，记为待测化合物组；同时在相同条件下以不给药孵育设置对照，记为对照组；
2、在斑马鱼胚胎48hpf时(即斑马鱼胚胎给药后继续发育1天)，将斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉1min，然后固定斑马鱼胚胎于侧面体位，在荧光显微镜下观察、拍照，获得斑马鱼胚胎的荧光显微图像，记录斑马鱼尾部血管荧光情况，利用图像处理软件Image J对每组荧光显微图像斑马鱼的尾静脉(tPCV)网面积以及尾静脉网对应的节间血管(ISV)区域面积，获得的荧光照片如图2所示，测量前先校准标尺，得到准确的面积。按照如下公式计算tPCV网相对面积：
tPCV网相对面积＝tPCV网面积/对应的节间血管(ISV)区域面积；
3、定量分析
计算得到的每组斑马鱼tPCV网相对面积以表示，分析比较对照组、待测化合物组之间差异的显著性；
当待测化合物组斑马鱼的大于对照组斑马鱼的且达到统计学上的显著性水平(P<0.05)，待测化合物组斑马鱼的节间血管(ISV)无缺失，结果如表1所示。
表1：丹红注射液对斑马鱼血管生成的促进作用数据表
指标 正常组 药物组 p 结论
tPCV面积 96131.95±2485.0 83856.93±4143.9 <0.01 错误
tPCV相对面积 0.956±0.112 1.158±0.112 <0.01 正确
结果显示，中药丹红注射液在处理斑马鱼后，如果单纯从tPCV面积比较，药物组tPCV面积比正常组减小，但是也显示了统计学差异，这显然是错误的。但采用tPCV相对面积作为指标，发现药物组促进了tPCV网的生成，显示了显著的促进作用(p<0.01)。
实施例2快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的方法
1、将收集的受精卵，对受精卵进行消毒和清洗，移入斑马鱼胚胎培养用水中，28℃下控光培养。将受精后21h的发育正常斑马鱼胚胎在体视显微镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，移入24孔培养板中，每孔10枚，将丹参素溶于DMSO作为母液，吸取一定体积至培养孔中，然后用培养水加至2mL，使孔中丹参素浓度为80μg/mL,其中DMSO的限量控制在0.05％以下，然后加盖，置于光照培养箱(28℃)让胚胎继续发育1天，记为待测化合物组；同时在相同条件下以不给药孵育设置对照，记为对照组；
2、在斑马鱼胚胎48hpf时(即斑马鱼胚胎给药后继续发育1天3h)，将斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉1min，然后固定斑马鱼胚胎于侧面体位，在荧光显微镜下观察、拍照，获得斑马鱼胚胎的荧光显微图像，记录斑马鱼尾部血管荧光情况，利用图像处理软件Image J对每组荧光显微图像斑马鱼的尾静脉(tPCV)网面积以及尾静脉网对应的节间血管(ISV)区域面积，测量前先校准标尺，得到准确的面积。按照如下公式计算tPCV网相对面积：
tPCV网相对面积＝tPCV网面积/对应的节间血管(ISV)区域面积；
3、定量分析
计算得到的每组斑马鱼tPCV网相对面积以表示，分析比较对照组、待测化合物组之间差异的显著性；
当待测化合物组斑马鱼的大于对照组斑马鱼的且达到统计学上的显著性水平(P<0.05)，待测化合物组斑马鱼的节间血管(ISV)无缺失，结果如表2所示。
表2：丹参素对斑马鱼血管生成的促进作用数据表
指标 正常组 药物组 p 结论
tPCV面积 97336.95±3435.0 99852.93±11143.9 >0.05
tPCV相对面积 0.998±0.182 1.199±0.176 <0.01 正确
结果显示，丹参素在处理斑马鱼后，采用tPCV相对面积作为指标，发现药物组促进了tPCV网的生成，显示了显著的促进作用(p<0.01)。单纯从tPCV面积比较，药物组与比正常组比较，并未显示出差异。
对比例
1、将收集的受精卵，对受精卵进行消毒和清洗，移入斑马鱼胚胎培养用水中，28℃下控光培养。将小分子药物(PTK787)用二甲基亚砜(DMSO)配成1mg/mL的母液，备用。将受精后24h的发育正常斑马鱼胚胎在体视显微镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，移入24孔培养板中，每孔10枚，实验时吸取一定体积小分子药物(PTK787)至培养孔中，然后用培养水加至2mL，使孔中PTK787浓度为0.4μg/mL，其中DMSO的限量控制在0.05％以下，然后加盖，置于光照培养箱(28℃)让胚胎继续发育1天，记为待测化合物组；同时在相同条件下以不给药孵育设置对照，记为对照组；
2、在斑马鱼胚胎48hpf时(即斑马鱼胚胎给药后继续发育1天)，将斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉1min，然后固定斑马鱼胚胎于侧面体位，在荧光显微镜下观察、拍照，获得斑马鱼胚胎的荧光显微图像，记录斑马鱼尾部血管荧光情况，利用图像处理软件Image J对每组荧光显微图像斑马鱼的尾静脉(tPCV)网面积以及尾静脉网对应的节间血管(ISV)区域面积，获得的荧光照片如图3所示，该图待测化合物组斑马鱼的节间血管(ISV)有缺失，按照如下公式计算tPCV网相对面积：
tPCV网相对面积＝tPCV网面积/对应的节间血管(ISV)区域面积；
3、定量分析
计算得到的每组斑马鱼tPCV网相对面积以表示，分析比较对照组、待测化合物组之间差异的显著性；
当待测化合物组斑马鱼的大于对照组斑马鱼的且达到统计学上的显著性水平(P<0.05)，结果如表3所示。
表3：小分子药物(PTK787)处理斑马鱼后PCV面积数据表
结果发现，如果不考虑药物处理后ISV的变化，单纯看PCV网的面积，药物处理后，PCV网的面积呈现杂乱的状态，有部分增大，有部分减少，总体呈减少趋势，与正常组相比，没有体现统计学差异。
所以在采用PCV网面积进行评价药物对血管生成的作用时，ISV是否缺失是先决条件。当ISV出现缺失，体现的是药物对血管生成的抑制作用，不管PCV面积发生增大或缩小的变化，都不足以推测药物是否具有血管生成的促进作用。

Claims (10)

1.一种快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的方法，包括步骤如下：
(1)将受精后21h～24h的发育正常斑马鱼胚胎移入培养孔中，对培养孔中的斑马鱼胚胎连续给药孵育，记为待测化合物组；同时在相同条件下以不给药孵育设置对照，记为对照组；
(2)麻醉孵育后对照组、待测化合物组的每条斑马鱼，采集每条斑马鱼的荧光显微图像，记录斑马鱼尾部血管荧光情况，测量每组斑马鱼的尾静脉(tPCV)网面积以及尾静脉网对应的节间血管(ISV)区域面积，按照如下公式计算tPCV网相对面积：
tPCV网相对面积＝tPCV网面积/对应的节间血管(ISV)区域面积；
(3)定量分析
计算得到的每组斑马鱼tPCV网相对面积以表示，分析比较对照组、待测化合物组之间差异的显著性；
当待测化合物组斑马鱼的大于对照组斑马鱼的且达到统计学上的显著性水平P<0.05，待测化合物组斑马鱼的节间血管(ISV)无缺失，说明待测药物对斑马鱼的血管生成具有促进作用。
2.根据权利要求1所述的快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的方法，其特征在于，步骤(1)中，斑马鱼胚胎为24hpf的斑马鱼胚胎。
3.根据权利要求1所述的快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的方法，其特征在于，所述斑马鱼胚胎为血管荧光标记的转基因斑马鱼胚胎。
4.根据权利要求1所述的快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的给药方式为将斑马鱼胚胎不间断浸泡在药液中，直至观察结果。
5.根据权利要求1所述的快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的方法，其特征在于，待测化合物组、对照组每组斑马鱼胚胎总数不少于8枚，孵育温度为26～30℃，避光孵育，孵育时间为1天。
6.根据权利要求1所述的快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的方法，其特征在于，步骤(2)中斑马鱼的麻醉为采用质量浓度为0.3‰的三卡因浸泡40～90s进行麻醉。
7.根据权利要求1所述的快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的方法，其特征在于，步骤(2)中采集图像为将斑马鱼胚胎固定侧面体位固定，在荧光显微镜下观察、拍照，获得斑马鱼胚胎的侧位图像。
8.根据权利要求1所述的快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的方法，其特征在于，步骤(2)中，采集的图像是在同一的放大倍数下获得的，图像格式为jpg格式。
9.根据权利要求1所述的快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的方法，其特征在于，步骤(2)中测量面积为利用图像处理软件Image J对采集的图像进行测量，测量前先校准标尺，得到准确的面积。
10.根据权利要求1所述的快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的方法，其特征在于，步骤(3)中的定量分析，是在待测化合物组斑马鱼的节间血管(ISV)无缺失条件下进行。
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