ES2286794T3 - Procedimiento de cribage que utiliza el pez cebra y la barrera hemato-encefalica. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de cribado para obtener una sustancia con actividad biológica en el sistema nervioso central (SNC), cerebro u ojo, comprendiendo el procedimiento: administrar una sustancia de ensayo a un pez cebra de ensayo determinar el efecto de la sustancia de ensayo sobre la actividad o función del sistema nervioso central, cerebro u ojo, o el efecto de la sustancia de ensayo sobre un síntoma o una enfermedad o trastorno del sistema nervioso central, cerebro u ojo del pez de ensayo, identificando de esta manera una sustancia con dicha actividad biológica; donde se sabe que la sustancia de ensayo atraviesa la barrera hematoencefálica y el procedimiento se realiza en pez cebra de cualquier edad; o se sabe que la sustancia de ensayo no atraviesa la barrera hematoencefálica y el procedimiento se realiza en pez cebra con una edad menor de cinco días desde la fertilización para moléculas de 960 daltons o más, menor de diez días desde la fertilización para moléculas de menos de 960 daltons no expulsadas por la glicoproteína p (pgp), o menor de 8 días desde la fertilización para moléculas expulsadas de forma activa por pgp, y/o se realiza en pez cebra con una edad de al menos cinco días desde la fertilización para moléculas de 960 daltons o más, o al menos diez días desde la fertilización para moléculas de menos de 960 daltons no expulsadas por la pgp y al menos ocho días desde la fertilización para moléculas expulsadas activamente por la pgp, y comprende la liberación directa de la sustancia de ensayo para evitar la barrera hematoencefálica; o, sin saber si la sustancia de ensayo puede o no atravesar la barrera hematoencefálica, el procedimiento se realiza en un pez cebra con una edad de al menos cinco días desde la fertilización para moléculas de 960 daltons o más, y al menos diez días desde la fertilización para moléculas de menos de 960 daltons, con la liberación directa de la sustancia de ensayo para evitar la barrera hematoencefálica; donde las edades indicadas se refieren alpez cebra criado en condiciones convencionales y se ajustan si el pez cebra se cría en condiciones que aceleran o retrasan la consecución de una fase de desarrollo equivalente.
Description
Procedimiento de cribado que utiliza el pez
cebra y la barrera hemato-encefálica.
La presente invención se refiere al uso de un
pez, en particular el pez cebra, en el cribado
("screening") de sustancias con un efecto oftalmológico
o un efecto biológico sobre el cerebro o el sistema nervioso central
y/o un efecto sobre una enfermedad o trastorno del cerebro o el
sistema nervioso central. Además se refiere al uso del pez cebra en
el cribado de sustancias que tienen una actividad biológica deseada
y que no cruzan la barrera hematoencefálica.
La invención se basa en parte en el
descubrimiento de que los inventores de que los peces cebra tiene
una barrera hematoencefálica (BBB) y que esta barrera
hematoencefálica se establece en momentos definidos. Aunque todos
los vertebrados tienen alguna forma de BBB, esta barrera está poco
caracterizada en los vertebrados inferiores. Aunque se han
identificado algunas diferencias claras en las propiedades de la BBB
en teleósteos y mamíferos, por ejemplo, las monoaminas pueden
atravesar la BBB de teleósteos pero no la de roedores (Khan y
Deschaux, 1997), se sabe poco sobre cómo difiere la BBB en términos
de estructura o función entre especies de vertebrados. Además, se
sabe que, en los mamíferos, la BBB "se hace más hermética" a lo
largo del desarrollo y sólo es madura en los animales después de
nacer (Ibiwoye et al., 1994; Wolburg y Lippoldt, 2002; Nag.,
2003). Uno de los efectos beneficiosos principales del pez cebra
como organismo modelo es la capacidad de realizar los cribados en
fases juveniles, pero en la técnica no se dispone del conocimiento
sobre la presencia de una barrera hematoencefálica en estos
organismos y del momento de formación de esta barrera durante el
desarrollo. El conocimiento proporcionado ahora por primera vez en
este documento tiene una aplicación técnica importante en el diseño
y ejecución de cribados de sustancias que tienen efectos
biológicos deseados en el cerebro o el sistema nervioso central, desde el punto de vista oftalmológico y similares.
biológicos deseados en el cerebro o el sistema nervioso central, desde el punto de vista oftalmológico y similares.
En mamíferos, la BBB proporciona una barrera
compleja a la penetración de fármacos en el SNC. La red capilar del
cerebro es tan densa que cada neurona y célula de la glia está a una
distancia no mayor de 20 micrómetros de un capilar vecino. Hasta
ahora, la presencia de la barrera hematoencefálica ha sido uno de
los mayores obstáculos en el desarrollo de fármacos para tratar
afecciones neurológicas, atravesando esta barrera menos de un 1% de
las moléculas pequeñas. Además, existen las barreras de membrana
epitelial aracnoideas y las barreras epiteliales del plexo
coroideo, aunque la barrera hematoencefálica tiene un área de
superficie 1000 veces mayor que las barreras
sangre-CSF y las barreras de membrana aracnoidea y,
por lo tanto, es cuantitativamente el sistema de barrera más
importante (Dohrmann, 1970).
El primer nivel de barrera se presenta por las
uniones endoteliales estrechas, que poseen las uniones estrechas de
alta resistencia observadas en las células epiteliales, haciendo que
el endotelio capilar del cerebro esté sellado, a diferencia de sus
parientes endoteliales periféricos permeables. De esta manera, no
existe movimiento paracelular de fluidos y sólo se produce una
pinocitosis mínima (Brightman, 1977). Las tres células componentes
de la barrera hematoencefálica son las propias células endoteliales,
los pericitos capilares y los procesos pediculares de astrocitos
perivasculares (Pardridge, 2003), expresando todos ellos una
diversidad de enzimas tales como aminopeptidasas,
carboxipeptidasas, endopeptidasas y colinesterasas que inactivan
muchos fármacos (Pardridge, 2002), aunque las enzimas también
pueden activar profármacos. Los sistemas transportadores permiten
la entrada de una diversidad de moléculas que de otra manera no
entrarían en el cerebro (Pardridge, 2002). Además, ciertas
moléculas se difunden libremente a través de la barrera
hematoencefálica, pero son expulsadas de forma activa por
transportadores de salida activos, de los que el más importante es
la glicoproteína p (pgp) (Tsuji y Tamai, 1999).
Previamente no se ha establecido si los peces
cebra tienen una barrera hematoencefálica. Existen pruebas de algún
tipo de BBB en varias especies de peces, pero no ha habido ningún
informe previo de una BBB en el pez cebra.
Borg-Neczak y Tjalve, 1996, examinaron el lucio y
demostraron la captación selectiva de mercurio inyectado
periféricamente en la trucha adulta, que sugería la exclusión a
través de la mayor parte del cerebro, lo cual implicaba una barrera
hematoencefálica. Otro estudio sobre la trucha arco iris (de 42 días
de edad) usando 3-OMG, un análogo de glucosa no
metabolizable que usa el mismo vehículo de transporte que la
glucosa, presentó resultados indicativos de que se facilitaba la
captación en el cerebro, de forma similar a lo notificado también
para el triptófano en el cerebro de la trucha arco iris (Aldegunde
et al., 2000), aunque la evolución de los niveles de
radiactividad a lo largo del tiempo en el cerebro y el plasma se
pudieron explicar por una barrera hematoencefálica incompleta. Se
presentó un resultado similar en la trucha arco iris que mostraba
un transporte axonal que evitaba la barrera hematoencefálica para el
tributilestaño, un organometal presente en el agua (Rouleau, Xiong,
Pace Pavicius 2003). Sin embargo, hasta la fecha no ha habido ningún
informe sobre si el pez cebra posee una BBB y, de hecho, también
hay indicios contradictorios que sugieren que ciertas especies de
peces no tienen una barrera hematoencefálica. Bachaur (Bachaur,
Failing, Georgii) examinó las concentraciones de bifenilos
policlorados (PCB) en diversos tejidos de trucha arco iris (de
edades no indicadas), zorros, corzos y seres humanos e indicaron la
exclusión de los PCB del cerebro de mamíferos en comparación con los
peces, concluyendo que la barrera hematoencefálica de los peces
debe ser menos eficaz que la de los mamíferos. Khan y Deschaux
(Journal of Experimental Biology, Volume 200, 1997) indicaron que
las aminas biogénicas podían pasar a través de la barrera
hematoencefálica de peces teleósteos, remitiéndose a las pruebas de
Fritsche (Fritsche, Reid, Thomas y Perry, 1993), aunque el
documento mencionado no parece proporcionar ninguna prueba de
esto.
Otro hecho que se desconoce en la técnica aparte
de si el pez cebra tiene una barrera hematoencefálica, es lo madura
que es esta barrera hematoencefálica en relación con un organismo
más avanzado. En los mamíferos, la concentración eficaz en el
cerebro de un compuesto es profundamente dependiente de las bombas
de entrada y salida activas, principalmente de pgp (Schumacher y
Mollgard, 1997). El tamaño de los poros también está bajo un
estrecho control regulador que implica moléculas tales como
claudin-5 (Nitta et al., 2003).
Además, se reconoce que la barrera
hematoencefálica madura gradualmente durante el desarrollo en los
mamíferos, reduciéndose la permeabilidad a las pequeñas moléculas
con la edad. Se sabe que las sustancias excluidas del cerebro de
rata adulta atraviesan los capilares cerebrales del embrión (Wolburg
y Lippoldt, 2002). De forma similar, la BBB del ratón en desarrollo
muestra una menor permeabilidad a los compuestos según madura
(Stewart y Hayakawa, 1987).
La contribución hecha mediante el trabajo
descrito en este documento es crítica en la interpretación de la
penetración potencial de la barrera hematoencefálica en el pez
cebra, dado que la estrategia evolutiva del pez cebra es
desarrollarse de una forma extremadamente rápida para alcanzar un
estado parecido al del adulto en 72 horas para poder escapar de los
depredadores. De esta manera, en el día cuatro ya pueden ver,
escapar de los depredadores y alimentarse, aunque no alcanzan la
madurez sexual hasta los tres meses. Este rápido desarrollo ha
permitido estudiar y modelar muchos procesos en esta fase larvaria
en la que su pequeño tamaño y su fácil cría hace que sean los más
adecuados para el cribado de compuestos. Sin embargo, previamente
se desconocía la sofisticación de cualquier desarrollo de la barrera
hematoencefálica en el pez cebra y lo madura que es esta barrera en
las fases larvarias.
En este documento se demuestra que el pez cebra
efectivamente desarrolla una barrera hematoencefálica sofisticada
con sistemas de transporte activos y que la desarrolla de una manera
dependiente del tiempo. Por lo tanto, la presente invención puede
proporcionar por primera vez estrategias racionales para investigar
compuestos con indicaciones neurológicas, así como para generar un
sistema in vivo para determinar la penetración en el cerebro
de un compuesto in vivo.
La figura 1 es un organigrama esquemático que
presenta el cribado de acuerdo con una realización de la presente
invención. Aquí, como en otras partes de este documento, la
referencia a "después del día 5" es 5 días después de la
fertilización o posteriormente, es decir, después del
establecimiento de la barrera hematoencefálica tal y como se
determina en este documento.
La figura 2 es un histograma que muestra la
intensidad media de fluorescencia en el cerebro de peces a los que
se les ha inyectado azul de Evans y controles con solución salina.
El eje X representa los días transcurridos después de la
fertilización y el eje Y representa la intensidad de fluorescencia
en el cerebro. Cada serie de barras representa un solo punto de
tiempo, representando las barras oscuras los controles a los que se
les ha inyectado solución salina y representando las barras
sombreadas muestras a las que se les ha inyectado azul de Evans.
Existe un descenso dependiente de la edad de la intensidad de
fluorescencia en el cerebro, que indica la exclusión del azul de
Evans según madura la BBB.
La figura 3 es un organigrama esquemático que
incorpora las características de la reivindicación 1 e ilustra
además el uso de los resultados obtenidos en los cribados de acuerdo
con la presente invención para evaluar actividades biológicas de
sustancias de ensayo.
La figura 4 muestra la exclusión del colorante
fluoresceína sódica, un colorante de bajo peso molecular, del
cerebro 10 días después de la fertilización (d.p.f.). El eje X
representa los días transcurridos posteriores a la fertilización y
el eje Y representa la intensidad de fluorescencia en el cerebro.
Cada serie de barras representa un solo punto de tiempo
representando las barras oscuras los controles a los que se les ha
inyectado solución salina y representando las barras sombreadas las
muestras a las que se les ha inyectado fluoresceína sódica. Existe
un rápido descenso dependiente de la edad en la intensidad de
fluorescencia en el cerebro a 10 d.p.f., que indica la exclusión de
pequeñas moléculas del cerebro en ese momento.
La figura 5 muestra la exclusión de colorante
rodamina 123 (R123), un colorante de bajo peso molecular, del
cerebro 10 días después de la fertilización (d.p.f.). Aunque es
similar en peso molecular a la fluoresceína sódica, R123 es un
sustrato para Pgp y, por lo tanto, se transporta activamente hacia
el exterior del SNC. El eje X representa los días transcurridos
posteriores a la fertilización y el eje Y representa la intensidad
de fluorescencia en el cerebro. Cada serie de barras representa un
solo punto de tiempo representando las barras oscuras los controles
a los que se les ha inyectado solución salina y representando las
barras sombreadas las muestras a las que se les ha inyectado R123.
Hay un rápido descenso dependiente de la edad en la intensidad de
fluorescencia en el cerebro a 8 d.p.f., que indica la exclusión de
R123 del cerebro en ese momento. Este punto de tiempo coincide con
el inicio de la expresión de Pgp en el endotelio vascular del SNC.
Por lo tanto, aunque la fluoresceína sódica y el R123 tienen un
tamaño similar, R123 es excluido del cerebro a edades más jóvenes
que la fluoresceína sódica ya que se retira activamente
por Pgp.
por Pgp.
La figura 6 demuestra que la exclusión del
colorante rodamina 123 (R123) del cerebro se realiza a través de un
mecanismo dependiente de Pgp. El eje X representa los días
transcurridos después de la fertilización y el eje Y representa la
intensidad de fluorescencia en el cerebro. Cada serie de barras
representa un solo punto de tiempo, representando las barras
oscuras las larvas en las que se ha inyectado R123 criadas en medio
de embrión y representando las barras sombreadas muestras a las que
se les ha inyectado R123 desarrolladas en presencia de un inhibidor
de Pgp, verapamil (V). Cuando se crían en condiciones normales
(medio de embrión), existe un rápido descenso dependiente de la
edad en la intensidad de fluorescencia en el cerebro a 8 d.p.f.,
que indica la exclusión de R123 del cerebro en este momento y
coincide con la expresión de Pgp cuando se detecta por
inmunohistoquímica. Esta exclusión dependiente de la edad se
invierte incubando larvas en medio de embrión que contiene el
inhibidor de Pgp verapamil, de tal forma que la fluorescencia en los
cerebros de estas muestras a 8 d.p.f. y 10 d.p.f. es equivalente a
la observada a edades más jóvenes (3 y 5 d.p.f.).
Es bien conocido que la investigación
farmacéutica que lleva a la identificación de un nuevo fármaco
puede implicar el cribado de cantidades muy grandes de sustancias
candidatas, tanto antes como después de haber encontrado un
compuesto candidato. Éste es un factor que hace que la investigación
farmacéutica sea muy cara y requiera mucho tiempo. Los medios para
ayudar a los procesos de cribado tienen una utilidad e importancia
comercial considerables.
El pez cebra se está haciendo cada vez más
popular como una herramienta sofisticada de investigación del
efecto de pequeñas moléculas sobre procesos fisiológicos y
patológicos complejos (Goldsmith, 2004). Esto se debe a que son
vertebrados con un tamaño y complejidad de genoma similares a los de
los seres humanos, pero es posible generar cientos de miles de
descendientes en un tamaño moderado de acuario cada año. Cuando los
descendientes no tienen más que unos pocos milímetros de longitud,
viviendo las larvas en volúmenes tan pequeños como de 50
microlitros, son particularmente adecuadas para la investigación de
compuestos de alto rendimiento. En la bibliografía se están
presentando cada vez más modelos de enfermedades humanas, tales como
la enfermedad de Parkinson (Anichtchik et al., 2004),
degeneraciones de la retina (Goldsmith et al., 2003), y
sordera sensorineural (Whitfield, 2002).
Aunque se ha demostrado que en el pez cebra los
efectos de varios compuestos farmacéuticos son similares a los de
los mamíferos (Langheinrich, 2003), una cuestión principal con
respecto a la utilidad de la investigación de moléculas pequeñas
para una afección neurológica u oftalmológica es si una molécula
pequeña alcanzará su sitio diana. Como se ha indicado, la presente
invención proporciona una contribución importante al diseño y uso
de nuevos procedimientos de cribado y ensayo, permitiendo la
identificación y uso de nuevos fármacos.
En diversos aspectos adicionales, la presente
invención se refiere a procedimientos y medios de cribado y ensayo,
y a las sustancias identificadas por estos métodos y medios.
Más específicamente, la presente invención
emplea el pez cebra en procedimientos de cribado y ensayo de
sustancias que son biológicamente activas en el cerebro o el sistema
nervioso central (SNC) y/o ejercen un efecto biológico
oftalmológico, por ejemplo, mejorando uno o más síntomas de una
enfermedad o trastorno del cerebro o el sistema nervioso central,
donde la metodología de cribado o ensayo tiene en cuenta el
conocimiento (1) de que el pez cebra tiene una barrera
hematoencefálica y (2) que la barrera hematoencefálica se forma en
los embriones del pez cebra a los cinco días.
Debe indicarse que la referencia en este
documento al establecimiento de una barrera hematoencefálica cinco
días después de la fertilización es una referencia al
establecimiento de una barrera hematoencefálica suficiente para
excluir moléculas de Mr comparable al azul de Evans. En el caso de
moléculas más pequeñas, pueden excluirse posteriormente cuando se
haya desarrollado una barrera hematoencefálica eficaz. De esta
manera, en todos los aspectos y realizaciones de la presente
invención, debe determinarse si las moléculas más pequeñas pueden
atravesar la barrera hematoencefálica a los 5 días después de la
fertilización, pero se excluyen en un punto posterior en el tiempo,
entonces ese punto en el tiempo (por ejemplo, 6 días o 7 días
después de la fertilización) ha de ser sustituido por la referencia
de los 5 días después de la fertilización, cuando la sustancia de
ensayo tiene ese tamaño más pequeño.
Más específicamente, en este documento se
establece que moléculas de 960 daltons o mayores se excluyen a los
cinco días y moléculas menores de 960 daltons se excluyen a los diez
días, excepto cuando hay una salida activa de las moléculas por pgp
a los 8 días, refiriéndose las edades indicadas al pez cebra criado
en condiciones convencionales, y son ajustadas si el pez cebra
crece en condiciones que aceleran o retrasan la consecución de la
fase de desarrollo equivalente.
Como sabrá cualquier biólogo especializado en el
pez cebra, la velocidad de desarrollo puede ser más lenta o más
rápida si se altera, en particular, la temperatura del acuario o si
se usa una cepa diferente. Se sabe que un aumento de la temperatura
acelera el desarrollo mientras que un descenso de la temperatura
retrasa el desarrollo. Las condiciones convencionales implican el
crecimiento del pez cebra a una temperatura de 28,5ºC. Más
específicamente, las condiciones pueden ser las definidas por
Westerfield (1995) y definidas adicionalmente por Kimmel et
al., (1995), específicamente una temperatura de 28,5ºC a baja
densidad (no más de 5 larvas por ml) en medio de embrión (NaCl 5
mM, KCl 0,17 mM, CaCl_{2} 0,33 mM, Mg_{2}SO_{4} 0,33 mM, azul
de metileno al 10^{-5}%) en un ciclo de 14 horas de luz y 10 horas
de oscuridad.
En estas condiciones, se alcanzan las siguientes
fases del desarrollo a los 5, 8 y 10 días, respectivamente:
(i) 5 días - el momento en el que aparecen por
primera vez las células caliciformes en la parte posterior del tubo
digestivo, está presente osificación en el opérculo y la vaina de la
punta anterior de la notocorda;
(ii) 8 días - el momento en el que es evidente
la osificación del centro en la columna vertebral, se expresa pgp
en el endotelio vascular que rodea al SNC y se observa mielina
compactada madura en el rombencéfalo;
(iii) 10 días - el momento en el que son
evidentes centros de osificación en el cartílago de Meckel y el
palatocuadrado, están presentes arcos neurales en las vértebras
cervicales, y es evidente osificación en todos los centros
cervicales y torácicos.
Por consiguiente, cuando se dice que se realiza
un procedimiento a los 5, 8 ó 10 días, una definición alternativa
del tiempo requerido es por referencia a la fase del desarrollo
equivalente, es decir, 5 días para el pez cebra en condiciones
convencionales equivale a la aparición de las características
indicadas en el punto (i) anterior sean cuales sean las condiciones
en las que está creciendo el pez cebra, que puede tener lugar, por
ejemplo, antes de cinco días para el pez cebra criado a una
temperatura mayor de 28,5ºC o después de cinco días para el pez
cebra criado a una temperatura menor de 28,5ºC. De forma similar, 8
días equivale a la aparición de las características indicadas en el
punto (ii) anterior y 10 días equivale a la aparición de las
características indicadas en el punto (iii) anterior.
Teniendo en cuenta la variación que se produce
por la alteración de las condiciones, las moléculas menores de 960
daltons pueden excluirse entre el día 7 y 13, y especialmente entre
el día 9 y 11, y en particular en el día 10, con una salida activa
cuando sea aplicable entre el día 6 y 12 y especialmente entre el
día 7 y 10, y en particular en el día 8.
La presente invención, por ejemplo, proporciona
un procedimiento de cribado de una sustancia con el efecto deseado,
donde el procedimiento es sustancialmente como se indica en la
figura 1. "Compuesto x" se refiere a una sustancia de
ensayo.
La presente invención proporciona una solución
para los problemas técnicos asociados con la falta de conocimiento
en relación con la barrera hematoencefálica.
Si no se tienen conocimientos sobre la formación
de la barrera hematoencefálica en el pez cebra, pueden obtenerse
resultados falsos negativos o falsos positivos cuando se buscan
sustancias con un efecto sobre el cerebro o el sistema nervioso
central.
Por ejemplo, si el cribado se realiza después de
haberse formado la barrera hematoencefálica (como ha sido
determinado por los presentes inventores), una sustancia que pueda
ejercer el efecto biológico deseado si se administra al cerebro
pero no pueda ejercer el efecto biológico deseado cuando no se
administra específicamente al cerebro porque no atraviesa la
barrera hematoencefálica producirá un resultado falso negativo. Una
persona que ensaya esa sustancia sin saber que existe una barrera
hematoencefálica a través de la cual no puede pasar la sustancia
descartará la sustancia considerándola no útil para conseguir el
efecto biológico deseado, aunque si se usara la administración
correcta (por ejemplo, directamente en el cerebro o el ojo) la
sustancia efectivamente sería útil para conseguir ese efecto
biológico.
Por otra parte, si se realiza esta búsqueda
usando el pez cebra antes de la formación de la barrera
hematoencefálica (como ha sido determinado por los presentes
inventores), puede obtenerse un resultado equivalente a un
resultado falso positivo. Por ejemplo, una sustancia puede ejercer
el efecto biológico deseado en el cribado, pero posteriormente
puede fallar en adultos porque no puede atravesar la barrera
hematoencefálica. La sustancia entonces puede descartarse
considerándose no útil, después de realizar algún aporte de
esfuerzos significativo a la luz del resultado inicialmente
positivo en el cribado. La evaluación de la capacidad de atravesar
la barrera hematoencefálica y, además, de emplear un pez de ensayo
en una fase apropiada del desarrollo, teniendo en cuenta el
conocimiento proporcionado por la presente invención, evita estos
problemas y es muy beneficioso en la técnica.
De acuerdo con aspectos y realizaciones de la
presente invención, aplicando el conocimiento de la existencia y
momento de formación de la barrera hematoencefálica del pez cebra,
el experto en la materia obtendrá resultados mejores y más útiles
con las sustancias de ensayo. Por ejemplo, puede ensayarse una
actividad biológica deseada en una sustancia que se sabe que no
puede atravesar la barrera hematoencefálica, en un cribado que se
diseña teniendo en cuenta la presencia o ausencia de una barrera
hematoencefálica en el pez empleado en la investigación. Pueden
usarse embriones de peces antes de la formación de una barrera
hematoencefálica y pueden encontrarse sustancias que tengan el
efecto biológico deseado. Adicional o alternativamente, pueden
ensayarse sustancias en peces en los que se ha formado una barrera
hematoencefálica, estableciendo de esta manera no sólo la capacidad
de ejercer la actividad biológica deseada, sino también la capacidad
de atravesar la barrera hematoencefálica. Una opción es administrar
la sustancia directamente en el cerebro en un pez en el que se sabe
que se ha formado la barrera hematoencefálica, ensayando de esta
manera su capacidad de ejercer el efecto biológico deseado sin
limitación en cuanto a su capacidad de atravesar la barrera
hematoencefálica.
En otras realizaciones, la invención proporciona
procedimientos de cribado de sustancias que ejercen una actividad
biológica deseada en el cuerpo pero también una actividad biológica
indeseada en una diana que existe en el cerebro, sistema nervioso
central y/u ojo. De esta manera, puede emplearse un procedimiento de
cribado para determinar la actividad biológica de una sustancia de
ensayo y determinar la capacidad o incapacidad de la sustancia de
ensayo de atravesar la barrera hematoencefálica, por ejemplo,
determinando si la sustancia aparece o no aparece en alguna medida
significativa dentro del cerebro, el sistema nervioso central o el
ojo cuando no se administra directamente a estos tejidos. El
conocimiento sobre la existencia de la barrera hematoencefálica en
el pez cebra y el momento de su establecimiento permite diseñar
procedimientos de cribado en los que puede determinarse la
exclusión de sustancias del cerebro, sistema nervioso central y/o el
ojo en virtud de su incapacidad de atravesar la barrera
hematoencefálica y emplearse, por ejemplo, en la selección de
compuestos candidatos para el desarrollo adicional como
fármacos.
La persona experta está bien documentada en el
diseño y realización de investigaciones biológicas y la aplicación
de experimentos de control apropiados. La presente invención incluye
cribados en el pez cebra que tienen en cuenta la existencia de la
barrera hematoencefálica en el pez cebra y el momento de su
formación.
En diversos aspectos y realizaciones, la
presente invención proporciona la materia objeto indicada en las
reivindicaciones presentadas más adelante.
Además, puede determinarse si una molécula es
metabolizada por la barrera hematoencefálica evaluando el perfil de
metabolitos por HPLC de una sustancia de ensayo administrada tanto
antes como después de la formación de la BBB.
La invención generalmente es aplicable a
cualquiera de una diversidad de enfermedades y trastornos, y a
continuación se indican específicamente una serie de ejemplos: Las
siguientes enfermedades son trastornos comunes del sistema nervioso
central. Una característica común de todos estos trastornos es que
la célula a la que se dirige el agente terapéutico está detrás de
una barrera celular - la barrera hematoencefálica o la barrera
sangre-retina.
\global\parskip0.990000\baselineskip
Degeneraciones de la retina, incluyendo:
- \quad
- Degeneración macular
- \quad
- Retinitis pigmentosa
- \quad
- Degeneración de células ganglionares (glaucoma)
\vskip1.000000\baselineskip
Trastornos desmielinizantes, incluyendo:
- \quad
- Esclerosis múltiple
- \quad
- ADEM
\vskip1.000000\baselineskip
Trastornos degenerativos, incluyendo:
- \quad
- Enfermedad de Parkinson
- \quad
- Enfermedad de Alzheimer
- \quad
- Enfermedad de Huntington
- \quad
- Enfermedades con inclusiones de neuronas motoras
- \quad
- Tauopatías
- \quad
- Degeneración corticobasal
\vskip1.000000\baselineskip
Trastornos neuropsiquiátricos, incluyendo:
- \quad
- Depresión
- \quad
- Enfermedad bipolar
- \quad
- Esquizofrenia
- \quad
- Ansiedad
- \quad
- Agresión
- \quad
- Disfunción sexual
\vskip1.000000\baselineskip
Trastornos diversos, incluyendo:
- \quad
- Epilepsia
- \quad
- Dolor de cabeza
- \quad
- Dolor
- \quad
- Trastornos del sueño
- \quad
- Saciedad
- \quad
- Malignidades del SNC/retina
\global\parskip1.000000\baselineskip
Pueden encontrarse afecciones menos frecuentes
del SNC y la retina en cualquier libro de texto médico
convencional.
La presente invención proporciona la formulación
de un algoritmo para aplicar en el diseño de ensayos de cribado,
teniendo en cuenta la existencia de la barrera hematoencefálica en
el pez cebra (como ha sido determinado por los presentes
inventores) y el momento de formación de la barrera
hematoencefálica, opcionalmente también si se sabe o no que una
sustancia de ensayo puede o no atravesar la barrera
hematoencefálica. Por medio de una estrategia algorítmica, la
persona experta determina la combinación o combinaciones de
experimentos que emplean pez cebra de una edad particular, el modo
y sitio de administración de la sustancia de ensayo, la naturaleza
de la sustancia de ensayo, el procedimiento para determinar el
efecto, etc., que se emplean en el procedimiento de cribado.
Además, esta estrategia permite interpretar los resultados obtenidos
en diferentes experimentos, tal y como se ilustra, por ejemplo, en
la figura 3.
El pez cebra de ensayo puede tener uno o más
síntomas o signos de una enfermedad o trastorno antes del uso en el
cribado de una sustancia con la actividad deseada.
La sustancia de ensayo puede administrarse con o
antes de la administración de una sustancia que también induce uno
o más síntomas o signos de la enfermedad o trastorno de interés.
De esta manera, la invención es igualmente
aplicable a la investigación de sustancias que ejercen un efecto
biológico que altera una actividad o función en el sistema nervioso
central, cerebro u ojo, ya sea normal o esté sujeta a una
enfermedad o trastorno, para investigar si las sustancias que
ejercen un efecto biológico que mejora un signo o síntoma de una
enfermedad o trastorno, son terapéuticas o son profilácticas.
El organismo de ensayo es un pez cebra.
El pez cebra es un organismo que combina muchas
de las ventajas de los sistemas modelo de mamíferos e
invertebrados. Es un vertebrado y, por lo tanto, más relevante en
modelos de enfermedad humana que Drosophila u otros
invertebrados, pero a diferencia de otros modelos de vertebrados
puede usarse para realizar cribados genéticos.
Varios documentos revisados por iguales destacan
y validan el uso del pez cebra como especie en la que crear modelos
de trastornos humanos. [Dooley K y Zon LI (2000) Zebrafish: a model
system for the study of human disease. Current Opinion in Genetics
and Development 10: 252-6-Barut BA y
Zon LI (2000) Realising the potential of Zebrafish as a model for
human disease Physiological Genomics 13: 49-51 -
Fishman MC (2001) Zebrafish: The Canonical Vertebrate. Science 294:
1290-1].
Los inventores han apreciado que el pez cebra
ofrece la combinación única de las capacidades de reproducción de
los invertebrados y de modelado de los vertebrados. Se desarrollan
rápidamente, habiéndose establecido ya el plan básico del cuerpo a
las 24 horas de la fertilización. Además, su desarrollo extrauterino
dentro de una cápsula transparente facilita la visualización in
vivo de órganos internos por medio de un microscopio de
disección. Muchas patologías pueden modelarse dentro de la primera
semana de vida, momento en el que los embriones sólo tienen unos
pocos milímetros de longitud y pueden vivir en 100 \mul de fluido.
Esto permite el análisis de embriones individuales en formato
multicanal, tal como un formato de placa de 96 pocillos. Esto es
particularmente útil para la investigación de fármacos, disponiendo
de muchos agentes químicos en un formato de placa de 96
pocillos.
Puede emplearse una población de pez cebra en
una placa Petri o un depósito. Una población del pez puede tratarse
conjuntamente y puede ensayarse conjuntamente, por ejemplo, por
medio de la adición de una o más o una combinación de sustancias de
ensayo al agua.
El pez cebra tiene un corto periodo de
maduración de dos a tres meses y es muy fecundo, pudiendo producir
una sola pareja de adultos de 100 a 200 descendientes por semana.
Tanto los embriones como los adultos son pequeños, siendo los
embriones de unos pocos mm y los adultos de 2-3 cm
de longitud. Son baratos y fáciles de mantener. La capacidad de
generar grandes números de descendientes en un pequeño sitio ofrece
la posibilidad de producción a gran escala.
El pez cebra, por lo tanto, es un organismo
válido para la investigación de sustancias con actividad biológica
en vertebrados, incluyendo mamíferos, incluyendo seres humanos,
siendo estas sustancias útiles in vivo, por ejemplo, como
agentes terapéuticos. La presente invención amplía el valor de los
cribados en el pez cebra mejorando el diseño de las investigaciones
y mejorando la utilidad de los resultados obtenidos.
Una ventaja adicional del pez cebra es el hecho
de que vive en agua. Esto facilita la administración de las
sustancias de ensayo ya que pueden añadirse al agua en la que están
los peces. El pez cebra absorbe fácilmente agentes químicos. La
concentración eficaz de agentes químicos en el agua a menudo
equivale a la concentración plasmática eficaz en mamíferos.
A cada pocillo de una placa multipocillo, tal
como una placa de 96 pocillos, se le pueden añadir diferentes
sustancias de ensayo para identificar la sustancia de ensayo que
presenta un efecto beneficioso o perjudicial. En cada pocillo puede
haber uno o múltiples peces expuestos a la sustancia de ensayo.
El pez cebra también es tolerante al DMSO
(dimetilsulfóxido). Esto es importante, ya que el DMSO se usa como
disolvente para disolver muchos fármacos. Los inventores han
establecido que el pez cebra puede tolerar el DMSO al 1%. De esta
manera, un fármaco candidato u otra sustancia de ensayo puede
disolverse en DMSO y administrarse al pez cebra añadiéndose al agua
del pez para dar una concentración final de DMSO de al menos hasta
un 1%. Esto se emplea en diversos aspectos preferidos y
realizaciones de la presente invención.
La misma sustancia de ensayo puede añadirse a
diferentes pocillos a una concentración diferente. Por ejemplo, la
sustancia de ensayo 1 puede añadirse al pocillo A1 a una
concentración de 1 mM, al pocillo A2 a una concentración de 100
\muM, al pocillo A3 a una concentración de 10 \muM, al pocillo
A4 a una concentración de 1 \muM y al pocillo A5 a una
concentración de 0,1 \muM. Entonces la sustancia de ensayo 2 se
puede añadir al pocillo B1, etc. Las sustancias de ensayo pueden
ser fármacos conocidos o nuevas entidades químicas.
Además, las sustancias de ensayo pueden añadirse
en combinación. Por ejemplo, el pocillo A2 puede contener
sustancias de ensayo 1 y 2, el pocillo A3 sustancia de ensayo 1 y 3,
y el pocillo B2 sustancia de ensayo 2 y 3. Como alternativa, cada
pocillo puede contener la sustancia de ensayo x, conteniendo los
pocillos individuales una serie de sustancias de ensayo
adicionales.
En otras opciones, puede emplearse una población
de pez cebra en una placa Petri o un depósito y tratarse
conjuntamente, por ejemplo, mediante la adición de una o más o una
combinación de sustancias de ensayo en el agua.
Para la administración en el cerebro, puede
emplearse un sistema de administración, por ejemplo, que usa una
molécula de liberación lipófila, administrándose el "caballo de
Troya" entero al agua del pez. Como alternativa, la sustancia de
ensayo puede inyectarse directamente con la ayuda de un
micromanipulador, en el SNC, por ejemplo en un ventrículo, evitando
de esta manera la BBB.
De esta manera, el pez cebra permite investigar
la ruta biológica entera de un vertebrado de una forma de alto
rendimiento.
La presente invención, en ciertos aspectos y
realizaciones, proporciona el cribado y preferiblemente la
identificación u obtención de una sustancia que proporciona una
combinación sinérgica con otra sustancia, o el cribado y
preferiblemente la identificación u obtención de dos o más
sustancias que conjuntamente proporcionan una combinación aditiva o
sinérgica. Las combinaciones sinérgicas de fármacos a menudo
proporcionan ventajas clínicas. El uso de un sistema de cribado de
acuerdo con la presente invención permite la identificación de
estas combinaciones sinérgicas.
De esta manera, en ciertas realizaciones, la
invención comprende tratar el pez cebra, como se ha descrito, con
dos o más sustancias, de las que al menos una es una sustancia de
ensayo, y comparar el efecto de las dos o más sustancias en
combinación para determinar el efecto óptimo (tanto si se aplican
simultáneamente como si se aplican secuencialmente) sobre un
aspecto del comportamiento o fisiología con el efecto de cualquiera
o las dos o más sustancias cuando se aplican individualmente o
solas. Todas (o las dos) sustancias aplicadas pueden ser una
sustancia de ensayo, o una de las sustancias puede ser un fármaco
que se sabe que tiene un efecto beneficioso en la enfermedad que es
objeto del cribado, o al menos un efecto en el pez de ensayo.
De esta manera, la invención proporciona el
cribado, y preferiblemente la identificación u obtención de una
sustancia que proporciona un efecto aditivo a un fármaco conocido o
un efecto sinérgico con el fármaco conocido. También permite el
cribado y preferiblemente la identificación u obtención de una
combinación de dos o más sustancias que proporcionan un efecto
sinérgico, en comparación con el efecto de las dos sustancias
cuando se emplean individualmente o solas.
Las terapias de adición son útiles porque es
difícil realizar ensayos clínicos en los que un fármaco existente
se retira de un paciente y se reemplaza con un fármaco nuevo. El
paciente se ve privado de un fármaco que ha conseguido al menos
alguna eficacia demostrada y alguna confianza en su perfil de
efectos secundarios. Además, el paciente será vulnerable a su
enfermedad durante las fases de retirada del fármaco existente y
acumulación del fármaco de ensayo.
El pez cebra de ensayo puede estar mutado en
lugar de ser de tipo salvaje. Entonces, es posible ensayar efectos
de interacción, efectos sinérgicos beneficiosos o efectos
perjudiciales de la mutación más las sustancias de ensayo. Como
alternativa, el análisis puede ser del agente terapéutico conocido y
la mutación genética para descubrir un nuevo fármaco diana
beneficioso en combinación con el fármaco conocido, o un marcador
genético para uso en la predicción de los pacientes con más
probabilidad de beneficiarse (o no beneficiarse) de la prescripción
del fármaco conocido.
En otra realización, se administra una
combinación de agentes potencialmente útiles a un pez cebra de
ensayo que tiene uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno,
que puede generarse por medio de la adición de un agente al pez de
ensayo, por ejemplo, por adición al agua donde vive el pez o a
través de la expresión o desactivación de un gen, para evaluar si
la combinación es más eficaz que cualquiera de los agentes
individuales.
La presente invención también proporciona el
cribado y preferiblemente la identificación u obtención de una
sustancia que mejora uno o más efectos secundarios de una sustancia
activa, por ejemplo, una sustancia terapéuticamente activa. Hay
muchos fármacos que se han abandonado en ensayos clínicos, o se
comercializan pero se recetan con poca frecuencia, no porque no
sean terapéuticamente eficaces, sino porque su perfil de efectos
secundarios es limitante. Los efectos secundarios pueden ser
relativamente benignos pero significativos para el paciente, tal
como lesión renal (por ejemplo, ciclosporina). Es deseable permitir
la administración de estos fármacos, con efectos beneficiosos
demostrados, por medio de la co-administración de un
agente adicional para mejorar el perfil de efectos secundarios.
De acuerdo con la presente invención, estos
agentes se investigan en el pez cebra en el que la administración
de la sustancia activa induce un efecto secundario u otro fenotipo
que refleja o indica un efecto secundario. De esta manera, en
realizaciones de la invención, se administra un agente activo a un
pez cebra de ensayo que tiene uno o más síntomas de una enfermedad
autoinmune y se evalúa el efecto secundario de otro fenotipo para
dicho pez cuando se somete a una o más sustancias de ensayo. Esto no
requiere un conocimiento previo de la acción del agente
coadministrado. En otras realizaciones, pueden cribarse agentes que
consiguen el efecto terapéutico deseado con una reducción de
efectos secundarios, y preferiblemente identificarse u obtenerse,
por medio de la evaluación de un fenotipo de enfermedad y un
fenotipo de efectos secundarios. Como ocurre con otros aspectos y
realizaciones de la presente invención, esto puede implicar la
coadministración de un compuesto primario junto con una serie de
sustancias candidatas, o junto con una mutación genética inducida
aleatoriamente. Con esta última estrategia, es decir, mutación, se
necesitan etapas posteriores para identificar el agente
co-terapéutico apropiado después de la
identificación del pez con una mutación que proporciona un efecto de
mejora.
Puede usarse una biblioteca diversa de
compuestos de tipo fármaco, tales como la biblioteca LOPAC (Sigma)
o la biblioteca combinatoria diversa Chembridge PHARMACOphore.
Pueden usarse otras bibliotecas dirigidas contra clases de dianas
particulares, tales como bibliotecas de canales iónicos y
bibliotecas de proteína G.
Después de la identificación de una sustancia
activa usando un cribado de acuerdo con la presente invención, la
sustancia puede usarse en un método de tratamiento médico de la
presente invención, realizándose la administración preferiblemente
en una "cantidad profilácticamente eficaz" o una "cantidad
terapéuticamente eficaz" (según sea el caso, aunque la
profilaxis puede considerarse una terapia), siendo esta cantidad
suficiente para mostrar un efecto beneficioso para el individuo. La
cantidad real administrada, y el ritmo y el curso de administración
a lo largo del tiempo, dependerán de la naturaleza y gravedad del
trastorno que se está tratando. La prescripción del tratamiento,
por ejemplo, las decisiones sobre la dosificación, etc., está dentro
de la responsabilidad de los especialistas generales y otros
médicos.
1. Una sustancia de ensayo se añade al pez de
ensayo antes de la aparición de la patología, en el momento de la
inducción de la patología o después de la inducción de la patología.
Las dos primeras situaciones tienen más probabilidad de identificar
un agente químico profiláctico, y la última un fármaco que invierte
la patología de nuevo a un estado normal. La sustancia de ensayo
puede ser un agente químico y puede ser un agente químico aleatorio
administrado de una forma de alto rendimiento a peces en un formato
de placa de 96 pocillos, o un agente químico seleccionado
administrado a un grupo de peces en una placa Petri.
2. Después se investiga en el pez la desviación
de la patología inicial.
En el cribado son muy deseables las siguientes
etapas adicionales y su uso se proporciona por la presente
invención en realizaciones preferidas:
En lugar de añadir un solo agente químico, se
añade una combinación de agentes químicos. Por ejemplo, puede
administrarse a todos los peces un agente terapéutico conocido a una
dosis a la que aún pueda detectarse un efecto beneficioso
adicional. Después se añade una biblioteca química aleatoria al pez
y se investiga un efecto en aumento.
1. Inducir una patología autoinmune por medio de
la administración de anticuerpos a un pez.
2. Administrar fármaco 1 a la fila 1, fármaco 2
a la fila 2, etc.
3. Administrar fármaco 1 a la columna 1, fármaco
2 a la columna 2, etc.
4. Comparar el efecto inmunosupresor de todos
los pocillos con el de los fármacos cuando se administran solos.
Otra realización de lo anterior permite la
detección del aumento de un fármaco particular por medio de una
mutación particular, como se indica a continuación:
1. Inducir una mutación genética por medio de
cualquiera de los puntos anteriores.
2. Inducir una patología por medio de cualquiera
de los puntos anteriores.
3. Administrar el compuesto químico de
ensayo.
4. Evaluar si la combinación de la mutación más
el agente químico tiene un efecto mayor que cuando se administran
solos.
5. El gen mutado después se usa a continuación
como diana beneficiosa, como se ha descrito anteriormente.
Otra realización de la invención permite la
identificación de factores genéticos que ayudan a determinar la
idoneidad de un agente terapéutico particular para un paciente dado.
Si la mutación aumenta el efecto del fármaco, se busca esa mutación
en homólogos humanos. A los pacientes con esta mutación se les debe
recetar preferentemente el fármaco. Si la mutación produce un
efecto perjudicial o ausencia de efecto, entonces los pacientes
deben evitar este fármaco.
Se usó colorante azul de Evans (961 Da) para
investigar la presencia de BBB en larvas de pez cebra. El azul de
Evans se usa en estudios de BBB en roedores y se excluye del cerebro
si la BBB está intacta. En roedores, se observa una fuga de azul de
Evans después de un traumatismo cerebral.
1) Se inyectó azul de Evans al 2% en solución
salina al 0,9% en el saco pericárdico de larvas con edades
comprendidas entre dos días después de la fertilización (d.p.f.) y
un mes. Como control se inyectó solución salina al 0,9%.
2) Las larvas se dejaron desarrollar durante 6
horas para dejar que el colorante penetrara desde el torrente
sanguíneo a los tejidos.
3) Las larvas se visualizaron con un microscopio
de disección fluorescente (filtro TRITC) para asegurar que el
colorante estaba presente en los vasos sanguíneos.
4) Las larvas se anestesiaron y se fijaron en
PFA al 4% a 4ºC durante una noche.
5) Se incluyeron en O.C.T. (compuesto de
temperatura óptima de corte) y se tomaron secciones congeladas de
10 \mum en el plano parasagital.
6) Las secciones centrales se visualizaron en un
microscopio fluorescente (filtro TRITC) a 40x. Se tomaron imágenes
de muestras a las que se les había inyectado azul de Evans y
solución salina.
7) La intensidad de fluorescencia se midió en 3
regiones de control y muestras en las que se había inyectado azul
de Evans usando el software Analysis. Se calculó la intensidad media
de fluorescencia para cada grupo de edad.
8) Se comparó la intensidad media de
fluorescencia en los que se había inyectado azul de Evans frente a
los controles con solución salina por medio de un histograma
(figura 2).
Un alto nivel de fluorescencia en el cerebro en
3 d.p.f. indicó que el azul de Evans entraba en el cerebro y que no
se había establecido la BBB. A la edad de 5 d.p.f., la fluorescencia
del cerebro en las muestras a las que se les había inyectado azul
de Evans no fue diferente de las muestras que habían recibido
inyecciones de solución salina, demostrando que el azul de Evans se
excluía e indicando que la BBB se había desarrollado a la edad de 5
d.p.f.
Se recogieron embriones procedentes del
emparejamiento de adultos (cepas TL, AB y WIK), criados en
condiciones convencionales (Westerfield, 1995). Los embriones se
criaron en un medio de embrión (NaCl 5 mM, KCl 0,17 mM, CaCl_{2}
0,33 mM, Mg_{2}SO_{4} 0,33 mM, azul de Metileno al 10^{-5}%) y
se clasificaron usando un criterio convencional (Kimmel et
al., 1995).
Se prepararon soluciones madre para inyección de
azul de Evans al 2% en solución salina al 0,9% y fluoresceína
sódica al 10% en solución salina al 0,9% y se almacenaron a 4ºC. Las
larvas se anestesiaron por inmersión en 0,2 mg/ml de ácido
3-aminobenzoico (MS222) antes de inmovilizarse y
orientarse en metilcelulosa al 3% en medio de embrión en una
posición lateral de manera que el corazón fuera accesible. En larvas
y juveniles de 2 días después de la fertilización (d.p.f.) a 30
d.p.f. se inyectaron en la región pericárdica de 0,5 a 2 nl de
colorante o control de solución salina, dependiendo de la edad,
usando un aparato de microinyección de huevos de pez cebra
convencional (Westerfield, 1995). Los peces se transfirieron a medio
de embrión nuevo para que se recuperaran de la anestesia y después
se visualizaron usando un microscopio de disección de fluorescencia
a intervalos de 1 hora para determinar el momento de captación del
colorante en la circulación y el momento en el que el colorante se
había infiltrado desde la circulación al tejido corporal no
vascular. Se anestesiaron las larvas en las que se había inyectado
colorante y solución salina a las 4 horas y 6 horas después de la
inyección y se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS. Se
incluyeron 10 larvas por grupo de edad y tratamiento con inyección
en Compuesto OCT Sakura Tissue-Tek (Bayer, Newbury,
UK) y se cortaron secciones parasagitales congeladas con un espesor
de 10 \mum.
Las secciones se visualizaron sin medio de
montaje por microscopía de fluorescencia en un microscopio Olympus
BX51. Se identificaron tres secciones sagitales centrales de cada
larva y se capturaron imágenes usando una cámara ColorView
(Olympus) y el software AnalySis (Soft Imaging System). Se
cuantificó la intensidad de fluorescencia dentro del cerebro para
cada sección central de cada larva en cada grupo de tratamiento
usando mediciones del umbral de color y de área en AnalySis. Los
valores medios, las desviaciones estándar y los ensayos T se
calcularon usando el software Excel (Microsoft Office).
Se fijaron larvas a 3, 5, 8 y 10 d.p.f. en
glutaraldehído al 4% en tampón cacodilato que contenía peróxido de
hidrógeno al 0,006% durante 3 horas, y posteriormente se lavaron en
tampón cacodilato antes de la fijación posterior en tetróxido de
osmio. Las muestras se tiñeron de forma generalizada con acetato de
uranilo, se deshidrataron en etanol y se incluyeron en resina de
Spurr. Se prepararon secciones finas (5 nm) con un Leica Ultracut
UCT, se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo y se
visualizaron en un microscopio electrónico Philips CM100 a 80
KV.
Se fijaron las larvas a 3, 5, 8 y 10 d.p.f. en
PFA al 4% y se procesaron para el crioseccionamiento como se ha
descrito anteriormente. Después se lavaron secciones de 10 \mum en
PBS y se realizó tinción con anticuerpo contra pgp (Abcam) a una
dilución 1:100 y la tinción se detectó usando un anticuerpo
secundario fluorescente Alexa 568 (Molecular Probes). Las secciones
se tiñeron con un colorante de contraste y se montaron usando
Vectamount que contenía DAPI (Vector Laboratories, Peterborough, UK)
y después se visualizaron usando un microscopio Olympus BX51 con
iluminación fluorescente. Las imágenes representativas se capturaron
usando una cámara ColorView (Olympus) y un software AnalySis (Soft
Imaging System).
Se transfirieron aproximadamente 100 larvas a un
solo pocillo de una placa de 12 pocillos (Corning) que contenían
medio de embrión. El volumen final del medio de embrión por pocillo
se ajustó a 1,5 ml. Los compuestos de interés se prepararon como
soluciones madre congeladas a 2 mg/ml en DMSO. Se añadieron 11,25
\mul de solución madre a cada pocillo para dar una concentración
final de 15 \mug/ml. Las larvas se incubaron con el fármaco
durante 1 hora a temperatura ambiente y después se anestesiaron en
hielo. Para el análisis de captación completo, las larvas
anestesiadas se transfirieron a pequeños tubos de microcentrífuga y
se retiró todo el exceso de líquido. Para el análisis de captación
en el cerebro frente al cuerpo, las larvas se anestesiaron por
enfriamiento y después se decapitaron usando tijeras finas para
iridectomía. Se recogieron muestras de tejido cefálico y corporal
en tubos de microcentrífuga separados en hielo y se retiró todo el
exceso de líquido. Se midió el peso total de la muestra de tejido.
Las muestras después se congelaron a -20ºC antes de la extracción
para HPLC. Para el análisis de HPLC posterior, se descongelaron
muestras de tejido y se realizó una extracción inicial usando
terc-butilmetiléter (t-bme). Después
se evaporó el extracto de disolvente y se reconstituyó en tampón
acetato 1 M, pH 4,7. Se obtuvo una limpieza adicional usando un
procedimiento de extracción en fase sólida de modo mixto
(intercambio catiónico). El eluato se evaporó y se reconstituyó en
metanol/ácido acético. Se realizaron inyecciones de 10 ml de
muestras extraídas en un sistema LCMS usando una columna analítica
Waters SymmetryShield (150 x 3,9) RP8. Las muestras se analizaron
por LCMS/MS de exploración completa en condiciones de APCI en modo
de ion positivo. Las condiciones de LC se proporcionan en la Tabla
1. Los parámetros de exploración de MS/MS se proporcionan en la
Tabla 2.
Fueron necesarias modificaciones adicionales
para la extracción de simvastatina y pravastatina, ya que se
realizaron inyecciones de 10 \mul en el sistema de LCMS usando una
columna analítica Luna C18 (5 x 4,6). Las muestras se analizaron
por LCMS/MS de exploración completa en condiciones de ESI en modo de
ion positivo para simvastatina y en modo de ion negativo para
pravastatina. Las condiciones de LC se proporcionan en la Tabla 3.
Los parámetros de exploración de MC se proporcionan en la Tabla
4.
Se disolvió rodamina 123 en EtOH al 10% en
solución salina al 0,9% para obtener una solución madre de 0,5
mg/ml. Se realizaron experimentos de exclusión de colorante en
larvas a 3, 5, 8 y 10 d.p.f. como se ha descrito anteriormente
usando 0,5 mg/ml de rodamina 123 en presencia o ausencia de
verapamil. Las larvas se expusieron a verapamil a 50 \mug/ml
durante 2 horas antes y durante la inyección intrapericárdica del
colorante y durante 3 horas después de la inyección. Tres horas
después de la inyección, las larvas se anestesiaron y se fijaron en
PFA al 4% antes del procesamiento para obtener las secciones
congeladas. La cuantificación de fluorescencia en el cerebro se
realizó como se ha descrito anteriormente.
Se transfirieron larvas a 3, 5 y 10 d.p.f. a
placas de 96 pocillos (Millipore) que contenían medio de embrión.
El análisis del comportamiento se realizó en placas de 96 pocillos
con un pez por pocillo. El volumen final de medio de embrión por
pocillo se ajustó a 200 \mul. Se obtuvieron soluciones madre de
compuestos de ensayo a una concentración de ensayo 100x. Los
compuestos de ensayo eran fármacos antihistamínicos seleccionados
basándose en su capacidad de atravesar la BBB en mamíferos;
difenhidramina, un fármaco sedante que atraviesa la BBB; y
desloratidina, un fármaco no sedante que no atraviesa la BBB. En
cada pocillo de la placa de cribado se añadieron 2 \mul de
solución madre de compuesto de ensayo. Se prepararon 12 pocillos
para cada compuesto en cada edad larvaria. La actividad se registró
con pocillos individuales de la placa de 96 pocillos durante un
periodo de 2 horas usando un equipo y software Ethovision TrackSys.
Se calculó la actividad total media para cada grupo de tratamiento
en cada edad larvaria usando un software Excel.
TEM a 3 d.p.f. no muestra ningún indicio de
uniones estrechas. Por el contrario, TEM a 5 d.p.f. muestra que
están presentes uniones estrechas en parte pero no en todo el
endotelio vascular, produciéndose posteriormente una maduración
gradual.
La clonación in silico identificó un ortólogo de
pez cebra potencial de pgp humana.
Pgp se expresa en el endotelio vascular del SNC
a 8 d.p.f. y fases posteriores.
Los fármacos que no atraviesan la BBB están
presentes en todo el cuerpo de muestras a 3 d.p.f., pero se
excluyen de la cabeza a 10 d.p.f. Los fármacos que atraviesan la BBB
se distribuyen igualmente en muestras a 3 d.p.f. y a 10 d.p.f.
La intensidad de fluorescencia del compuesto de
ensayo y el agente de control se midió en el cerebro del pez cebra
después de una inyección periférica en diversos puntos de tiempo. La
fluoresceína sódica, al igual que otras moléculas pequeñas
ensayadas, se infiltra en el cerebro hasta el día 8, pero se excluye
desde el día 10.
Por el contrario, el Azul de Evans, una molécula
mucho mayor que se sabe que forma multímeros, se excluye del
cerebro desde el día 5.
Se observó que ciertos antihistamínicos que se
sabía que no eran sedantes en seres humanos debido a su exclusión
del cerebro no tenían un efecto sedante en el pez cebra d10, a
diferencia de los antihistamínicos conocidos por tener un efecto
sedante en seres humanos basándose en su penetración en el cerebro,
que también tenían un efecto sedante en el pez cebra d10.
R123 es rodamina 123, un sustrato fluorescente
para pgp. La coadministración de verapamil, un inhibidor de pgp,
conduce a la penetración de rodamina 123 en el cerebro en puntos de
tiempo cuando de otra manera se excluiría, demostrando una salida
activa de rodamina 123.
La creación de un compartimento selectivo por
medio de la formación de una barrera epitelial utiliza dos tipos de
uniones: uniones herméticas y uniones tabicadas. Las dos uniones son
selectivas y dinámicas y pueden asociarse a señales y rutas
intracelulares a través de proteínas asociadas a la membrana.
Las barreras epiteliales de cerebro de los peces
se han estudiado anatómicamente en varias especies por microscopía
electrónica (Nakao, 1979). Con microscopía electrónica de secciones
ultrafinas, aparecen uniones estrechas en la zona de contacto
completo entre las membranas plasmáticas de células adyacentes
(Farquhar y Palade, 1965). Tras una electromicroscopía de fractura
por congelación, aparecen como una red anastomótica continua de
cadenas de uniones estrechas de salientes y ranuras complementarias
(Staehelin, 1974). Rascher y Wolburg (Rascher y Wolburg, 1997)
examinaron secciones ultrafinas de carpa adulta y mostraron uniones
estrechas y huecos y desmosomas en la membrana aracnoidea. El mismo
documento demostró una maduración gradual de las uniones estrechas
en el polluelo. Concluyen su discusión con la siguiente afirmación
(última frase, última página): la gran variabilidad de la anatomía
de las capas meníngeas en vertebrados y - como hemos demostrado
aquí - de la estructura de unión estrecha dificulta el
esclarecimiento del mecanismo de la inducción de la barrera
aracnoidea y la transferencia de un resultado de una especie a
otra.
A través de la administración periférica de
fluoresceína sódica, de peso molecular 376 Da, se ha podido
demostrar que el pez cebra efectivamente tiene una barrera
hematoencefálica. Ésta empieza a formarse el día 5, con el
resultado de que a partir de este momento se excluyen moléculas de
mayor tamaño tales como el azul de Evans (que algunas veces puede
formar multímeros). La BBB permanece permeable, sin embargo, a
pequeñas moléculas tales como moléculas pequeñas de tipo fármaco
hasta que la BBB ha madurado adicionalmente en el día 10, a menos
que haya una salida activa por pgp, en cuyo caso la exclusión eficaz
se produce a partir del día 8.
Un buen ejemplo clínico del papel de expulsión
de la glicoproteína p es la explicación de los efectos no sedantes
de antihistamínicos de segunda generación, saliendo éstos
activamente desde el cerebro a diferencia de sus homólogos de
primera generación (Chen et al., 2003). Por ejemplo, la
hidroxizina, la difenhidramina y la triprolidina son
antihistamínicos sedantes, mientras que la loratadina, la
desloratadina (el metabolito activo de la loratadina) y la
cetirizina (el metabolito activo de la hidroxizina) son no
sedantes.
La pgp está presente en células epiteliales
especializadas en la secreción y excreción de moléculas indeseadas,
particularmente en el intestino, hígado, riñón y BBB. Las
glicoproteínas p experimentan modificaciones postraduccionales
extensas, incluyendo la fosforilación y la glicosilación. Hay al
menos 3 tipos de glicoproteína p en mamíferos. Bard (aquatic
toxicology, 2000) resume la expresión de proteínas de tipo pgp en
peces en la figura 2, aunque no indica la expresión de BBB.
En el presente documento se han proporcionado
pruebas tanto anatómicas como funcionales del transporte activo de
moléculas a través de la barrera hematoencefálica en el pez cebra.
De esta manera, aunque moléculas pequeñas que no son sustratos de
la pgp pueden atravesar la BBB hasta el día 10, las que son
sustratos de pgp se expulsan activamente a partir del día 8.
Los intentos de predecir la penetración de
fármacos a través de las membranas incluyen la medición del reparto
de fármacos en disolventes; aunque la perfusión a través de
disolventes no es idéntica a la difusión a través de las membranas
biológicas, no olvidemos la falta de información sobre los sistemas
de transporte activos (Lieb y Stein, 1976). De hecho, como
resultado de proteínas de transporte tales como las glicoproteínas
p, los efectos netos de una diversidad de fármacos hidrófobos, tales
como digoxina, ciclosporina y loperamida, es relativamente baja
(Schinkel et al., 1996).
Los modelos de barrera hematoencefálica que
implican sistemas de cultivo de células juegan algún papel en la
evaluación de si los fármacos pueden atravesar la barrera
hematoencefálica, pero son limitados, ya que los sistemas de
transporte y las enzimas de la barrera hematoencefálica pueden
regularse negativamente de forma severa o no estar presentes en
absoluto (Terasaki et al., 2003). Además, no forman uniones
herméticas rígidas.
El pez cebra, por lo tanto, puede emplearse de
manera muy útil para determinar si un compuesto atraviesa la BBB en
una situación in vivo. Además, estos resultados permiten la
investigación racional de pequeñas moléculas para criterios de
valoración del SNC y oftalmológicos en el pez cebra.
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Claims (36)
1. Procedimiento de cribado para obtener una
sustancia con actividad biológica en el sistema nervioso central
(SNC), cerebro u ojo, comprendiendo el procedimiento:
administrar una sustancia de ensayo a un pez
cebra de ensayo
determinar el efecto de la sustancia de ensayo
sobre la actividad o función del sistema nervioso central, cerebro
u ojo, o el efecto de la sustancia de ensayo sobre un síntoma o una
enfermedad o trastorno del sistema nervioso central, cerebro u ojo
del pez de ensayo,
identificando de esta manera una sustancia con
dicha actividad biológica;
donde
se sabe que la sustancia de ensayo atraviesa la
barrera hematoencefálica y el procedimiento se realiza en pez cebra
de cualquier edad;
o se sabe que la sustancia de ensayo no
atraviesa la barrera hematoencefálica y el procedimiento se realiza
en pez cebra con una edad menor de cinco días desde la fertilización
para moléculas de 960 daltons o más, menor de diez días desde la
fertilización para moléculas de menos de 960 daltons no expulsadas
por la glicoproteína p (pgp), o menor de 8 días desde la
fertilización para moléculas expulsadas de forma activa por pgp, y/o
se realiza en pez cebra con una edad de al menos cinco días desde
la fertilización para moléculas de 960 daltons o más, o al menos
diez días desde la fertilización para moléculas de menos de 960
daltons no expulsadas por la pgp y al menos ocho días desde la
fertilización para moléculas expulsadas activamente por la pgp, y
comprende la liberación directa de la sustancia de ensayo para
evitar la barrera hematoencefálica;
o, sin saber si la sustancia de ensayo puede o
no atravesar la barrera hematoencefálica, el procedimiento se
realiza en un pez cebra con una edad de al menos cinco días desde la
fertilización para moléculas de 960 daltons o más, y al menos diez
días desde la fertilización para moléculas de menos de 960 daltons,
con la liberación directa de la sustancia de ensayo para evitar la
barrera hematoencefálica;
donde las edades indicadas se refieren al pez
cebra criado en condiciones convencionales y se ajustan si el pez
cebra se cría en condiciones que aceleran o retrasan la consecución
de una fase de desarrollo equivalente.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, donde dicha liberación directa comprende la
inyección en el cerebro o el ojo.
3. Procedimiento de cribado para obtener una
sustancia con actividad biológica en el sistema nervioso central
(SNC), cerebro u ojo, comprendiendo el procedimiento:
administrar una sustancia de ensayo a un pez
cebra de ensayo,
determinar el efecto de la sustancia de ensayo
sobre una actividad o función del sistema nervioso central, cerebro
u ojo, o el efecto de la sustancia de ensayo sobre un síntoma o una
enfermedad o trastorno del sistema nervioso central, cerebro u ojo
del pez de ensayo,
identificando de esta manera una sustancia con
dicha actividad biológica;
donde el procedimiento se realiza para moléculas
de 960 daltons o más en pez cebra con una edad menor de cinco días
desde la fertilización y en pez cebra con una edad de al menos cinco
días desde la fertilización, o se realiza para molécula de menos de
960 daltons en pez cebra con una edad menor de diez días desde la
fertilización y en pez cebra con una edad de al menos diez días
desde la fertilización, sin la liberación directa de la sustancia
de ensayo para evitar la barrera hematoencefálica, con lo que se
obtiene una sustancia que tiene dicha actividad biológica y tiene
la capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica;
donde las edades indicadas se refieren al pez
cebra que se ha criado en condiciones convencionales y se ajustan
si el pez cebra se cría en condiciones que aceleran o retrasan la
consecución de la fase de desarrollo equivalente.
4. Procedimiento para obtener una sustancia con
actividad biológica en el sistema nervioso central (SNC), cerebro u
ojo, comprendiendo el procedimiento un ensayo de cribado llevado a
cabo administrando una sustancia de ensayo a un pez cebra de
ensayo, con lo que se obtiene una sustancia con dicha actividad
biológica, donde el diseño del ensayo de cribado emplea un
algoritmo formulado para tener en cuenta la presencia y el momento
de la formación de una barrera hematoencefálica en el pez cebra.
5. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, donde el algoritmo se formula adicionalmente para
tener en cuenta si la sustancia de ensayo atraviesa o no la barrera
hematoencefálica.
6. Procedimiento de cribado para una sustancia
con actividad biológica en el sistema nervioso central (SNC),
cerebro u ojo sustancialmente como se presenta en la figura 1.
7. Uso de la existencia y el momento de
formación de una barrera hematoencefálica en un pez cebra en el
diseño de un ensayo para cribado de una sustancia con actividad
biológica en el sistema nervioso central (SNC), cerebro u ojo.
8. Procedimiento de cribado para obtener una
sustancia con actividad biológica, sustancia que no atraviesa la
barrera hematoencefálica, comprendiendo el procedimiento:
administrar una sustancia de ensayo al pez cebra
de ensayo y
determinar el efecto de la sustancia de ensayo
sobre la actividad o función en el pez cebra o el efecto de la
sustancia de ensayo sobre un síntoma o una enfermedad o un trastorno
en el pez cebra,
identificando de esta manera una sustancia con
dicha actividad biológica,
donde el procedimiento comprende además
determinar la capacidad o incapacidad de la sustancia con dicha
actividad biológica de atravesar la barrera hematoencefálica en el
pez cebra de ensayo con una edad de al menos cinco días desde la
fertilización para moléculas de 960 daltons o más, o al menos diez
días desde la fertilización para moléculas de menos de 960 daltons,
identificando de esta manera una sustancia con dicha actividad
biológica y que no atraviesa la barrera hematoencefálica;
donde las edades indicadas se refieren al pez
cebra que se ha criado en condiciones convencionales y se ajustan
si el pez cebra se cría en condiciones que aceleran o retardan la
consecución de la fase de desarrollo equivalente.
9. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, que comprende identificar la sustancia con dicha
actividad biológica en un pez cebra de ensayo con una edad menor de
cinco días desde la fertilización para una molécula de 960 daltons
o más, menor de diez días desde la fertilización para una molécula
de menos de 960 daltons que no se expulsa por pgp o menor de ocho
días desde la fertilización para una molécula que se expulsa de
forma activa por pgp; donde las edades indicadas se refieren al pez
cebra criado en condiciones convencionales y se ajustan si el pez
cebra se cría en condiciones que aceleran o retrasan la consecución
de la fase de desarrollo equivalente.
10. Uso de la existencia y el momento de
formación de una barrera hematoencefálica en un pez cebra en el
diseño de un ensayo para el cribado de una sustancia con actividad
biológica y que no atraviesa la barrera hematoencefálica.
11. Procedimiento o uso de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende
determinar si una sustancia de ensayo se transporta activamente a
través de la barrera hematoencefálica.
12. Procedimiento o uso de acuerdo con la
reivindicación 11, que comprende determinar si una sustancia de
ensayo se transporta activamente al interior del cerebro.
13. Procedimiento o uso de acuerdo con la
reivindicación 11, que comprende determinar si una sustancia de
ensayo se transporta activamente al exterior del cerebro.
14. Procedimiento o uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende
determinar si una sustancia de ensayo es transportada por la
glicoproteína p.
15. Procedimiento o uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende
determinar si una sustancia de ensayo interfiere en la función de
la glicoproteína p.
16. Procedimiento o uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende
determinar si una sustancia de ensayo altera la expresión de la
glicoproteína p.
17. Procedimiento o uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, donde la sustancia de
ensayo se evalúa tanto antes como después del desarrollo de
glicoproteínas p funcionales.
18. Procedimiento o uso de acuerdo con la
reivindicación 17, donde la sustancia de ensayo se evalúa el día 8
ó 9 después de la fertilización, así como el día 10 o posterior,
donde las edades indicadas se refieren al pez cebra que se ha
criado en condiciones convencionales y se ajustan si el pez cebra se
cría en condiciones que aceleran o retrasan la consecución de la
fase de desarrollo equivalente.
19. Procedimiento o uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende
determinar si una combinación de sustancias de ensayo ha alterado
la penetración a través de la BBB en comparación con una sustancia
de ensayo administrada sola.
20. Procedimiento o uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende
determinar los gradientes de concentración de fármaco
cuerpo:cerebro.
21. Procedimiento o uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende
comparar eficacias relativas de sustancias de ensayo con la
actividad deseada en el sistema nervioso central en presencia de
una barrera hematoencefálica.
22. Procedimiento o uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende
determinar la penetración de una sustancia de ensayo a través de la
barrera sangre-retina.
23. Procedimiento o uso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende
determinar si una sustancia de ensayo es metabolizada por la
barrera hematoencefálica.
24. Uso del pez cebra para determinar si una
sustancia de ensayo se transporta activamente a través de la
barrera hematoencefálica.
25. Uso del pez cebra para determinar si una
sustancia de ensayo se transporta activamente al interior del
cerebro.
26. Uso del pez cebra para determinar si una
sustancia de ensayo es transportada activamente al exterior del
cerebro.
27. Uso del pez cebra para determinar si una
sustancia de ensayo se transporta a través de la barrera
hematoencefálica por la glicoproteína p.
28. Uso del pez cebra para determinar si una
sustancia de ensayo interfiere con la función de la glicoproteína
p.
29. Uso del pez cebra para determinar si una
sustancia de ensayo altera la expresión de la glicoproteína p.
30. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 27 a 29, donde la sustancia de ensayo se evalúa
tanto antes como después del desarrollo de glicoproteínas p
funcionales.
31. Uso de acuerdo con la reivindicación 30,
donde la sustancia de ensayo se evalúa el día 8 ó 9 después de la
fertilización, así como el día 10 o posterior, donde las edades
indicadas se refieren al pez cebra que se ha criado en condiciones
convencionales y se ajustan si el pez cebra se cría en condiciones
que aceleran o retrasan la consecución de una fase de desarrollo
equivalente.
32. Uso del pez cebra para determinar si una
combinación de sustancias de ensayo ha alterado la penetración a
través de la BBB en comparación con una sustancia de ensayo
administrada sola.
33. Uso del pez cebra para determinar gradientes
de concentración de fármaco cuerpo:cerebro.
34. Uso del pez cebra para comparar eficacias
relativas de sustancias de ensayo con actividad deseada en el SNC
en presencia de una barrera hematoencefálica.
35. Uso del pez cebra para determinar la
penetración de una sustancia de ensayo a través de la barrera
sangre-retina.
36. Uso del pez cebra para determinar si una
sustancia de ensayo es metabolizada por la barrera
hematoencefálica.
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