CN101445792A

CN101445792A - 诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的细胞共培养方法

Info

Publication number: CN101445792A
Application number: CNA200810220421XA
Authority: CN
Inventors: 查振刚; 林宏生; 吴昊
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University; University of Jinan
Priority date: 2008-12-25
Filing date: 2008-12-25
Publication date: 2009-06-03

Abstract

本发明提供了一种诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的方法。该方法是在骨髓间充质干细胞培养体系中，加入少量成骨细胞，形成成骨微环境，成骨细胞数量优选占总细胞数量的30％以上。本发明首次利用少量成骨细胞提供的成骨微环境，通过共培养方法诱导BMSCs在体外形成成熟的骨组织，在骨组织修复和重建领域具有广阔的前景。

Description

诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的细胞共培养方法

技术领域

本发明涉及组织工程领域，具体涉及一种诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为成骨细胞(OB)的细胞共培养方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞(BMSCs)只有在特定的诱导条件下才能向成骨细胞转化，对于BMSCs向成骨细胞定向分化的条件研究较多，目前多采用在培养液中加入化学物质、细胞因子以及采用基因转染等的方法达到促定向分化的目的。

在将骨髓基质细胞向成骨细胞定向诱导分化的问题上，现有的几种方法均存在不足之处：常规诱导液导致细胞生长减慢且其具体的作用方式和条件仍存在着争论；使用相关细胞生长因子的刺激尚处于摸索阶段，且细胞生长因子用量大、成本较高、并可引起机体的不良反应，等等。因此，有必要寻找一种新的诱导方法。

共培养(co-culture)，系指两种或多种细胞在同一个培养容器内，同样的培养条件下进行混合培养。根据实验不同的要求，可采用不同种类的敏感细胞，以细胞合适的比例进行协同培养。混合细胞培养已较广泛地用于细胞间相互作用机制、肿瘤细胞与正常细胞间关系以及免疫反应机制研究中。

国内外研究者发现，BMSCs的分化具有位点特异性，即在何种微环境中培养BMSCs，就倾向于向这类环境中的细胞分化。根据BMSCs分化的位点特异性，在骨组织工程中欲把BMSCs诱导分化为成骨细胞，采用模拟成骨微环境来诱导BMSCs的增殖与成骨分化可能也是一种有效的诱导方法。

发明内容

针对现有技术的缺陷与不足，本发明的目的是应用细胞共培养技术提供一种有效诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的方法。

为达到上述目的，本发明探索了利用成骨细胞为BMSCs提供成骨微环境从而诱导BMSCs的增殖与向成骨细胞分化的可能性。并探索了两种细胞在何种比例下直接混合培养更适合细胞功能的发挥。进一步发现，不同比例和不同时间直接混合培养细胞得到的效果也有所不同。

本发明提供的具体技术方案是：一种诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的细胞共培养方法，是在骨髓间充质干细胞培养体系中，加入成骨细胞，形成成骨微环境。

上述方法中，所述成骨细胞数量优选占总细胞数量的30％以上。

上述方法中，细胞培养的条件适用现有任何有利于BMSCs生长的条件。如可以是下面的具体培养方法：P3代成骨细胞接种于24孔板，待细胞接种24h后，弃培养液，PBS液洗2次，换入无血清培养基，24h同步化后，加入骨髓充质干细胞和1ml含10％胎牛血清DMEM培养基，培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养，每3—4d换液一次。

上述方法中，所述成骨细胞的接种密度优选1×10⁵个细胞/ml，所述骨髓充质干细胞的加入密度优选为7/3×10⁵个细胞/ml。

本发明利用少量成骨细胞提供的成骨微环境，通过共培养方法诱导BMSCs在体外形成成熟的骨组织，在骨组织修复和重建领域具有广阔的前景。

相对于现有技术，本发明的有益效果体现在以下几个方面：

(1)证明利用共培养的方法诱导BMSCs是可行的。因为直接共培养条件下，不仅细胞分泌的各种因子可通过培养液自由流动，且细胞相互接触，相互作用间作用更为密切，所以成骨细胞的加入为BMSCs提供了成骨微环境，从而有利于其向成骨细胞分化。

(2)共培养不需要添加昂贵的成骨细胞诱导因子和/或细胞生长因子，能有效促进成骨细胞的增殖和AP活性，增加新骨组织生成量。

(3)提供了优化的共培养比例，可以避免不必要的种子细胞的浪费，为该方法的更大规模的应用提供了前提。

附图说明

图1是OB与BMSCs混合培养48小时，Giemsa染色图。

其中，A：倒置相差显微镜×40，B：倒置相差显微镜×100。

图2是OB与BMSCs混合培养第6天时的细胞形态图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明，但本发明的实现方式并不局限于此。

实施例

1、成骨细胞、BMSCs的混合培养及镜下观察

P3代OB以1×10⁵cells/ml接种于24孔板，设置对照组及3个实验组，共4组，每组6个复孔。待细胞接种24h后，弃培养液，PBS液洗2次，换入无血清培养基，24h同步化后，对照组只加入1ml含10％胎牛血清DMEM培养基，实验1、2、3组分别加入密度为9×10⁵/ml、4×10⁵/ml、7/3×10⁵/ml浓度的BMSCs和1ml含10％胎牛血清DMEM培养基，使OB和BMSCs直接联合共培养的比例为1∶0、1∶9、2∶8、3∶7。培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养。每3—4d换液一次，连续共培养9d。共培养期间倒置相差显微镜逐日观察细胞形态的变化并行Giemsa染色观察。

如图1所示，OB与BMSCs混合培养48小时后完全贴壁，两种细胞交织生长，无排斥和吞噬现象，OB体积较大，BMSCs体积较小。

如图2所示，OB与BMSCs混合培养，两种细胞混合生长，细胞相容性好。共同培养第6天时OB与BMSCs失去各自细胞形态均呈长梭形生长。

2、成骨细胞促BMSCs有效骨向分化的最小浓度比

碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞分化的早期标志物，基质合成期开始出现，钙化期达到高峰，常作为成骨细胞的鉴定指标和功能状态的评价指标。

P3代OB以1×10⁵cells/ml接种于24孔板，设置对照组及3个实验组，共4组，每组6个复孔。待细胞接种24h后，弃培养液，PBS液洗2次，换入无血清培养基，24h同步化后，对照组只加入1ml含10％胎牛血清DMEM培养基，实验1、2、3组分别加入密度为9×10⁵/ml、4×10⁵/ml、7/3×10⁵/ml浓度的BMSCs和1ml含10％胎牛血清DMEM培养基，使OB和BMSCs直接联合共培养的比例为1∶0、1∶9、2∶8、3∶7。培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养。每3—4d换液一次，连续共培养9d。共培养期间分别取3、6、9d细胞上清液，-20℃保存，收集齐后运用ALP试剂盒检测ALP活性。

#：与A组、B组比较P值<0.05；^＊：与D组比较，P值>0.05

表各共培养组不同时间点的ALP活性(n＝6，x±s)

对照组与实验组C(OB:BMSCs为3∶7)碱性磷酸酶活性明显高于其他两个实验组(P<0.05)，而对照组与实验组C之间碱性磷酸酶活性并无显著性差异(P>0.05)。

3、统计学分析

采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。采用单因素方差分析，选择q检验进行组间比较。以P<0.05有显著性差异，P<0.01有非常显著性差异。

以上实验证明，在骨髓间充质干细胞和成骨细胞的共培养体系中，在培养条件一定的情况下，成骨细胞的最低添加量在30％时，即达到骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化与增殖的最佳条件。

Claims

1、一种诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的细胞共培养方法，其特征在于：是在骨髓间充质干细胞培养体系中，加入成骨细胞，形成成骨微环境。

2、根据权利要求1所述的诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的方法，其特征在于：所述成骨细胞数量占总细胞数量的30％以上。

3、根据权利要求1或2所述的诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的方法，其特征在于包括以下具体步骤：P3代成骨细胞接种于24孔板，待细胞接种24h后，弃培养液，PBS液洗2次，换入无血清培养基，24h同步化后，加入骨髓充质干细胞和1ml含10％胎牛血清DMEM培养基，培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养，每3—4d换液一次。

4、根据权利要求3所述的诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的方法，其特征在于：所述成骨细胞的接种密度1×10⁵个细胞/ml，所述骨髓充质干细胞的加入密度为7/3×10⁵个细胞/ml。