CN102978157A

CN102978157A - 一种诱导间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法

Info

Publication number: CN102978157A
Application number: CN2012105355307A
Authority: CN
Inventors: 安沂华; 董健伸
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-12-13
Filing date: 2012-12-13
Publication date: 2013-03-20

Abstract

本发明涉及一种使用具有半通透型支架隔离系统的培养小室，定向诱导间充质干细胞分化为成骨细胞的方法，使用Transwell支架培养系统，在嵌套内室接种MSCs，在外室接种成骨细胞，通过控制两种细胞的合理比例，以及适当时间加入特定的细胞因子，快速的诱导MSCs分化为成骨细胞。

Description

一种诱导间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法

本发明涉及一种诱导间充质干细胞定向分化为成骨细胞的方法，具体而言，是一种使用具有半通透型支架隔离系统的培养小室，定向诱导间充质干细胞分化为成骨细胞的方法。

背景技术

近年来研究表明，成熟细胞在体外扩增困难，并且会很快老化进而失去增殖能力。干细胞具有自我复制的能力以及向一种或多种成熟细胞分化的特征。因此体外培养干细胞可以作为组织工程学等生物研究种子细胞的新来源。干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞具有全能性，可以分化成各种类型的细胞，但存在伦理问题和瘤化风险，因此应用受到了限制。成体干细胞取材方便、来源广泛，也可以分化成多种类型的细胞，且培养诱导容易，因此更加适合作为临床应用的种子细胞。间充质干细胞作为成体干细胞的一种，因为其分离培养技术最为成熟，目前应用最为广泛。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

目前，实现MSCs细胞的诱导分化主要包括：采用化学因子诱导、添加特定的细胞因子、转入特定基因等方法。这些方法存在比较明显的缺陷，添加的化学因子，对细胞有一定的毒副作用，使细胞生长减缓，细胞内部产生一系列不易被检测到的变化：细胞因子成本较高，只是几种细胞因子的组合，并不一定是最适的组合，同时由于细胞因子添加的比例不合适可能会引发众多的不相关生化反应；转基因技术本身成本过高，同时，会在细胞内引入多余的基因，改造过的细胞的安全性得不到保障。还有人使用如成骨细胞和MSCs直接共培养的方法来诱导分化，这种方法难于实现大规模诱导，诱导用细胞一次性消耗，需要不断培养用于诱导的成骨细胞，同时诱导出的细胞是混杂的细胞，没办法得到纯化的诱导细胞。

对于细胞和细胞间的相互作用以及共培养诱导细胞定向分化的研究技术，本领域有很多相关的报道，例如，Transwell技术即是现有的较为常见的细胞共培养定向诱导技术，Transwell技术的核心是利用一类有通透性的杯状的装置，例如膜滤器(Membrane filters)、通透性的支架(permeable supports)等，研究不同细胞之间的相互作用，以及定向诱导的情况，该技术广泛的应用在如趋化性实验、肿瘤细胞的迁徙、侵润的实验等具体的工作中。

但是，将这种这一技术应用于间充质干细胞的定向诱导或定向分化中，目前尚未见有系统性的研究工作。利用小室技术来诱导MSC细胞定向分化，需要确定以下问题：在基础培养基中是否要添加细胞因子、激素、小分子化合物或特殊成分；还要确定最佳的诱导比例，即目标细胞与MSC细胞的比例；诱导时间的长短。

本发明使用成骨细胞作为底层细胞，MSCs作为内层细胞，利用Transwell小室进行共培养，最大限度上的减少培养基中特异添加物，只需要共培养8-10天就可得到生长旺盛的诱导细胞。

发明内容

具体而言，本发明涉及一种通过transwell技术对间充质干细胞的进行定向诱导，促使其向成骨细胞分化的方法。

本发明所述的培养MSC细胞并将其诱导为成骨细胞的方法中，所述的MSC细胞和诱导用成骨细胞可以是自体来源，也可以是异体来源。

具体而言，本发明所述的培养MSC细胞并将其诱导为成骨细胞的方法为：

步骤1、MSC细胞的获取与稳定培养。

无菌条件下，采健康人红骨髓，等体积加入含肝素钠(0.1～1.5mg/ml)的生理盐水，充分混匀，轻轻加入到密度为1.077g/mL的Ficol溶液上(Sigma，USA)，1500～2500r/min，离心20～40min，收集离心管中部云雾状的单个核层细胞层，用PBS(pH7.2～7.4)洗两遍。

按照0.5～2x10⁶cells/瓶，接种上述步骤中获得的细胞到75cm²培养瓶中，DMEM(含10％胎牛血清FCS)，37℃5％CO₂，培养。培养传代至P3代，流式检测、鉴定MSC纯度。

步骤2、成骨细胞的获取与培养

取手术获得的骨标本，室温无菌生理盐水冲洗数次切下骨小梁，洗数次除去血污及脂肪，把骨小梁切成1-3mm³的碎块，加入10ml Ham’s F12培养基，37℃5％CO₂，培养5-7天，细胞长满后可以去除组织块，用胰酶消化收集细胞，传代培养。

步骤3、诱导MSC定向分化为成骨细胞

Transwell选用聚碳酯膜(PC)，孔径0.4～3.0μm，优选3.0μm，Transwell嵌套直径可根据实际需要设定，可以是适配96孔板、48孔板、24孔板、12孔板或6孔板的系统，优选适配6孔板的24mm直径，培养板也可根据实际需要设定，优选为6孔板。(产品来自Corning公司)。接种前先用培养基DMEM含10％FCS将小室浸润37℃、1h。

将上述步骤1获得的P3代MSCs细胞接种于嵌套内，接种细胞量根据实际的小室培养面积设定为0.05～10x10⁴cell/孔，接种密度1～3x10⁵cell/ml，对于优选的适配6孔板的transwell系统，MSCs细胞接种量为2～10x10⁴个/孔，优选为4x10⁴个/孔，。

将上述步骤2获得的成骨细胞接种于作为底层细胞外室，接种细胞量根据实际的培养孔培养面积设定为0.05～10x10⁴cell/孔，对于优选的6孔板系统，优选成骨细胞接种量为0.5～2x10⁴个/孔。

MSCs与成骨细胞诱导比例为3∶2～10∶1，初始诱导培养基为DMEM(含10％FCS)，培养温度37℃，CO₂5％，在初始诱导培养基培养第1天至第7天时(优选为第3天)，向初始诱导培养基中加入成纤维细胞生长因子(FGF)，FGF浓度为1～100pg/ml，优选10pg/ml。

步骤(4)、继续培养至第8～12天，优选为第10天，收集Transwell内室的细胞，该细胞即为由MSCs诱导成的成骨细胞，对诱导分化后嵌套内室中的细胞进行性状的鉴定：

1、ALP活性鉴定

碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞分化的早期标志物，分化早期开始出现，钙化期达到峰值，可作成骨细胞鉴定的指标，ALP是分泌型蛋白，在培养液中可以直接检测。

P3代MSCs细胞与P3代成骨接种比例分别为1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，0∶1。每一组重复3个孔。按照步骤3所述方法诱导成骨细胞，使用ALP试剂盒检测培养液中的ALP活性。检测结果见表1

表1：检测不同细胞接种比例培养基中ALP含量

结论，A-D四组之间ALP活性，D组最好；E组与F组P＜0.05，差别不显著。

2、染色鉴定

2.1、碱性磷酸酶钙钴法染色

取出共培养第10天的小室，置于4℃的甲醛-钙溶液(40％甲醛，2％氯化钙)固定2h，用PBS(pH7.2-7.4)洗两遍，每次5min；小室放入底液(0.4％β-甘油磷酸钠，0.4％巴比妥，0.86％氯化钙，0.043％硫酸镁，pH9.2)，37℃孵育1.5h，蒸馏水室温冲洗2-3次；转入2％硝酸钴溶液内浸泡2min；1％硫化铵溶液漂洗1min，完成染色，显微镜下观察照相，较诱导前细胞从长梭形变为不规则的多角形，多角形的细胞聚集成团，可以观察到较大的细胞结，显现出典型的成骨细胞的特性。

2.2、Von Kossa染色

取出共培养第10天的小室，用PBS(pH7.2-7.4)洗3-4次，每次2min；室温下浸泡于中性福尔马林中固定5min，蒸馏水洗涤3次；转入5％硝酸银溶液中浸泡2h，紫外光照射1h，蒸馏水冲洗3次；5％硫代硫酸钠中和残留的硝酸银，显微镜下观察、照相，较诱导前细胞从长梭形变为不规则的多角形，多角形的细胞聚集成团，可以观察到较大的细胞结，显现出典型的成骨细胞的特性。

相比于现有的诱导分化的方法和已有的Transwell诱导方法，本发明通过优化诱导用细胞和前体MSCs的比例，选择适当的诱导时间点，以及添加单一的细胞因子，使得MSCs能够快速定向分化为成骨细胞。

附图说明

图1、P3代MSCs细胞，未进行共培养诱导时形态

图2，经成骨细胞共培养诱导后的MSCs细胞，使用碱性磷酸酶钙钴法染色

图3，经成骨细胞共培养诱导后的MSCs细胞，使用Von Kossa染色

具体实施方式

实施例1，MSC细胞、成骨细胞的培养，

无菌条件下，采健康人红骨髓45ml，加入45ml含10mg肝素钠的生理盐水，充分混匀，轻轻加入到密度为1.077x10³g/L的Ficol溶液上(Sigma，USA)，2000r/min离心30min，收集离心管中部云雾状的单个核层细胞层，用PBS(pH7.2-7.4)洗两遍。1x10⁶cells/瓶，接种到75cm²培养瓶中，DMEM含10％FCS(Hyclone，USA)，37℃5％CO₂，培养，每隔3天换液。培养传代至P3代，流式检测，鉴定MSC纯度，所获MSC的显微镜照片见图1，MSCs细胞增殖到较高密度细胞呈长梭状，整体细胞形态呈鱼群状规则分布。

成骨细胞的获取与培养。取手术获得的骨标本，室温无菌生理盐水冲洗数次切下骨小梁，洗数次除去血污及脂肪，把骨小梁切成1-3mm³的碎块，加入10mlHam’s F12培养基，37℃5％CO₂，培养5-7天，细胞长满后可以去除组织块，用胰酶消化收集细胞，传代培养。

实施例2，MSC细胞诱导分化为成骨细胞

Transwell选用聚碳酯膜(PC)，孔径3.0μm，Transwell嵌套直径24mm，嵌套膜生长面积4.67cm²，6孔板。(产品来自Corning公司)。接种前先用培养基DMEM含10％FCS将小室浸润37℃、1h。

将上述实施例1获得的P3代MSCs细胞接种于嵌套内，接种细胞量为4x10⁴个/孔。

将上述步骤1获得的P3代成骨细胞接种于作为底层细胞外室，接种细胞量为1x10⁴个/孔，MSCs与成骨细胞诱导比例为4∶1，培养基DMEM含10％FCS，培养温度37℃，CO₂ 5％，培养至第3天，培养基中加入成纤维细胞生长因子FGF 10pg/ml，继续培养至第10天。

实施例3，MSC诱导分化为成骨细胞后的性状鉴定

1、碱性磷酸酶钙钴法染色鉴定分化后的MSC细胞特性

取出共培养第10天的小室，置于4℃的甲醛-钙溶液(40％甲醛，2％氯化钙)固定2h，用PBS(pH7.2-7.4)洗两遍，每次5min；小室放入底液(0.4％β-甘油磷酸钠，0.4％巴比妥，0.86％氯化钙，0.043％硫酸镁，pH9.2)，37℃孵育1.5h，蒸馏水室温冲洗2-3次；转入2％硝酸钴溶液内浸泡2min；1％硫化铵溶液漂洗1min，完成染色，显微镜下观察，较诱导前MSCs细胞从长梭形变为不规则的多角形，多角形的细胞聚集成团，可以观察到较大的细胞结，显现出典型的成骨细胞的特性，结果见图2。

2、Von Kossa染色鉴定分化后的MSC细胞特性

取出其培养第10天的小室，用PBS (pH7.2-7.4)洗3-4次，每次2min；室温下浸泡于中性福尔马林中固定5min，蒸馏水洗涤3次；转入5％硝酸银溶液中浸泡2h，紫外光照射1h，蒸馏水冲洗3次；5％硫代硫酸钠中和残留的硝酸银，显微镜下观察、照相，较诱导前细胞从长梭形变为不规则的多角形，多角形的细胞聚集成团，可以观察到较大的细胞结，显现出典型的成骨细胞的特性，结果见图3。

由此，可以得出，诱导后的MSC细胞已经成功分化为成骨细胞。

最后需要说明的是，上述实施例仅供本领域技术人员进行理解本发明并给出技术方案的实施参考，并不用于严格限定本发明的实际保护范围，本发明的实际保护范围同样适用于本领域技术人员所能自行推导的其他实施方式。

Claims

1.一种成骨细胞的定向诱导方法，所述方法包括如下步骤：

步骤(1)、MSCs细胞的获取；

步骤(2)、诱导用成骨细胞的获取；

步骤(3)、定向诱导MSC细胞为成骨细胞：

选用聚碳酯膜(PC)Transwell系统，Transwell系统的孔径0.4～3.0μm，优选3.0μm，Transwell系统可以是适配96孔板、48孔板、24孔板、12孔板或6孔板的系统，优选为适配6孔板的24mm直径的Transwell系统，接种前先用培养基DMEM含10％胎牛血清(FCS)将小室浸润37℃、1h；

将上述步骤(1)获得的P3代MSCs细胞接种于Transwell嵌套内，接种细胞量为0.05～10x10⁴cell/孔，接种密度1～3x10⁵cell/ml；

将上述步骤(2)获得的成骨细胞接种于作为底层细胞外室，接种细胞量为0.05～10x10⁴cell/孔，MSCs与成骨细胞接种比例为MSCs∶成骨细胞＝3∶2～10∶1，优选为MSCs∶成骨细胞＝4∶1；

初始诱导培养基为DMEM(含10％FCS)，培养温度37℃，CO₂5％，在初始诱导培养基培养第1～7天时，优选为第3天时，向初始诱导培养基中加入成纤维细胞生长因子(FGF)，FGF浓度为1～100pg/ml，优选10pg/ml；

步骤(4)、继续培养至第8～12天，优选为第10天，收集Transwell内室的细胞，该细胞即为由MSCs诱导成的成骨细胞，根据需要，进行鉴定。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的MSCs细胞的获取步骤为：

无菌条件下，采健康人红骨髓，等体积加入含肝素钠(0.1～1.5mg/ml)的生理盐水，充分混匀，轻轻加入到密度为1.077g/mL的Ficol溶液上，1500～2500r/min，离心20～40min，收集离心管中部云雾状的单个核层细胞层，用PBS(pH7.2～7.4)洗两遍；

按照0.5～2x10⁶cells/瓶，接种上述步骤中获得的细胞到75cm²培养瓶中，DMEM (含10％胎牛血清FCS)，37℃5％CO₂，培养。培养传代至P3代，流式检测、鉴定MSC纯度。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)诱导用成骨细胞的获取步骤为：

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MSCs和成骨细胞是自体来源或异体来源。

5.权利要求1-4所述的方法在制备自体或异体骨组织中的应用。

6.权利要求1-4所述的方法在临床骨组织诱导和移植中的应用。