CN114621915A - 一种小分子药制备成骨微环境的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种小分子药物制备成骨微环境的方法及其应用。本发明通过小分子药物处理细胞24小时后，然后撤药，利用持续激活的Wnt信号构建骨细胞Wnt成骨微环境并促进ST2细胞成骨分化，这种方式可以保证细胞信号通路不被长期激活或者过度激活，以及减少药物对其它组织细胞产生的失控作用或者副作用。该方法可以进一步结合硬材料与细胞一体化3D打印新技术制备具有成骨微环境的骨修复功能模块，在硬材料表面实现高存活率和增殖活性，增强材料的生物学活性。特别是模块中不含药物，使其可以安全地用于骨组织工程。此外，还可以通过合成靶向药物设计连接靶向骨的小分子基团，应用于骨松病人、促进老年人骨折愈合以及治疗骨不连等。

Description

一种小分子药制备成骨微环境的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种小分子药制备成骨微环境的方法及其应用。
背景技术
骨缺损的来源有多种，包括感染、肿瘤切除、复杂创伤、翻修手术等。仅美国每年需要超过160万例骨移植，这给社会造成了巨大的经济负担。然而，目前的产品仍然面临着两个挑战：解剖特征不匹配和缺乏生物活性，导致不稳定、松动和需要翻新，这是外科医生头疼的问题。尽管3D打印技术可以通过按需打印所需的骨材料的结构和形状，消除了传统骨移植的不足，为功能性骨移植的发展创造了机会。但它们在促进骨骼组织再生时，也有相应的副作用，例如，在BMP的情况下，异位骨化、骨溶解和肿胀。目前，生物活性低仍然是一个需要克服的瓶颈。为了进一步提高骨移植的生物活性，以骨形态发生蛋白(BMP)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)等为主要生长因子的生物成分已成功地与各种生物材料结合制成骨植入物。
细胞微环境的生物学功能在维持骨骼组织的生理稳态以及骨修复和再生方面起着至关重要的作用。参与骨再生的细胞主要有三种：维持结构平衡的成骨细胞和破骨细胞，以及对环境、机械或化学信号刺激作出反应的骨细胞。近年来，研究人员对骨细胞的功能有了更全面的了解：除了作为机械传感细胞，向成骨细胞、破骨细胞等其他受体细胞发送信号外，它们还作为重要的内分泌细胞，分泌许多对成骨细胞和破骨细胞有很强作用的生物因子，控制骨微环境。例如，骨细胞分泌硬化素，一种有效的Wnt信号抑制剂，负向调节成骨细胞的分化和存活。
Wnt信号通过经典/非经典途径调控发育和出生后的过程，包括细胞增殖、分化、极化和迁移。β-catenin是经典途径中的中枢转导因子，其配体与其受体Frizzled5/6及相关受体低密度脂蛋白(LRP5/6)结合，稳定胞浆内的β-catenin。然后稳定的β-catenin进入细胞核，与Wnt信号因子Tcf/Lef家族成员相互作用，激活Wnt靶基因的转录。我们发现，骨细胞中Wnt信号的激活介导了骨形成和骨吸收，这是骨合成代谢的一种生理功能。我们不仅在体内的基因操作研究中发现了骨细胞的这种功能，而且在Wnt激活的分离的原代骨细胞的体外研究中也发现了这种功能，尽管基于基因操作表达Wnt信号可以产生以上多种生物学功能，但无法转化应用。
因此如何在体外制备成骨微环境是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小分子药制备成骨微环境的方法，在体外制备成骨微环境具有促进成骨分化作用的同时还能保证其生物活性，能够应用于骨移植中，提高骨修复再生效率的同时减少它们在促进骨骼组织再生时带来的副作用。
为达到上述目的，本发明采用的具体技术方案如下：
本发明提供了一种小分子药制备成骨微环境的方法，所述方法包括：
步骤一：细胞的复苏与培养；
步骤二：细胞的传代；
步骤三：小分子药短时间范围激活细胞Wnt信号；
步骤四：获得成骨微环境；
所述营造成骨微环境的细胞包括骨髓基质细胞、骨祖细胞、前成骨细胞、成骨细胞、骨衬细胞、骨细胞或破骨细胞中至少一种细胞或两种以上细胞组合；
通过持续激活的Wnt信号制备成骨微环境并促进细胞成骨分化，保证细胞信号通路不被长期激活或者过度激活。
进一步地，所述细胞的复苏与培养包括以下步骤：
(1)将含10％胎牛血清、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素的90％α-MEM培养基、胰酶、无菌PBS提前30min放室温备用；
(2)从-80℃中取出骨细胞，立即放入37℃水浴中，快速摇晃1min，令其尽快融化；
(3)从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液至培养皿，加入10ml完全培养基培养，轻轻摇晃均匀放回37℃培养箱；
(4)12小时后吸弃培养液，再加入6ml新鲜完全培养基，放入37℃继续培养，此后两天半量更换新鲜培养基，每次换液时残余之前的培液3ml，加入新鲜培液3ml，根据细胞生长的状态，一般4-5天左右待细胞长到融合度80％-90％时进行传代。
通过以上步骤，使细胞从休眠状态恢复活性，并迅速生长，细胞状态较好便于细胞传代。
进一步地，所述细胞的传代包括以下步骤：
(1)取需要传代的细胞，吸弃培养液，每个培养皿加入2ml无菌PBS，轻轻摇晃后吸弃，加入1ml预热的胰酶，放入37℃培养箱中消化1-2min，显微镜下观察贴壁细胞呈圆形浮起即可加入1ml完全培养基终止消化；
(2)用5ml移液管轻轻吹打细胞使其脱落，并将细胞收集移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；
(3)弃上清，在离心管中加入1ml完全培养基，重悬细胞，计数，以1.5×105cells/mL的密度接种于6孔板，每孔中加入1ml完全培养基，过夜生长12小时待细胞贴壁，生长稳定。
进一步地，小分子药激活骨细胞Wnt信号包括：
取出细胞，加入小分子药激活Wnt信号，作用24小时；
所述小分子药包括了所有能够激活Wnt信号的药物。
进一步地，所述制备成骨微环境的方法，所述小分子药为SKL2001，浓度为5-100μM；
优选地，所述浓度为60μM。
进一步地，所述获得成骨微环境包括以下步骤：
(1)Wnt信号激活剂作用细胞24小时，吸弃含SKL2001的培养基；
(2)加入无菌PBS清洗细胞2-3次后加入不含Wnt信号激活剂的完全培养基；
(3)将细胞按照上述传代方法消化。
本发明提供一种成骨微环境，所述成骨微环境通过上述方法制备获得。
本发明还提供了一种成骨微环境在新骨形成中的应用，所述成骨微环境，能够促进成骨分化，形成新骨，可用于骨缺损、骨质疏松性、骨折。
一种利用成骨微环境制备骨功能模块的方法，包括高强度生物医用材料与成骨微环境制备骨功能模块的方法；
所述高强度生物医用材料是指压缩强度在2MPa及以上的硬材料；
所述高强度生物医用材料以硬材料束的形式进行打印，所述成骨微环境以细胞束的形式进行打印；
所述方法还包括，利用多喷头交替打印硬材料束和细胞束，使硬材料束和细胞束平行排列成层，再逐层打印成具有孔道的立体结构，层间硬材料束和细胞束打印方向相互垂直，得到骨功能模块模块；使得硬材料表面具有高存活率和增殖活性，增强材料的生物学活性；
所述多喷头包括至少两个喷头，即材料打印喷头和细胞打印喷头。
这两束相互打印在一个层面上，对于每个附加层，打印的高强度生物医用材料光束和细胞束垂直于前一层的打印束；
将冻干的GelMA完全溶解在完全培养基中以制备含有0.5％(w/v)苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)光引发剂的20％(w/v)GelMA溶液；
然后将成骨微环境悬浮于0.5mL完全培养基中；将成骨微环境悬浮液与等体积的GelMA溶液混合用于3D生物打印；
将装有细胞的GelMA溶液放入注射器中并在4℃下预冷却5分钟，然后将注射器放入细胞打印喷嘴中以通过气压挤出；将高强度生物医用材料放入硬质材料喷嘴中并在95℃下熔化；
然后将熔化的高强度生物医用材料以400μm直径以1100μm的间隔以2mm/秒的印刷速度打印；将高强度生物医用材料打印为支架的框架结构，然后将载有细胞的GelMA溶液以300μm直径打印在高强度生物医用材料条之间，细胞束之间以500mm间隔以5mm/秒的打印速度进行打印；打印后，将GelMA水凝胶在405nm的蓝光下交联30秒；每层垂直打印在前一层上，形成0°/90°支撑结构，直至沉积4层。
进一步地，所述骨微环境的细胞包括与骨组织形成有关的细胞；
所述营造成骨微环境的细胞为骨髓基质细胞或者骨细胞或者两者的组合；
优选地，所述骨细胞为Wnt信号激活骨细胞，用于营造成骨微环境，促进骨髓基质细胞的增殖、成骨分化以及生物矿化，促进破骨细胞的分化，促进骨的再生修复；
优选地，所述Wnt信号激活骨细胞与骨髓基质细胞数量比为1：(2～8)；
优选地，所述Wnt信号激活骨细胞与骨髓基质细胞的数量比为1:4。
本发明至少具有以下有益效果：
1、本发明通过经Wnt信号激活的骨细胞获得的成骨微环境有效促进骨髓基质细胞成骨分化；
2、本发明通过经Wnt信号激活的骨细胞获得的成骨微环境有效促进骨髓基质细胞成骨分化的同时减少药物直接作用细胞的副作用；
3、本发明通过经Wnt信号激活的骨细胞获得的成骨微环境所制备骨功能模块中，细胞存活率高且显著促进细胞增殖；
4、本发明通过经Wnt信号激活的骨细胞获得的成骨微环境所制备骨功能模块，能显著促进成骨分化和矿化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1实验流程示意图；
图2为实施例1、5、6、7和对比例1Wnt信号靶基因的表达情况；
图3为实施例1、5、6、7、8和对比例1细胞增殖情况；
图4为实施例1和对比例1细胞β-catenin入核情况；
图5为实施例1和对比例1细胞在SKL2001处理24小时撤药后5天的Wnt靶基因表达情况；
图6为是实施例2和对比例2的碱性磷酸酶活性定性检测和定量检测结果；
图7为实施例2和对比例2成骨相关基因表达结果对比；
图8为实施例2和对比例2矿化结果对比；
图9为实施例3和对比例3小管形成实验结果对比；
图10为实施例3和对比例3成血管相关基因表达结果对比；
图11为实施例4和对比例4在功能模块中细胞活性和细胞增殖结果对比；
图12为实例4和对比例4在功能模块中碱性磷酸酶活性定性检测和定量检测结果；
图13为实例4和对比例4在功能模块中细胞成骨分化基因表达情况；
图14为实例4和对比例4在功能模块中细胞矿化结果对比。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
1.1细胞的复苏与培养
(1)将完全培养基、胰酶、无菌PBS提前30min放室温备；
(2)从-80℃冰箱中中取出MLO-Y4细胞冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃1min，使其尽快完全融化；
(3)从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液至培养皿，加入10ml完全培养基培养，轻轻摇晃均匀放回37℃培养箱；
(4)12小时后吸弃培养液，再加入6ml新鲜完全培养基，放入37℃继续培养，此后两天半量更换新鲜培养基，每次换液时残余之前的培液3ml，加入新鲜培液3ml，根据细胞生长的状态，一般4-5天左右待细胞长到融合度80％-90％时进行传代。
1.2骨细胞的传代
(1)取需要传代的骨细胞，吸弃培养液，每个培养皿加入2ml无菌PBS，轻轻摇晃后吸弃，加入1ml预热的胰酶，放入37℃培养箱中消化1-2min，显微镜下观察贴壁细胞呈圆形浮起即可加入1ml完全培养基终止消化；
(2)用5ml移液管轻轻吹打细胞使其脱落，并将细胞收集移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；
(3)弃上清，在离心管中加入1ml完全培养基，重悬细胞，计数，以3×104cells/mL的密度接种于24孔板，每孔中加入1ml完全培养基，过夜生长12小时待细胞贴壁，生长稳定。
1.3SKL2001激活骨细胞的Wnt信号
取3个孔的骨细胞，每孔加入60μM的SKL2001或者其他Wnt激活剂，作用24小时，取3个孔的骨细胞，每孔加入DMSO作为对照组。
1.4RNA提取及基因表达水平的测定
进行总RNA提取和定量PCR(QPCR)。简单地说，从用Trizol处理的细胞中提取总RNA。用高容量的cDNA逆转录试剂盒合成该cDNA，并以此为模板进行qPCR(表1)。使用ΔCt方法将相对管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA表达水平归一化。
Figure BDA0003522020790000091
表1
实施例1、5、6、7和对比例1进行了上述实验，如图2结果所示，实施例1，5，6，7的Wnt靶基因Lef1、Axin2、Bmp4和Smad6较对比例1依次递增。表明SKL2001可以以剂量依赖的方式激活骨细胞Wnt信号。
1.5细胞增殖活性测定
MLO-Y4细胞培养于60μM的SKL2001或DMSO处理的24孔板中，24小时后，加入无菌PBS清洗细胞2-3次后使用细胞计数试剂盒。每孔加入450μL不含药的完全培养基与50μLCCK8，孵育2h。随后，将每孔的上清液分别吸取到新的96孔板中，每孔100μL，并使用酶标仪测量450nm处的吸光度。
实施例1、5、6、7、8和对比例1进行了上述实验，如图3结果所示，实施例1中的MLO-Y4细胞的增殖活性不受影响。实施例5、6、7与对比例1相比，细胞增殖活性增强，实施例8中的细胞增殖活性降低。表明60μM的SKL2001能够不影响骨细胞增殖活性。
1.6入核实验
MLO-Y4细胞培养于60μM的SKL2001或DMSO处理的24孔板中，24h后，用含0.25％Triton X-100(PBS-T)的PBS洗涤，4％多聚甲醛固定，用含0.25％Triton X-100(PBS-T)的PBS通透细胞和1％BSA封闭。用兔抗鼠β-catenin多克隆抗体(1：50)和FITC标记的羊抗兔IgG(H+L)二抗(1：500)进行免疫染色。样品在PBS中洗涤三次，其中一次包括在DAPI(1：5000)中孵育5分钟，再次洗涤。然后用荧光显微镜采集图像。
实施例1和对比例1进行了上述实验，如图4结果所示，实施例1中SKL2001激活的Wnt信号的骨细胞较对比例1进入细胞核的β-cantenin更多，表明SKL2001激活了骨细胞的Wnt信号。
实施例2
2.1骨髓基质细胞成骨分化
本实施例进行了上述1.1-1.3步骤，将60μM SKL2001处理MLO-Y4细胞24h，加入无菌PBS清洗细胞2-3次再加入不含Wnt信号激活剂的完全培养基，与ST2细胞按照0.5×104：2×104(1：4)的比例共培养三天。
2.2碱性磷酸酶染色
MLO-Y4细胞与ST2细胞共培养3d后，用PBS洗涤，3.7％甲醛室温固定5min。用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒对细胞进行碱性磷酸酶染色30min。
实施例2和对比例2进行了碱性磷酸酶活性定性检测，结果如图6所示，由图6可以看出，经过3天的共培养，实施例2中的Wnt激活的骨细胞的碱性磷酸酶活性定性测定结果比对比例2中的高，证明SKL2001激活Wnt信号的骨细胞与骨髓基质细胞系共培养，与DMSO处理的骨细胞与骨髓基质细胞系共培养相比，具有更加促进成骨分化的作用。
2.3碱性磷酸酶生化活性测定
MLO-Y4细胞与ST2细胞共培养3d后，用PBS洗涤，每孔加入0.3mL50mMTris/HCl(pH7.4)后，通过刮取的方式将细胞从平板上刮下。整个过程都是在冰上进行的。在12000rpm下离心3min后，用AP检测试剂盒逐级测定上清液。
对实施例2和对比例2进行上述检测，检测结果如图6所示，由图6可以看出，经过3天的共培养，实施例2中的Wnt激活的骨细胞的碱性磷酸酶活性定量测定结果比对比例2中的高，证明S24激活Wnt信号的骨细胞与骨髓基质细胞系共培养，与DMSO处理的骨细胞与骨髓基质细胞系共培养相比，具有更显著促进成骨分化的作用。
2.4RNA提取及基因表达水平的测定
MLO-Y4细胞与ST2细胞共培养3d后，检测步骤参见1.4，对实施例2和对比例2进行上述检测，检测结果如图7中所示，由图7可以看出，通过对包括ALP在内的4个与成骨分化相关基因的mRNA进行检测，进一步证明了，实施例2提供的SKL2001激活骨细胞的Wnt微环境具有促进成骨分化的功能。
2.5矿化
MLO-Y4细胞与ST2细胞共培养14d后，在含有0.1mM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸二钠和50μg/mL L-抗坏血酸的成骨培养基中诱导矿化结节形成14d。茜素红S染色分析基质矿化情况。0.4％茜素红S染色30min，显微镜下拍照。然后在室温下用PBS广泛洗涤模块，样品在10％十六烷基氯化吡啶中脱色1h，洗涤液在562nm处测定吸光度，以定量矿化状态。
对实施例2和对比例2进行上述检测，如图8结果显示，实施例2形成的矿化结节数量和大小都高于对比例2，表明实施例2提供的SKL2001激活Wnt信号的骨细胞创造的微环境可以显著促进矿化。
实施例3
本实施例与实施例2的区别是将60μM SKL2001处理MLO-Y4细胞24h加入无菌PBS清洗细胞2-3次后加入不含Wnt信号激活剂的完全高糖培养基，再与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞按照0.3×105cells/mL：1.2×105cells/mL(1：4)的比例共培养。
3.1人脐静脉内皮细胞体外成管试验
将浓度为0.3×105cells/mL MLO-Y4(按照上诉方法经SKL2001或DMSO处理后的骨细胞)与1.2×105cells/mL HUVECs细胞混合，接种于铺好200μL基质胶/孔的24孔板中，在培养箱中培养6小时。每两小时观察一次，待出现毛细血管样结构后在显微镜下计数。用ImageJ定量分析人脐静脉内皮细胞(HUVEC)形成的血管网。
对实施例3和对比例3进行上述检测，如图9结果显示，实施例3较对比例3形成了更多的小管，表明实施例3提供的SKL2001激活Wnt信号的骨细胞创造的微环境可以显著促进HUVEC形成小管。
3.2RNA提取及基因表达水平的测定
MLO-Y4细胞与HUVEC细胞共培养24小时后提取并测定RNA，检测步骤参见1.4，如图10结果显示，实施例3较对比例3血管形成相关基因之一的Ang-1基因表达水平更高，表明实施例3提供的SKL2001激活Wnt信号的骨细胞创造的微环境可以显著促进HUVEC Ang-1的表达。
实施例4
本实施例与实施例2的区别是，将SKL2001处理24小时后的骨细胞与骨髓基质细胞按照2×105cells/mL：8×105cells/mL(1：4)的比例混合后结合3D-细胞材料一体化打印技术构建骨功能模块。
用聚己内酯(PCL)和细胞一体化打印的3D模块通过双喷头打印机生物打印，一个头打印PCL束用于支撑，另一个打印载有细胞的水凝胶束用于骨形成。这两束相互打印在一个层面上。对于每个附加层，打印的PCL光束和细胞束垂直于前一层的打印束。将冻干的GelMA完全溶解在完全培养基中以制备含有0.5％(w/v)苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)光引发剂的20％(w/v)GelMA溶液。然后将2×105MLO-Y4细胞和8×105ST2细胞混合并悬浮于0.5mL完全培养基中。将细胞悬浮液与等体积的GelMA溶液混合用于3D生物打印。将装有细胞的GelMA溶液放入注射器中并在4℃下预冷却5分钟，然后将注射器放入细胞打印喷嘴中以通过气压挤出。将聚己内酯(PCL)放入硬质材料喷嘴中并在95℃下熔化。然后将熔化的PCL以400μm直径以1100μm的间隔以2mm/秒的印刷速度打印。将PCL打印为支架的框架结构，然后将载有细胞的GelMA溶液以300μm直径打印在PCL条之间，细胞束之间以500mm间隔以5mm/秒的打印速度进行打印。打印后，将GelMA水凝胶在405nm的蓝光下交联30秒。每层垂直打印在前一层上，形成0°/90°支撑结构，直至沉积4层。将打印的PCI3D模块置于含细胞生长培养基的6孔板中，并在37℃和5％CO2条件下培养，用于后续实验。
4.1细胞活死染色
通过细胞活性检测试剂盒测定PCI3D模块中的细胞活力。细胞培养1,4,7天后，用PBS洗涤细胞并在染色混合液中孵育，染色混合液通过在1ml中加入1μL钙黄绿素AM(1000×)和1μL PI(1000×)制备。测定缓冲液。钙黄绿素AM用于染色活细胞，PI用于染色死细胞。将板在培养箱中孵育0.5小时后，立即使用倒置荧光显微镜(Leica，Wetzlar，Germany)对样品成像。使用ImagJ软件(64位，v1.46)定量细胞活力。
对实施例4和对比例4进行了上述检测，检测结果如图11所示，由图11可以看出，实施例4和对比例4在SKL2001和DMSO处理条件下的骨细胞微环境中的细胞存活率高达91％。
4.2细胞增殖活性测定
在培养开始后的第1、4、7天使用CCK8试剂盒来评估功能模块中细胞的增殖活性。PCI3D模块用PBS清洗，切成4块，放入96孔板中。每孔加入10μL CCK8(孔中提前加入90μLPBS)，孵育2h。随后，将上清液吸取到新的96孔板中，并使用酶标仪测量450nm处的吸光度。
对实施例4和对比例4进行上述检测，检测结果如图11所示，由图11可以看出，实施例4和对比例4在功能模块中的细胞活性显著高于对比例4，证明了实施例4提供的SKL2001激活Wnt信号的骨细胞成骨微环境构建的功能模块可以显著促进细胞增殖。
4.3碱性磷酸酶染色
检测方法参见2.3，对实施例4和对比例4进行上述检测，检测结果如图12所示，由图12可以看出，实施例4的成骨细胞标志基因的表达量远远高于对比例4和对比例6，证明了实施例4提供的SKL2001激活Wnt信号的骨细胞创造的微环境具有很好的促进成骨分化的功能。
经过7天和14天的共培养，实施例4中的Wnt激活的骨细胞的碱性磷酸酶活性定性测定结果比对比例4中的高，证明Wnt信号激活骨细胞与骨髓基质细胞的打印组合，与野生型骨细胞与骨髓基质细胞的相比，具有更加促进成骨分化的作用。
4.4碱性磷酸酶生化活性测定
测定方法参加2.4，经过7天和14天的共培养，实施例4中的Wnt激活的骨细胞的碱性磷酸酶活性定性测定结果比对比例4中的高，证明Wnt信号激活骨细胞与骨髓基质细胞的打印组合，与野生型骨细胞与骨髓基质细胞的相比，具有更加促进成骨分化的作用。
4.5RNA提取及基因表达水平的测定
将功能模块在培养基中分别培养7、14天用于提取RNA，后续测定步骤同1.4。
对实施例4和对比例4进行上述检测，检测结果如图13所示，由图13可以看出，实施例4的成骨细胞标志基因的表达量远远高于对比例4和对比例6，证明了实施例4提供的骨修复功能模块具有很好的促进成骨分化的功能。
4.6矿化
功能模块首先在生长培养基中培养7天。然后在含有0.1mM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸二钠和50μg/mL L-抗坏血酸的成骨培养基中诱导矿化结节形成21d。茜素红S染色分析基质矿化情况。0.4％茜素红S染色30min，显微镜下拍照。然后在室温下用PBS广泛洗涤模块，样品在10％十六烷基氯化吡啶中脱色1h，洗涤液在562nm处测定吸光度，以定量矿化状态。
对实施例4和对比例4进行上述检测，检测结果如图14所示，由图14可以看出，实施例4形成的矿化结节数量和大小都高于对比例4，证明了实施例4提供的骨修复功能模块具有很好的促进矿化的功能。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于，SKL2001的浓度为10μM。
实施例6
本实施例与实施例1的区别在于，SKL2001的浓度为20μM。
实施例7
本实施例与实施例1的区别在于，SKL2001的浓度为40μM。
实施例8
本实施例与实施例1的区别在于，SKL2001的浓度为100μM。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例中对照实施例1使用DMSO处理MLO-Y4细胞。
对比例2
本对比例与实施例2的区别在于，将DMSO处理24小时后的骨细胞与骨髓基质细胞共培养3天。
对比例3
本对比例与实施例3的区别在于，将DMSO处理24小时后的骨细胞与HEVEC细胞共培养3天。
对比例4
本对比例与实施例4的区别在于，将DMSO处理24小时后的骨细胞与骨髓基质细胞混合后结合3D-细胞材料一体化打印技术构建骨功能模块。

Claims (10)

1.一种小分子药制备成骨微环境的方法，其特征在于：所述方法包括：
步骤一：细胞的复苏与培养；
步骤二：细胞的传代；
步骤三：小分子药短时间范围激活细胞Wnt信号；
步骤四：获得成骨微环境；
所述细胞为骨细胞，包括骨细胞系，原代骨细胞至少一种细胞或两种以上骨细胞组合；
所述成骨微环境为经过上述步骤制备的细胞；
通过持续激活的Wnt信号的骨细胞及其培养上清，或者分泌的囊泡或外泌体，或者脱细胞基质，或者两种或者两种以上的组合，制备成骨微环境并促进细胞成骨分化、矿化，形成骨。而且Wnt信号通路不被长期激活。
2.根据权利要求1所述制备成骨微环境的方法，其特征在于：所述细胞的复苏与培养包括以下步骤：
(1)将含10％胎牛血清、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素的90％α-MEM培养基、胰酶、无菌PBS提前30min放室温备用；
(2)从-80℃中取出骨细胞，立即放入37℃水浴中，快速摇晃1min，令其尽快融化；
(3)从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液至培养皿，加入10ml完全培养基培养，轻轻摇晃均匀放回37℃培养箱；
(4)12小时后吸弃培养液，再加入6ml新鲜完全培养基，放入37℃继续培养，此后两天半量更换新鲜培养基，每次换液时残余之前的培液3ml，加入新鲜培液3ml，根据细胞生长的状态，一般4-5天左右待细胞长到融合度80％-90％时进行传代。
3.根据权利要求2所述制备成骨微环境的方法，其特征在于：所述细胞的传代包括以下步骤：
(1)取需要传代的细胞，吸弃培养液，每个培养皿加入2ml无菌PBS，轻轻摇晃后吸弃，加入1ml预热的胰酶，放入37℃培养箱中消化1-2min，显微镜下观察贴壁细胞呈圆形浮起即可加入1ml完全培养基终止消化；
(2)用5ml移液管轻轻吹打细胞使其脱落，并将细胞收集移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；
(3)弃上清，在离心管中加入1ml完全培养基，重悬细胞，计数，以1.5×105cells/mL的密度接种于6孔板，每孔中加入1ml完全培养基，过夜生长12小时待细胞贴壁，生长稳定。
4.根据权利要求3所述制备成骨微环境的方法，其特征在于：小分子药物激活细胞Wnt信号包括：
取出细胞，加入小分子药激活Wnt信号，作用24小时；所述小分子药包括了所有能够激活Wnt信号的药物。
优选地，所述Wnt信号激活的方法，包括生物医用材料、小分子药物、蛋白质、多肽中的一种或两种及以上成分激活经典Wnt/β-catenin信号。
5.根据权利要求4所述制备成骨微环境的方法，其特征在于：所述小分子药为SKL2001，浓度为5-100μM；
优选地，所述SKL2001的浓度为60μM。
6.根据权利要求4或5所述制备成骨微环境的方法，其特征在于：获得成骨微环境包括以下步骤：
(1)Wnt信号激活剂作用细胞24小时，吸弃含SKL2001的培养基；
(2)加入无菌PBS清洗细胞2-3次后加入不含Wnt信号激活剂的完全培养基；
(3)将细胞按照上述传代方法消化。
7.一种成骨微环境，其特征在于：所述成骨微环境通过权利要求6的方法制备获得。
8.一种成骨微环境在新骨形成中的应用，其特征在于Wnt信号激活的小分子药物连接靶向骨的小分子基团，应用于骨松病人、以及促进老年人骨折愈合、治疗骨不连等。
9.一种利用成骨微环境制备骨功能模块的方法，其特征在于：包括高强度生物医用材料与成骨微环境制备骨功能模块的方法；
所述高强度生物医用材料是指压缩强度在2MPa及以上的硬材料；
所述高强度生物医用材料以3D打印硬材料束的形式进行打印，所述成骨微环境以细胞束的形式进行打印；
所述方法还包括，利用多喷头交替打印硬材料束和细胞束，使硬材料束和细胞束平行排列成层，再逐层打印成具有孔道的立体结构，层间硬材料束和细胞束打印方向相互垂直，得到骨功能模块模块；使得硬材料表面具有高存活率和增殖活性，增强材料的生物学活性；
所述多喷头包括至少两个喷头，即材料打印喷头和细胞打印喷头。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述骨微环境的细胞包括与骨组织形成有关的细胞；
所述营造成骨微环境的细胞为骨髓基质细胞或者骨细胞或者两者的组合；
优选地，所述骨细胞为Wnt信号激活骨细胞，用于营造成骨微环境，促进骨髓基质细胞的增殖、成骨分化以及生物矿化，促进破骨细胞的分化，促进骨的再生修复；
优选地，所述Wnt信号激活骨细胞与骨髓基质细胞数量比为1：(2～8)；
优选地，所述Wnt信号激活骨细胞与骨髓基质细胞的数量比为1:4。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114214271A (zh) * 2021-09-30 2022-03-22 重庆医科大学 硬材料与细胞一体化三维生物打印方法、骨修复功能模块和骨类器官的制备方法与应用
CN114870088A (zh) * 2022-06-20 2022-08-09 重庆医科大学 一种Wnt信号激活骨细胞脱细胞基质及其表衬的骨修复支架的制备方法与应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004078261A1 (en) * 2003-03-07 2004-09-16 The University Court Of The University Of Aberdeen Cannabinoid receptor inverse agonists and neutral antagonists as therapeutic agents for the treatment of bone disorders
US20060252045A1 (en) * 2003-06-06 2006-11-09 Moitreyee Chatterjee-Kishore Methods and materials for identifying agents which modulate bone remodeling and agents identified thereby
GB0707301D0 (en) * 2007-04-16 2007-05-23 Nordic Bioscience As Screening for bone anabolic factors
CN101445792A (zh) * 2008-12-25 2009-06-03 暨南大学 诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的细胞共培养方法
CN104096233A (zh) * 2013-04-03 2014-10-15 中国科学院上海生命科学研究院 预防和治疗糖皮质激素药物引起的骨病
WO2018114832A1 (en) * 2016-12-19 2018-06-28 Katholieke Universiteit Leuven Methods and media for preparing cells for healing bone and joint disorders
CN109381749A (zh) * 2018-10-23 2019-02-26 杭州捷诺飞生物科技股份有限公司 骨组织修复墨水、组合物、支架及制备方法以及试剂盒
CN110302428A (zh) * 2019-07-30 2019-10-08 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 基于活细胞3d打印的软骨-骨-骨髓复合组织结构及方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004078261A1 (en) * 2003-03-07 2004-09-16 The University Court Of The University Of Aberdeen Cannabinoid receptor inverse agonists and neutral antagonists as therapeutic agents for the treatment of bone disorders
US20060252045A1 (en) * 2003-06-06 2006-11-09 Moitreyee Chatterjee-Kishore Methods and materials for identifying agents which modulate bone remodeling and agents identified thereby
GB0707301D0 (en) * 2007-04-16 2007-05-23 Nordic Bioscience As Screening for bone anabolic factors
CN101445792A (zh) * 2008-12-25 2009-06-03 暨南大学 诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的细胞共培养方法
CN104096233A (zh) * 2013-04-03 2014-10-15 中国科学院上海生命科学研究院 预防和治疗糖皮质激素药物引起的骨病
WO2018114832A1 (en) * 2016-12-19 2018-06-28 Katholieke Universiteit Leuven Methods and media for preparing cells for healing bone and joint disorders
CN109381749A (zh) * 2018-10-23 2019-02-26 杭州捷诺飞生物科技股份有限公司 骨组织修复墨水、组合物、支架及制备方法以及试剂盒
CN110302428A (zh) * 2019-07-30 2019-10-08 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 基于活细胞3d打印的软骨-骨-骨髓复合组织结构及方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU, YX等: "The Osteocyte Stimulated by Wnt Agonist SKL2001 Is a Safe Osteogenic Niche Improving Bioactivities in a Polycaprolactone and Cell Integrated 3D Module", CELLS, vol. 11, no. 5 *
PETER V N BODINE等: "A small molecule inhibitor of the Wnt antagonist secreted frizzled-related protein-1 stimulates bone formation", BONE, vol. 44, no. 6, XP026093850, DOI: 10.1016/j.bone.2009.02.013 *
付志斌等: "Wnt信号通路调控骨髓间充质干细胞分化与股骨头坏死发病的相关性", 甘肃医药, vol. 40, no. 5 *
任磊等: "骨细胞Wnt/β-Catenin通过Notch信号促进BMSCs成骨分化", 中国骨质疏松杂志, vol. 24, no. 5, pages 1 *
胡静;等: "骨微环境对骨转换的影响及其机制", 中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志, no. 3 *
谢正松等: "骨细胞Jag1调控骨形成的研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）基础科学辑, no. 1, pages 4 - 2 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114214271A (zh) * 2021-09-30 2022-03-22 重庆医科大学 硬材料与细胞一体化三维生物打印方法、骨修复功能模块和骨类器官的制备方法与应用
CN114214271B (zh) * 2021-09-30 2024-01-26 重庆医科大学 硬材料与细胞一体化三维生物打印方法、骨修复功能模块和骨类器官的制备方法与应用
CN114870088A (zh) * 2022-06-20 2022-08-09 重庆医科大学 一种Wnt信号激活骨细胞脱细胞基质及其表衬的骨修复支架的制备方法与应用
CN114870088B (zh) * 2022-06-20 2024-06-11 重庆医科大学 一种Wnt信号激活骨细胞脱细胞基质及其表衬的骨修复支架的制备方法与应用

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